CN101625341B - 药品、保健食品和食品中pde5型抑制剂的高效液相色谱-串联质谱联用检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种药品、保健食品和食品中PDE₅型抑制剂的高效液相色谱-串联质谱联用检测方法，以乙腈为提取剂、50％乙腈为稀释剂、甲酸-乙酸铵溶液-甲醇-乙腈体系为流动相，在流速为0.2～0.4ml/min、柱温20～50℃条件下经液相色谱柱分离后，采用电喷雾(ESI)离子源离子化，正离子模式全扫描一、二级质谱，根据二级质谱定性判别样品是否添加PDE₅型抑制剂。本方法的样品前处理简单，准确度高、专属性好、检测灵敏度高、分析周期短，一次实验就能完成十一种PDE₅型抑制剂的定性分析，适合PDE₅型抑制剂的微量分析，也可作为监督检验的确证和仲裁方法。

Description

药品、保健食品和食品中PDE5型抑制剂的高效液相色谱-串联质谱联用检测方法

技术领域

本发明涉及一种高效液相色谱-串联质谱联用检测方法，尤其涉及药品、保健食品和食品中PDE₅型抑制剂的高效液相色谱-串联质谱联用检测方法的新技术。

背景技术

补肾壮阳类中成药、保健食品和食品中非法添加化学成分的行为日益猖獗，且针对标准的高科技造假行为越来越多，严重威胁人民群众的身体健康。此类违法活动尤以在补肾壮阳功效的中成药、保健食品和食品中非法添加PDE₅型抑制剂(磷酸二酯酶5型抑制剂，phosphodiesterase type-5 inhibitor)最为典型活跃。PDE₅型抑制剂是目前治疗男性性功能勃起障碍最有效的化学药品，美国食品药品管理局(FDA)先后批准了西地那非、伐地那非和他达拉非三种PDE5型抑制剂(详见表2)。查阅大量文献证实，壮阳类化学成分的非法添加主要以PDE₅型抑制剂为主。PDE₅型抑制剂属于处方药，临床应用时有严格的适应症、禁忌症和一定的副作用，患者在不知情的情况下摄入容易引起严重的药物不良反应，甚至导致死亡。近年来，还发现了添加大量上述三种PDE₅型抑制剂的未知衍生物，这些化学成分与母体有着共同的核心结构(详见表2)，但均未经严格的安全性实验评价其药效与毒副作用，存在着严重隐患。

中药、保健食品和食品化学成分复杂多样，各成分之间干扰严重，加上生产工艺的影响，使得添加化学成分的检测方法要求更具专属性。当前用于检测中成药中PDE₅型抑制剂的方法主要有理化反应、薄层层析(TLC)、近红外、高效液相色谱-紫外/二管阵列检测器(HPLC-UV/DAD)、高效液相色谱法-质谱(HPLC-MS)等方法。

理化反应具有操作简单、检测快速、检测试剂少且无毒、检测成本低、易于培训掌握的优势，非常适合基层打假快速筛查可疑样品。广东省药品检验所开发的那非类和拉非类两大理化快筛方法，可准确筛查前述十一种PDE₅型抑制剂，推广应用可望获得了良好的经济与社会效益。薄层层析因多用有机溶剂，且与理化反应相比优势较少，故较少使用。

近红外最大的优点在于无损、快速分析，通常检测一个样品，时间以秒计。但近红外检测需要专业人员预先建立模板，近红外仪也需要相应的检测平台。目前，近红外多作为药品检测车的车载技术，在打假一线现场使用。

HPLC-UV/DAD和HPLC-MS因为其出色的分离能力与高自动化水平，已成为确证中成药中PDE5型抑制剂的主流技术。相比较而言，HPLC-UV仅依据保留时间进行定性判别的模式，准确性不如HPLC-/DAD和HPLC-MS。

HPLC-DAD可以提供分析对象的三维光谱信息，通过与相应对照品的光谱图比较，用于掺假化学成分的确证，基本可以排除阳性干扰。但HPLC-DAD要求分析对象与干扰成分完全分离，这将致使分析时间延长；此外，HPLC-DAD不能分析没有紫外吸收的化学成分，这使DAD的使用受到一定的限制。

