CN101626764B - 氨基酸组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种氨基酸组合物，该组合物能够促进在马拉松等中的脂肪燃烧、提高耐力、减轻疲劳、减轻肥胖以及增强抗压能力。以下述氨基酸的总量为100质量份时，本发明的氨基酸组合物含有3.0～10.0质量份天冬氨酸、2.5～9.0质量份苏氨酸、2.0～9.5质量份丝氨酸、12.0～40.0质量份谷氨酸、7.0～20.0质量份脯氨酸、0.5～4.5质量份甘氨酸、1.0～4.5质量份丙氨酸、3.0～12.0质量份缬氨酸、0.1～0.8质量份胱氨酸、1.5～5.0质量份甲硫氨酸、2.0～8.0质量份异亮氨酸、5.0～15.0质量份亮氨酸、3.0～10.0质量份酪氨酸、3.0～10.0质量份苯丙氨酸、4.0～15.0质量份赖氨酸、0.8～4.0质量份色氨酸、1.5～5.0质量份组氨酸、2.0～6.0质量份精氨酸。

Description

氨基酸组合物
技术领域
本发明涉及一种氨基酸组合物，其用于谋求在需要耐力的比赛(例如，自行车赛等)或长时间的体力劳动等中促进脂肪燃烧、提高耐力和减轻疲劳等，或者谋求减轻肥胖、增强抗压能力等。
背景技术
对运动后的疲劳有减轻等作用的氨基酸组合物是以往人们已知的。
作为一例，已知“以下述的摩尔比含有下述氨基酸的氨基酸组合物，其中脯氨酸12.6～23.4摩尔、丙氨酸8.4～15.6摩尔、甘氨酸13.3～24.9摩尔、缬氨酸8.2～15.4摩尔、苏氨酸5.0～9.4摩尔、亮氨酸4.3～8.1摩尔、组氨酸1.8～11.9摩尔、丝氨酸1.7～3.3摩尔、赖氨酸6.0～11.2摩尔、异亮氨酸3.1～5.9摩尔、谷氨酸2.2～10.4摩尔、精氨酸2.4～4.6摩尔、苯丙氨酸2.6～5.0摩尔、酪氨酸4.2～7.8摩尔、色氨酸1.5～2.9摩尔”(专利文献1)。
作为其他例，已知一种恢复疲劳用的食品组合物，其是以天冬氨酸为有效成分的具有疲劳恢复作用的食品组合物，其特征在于，以天冬氨酸成人每日的给与量为2g以上的量摄取该组合物(专利文献2)。
作为另一其他例，已知以含有支链氨基酸为特征的中枢神经系统的疲劳恢复剂(专利文献3)。在该文献中记载了优选使用L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸的混合物作为支链氨基酸的内容。
专利文献1：日本特许第3814683号公报
专利文献2：日本再公表特许公报(国际公开号：WO2003/011056)
专利文献3：日本再公表特许公报(国际公开号：WO2002/034257)
发明内容
上述的专利文献1所记载的发明中，基于(i)黄蜂幼虫分泌的唾液中所含有的氨基酸组合物(VAAM；Vespa Amino Acid Mixture)通过口服给与后调节运动时的脂质和糖质的代谢；以及(ii)构成VAAM的氨基酸组成与运动导致疲劳时减少的血中氨基酸显示出极高的相关性；等等的认识，通过在上述(i)的构成VAAM的氨基酸组成中补加大大偏离上述(ii)的相关性、在疲劳时显示较大的减少率的特定的氨基酸(具体地说，丙氨酸、缬氨酸、组氨酸、谷氨酸)，从而获得新的氨基酸组合物。而且，利用该新的氨基酸组合物，能够补充伴随剧烈运动血中减少的氨基酸，获得提高运动功能和运动后减轻疲劳及疲劳恢复的效果。
并且，上述的专利文献2所记载的发明中，与市售的滋养强壮饮料所含有的天冬氨酸的用量较少(1次给与量为200mg以下)的情况相对，通过将天冬氨酸每日的给与量规定为大量(1次给与量为2g以上)，从而快速地改善了肝脏的能量代谢，获得疲劳恢复效果。
进而，上述的专利文献3所记载的发明具有的效果是，特异性地有利于计算机作业等导致的中枢神经系统疲劳(脑疲劳)的恢复和预防。
但是，对于专利文献1～3等记载的组合物以外的氨基酸组合物，也留有确认具有提高运动功能等效果的可能性。
特别是在自行车赛、赛艇、马拉松、铁人三项等需要耐力的比赛和长时间的体力劳动等中，如果能够发现可促进脂肪燃烧、提高耐力且减轻疲劳的组合物(特别是能经口摄取的液态组合物)，则作为比赛前或比赛中等摄取用的饮料等的有用性高，认为可在比赛后半程的冲刺阶段等发挥效果。
并且，对于具有易肥胖的体质的人来说，如果存在具有脂肪粒难以在细胞内蓄积的效果的氨基酸组合物，则通过摄取该氨基酸组合物，可以期待抗肥胖(减轻、抑制或防止肥胖)。
在这一点上，现有的氨基酸组合物大多如专利文献1～3所记载的那样，主要目的与其说是提高耐力等，还不如说是恢复疲劳。
