CN101617218B - 用于定量实时分析荧光样品的方法和装置 - Google Patents

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Abstract

提供了用于定量实时分析荧光样品的方法，其中，所述样品中的每一个被样品单用光源(12)激励而发荧光，并且测量样品发射的光的强度。为减少分析时间，为了即使在光强度低时也进行高度精确的测量，每个光源(12)在所定义的间隔期间通过具有恒定脉冲频率的时钟脉冲序列交替地打开和关闭。仅仅在所述光源(12)的开启阶段进行对这些间隔期间的发射光强度的测量。

Description

用于定量实时分析荧光样品的方法和装置
技术领域
本发明涉及根据权利要求1前序部分所述的用于定量实时分析荧光样品的方法和装置。
背景技术
与聚合酶链式反应，即所谓的PCR(Polymerase Chain Reaction)相结合，该方法尤其用在临床诊断中，以确定DNA(脱氧核糖核酸)的量。根据反复的循环，为了分别被复制或扩增，利用作为起始DNA的引物(primer)以及与引物结合的核苷酸，DNA分子样品在循环的第一步内被加热到95℃，从而使DNA的互补链变性。通过在循环的第二步将温度降低到55℃，发生杂交(hybridization)，其中，引物结合到DNA上。在循环的第三步，样品被加热到72℃。在该工作温度下，聚合酶进一步将核苷酸集合到生长的DNA链上，并且引物和那些DNA片断之间的不完全互补的松散结合(loose bond)再次断开。在由所述三个循环步骤组成的循环的永久重复中，被复制的DNA分子的数量在每个新的循环内加倍。
为了确定所形成的DNA分子，样品被提供有例如溴化乙锭(EtBr)的染料，如果所述染料结合到双链DNA分子上并且如果用光激励的话，则是发荧光的。根据荧光发射的光强度能够得出所形成的DNA量。
根据一种用于分析样品的已知分析方法(EP0902271 A2)，来自多个光源的光分别经由相同数量的光纤被引导到一个样品上。由于在与样品被光源激励的那些时间相对应的连续时间内因荧光性引起的光的激励，因此每个所述的样品都发出光。为检测由多个样品发出的光量(即所谓的光强度)，使用了单个向其中导入了许多始于样品的光纤的光检测器。因此，使用叉状光纤，所述光纤提供了一个主干，并且从主干分出两个分支。所述叉状光纤中的每一个都通过其主干被分配到样品，同时一个分叉被分配到光源并且另一个分叉位于光检测器处。位于光检测器处的所有的所述分叉末端都通过连接器(章鱼式连接器)捆扎起来。绿色滤光器位于具有多个分叉末端的连接器出口和光检测器之间。具有来自于蓝光光谱的波长的LED被用作光源。作为光检测器，优选使用光敏放大器阀，即所谓的光电倍增管(PM)。光电倍增管产生相当于被检测的光的强度的电信号。所述电信号被储存在微控制器中。光源分别依次开启持续预定周期，并且独立地储存样品的光强度直到所有的光源都已经被开启一次。随后，从第一光源开始，通过对所有光源执行新的顺序启动而重复测量序列。当将所测的强度相对于测量的次数作图时，对每个样品的多次测量便产生一个钟形曲线。在最大值的80％处，根据每个样品的测量次数确定例如包含在样品中的DNA数量。
一种已知的用于检测并测量由荧光引起的光发射的荧光计(WO 01/35079A1)(其尤其是和基于PCR的研究关联使用)，具有多个光源(优选为发光二极管LED)，用于照明包含在小容器中的样品；具有位于每个LED及其分配的容器之间的第一光路，以及位于每个容器和在样品被激励而发荧光的情况下用于感测样品引起的光辐射的光电装置之间的第二光路。作为光电装置，使用光敏放大器阀(所谓的光电倍增管)和CCD相机，当接收每个光子时光敏放大器阀产生电荷或信号脉冲。借助于所述荧光计，实施用于分析PCR扩增的材料的方法，从而使要被PCR扩增的样品被填充到容器内，所述样品依次被所述LED照射，并且由所述光电装置检测所述样品由于荧光而发出的光，而且将测量的光量，即光强度与预定的参考值进行比较。
为了获得可靠的分析结果，测量需要足够高的光强度；这是因为对较小光强度的测量严重地受到噪声的干扰，尤其是当光电倍增管用作光检测器时，测量严重地受到碰撞声、电容和电感干扰、电源电压波动等的干扰。为获取足够高的光强度，从而例如确定DNA(例如在PCR中)的量，需要其中DNA被复制的多次重复循环，使得分析通常是非常费时的。