HPLC-MS在定性上拥有无与伦比的特异性，灵敏度远远超过其它分析方法。多数物质在合适的电离方式与条件下能电离，并依据分子键能大小断裂成，产生与结构对应高度专属的质谱图。尤其是二级或多级质谱，即使在色谱共洗脱的情况下仍能准确定性分析成分，这大拓展了色谱的应用范围。因此，质谱是复杂混合物的定性的确证与仲裁方法。

上述方法各具特色，依据检测目的各有其适用范围。其中，理化、TLC、近红外等方法检测原理基本都是针对化学成分分子结构中的某一特殊部位建立，定性准确性有限，存在少数的假阳性干扰，因此，这些方法适合作为某类成分的筛选方法，而不能作为确证方法使用。HPLC-UV/DAD或HPLC-MS结果准确，但检测所需的贵重仪器决定检测只能在实验室内实施。

如前述，可掺入PDE₅型抑制剂的新衍生物逐年增多，现有检测技术中，理化、近红外等方法已可成功覆盖上述十一种PDE₅型抑制剂，确证与仲裁方法的研究相对滞后，目前，尚没有保健食品和食品中非法添加PDE₅型抑制剂的检测标准；已有中成药中PDE₅型抑制剂的检测标准也仅限于有限的几个成分且存在扫描范围过宽、处理复杂、背景信号大等缺陷。标准现状极大制约了监管的有效实施，市场迫切需要能广泛覆盖PDE₅型抑制剂的确证和仲裁方法。

发明内容

本发明的目的是为克服现有液相色谱质谱联用技术检测中成药中PDE₅型抑制剂的缺陷，提供一种涵盖药品、保健食品和食品中那红地那非、红地那非、伐地那非、羟基豪莫西地那非、西地那非、豪莫西地那非、氨基他达拉非、他达拉非、硫代艾地那非、伪伐地那非和那莫西地那非等十一种PDE₅型抑制剂的液质联用-串联质谱(HPLC-MS/MS)确证与仲裁方法。

为实现上述目的，本发明的药品、保健食品和食品中十一种PDE₅型抑制剂的HPLC-MS/MS联用检测方法以乙腈为提取剂、50％乙腈为稀释剂、甲酸-乙酸铵溶液-甲醇-乙腈体系为流动相，在流速为0.2～0.4ml/min、柱温为20～50℃条件下经液相色谱柱分离后，采用电喷雾(ESI)离子源离子化，正离子模式全扫描一、二级质谱。

优选的，所述样品提取剂为乙腈，稀释剂为50％乙腈。

优选的，所述甲酸-乙酸铵-甲醇-乙腈体系中，甲酸和乙酸铵的混合溶液、甲醇、乙腈分别为三组流动相。

优选的，所述三组流动相的体积比为：甲酸和乙酸铵的混合溶液：30～75，甲醇：10～55，乙腈：5～20。

优选的，所述甲酸和乙酸铵的混合溶液中的甲酸的体积百分比浓度为0.1～0.2％。

优选的，所述甲酸和乙酸铵的混合溶液中的乙酸铵的摩尔浓度浓度为0.01～0.02mol/L。

优选的，所述流速为0.2～0.4ml/min。

优选的，所述柱温为20～50℃。

优选的，所述色谱柱以十八烷基键合硅胶作为填充剂。

优选的，所述质谱仪为串联四级杆质谱仪。

优选的，所述离子源为电喷雾离子源(ESI)。

优选的，所述的离子化模式为正离子模式。

优选的，扫描范围为50～550amz。

定性分析可根据样品与对照品二级质谱图的匹配性或样品与质谱图库中标准质谱图匹配性定性。

本发明的高效液相色谱-串联质谱联用检测方法还可以根据非法添加的PDE₅型抑制剂特征裂解片段对应的核心结构溯源检测目标物的衍生母体，以确证不明物。

与现有HPLC-MS技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明的HPLC-MS/MS方法极大扩展了HPLC-MS方法检测PDE5型抑制剂的适用范围，由以前单一药品分析领域扩大应用到药品、保健食品和食品等领域。

2、本发明的HPLC-MS/MS方法显著提高了检测效率，一次实验即可分析十一种PDE5型抑制剂，检测指标的设置更符合当今非法添加的客观形势。

3、本发明的HPLC-MS/MS方法具有超高的灵敏度，本方法十一种PDE5型抑制剂的检出限均不超过10ng，而PDE5型抑制剂的临床起效剂量那非类和拉非类分别为50～100mg、5～20mg，本方法足以保证日常监督检验的技术需求。