因此，本发明的目的是提供一种氨基酸组合物，通过该组合物，可以谋求在自行车赛等需要耐力的比赛、长时间的体力劳动等中促进脂肪燃烧、提高耐力并预防、减轻、恢复疲劳等，并且对于易肥胖的人等，可以谋求减轻、抑制或防止肥胖，进而可以增强企业员工等的抗压能力。
为了解决上述课题，本发明人进行了深入研究，结果发现，利用组成与构成酪蛋白(酪蛋白是包含在牛奶等中的蛋白质)的氨基酸单元的组成相似的氨基酸组合物，可以获得在需要耐力的比赛、长时间体力劳动等中促进脂肪燃烧、提高耐力、以及预防、减轻、恢复疲劳等效果；以及对于易长胖的人等可以谋求减轻肥胖等效果；等等，从而完成了本发明。
即，本发明提供以下的[1]～[3]的技术方案。
一种氨基酸组合物，其特征在于，该组合物以下述的配合量(其中，下述18种氨基酸的总量为100质量份)含有下述氨基酸。
天冬氨酸   3.0～10.0质量份
苏氨酸     2.5～9.0质量份
丝氨酸     2.0～9.5质量份
谷氨酸     12.0～40.0质量份
脯氨酸     7.0～20.0质量份
甘氨酸     0.5～4.5质量份
丙氨酸     1.0～4.5质量份
缬氨酸     3.0～12.0质量份
胱氨酸     0.1～0.8质量份
甲硫氨酸   1.5～5.0质量份
异亮氨酸   2.0～8.0质量份
亮氨酸     5.0～15.0质量份
酪氨酸     3.0～10.0质量份
苯丙氨酸   3.0～10.0质量份
赖氨酸     4.0～15.0质量份
色氨酸     0.8～4.0质量份
组氨酸     1.5～5.0质量份
精氨酸     2.0～6.0质量份
如上述[1]所述的氨基酸组合物，其中，上述氨基酸组合物是口服用组合物。
如上述[1]或[2]所述的氨基酸组合物，其中，上述氨基酸组合物用于获得从下述效果中选择的一种以上效果：运动时促进脂肪燃烧；提高耐力；预防、减轻或恢复运动所致的疲劳；抗肥胖；以及抗压力。
利用本发明的氨基酸组合物，在自行车赛、赛艇、马拉松、铁人三项等需要耐力的比赛和工厂内长时间的体力劳动等中，即使在从通常负荷的运动切换到更高负荷的运动等时，与不摄取本发明的氨基酸组合物的情况相比也能够增加作业量。因此，在例如比赛后半程的冲刺阶段等能够期待明显的效果。
并且，利用本发明的氨基酸组合物，可以谋求对运动所致的疲劳的预防、减轻、恢复。
并且，利用本发明的氨基酸组合物，能够获得促进摄取者的脂肪燃烧的效果。
并且，利用本发明的氨基酸组合物，对易长胖的人等来说能够谋求减轻、抑制或防止肥胖。
进而，利用本发明的氨基酸组合物，能够谋求增强对压力的抵抗力。
这样，利用本发明的氨基酸组合物，可以获得从下述效果中选出的一种以上的效果：运动时促进脂肪燃烧；提高耐力；预防、减轻或者恢复运动所致的疲劳；抗肥胖以及抗压力。特别是在需要耐力的比赛、长时间的体力劳动等中，可以同时获得促进脂肪燃烧；提高耐力；以及预防、减轻、恢复疲劳的效果。并且，对于以抗肥胖为目的的人来说，可以同时获得预防、减轻、恢复减肥运动中的疲劳；以及减轻、抑制或防止肥胖的效果。进而，对于从事压力大的工作等的人来说，能够获得抗压力的效果。
因此，本发明的氨基酸组合物对谋求提高比赛成绩的运动员、进行长时间的体力劳动的人、期待抗肥胖效果的人、从事压力大的工作的人等是有用的。
附图说明
图1是表示提高耐力等的试验(实施例1、比较例1～2)的时间表的图表。
图2是表示小鼠纤维芽细胞中脂肪酸游离活性的程度的图表。
图3是表示第1次的游泳时间的结果的图表。
图4是表示3周内游泳时间随时间的变化的曲线图。
图5是表示血中3-羟基丁酸的浓度随时间的变化的图表。
图6是表示小鼠抗疲劳评价试验的结果的图表。
具体实施方式
本发明的氨基酸组合物以下述的配合量(其中，下述18种氨基酸的总量为100质量份)含有下述氨基酸。
天冬氨酸(Asp)的质量比例为3.0～10.0质量份、优选为4.0～9.0质量份、更优选为5.0～8.0质量份、特别优选为6.0～7.0质量份。
苏氨酸(Thr)的质量比例为2.5～9.0质量份、优选为3.0～7.5质量份、更优选为3.5～5.5质量份、特别优选为3.8～4.8质量份。
丝氨酸(Ser)的质量比例为2.0～9.5质量份、优选为3.0～8.0质量份、更优选为4.5～6.5质量份、特别优选为5.0～6.0质量份。
谷氨酸(Glu)的质量比例为12.0～40.0质量份、优选为14.0～32.0质量份、更优选为16.0～25.0质量份、特别优选为18.0～23.0质量份。