发明内容
本发明的目的是改进上面提到的方法，从而能够非常精确地测量很小的光强度，以减少用于实现可靠的分析所需的周期。
根据本发明，通过权利要求1的特征实现上述目的。
根据本发明的方法的优点在于，通过在所定义的时间间隔内周期性的开启和关闭每个光源并且通过仅仅在处于光源的开启阶段或启动阶段的所述间隔期间测量由样品发出的光的强度，而不检测出现在光源的关闭阶段或休止阶段中的那些干扰信号和出现的噪声；这是因为不具有与时钟脉冲序列相同的频率和/或相位的所有干扰量被滤除，并且对光强度的测量不起作用。每个周期的时钟脉冲数越高，所实现的干扰滤除就越好。结果，在较低的光强度下获得的全部信噪比已经足够好，从而使得对代表光强度的电信号的可靠评估成为可能。总之，从开始到存在信噪比的时间点的周期(其允许进行可靠的测量)，被根据本发明的方法极大地缩短，并且由此分析方法所需的时间周期被大大地减少。
具有根据本发明的有利进展和设计的根据本发明的方法的适当实施例在权利要求2-9中进一步阐述。
根据本发明的一种有利实施例，以1∶2的占空比产生时钟脉冲序列，并且在每个连续的时间间隔内，控制一对光源，从而使一对光源中的一个光源被时钟脉冲序列控制，而另一个光源被移动了一个脉冲周期并因此与原始的时钟脉冲序列反向的时钟脉冲序列控制。这样做的优势在于：多个现存的样品及其被分配的光源不是单独和依次被处理，而是成对地被处理，从而使得分析所需的时间另外被减半。
根据本发明的一个有利实施例，来自于每个样品的发射光被转换为电模拟信号，其在通过时钟脉冲预先确定的时间点处被采样，并且采样值被进行模拟/数字转换。在间隔内被采集并被数字化的所有采样值被相加，并且采样值之和的平均值作为光强度的度量而被输出。通过仅对带通放大器的模拟输出信号的一个采样值并非全部的输出信号进行模拟/数字转换，相应于A/D转换器的动态特性及其噪声不灵敏度而言，对A/D转换器仅有很低的要求，从而可以使用更廉价并且更缓慢的A/D转换器。使仅具有相同频率和相同相位的采样值相加仅需要很小的硬件努力，并且如果与其他的评价方法(例如相关或频率分析方法)相比，还节省了计算时间。
根据本发明的一种有利实施例，在每个时钟脉冲的脉冲周期中心附近进行模拟信号的采样，优选在从脉冲周期中心朝向脉冲周期的末端偏移处进行采样。这样做优点在于：在模拟信号的信号范围内进行采样，其中，模拟信号已经达到其调谐状态，并因此抑制了通过将发射光转换为电信号而产生的模拟信号的调谐过程，尤其是在使用了已知的光敏放大器阀或复用器并在下游设置有电流/电压转换器和带通放大器的情况下尤为如此。
根据本发明的一种有利实施例，模拟信号被高通滤波、电流/电压转换以及被频带限制地放大。这样做的优点在于：尤其是低频干扰(如碰撞声、电容和电感干扰、电源干扰等)以及低频噪声被消除，并且仅仅是位于带通通带内的模拟信号对测量有贡献。采用高通滤波避免了由低频干扰引起的电流/电压转换负担过度。
用于实施根据本发明的方法的有利设备是权利要求10的主题。
根据本发明的设备的适当实施例和设计是权利要求11-17的主题。
附图说明
参照附图，通过实施本发明的示例来说明本发明，附图如下：
图1是用于定量实时分析荧光样品的设备方框图，
图2是用于控制根据图1的设备中的光源的一种变型的控制单元的功能原理图，
图3是在设备的不同装置处运行的信号的图。
具体实施方式
在图1中示出了设备方框图，所述设备能够用于对荧光样品进行定量实时分析。作为一种示例，所述设备和聚合酶链式反应(PCR)一起使用，以确定所形成的DNA量。因此，多个具有将分别被复制或扩增的DNA分子的样品在如上描述的重复三阶段循环中被加热和退火，从而荧光染料结合到双链DNA上，并且当被外来光激励时发荧光。为确定样品中在每个循环中被复制的DNA的数量，通过所述设备测量由样品发出的光的强度。