4、本发明的HPLC-MS/MS方法具有优异的定性能力，本发明中，十一种PDE5型抑制剂细微结构差异，产生的质谱特征片段(详见表3)已存在较大差异，可准确确证可疑目标成分。

5、本发明的HPLC-MS/MS方法，只需在仪器上完成标准质谱图库的构建，后续分析可不需对照品，只需检测样品，将检品测试结果与质谱图谱库比较即可确证样品中的目标添加物。

6、本发明的HPLC-MS/MS方法，总结十一种PDE5型抑制剂二级质谱图共同的特征裂解片段，发现其虽来源于不同分子，但均为这些分子中共有的“核心基团”。共同特征裂解片段与共有的“核心基团”的确立，有望为今后新的未知PDE5型抑制剂衍生物的母体溯源与结构确证提供理论参考。

7、本发明的HPLC-MS/MS方法适用于胶囊剂、片剂、丸剂、合剂等各种剂型的中成药、保健食品和食品中PDE5型抑制剂的确证与仲裁。市场收集194个各种补肾壮阳类样品，其中132个添加PDE5型抑制剂，涉及8种PDE5型抑制剂，大大提高检验效率，节约检验费用，符合日常监督检验的需要。

综上所述，本发明对补肾壮阳类中成药、保健食品和食品中的PDE₅型抑制剂进行定性准确，可作为监督检验结果的确证和仲裁方法，亦适用于药品、保健食品和食品中PDE₅型抑制剂的微量分析。预处理方法简单、准确度高、专属性好、分析周期短，可作为确证与仲裁方法。

附图说明

图1～11是十一种PDE₅型抑制剂的典型二级质谱图，分别是西地那非、豪莫西地那非、羟基豪莫西地那非、那莫西地那非、硫代艾地那非、红地那非、那红地那非、伐地那非、伪伐地那非、他达那非、氨基他达那非的二级质谱图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

实施例一：十一种PDE₅型抑制剂的HPLC-MS/MS检测方法

1.对照品溶液的制备取西地那非、他达拉非、伐地那非、红地那非、豪莫西地那非、羟基豪莫西地那非、那莫西地那非、氨基他达拉非、伪伐地那非、硫代艾地那非、那红地那非对照品约10mg，置50ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，用50％乙腈溶液稀释制成每1ml含5μg的溶液，即得。

2.供试品溶液的制备若供试品为固体制剂，精密称取一次服用量，研细后转移至50ml量瓶中，加乙腈约40ml，超声处理15分钟，冷至室温，用乙腈稀释至刻度，摇匀，滤过；若供试品为液体制剂，精密量取一次服用量，置50ml量瓶中，加乙腈约40ml，振摇3分钟，用乙腈稀释至刻度，摇匀，滤过。精密量取续滤液适量，用50％乙腈稀释至与对照品溶液浓度相当，摇匀，滤过，即得。

3.测定法分别精密量取供试品溶液及对照品溶液各10μl注入液质联用仪，以十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂；以甲酸-乙酸铵-甲醇-乙腈体系为流动相，其中，甲酸-乙酸铵溶液为流动相A，甲醇为流动相B，乙腈为流动相C，其中，流动相A中甲酸的体积百分比浓度为0.1％，乙酸铵的摩尔浓度为0.01mol/L，三组流动相的体积份数为：流动相A甲酸和乙酸铵的混合溶液：30～75，流动相B甲醇：10～55，流动相C乙腈：5～20。按表1梯度洗脱程序洗脱，表1所示为液相色谱分离十一种PDE₅型抑制剂的梯度洗脱程序，在流速为0.2ml/min、柱温为20℃条件下经十八烷基键合硅胶为填充剂的液相色谱柱分离后，以电喷雾离子化源(ESI)离子化，采用正离子方式，全扫描一、二级质谱，扫描范围50～550amz；记录液相色谱图和一、二级质谱图。