脯氨酸(Pro)的质量比例为7.0～20.0质量份、优选为8.0～17.0质量份、更优选为9.0～13.0质量份、特别优选为9.5～11.5质量份。
甘氨酸(Gly)的质量比例为0.5～4.5质量份、优选为0.8～3.5质量份、更优选为1.2～2.5质量份、特别优选为1.4～2.2质量份。
丙氨酸(Ala)的质量比例为1.0～4.5质量份、优选为1.5～4.0质量份、更优选为2.0～3.5质量份、特别优选为2.3～3.3质量份。
缬氨酸(Val)的质量比例为3.0～12.0质量份、优选为4.0～10.0质量份、更优选为5.0～8.0质量份、特别优选为5.5～7.0质量份。
胱氨酸(Cys)的质量比例为0.1～0.8质量份、优选为0.1～0.6质量份、更优选为0.2～0.5质量份、特别优选为0.2～0.4质量份。
甲硫氨酸(Met)的质量比例为1.5～5.0质量份、优选为1.8～4.0质量份、更优选为2.1～3.0质量份、特别优选为2.3～2.9质量份。
异亮氨酸(Ile)的质量比例为2.0～8.0质量份、优选为3.0～7.0质量份、更优选为4.0～6.0质量份、特别优选为4.5～5.4质量份。
亮氨酸(Leu)的质量比例为5.0～15.0质量份、优选为6.0～12.0质量份、更优选为7.5～10.0质量份、特别优选为8.0～9.5质量份。
酪氨酸(Tyr)的质量比例为3.0～10.0质量份、优选为4.0～8.0质量份、更优选为4.5～6.5质量份、特别优选为4.8～5.8质量份。
苯丙氨酸(Phe)的质量比例为3.0～10.0质量份、优选为3.5～8.0质量份、更优选为4.0～6.0质量份、特别优选为4.2～5.5质量份。
赖氨酸(Lys)的质量比例为4.0～15.0质量份、优选为5.0～11.0质量份、更优选为6.0～9.0质量份、特别优选为7.0～8.0质量份。
色氨酸(Trp)的质量比例为0.8～4.0质量份、优选为1.0～3.0质量份、更优选为1.1～2.0质量份、特别优选为1.2～1.8质量份。
组氨酸(His)的质量比例为1.5～5.0质量份、优选为1.8～4.0质量份、更优选为2.1～3.2质量份、特别优选为2.3～3.0质量份。
精氨酸(Arg)的质量比例为2.0～6.0质量份、优选为2.5～5.0质量份、更优选为3.0～4.0质量份、特别优选为3.1～3.8质量份。
另外，赖氨酸、组氨酸、精氨酸的各配合量是对具有正电荷的状态的氨基酸而言(例如，赖氨酸的情况下，是指侧链的末端为-NH3 +的赖氨酸)。并且，天冬氨酸、谷氨酸的各配合量是对具有负电荷的状态的氨基酸而言(换言之，是指不含有钠等阳离子的各氨基酸)。
并且，本发明中使用的胱氨酸也可以部分或全部被还原，以半胱氨酸的形式存在。这种情况下，半胱氨酸的配合量换算成胱氨酸的质量，构成本发明规定的“胱氨酸的配合量”的一部分或全部。
本发明中使用的氨基酸也可以以钠盐、盐酸盐等盐类或衍生物的形式存在。但是，如上所述，本发明规定的“氨基酸的配合量”不包括钠等阳离子、氯化物离子等阴离子的质量。
本发明中使用的氨基酸优选为构成蛋白质的形态(L形；天然型)。
本发明中使用的氨基酸也可以包含2～5个氨基酸键合成肽的形态的氨基酸。这种情况下，上述的各氨基酸的配合量包含肽的质量。但是，本发明的氨基酸组合物优选不含有肽。
本发明的氨基酸组合物可以根据需要含有维生素C、维生素B1、维生素B2、维生素B6、砂糖、果糖、蔗糖、海藻糖、柠檬酸、三氯蔗糖、果胶、小苏打(碳酸氢钠)、甜菊、香料、其他的氨基酸(例如，谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn))等。
作为制备本发明的氨基酸组合物的方法的一例，可举出将市售的各种氨基酸以上述配合量混合的方法。
本发明的氨基酸组合物可以以液态物(例如水溶液)、固体物质(粉状物、颗粒物、片剂(药片)、胶囊剂等)、半固体物质(胶状物等)的任一形态使用，但从摄取的容易性等的方面出发，优选为液态物或半固体物质。液态物的情况下，可以通过口服给与、注射、直肠内给与等方式摄取。在固体物质和半固体物质的情况下，可以通过口服给与来摄取。
本发明中特别优选的使用形态为液态物和半固体物质。这种情况下，具有容易摄取并且容易将每日摄取量调整在优选的数值范围内的优点。
以本发明中规定的18种氨基酸的合计质量计，本发明的氨基酸组合物的摄取量优选为每日0.5～20g、更优选为每日1～15g、特别优选为每日3～10g。该量小于0.5g时，不能充分获得本发明的效果。该量超过20g时，在以液态物的形态摄取的情况下充分溶解氨基酸所需的水分的量过大，液态物整体的体积增大，所以有时会产生难以摄取等的问题。
对本发明氨基酸组合物的每日的摄取次数没有特别限定，通常为1～5次。
本发明的氨基酸组合物可以以药品、类似药品(医药部外品)、清凉饮料、碳酸饮料、食品(固态、半固态)等形式摄取。
实施例
[对运动员进行的in vivo(体内)实验(实施例1、比较例1～2)]
以要求耐力的比赛(自行车赛、赛艇或铁人三项)的12名运动员(男性6名、女性6名)为对象，针对含有发明的氨基酸组合物、水和香料的饮料(实施例1)、含有葡萄糖、水和香料的饮料(比较例1)、含有水和香料的饮料(比较例2)的各种情况，评价了(a)全力运动时的运动量、(b)稳定运动时的脂肪的总氧化量、(c)血浆中的胰高血糖素浓度和游离脂肪酸浓度的变化、(d)血中的乳酸浓度的变化。
[A.饮料的制备]
(a)本发明的饮料(实施例1)的制备
将6g下述的配合量的氨基酸组合物(其中，下述18种氨基酸的总量为100质量份)、1.7g香料以及水混合，制成380g饮料。
(氨基酸的种类)  (配合量)    (换算成摩尔％)
天冬氨酸          6.6质量份    6.5摩尔％
苏氨酸            4.3质量份    4.8摩尔％
丝氨酸            5.5质量份    7.0摩尔％
谷氨酸            20.3质量份   18.3摩尔％
脯氨酸            10.6质量份   12.3摩尔％
甘氨酸            1.8质量份    3.2摩尔％
丙氨酸            2.8质量份    4.2摩尔％
缬氨酸            6.2质量份    7.0摩尔％
胱氨酸            0.3质量份    0.2摩尔％
甲硫氨酸          2.6质量份    2.3摩尔％
异亮氨酸          5.0质量份    5.0摩尔％
亮氨酸            8.8质量份    8.9摩尔％
酪氨酸            5.4质量份    3.9摩尔％
苯丙氨酸          4.8质量份    3.9摩尔％
赖氨酸            7.5质量份    6.8摩尔％
色氨酸            1.5质量份    1.0摩尔％
组氨酸            2.7质量份    2.3摩尔％
精氨酸            3.4质量份    2.6摩尔％
(b)比较用饮料(比较例1)的制备
将6g葡萄糖、1.7g香料以及水混合，制成380g饮料。
(c)比较用饮料(比较例2)的制备
将1.7g香料以及水混合，制成380g饮料。
[B.试验方法]
使用三重双盲交叉(3-way double-blind crossover)法进行试验。即，12名运动员每个人使用上述3种饮料(实施例1、比较例1～2)的实验顺序为(1)实施例1、比较例1、比较例2的顺序；(2)实施例1、比较例2、比较例1的顺序；(3)比较例1、实施例1、比较例2的顺序；(4)比较例1、比较例2、实施例1的顺序；(5)比较例2、实施例1、比较例1的顺序；(6)比较例2、比较例1、实施例1的顺序；共6种方式，分成每2人一种方式，进行试验。
试验的时间表如图1所示。图1中，将绝食终止时刻作为基准时间(0小时)，在绝食终止前24小时至绝食终止前12小时之间进行规定进食和运动限制，在绝食终止前12小时至0小时之间绝食，从绝食终止时刻起经过30分钟后经口摄取饮料(实施例1、比较例1、比较例2的任意的饮料)。摄取饮料(图1中的“样品”)后，经过30分钟后，在最大氧摄取量的65％的运动负荷(使用固定式的训练用单车)下运动85分钟(以下称为稳定运动)，在终止稳定运动的同时进行5分钟全力运动(使用固定式的训练用单车)。
[C.饮料效果的评价]
(a)全力运动时的作业量
5分钟全力运动的作业量(12名的平均值)在实施例1的情况下为86.1kJ、比较例1的情况下为83.3kJ、比较例2的情况下为83.6kJ。
作业量的数值越大，表示耐力越优异。
相对于比较例1(83.3kJ)、比较例2(83.6kJ)的各数值，实施例1显示出明显(p＜0.05)高的值86.1kJ。
作业量(耐力)的检测法通过配对t检验(paired-t)来进行。
(b)稳定运动时脂肪的总氧化量(体脂肪的燃烧量)
85分钟的稳定运动中脂肪的总氧化量在实施例1的情况下为56.7g、比较例1的情况下为49.3g、比较例2的情况下为45.9g。