在另一个优选实施例中，流动相A中甲酸的体积百分比浓度为0.2％，乙酸铵的摩尔浓度为0.02mol/L，流速为0.4ml/min、柱温为50℃。

在另一个优选实施例中，流动相A中甲酸的体积百分比浓度为0.15％，乙酸铵的摩尔浓度为0.015mol/L，流速为0.3ml/min、柱温为30℃。

4.结果判断根据供试品与对照品的色谱图、一级质谱图和二级质谱图相互间的匹配性定性判别是否添加PDE₅型抑制剂；亦可根据供试品的色谱图、一级质谱图和二级质谱图与标准质谱库谱图的匹配性定性判别是否添加PDE₅型抑制剂，图1～11为十一种PDE₅型抑制剂的标准二级质谱图；表2所示为十一种PDE₅型抑制剂的化学信息与结构式，表3所示为十一种PDE₅型抑制剂的一级质谱分子离子峰与二级质谱主要特裂解片段，在没有对照品情况下，若供试品质谱图中出现表3中相应的准分子离子峰及三个以上二级质谱特征碎片离子时，可结合DAD光谱、近红外、理化反应与TLC结果定性判别是否添加PDE₅型抑制剂。

表1

表2

表3

5.注意事项：

(1)上述十一种PDE₅型抑制剂难于在同一色谱条件下完全分离。可在不改变色谱组成条件下，采用不同的洗脱程序、流速、柱温，以获得各成分的分离。

(2)上述十一种PDE₅型抑制剂中，他达那非与氨基他达那非，伐地那非与毫莫西地那非，硫代艾地那非与羟基毫莫西地那非、那莫西地那非与伪伐地那非等四对化学成分准分子离子峰质量数相近，此三对PDE₅型抑制剂应尽量在色谱完全分离条件下定性分析。

(3)因对照品昂贵且购买途径不便，较难集齐十一种化学物质的对照品，所以，首次采用本发明方法在某台仪器分析上述十一种PDE₅型抑制剂时，应同步完成质谱图谱库构建。后续实验仅需检测样品，将其结果与质谱图谱库比较即可确证样品中的目标添加物。

实施例2、本发明方法十一种PDE₅型抑制剂的灵敏度与样品检测结果

本发明以产生三倍基线噪音对应成分绝对质量为检出限，PDE₅型抑制剂的检出限均不超过10ng。参考PDE₅型抑制剂的临床起效剂量那非类为50～100mg，拉非类为5～20mg，添加起效剂量以上的样品，取一次口服量按本发明实施例1的方法检测，经10万倍稀释后进样，仍可准确定性检出。本发明灵敏度足以满足分析需要。

采用本发明方法对2006～2008年间收集的194个样品进行检测和分析，其中132个样品检出非法添加PDE₅型抑制剂；添加的PDE₅型抑制剂包括西地那非、伐地那非、他达那非、硫代艾地那非等8种。

本发明定性分析中成药中非法添加的十一种PDE₅型抑制剂，结果准确可靠。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (3)

1.一种药品和食品中PDE₅型抑制剂的高效液相色谱-串联质谱联用检测方法，其特征在于，以乙腈为提取剂，50％乙腈为稀释剂，甲酸-乙酸铵溶液-甲醇-乙腈体系为流动相，在流速为0.2～0.4ml/min、柱温20～50℃条件下经液相色谱柱分离后，采用电喷雾离子源离子化，正离子模式全扫描一、二级质谱，根据二级质谱定性分析判别样品是否添加PDE₅型抑制剂；

所述甲酸-乙酸铵溶液-甲醇-乙腈体系中，甲酸和乙酸铵的混合溶液、甲醇、乙腈分别为三组流动相；

所述三组流动相的体积比为：甲酸和乙酸铵的混合溶液：30～75，甲醇：10～55，乙腈：5～20；

所述甲酸和乙酸铵的混合溶液中的甲酸的体积百分比浓度为0.1～0.2％；

所述甲酸和乙酸铵的混合溶液中的乙酸铵的摩尔浓度浓度为0.01～0.02mol/L；

所述扫描的范围为50～550amz。

2.根据权利要求1所述的高效液相色谱-串联质谱联用检测方法，其特征在于，质谱仪为串联四级杆质谱仪。

3.根据权利要求1所述的高效液相色谱-串联质谱联用检测方法，其特征在于，所述液相色谱柱以十八烷基键合硅胶为填充剂。

Images