脂肪的总氧化量的数值越大，表示越能抑制糖酵解，结果可以节省糖原。一般来说，通过节省糖原，有效地燃烧体脂肪，可以持续长时间的运动而不会感到疲劳。
相对于比较例1(49.3g)、比较例2(45.9g)的各数值，实施例1显示出明显(p＜0.01)高的值56.7g。
脂肪的总氧化量的检测法通过配对t检验(Paired-t)来进行。
(c)血浆中的胰高血糖素浓度和游离脂肪酸浓度的测定
对血浆中的胰高血糖素浓度以及血浆中的游离脂肪酸浓度进行了测定，结果为，在从摄取饮料时起至全力运动后的实验期间，与脂肪的总氧化量同样地确认到从浓度高的开始依次为实施例1、比较例1、比较例2的顺序(特别是稳定运动中)。另外，胰高血糖素是具有使激素感受性脂肪酶活化并促进脂肪分解，从而使游离脂肪酸的释放量增大的作用的物质。这些胰高血糖素浓度和游离脂肪酸浓度的测定结果与稳定运动时的脂肪的总氧化量的测定结果匹配。
血浆中的胰高血糖素浓度和游离脂肪酸浓度的测定通过方差反复测量分析(repeated-ANOVA)来进行。
(d)全力运动时血中的乳酸浓度的变化
全力运动5分钟后的乳酸值在实施例1的情况下为9.8mmol/升、比较例1的情况下为8.8mmol/升、比较例2的情况下为8.0mmol/升。
另外，即将进行全力运动前(换言之，稳定运动后)的乳酸值在实施例1的情况下为1.4mmol/升、比较例1的情况下为1.5mmol/升、比较例2的情况下为1.6mmol/升。
全力运动后的乳酸值的数值越大，表示稳定运动中蓄积的糖质在全力运动时消耗掉而转变为乳酸的量越大。即，全力运动后的乳酸值的数值越大，表示最后冲刺的全力运动时的运动量越大，由此表示耐力得到了提高。
乳酸值的测定通过方差反复测量分析(repeated-ANOVA)来进行。
由以上的(a)全力运动时的运动量、(b)稳定运动时脂肪的总氧化量、(c)血浆中的胰高血糖素浓度和游离脂肪酸浓度的变化、(d)全力运动时血中的乳酸浓度的变化的评价结果可知，与摄取非本发明的饮料(比较例1～2)时相比，摄取了含有本发明的氨基酸组合物的饮料(实施例1)时可以显著地获得促进脂肪燃烧；提高耐力；预防、减轻、恢复疲劳；抗肥胖等效果。并且，可预测也具有抗压力的效果。
[in vitro(试管内)的实验(实施例2、比较例3～5)]
对本发明的氨基酸组合物是否具有阻断脂肪粒在细胞内的蓄积的活性(具体地说是阻断前体脂肪细胞的分化诱导的效果)进行实验。
该活性大表示脂肪粒难以在细胞内蓄积，具有抗肥胖效果。并且，也有可能表现出利用运动时的能量源糖质和脂质来提高运动的耐力，且减轻疲劳的效果。
[实验的原理]
实验的原理如下。
小鼠纤维芽细胞(3T3-L1细胞)在地塞米松(dexamethasone；DEX)、异丁基甲基黄嘌呤(isobutyl-methylxanthine；IBMX)和胰岛素(insulin)的存在下有效地分化成脂肪细胞。已知，此时若添加对脂肪细胞分化诱导具有阻断活性的物质“渥曼青霉素(Wortmannin)”，则向脂肪细胞的分化会受到抑制。该抑制效果可以通过测定GPDH活性来评价。
对于GPDH活性，将用于使小鼠纤维芽细胞(3T3-L1细胞)分化为脂肪细胞的1毫升培养液中所含的NADH在1分钟被氧化的量1nmol作为1单元(unit)来对GPDH活性进行定量。单元数越小，表示抑制分化的效果越大，脂肪粒在细胞内越难蓄积。
[实施例2]
(a)培养液的制备
将与实施例1相同的本发明氨基酸组合物以1质量％的浓度溶解在D-MEM培养基(含血清的液态培养基)中，得到培养液。此时，通过超声波处理来提高溶解性，使氨基酸组合物大致全部溶解。
接下来，使用1N的氢氧化钠水溶液将所得到的培养液的pH调整为8.2。对该调整完pH的培养液进行过滤灭菌，作为评价用培养液。
(b)使小鼠纤维芽细胞(3T3-L1细胞)向脂肪细胞分化诱导的方法
对含有小鼠纤维芽细胞(3T3-L1细胞)的培养液进行胰蛋白酶处理后，在4℃、1000rpm的条件下离心分离3分钟。将离心分离得到的固体物质(含有培养细胞)分注在微孔板(孔数：24)中，并使每1个孔的细胞数为4.2×104个，制成检测用微板。将该检测用微板在37℃、二氧化碳浓度5％的气氛下培养72小时后，在各孔内供给上述(a)中得到的评价用培养液，在37℃、二氧化碳浓度5％的气氛下静置30分钟。接下来，将地塞米松、异丁基甲基黄嘌呤和胰岛素添加在检测用微板的各孔内以使各自的最终浓度为20μM、10μM、1.7μM。添加48小时后，除去各孔内的液体成分(评价用培养液)，在各孔内供给新的评价用培养液以及最终浓度为1.7μM的量的胰岛素。其后，培养12天。以上的过程(各孔内的评价用培养液的交换以及胰岛素的供给)每隔3天重复进行一次，共培养12天。
(c)GPDH活性的测定方法
通过离心分离从上述的(b)中得到的培养液中除去液体成分，得到固体物质。将该固体物质用2毫升经冰冷却的PBS(Phosphate BufferedSaline；磷酸缓冲液)清洗2次。在清洗后的固体物质(细胞)中加入600微升Tris缓冲液(50mM的Tris-HCl(pH7.5)、1mM的EDTA和1mM的β-巯基乙醇的混合液)后，使用细胞刮剥离固体物质(细胞)，制成细胞悬液，接下来，将该细胞悬液收集在1.5毫升塑料管内。
对该细胞悬液进行超声波处理，将细胞膜破坏后，以15000rpm离心分离15分钟，将所得到的液体成分(液温：4℃)作为细胞提取液。
利用Bradford色素结合法，对细胞提取液所含的蛋白质进行定量后，使用与上述相同的Tris缓冲液，使液体中的蛋白质的浓度恒定(21μg/assay)。
对如此使蛋白质浓度恒定的细胞提取液进行GPDH活性测定。GPDH活性测定的方法中，首先在细胞提取液中加入经冰冷的反应液(100mM的三乙醇胺-盐酸(pH7.5)、0.12mM的NADH和0.1mM的β-巯基乙醇的混合液)，使总量为950微升。将该液体在25℃静置5分钟后，添加50微升反应引发液(4mM的二羟基丙酮磷酸酯)，使总量为1毫升。针对所得到的液体，在25℃的温度下测定对波长340nm的光在1分钟的吸光度的变化量。
另外，GPDH活性以在1分钟的时间将1nmol NADH氧化的酶量作为1单元来表示。
测定结果为3单元。
[比较例3]
使用缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸各支链氨基酸以质量比1∶2∶1混合而成的氨基酸组合物代替实施例2的氨基酸组合物，除此以外与实施例2同样地操作，得到评价用培养液。使用该评价用培养液与实施例2同样地操作，测定GPDH活性。
测定结果为168单元。
[比较例4]
将脂肪细胞分化诱导阻断物质“渥曼青霉素”溶解在D-MEM培养基中，使渥曼青霉素的浓度达到10μM，得到培养液，除此以外与实施例2同样地操作，得到评价用培养液。使用该评价用培养液与实施例2同样地操作，测定GPDH活性。
测定结果为47单元。
[比较例5]
在D-MEM培养基中不添加其他物质，除此以外与实施例2同样地操作，得到评价用培养液。使用该评价用培养液，与实施例2同样地操作，测定GPDH活性。
测定结果为370单元。
将实施例2(本发明的氨基酸组合物)和比较例3(非本发明的氨基酸组合物)进行比较可知，用量虽然相同(D-MEM培养基中浓度为1质量％)，但作为抑制向脂肪细胞分化的效果的指标的GPDH活性的值在实施例2中为3单元，效果优异，而比较例3中为168单元，效果差，两者在效果方面存在较大的差异。另外，如上所述，不添加氨基酸组合物的比较例5中GPDH活性的值为370单元。
并且，将实施例2(本发明的氨基酸组合物)和比较例4(渥曼青霉素)进行比较可知，与已知具有抑制向脂肪细胞分化的效果的“渥曼青霉素”(47单元)相比，本发明的氨基酸组合物(3单元)抑制向脂肪细胞分化的效果更大。
[小鼠纤维芽细胞中脂肪酸游离活性的评价实验(实施例3～5、比较例6～10)]
在12孔微孔板中，根据以往的报道进行小鼠纤维芽细胞(3T3-L1细胞)向脂肪细胞的分化诱导。进行脂肪细胞的分化诱导处理约2周后，在显微镜下确认各孔中分化诱导活性没有较大差异。
[实施例3]
除去培养液后，在各孔中添加各500微升(μL)以0.2质量％的含量含有本发明的氨基酸组合物(与实施例1相同的组合物；本说明书中也称为“本氨基酸组合物”)的磷酸缓冲液(PBS溶液)。4小时后，回收5μL PBS溶液，转移到96孔微孔板中。在96孔微孔板上，使用用于游离脂肪酸测定的NEFA C-test Wako，测定游离脂肪酸的量。
测定游离脂肪酸的量的原理如下。酰基CoA合成酶(ACS)作用于游离脂肪酸时，生成酰基CoA。在通过生成的酰基CoA与酰基CoA氧化酶(ACOD)的反应生成的过氧化氢的作用下，发生3-甲基-N-乙基-N-(β-羟基乙基)-苯胺(MEHA)与4-氨基安替比林的氧化缩合，生成蓝紫色色素。测定该蓝紫色色素的吸光度，就可以获知游离脂肪酸的量的大小。游离脂肪酸的量大，表示脂肪的分解程度大，脂肪难以在小鼠体内蓄积。
进行3次与上述同样的实验，计算出其平均值和标准偏差。
吸光度的平均值为0.083、标准偏差为0.044。
需要说明的是，吸光度为0.086时相当于油酸为0.25mEq/升。
[实施例4]
将氨基酸组合物的浓度设定为0.04质量％，除此以外与实施例3同样地进行实验。
实施例4中吸光度的平均值为0.046、标准偏差为0.037。
[实施例5]
将氨基酸组合物的浓度设定为0.008质量％，除此以外与实施例3同样地进行实验。
实施例5中吸光度的平均值为0.049、标准偏差为0.025。
[比较例6]
不使用本发明的氨基酸组合物，而使用将缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸各支链氨基酸以质量比1∶2∶1的比例混合而成的氨基酸组合物(本说明书中也称为“BCAA”)，除此以外与实施例3同样地进行实验。
吸光度的平均值为0.082、标准偏差为0.003。
[比较例7]
将氨基酸组合物的浓度设定为0.04质量％，除此以外与比较例6同样地进行实验。
比较例7中吸光度的平均值为0.048、标准偏差为0.022。
[比较例8]
将氨基酸组合物的浓度设定为0.008质量％，除此以外与比较例6同样地进行实验。
比较例8中吸光度的平均值为0.038、标准偏差为0.013。
[比较例9]
不使用含有本发明的氨基酸组合物的PBS溶液，而使用含有1μM的dl-异丙基肾上腺素(isoproterenol)的PBS溶液，除此以外与实施例3同样地进行实验。其中，dl-异丙基肾上腺素是已知显示脂肪酸游离活性的已知的化合物。
吸光度的平均值为0.041、标准偏差为0.004。
[比较例10]
作为对照实验，不使用含有本发明的氨基酸组合物的PBS溶液，而使用PBS溶液，除此以外与实施例3同样地进行实验。
吸光度的平均值为0.024、标准偏差为0.022。
以上的结果(平均值、标准偏差)见图2。
由图2可知，本发明的氨基酸组合物以0.2质量％和0.04质量％的浓度含在PBS溶液中的情况下(实施例3、4)，显示出与BCAA相同程度的脂肪酸游离活性。并且可知，本发明的氨基酸组合物以0.008质量％的浓度含在PBS溶液中的情况下(实施例5)，显示出比相同浓度的BCAA更高的脂肪酸游离活性。
[持续给与氨基酸组合物对小鼠游泳时间的影响的评价实验(实施例6、比较例11～12)]
将30只4周龄的ddY雄性小鼠驯化1周后，调查各小鼠的游泳时间(从游泳开始时起到能游泳的极限时的长度)，每10只一组，分成3组，各组间游泳时间的平均值为同等程度。
[实施例6]
上述分组1周后，对小鼠口服给与含有与实施例1相同的氨基酸组合物的生理盐水(saline)，其中小鼠每1kg体重的氨基酸组合物的给与量为500mg，给与1天后，测定小鼠的游泳时间(第1次)。小鼠的游泳时间是在小鼠尾巴上安上体重的5质量％的重物的情况下从游泳开始时起到能游泳的极限时(溺水时)的时间。
其结果，游泳时间(10只的平均值；以下相同)为19.1分钟，标准误差为0.85分钟。
其后，连续6周每日1次口服给与与上述同量的氨基酸组合物，同时在上述的第1次游泳的1周后、2周后、3周后的各时刻进行与上述第1次游泳同样的游泳，测定游泳时间。另外，在测定游泳时间的那天，在游泳开始30分钟前进行氨基酸组合物的口服给与。并且，实验期间允许自由摄取通常的固体食物。
其结果，1周后的游泳时间为22.3分钟、标准误差为2.50分钟；2周后的游泳时间为26.7分钟、标准误差为3.41分钟；3周后的游泳时间为26.1分钟、标准误差为2.77分钟。
进而，6周后，口服给与氨基酸组合物30分钟后在小鼠尾巴上安上体重的4.5质量％的重物，使其游泳15分钟。此时，测定即将口服给与时、即将游泳时(口服给与30分钟后)、刚结束游泳时的各时刻的血中3-羟基丁酸的量。血中3-羟基丁酸的量大，表示脂肪分解量大，脂肪难以在小鼠中蓄积。
其结果，血中3-羟基丁酸的量在即将口服给与时为31.2μmol/升(标准误差：1.61μmol/升)、即将游泳时为33.2μmol/升(标准误差：0.98μmol/升)、刚结束游泳时为37.5μmol/升(标准误差：1.83μmol/升)。
[比较例11]
不使用实施例6中使用的氨基酸组合物，而使用将缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸以质量比1∶2∶1的比例混合而成的氨基酸组合物(BCAA)，除此以外与实施例6同样地进行实验。
其结果，在第1次游泳中游泳时间为16.0分钟(标准误差：1.03分钟)，1周后游泳时间为16.0分钟(标准误差：2.15分钟)，2周后游泳时间为18.3分钟(标准误差：2.65分钟)，3周后游泳时间为19.6分钟(标准误差：2.74分钟)。
另外，血中3-羟基丁酸的量在即将口服给与时为33.3μmol/升(标准误差：2.49μmol/升)，即将游泳时为33.7μmol/升(标准误差：1.84μmol/升)，刚结束游泳时为37.6μmol/升(标准误差：1.66μmol/升)。
[比较例12]
除了不使用实施例6中使用的氨基酸组合物以外，与实施例6同样地进行实验。
其结果，在第1次游泳中游泳时间为15.4分钟(标准误差：1.31分钟)，1周后游泳时间为13.1分钟(标准误差：1.62分钟)，2周后游泳时间为15.1分钟(标准误差：1.54分钟)，3周后游泳时间为15.5分钟(标准误差：1.24分钟)。
另外，血中3-羟基丁酸的量在即将口服给与时为27.9μmol/升(标准误差：1.25μmol/升)，即将游泳时为26.9μmol/升(标准误差：1.79μmol/升)，刚结束游泳时为31.9μmol/升(标准误差：1.53μmol/升)。
以上的结果之中，第1次游泳时间的结果(平均值、标准误差)见图3。由图3可知，使用本发明的氨基酸组合物(实施例6)的情况下，游泳时间比使用BCAA的情况(比较例11)和对照组(control)的情况(比较例12)要长。
将3周内游泳时间(平均值、标准误差)随时间的变化示于图4。由图4可知，与使用BCAA的情况(比较例11)和对照组(control)的情况(比较例12)相比，使用本发明的氨基酸组合物(实施例6)的情况下在各时刻的游泳时间都长。
将血中3-羟基丁酸的浓度(平均值、标准误差)随时间的变化示于图5。由图5可知，使用本发明的氨基酸组合物的情况下(实施例6)，在各时刻血中3-羟基丁酸的浓度都大于对照组(control)的情况(比较例12)，且血中3-羟基丁酸的浓度与使用BCAA的情况(比较例11)大致相同。
另外，实验期间，在上述的实施例和比较例中使用的小鼠组中没有发现显著的体重差。
[小鼠抗疲劳评价试验；实施例7、比较例13]
[实施例7]
对小鼠口服给与含有与实施例1相同的氨基酸组合物的生理盐水，其中小鼠每1kg体重的氨基酸组合物的给与量为500mg，使小鼠强制步行3小时后，在暗室内静置15分钟。其后，进行与第1次同量的氨基酸组合物的口服给与(第2次)，自动统计90分钟内每15分钟的自发运动量，评价抗疲劳效果。
其中，自发运动量的统计具体是使用室町机械社制造的“SuperMex”(产品名)来进行的。
另一方面，对除了不强制步行3小时以外与上述同样地进行了实验的例子(无步行时)也评价了抗疲劳效果。
其中，被强制步行的小鼠的数量为20只，无步行的小鼠的数量为18只。
其结果，被强制步行的小鼠的自发运动量的统计数以平均值计为149(标准误差：33.4)。无步行的小鼠的自发运动量的统计数以平均值计为182(标准误差：42.8)。
无步行时的统计数(182)与强制步行时的统计数(149)的差为33。
[比较例13]
作为对照例(control)，除了不使用氨基酸组合物以外，与实施例7同样地进行实验。
其中，被强制步行的小鼠的数量为20只，无步行的小鼠的数量为28只。
其结果，被强制步行的小鼠的自发运动量的统计数以平均值计为74(标准误差：13.9)。无步行的小鼠的自发运动量的统计数以平均值计为241(标准误差：25.9)。
无步行时的统计数(241)与强制步行时的统计数(74)的差为167。
以上结果见图6。图6中，无步行时表示为“no run”，进行强制步行时表示为“run”。由图6可知，使用生理盐水的情况下(比较例13)，确认到强制步行时比无步行时的自发运动量的降低幅度大，因强制步行在小鼠身上蓄积的疲劳较多，而与此相对，使用本发明的氨基酸组合物的情况下(实施例7)，强制步行时比无步行时的自发运动量的降低幅度小，因强制步行在小鼠身上蓄积的疲劳较少。

Claims (2)

1.氨基酸组合物在提高人体耐力方面的用途，该组合物以下述的配合量含有下述氨基酸且施用于人体，其中下述18种氨基酸的总量为100质量份，
Figure FDA0000068086200000011
2.如权利要求1所述的用途，其中，所述氨基酸组合物是口服用组合物。
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