所述设备提供了一个具有多个小容器11的托盘，所述容器填充有具有DNA分子、引物、核苷酸和荧光染料的样品。托盘在上述循环内交替地被加热和退火。电气光源12被分配到托盘中的每个容器11，能够通过光学装置13照射包含在被分配的容器11内的样品，这使得可将每个光源12称为样品独用的光源12。在DNA分析的示例中，光源实现为发光二极管(LED)14，其发出例如在蓝光光谱中波长λ≈417nm的单色光。光学装置13包括半透分束器27，所述半透分束器27将LED 14发出的光引导至容器11并将由样品发出的荧光偏转到光收集器28。设置在光收集器28下游的是光敏放大器阀15，一种所谓的倍增器，优选是通道式光电倍增管(CPM)。在图1中以虚线示意性地示出了由LED 14发出的光的辐射路径以及由被光激励而发荧光的样品发出的光的辐射路径，其通过光学装置13到达光收集器28。设置在放大器阀15下游的是提供带有集成高通滤波器16的电流/电压转换器的信号处理装置、带通放大器17和具有一个用于A/D转换时间选择性启动的控制输入端的A/D转换器18以及求平均装置20。
时钟脉冲发生器23产生具有恒定频率(例如100kHz)、占空比为1∶2的时钟脉冲序列，如图3a所示。占空比通常被理解为脉冲周期与时钟脉冲或循环周期的比率。所述时钟脉冲序列被施加到用于控制LED14的控制单元24，被施加到具有时钟脉冲输入端、复位输入端和计数器输出端的脉冲计数器25，并且经由延时部件26而被施加到A/D转换器18的控制输入端，所述延时部件26被调节为延时τ。这里，脉冲计数器25被示例用作计时器，其输出具有恒定间隔的时间脉冲。连续的时间脉冲预先确定所述间隔，其中，LED14被时钟脉冲序列控制。脉冲计数器25通过计数时钟脉冲发生器23的时钟脉冲的预定数量来实现所述间隔，并且在其计数器输出端处输出时间脉冲，当时间脉冲达到预定的数量时标记所述间隔。
形成根据图1的控制单元24，使得信号LED14顺序地进行控制，即在时间连续的间隔中进行控制，从而在每个间隔内，仅有单一的发光二极管被时钟脉冲发生器23的时钟脉冲序列控制。分别被控制的LED 14在时钟脉冲序列的时钟脉冲周期T内(图3a)周期性地被开启和关闭，从而LED 14的开启或活动阶段与时钟脉冲序列的脉冲周期相符(图3a)。时钟脉冲被脉冲计数器25计数，并且当到达预定数量的时钟脉冲时脉冲计数器25在其计数器输出端处输出一时间脉冲，其中，所述时间脉冲一方面经由复位输入端复位脉冲计数器25，而另一方面所述时间脉冲到达控制单元24并且通过时钟脉冲发生器23的时钟脉冲序列开始它们对下一个LED14的控制。引起脉冲计数器25的计数脉冲的时间脉冲的多个时钟脉冲定义了其中LED 14分别被控制的间隔。所述间隔因此被两个连续的时间脉冲定义。在所述间隔期间，LED 14被时钟脉冲发生器23重复地开启和关闭，从而被分配到所述LED 14的容器11内的样品在所述间隔期间被照射并且被激励以发出光。由于信号处理装置的设计，对样品的发射光的强度测量仅仅发生在LED14的开启或活动期间。
由于光的发射而出现在放大器阀的输出端处的电流信号被带有集成的高通滤波器16的电流/电压转换器转换为电压信号。设置在电流/电压转换上游的高通滤波器的下截止频率小于时钟脉冲序列的脉冲频率。位于电流/电压转换器16的输出端处的电压信号被带通放大器17放大，并且带通放大器17的模拟输出信号到达A/D转换器。带通放大器17的下截止频率等于电流/电压转换器16中的高通滤波器的下截止频率，而带通放大器17的上截止频率是时钟脉冲序列的脉冲频率大约5-10倍高。
在图3b中示出了带通放大器17的模拟输出信号。在A/D转换器18中根据时钟脉冲序列的每个时钟脉冲采样输出信号一次，并且采样值被模拟/数字转换。为滤除输出信号的调谐过程，采样相对于时钟脉冲的上升斜率而被时间偏移，如在图3c中所示，在图3c中显示出模拟输出信号的采样值。因此，时钟脉冲序列经由具有延时τ的延时部件26而被施加到A/D转换器18的控制输入端。在延时部件26处的延时τ被调节，从而使输出信号的采样近似出现在时钟脉冲的脉冲周期中心，或者从脉冲周期中心朝向其末端略微偏移处。由于LED14的开启或活动阶段与脉冲周期相符，因此对输出信号的采样相应地分别出现在LED14的开启阶段的中心，或者从中心朝向末端略微偏移处。在一个间隔期间累积的所有数字采样值被相加，并且总和被平均。对于显示的设备示例，这发生在求平均装置20内。因此，求平均装置20通常包括加法器和减法器，其将在一个间隔内累积的数字采样值之和除以时钟脉冲数，并由此除以采样值的数量。在每个间隔的末端并且在输出由平均值形成的当前光强度的电确定值之后，求平均装置20通过脉冲计数器25的时间脉冲复位。对于每个LED 14重复该操作。所获得的被照射样品的当前光强度的所有电确定值连同其对相应样品的分配一起被单独储存，并被登记。
在PCR的每个重复循环内，对于每个LED 14重复上面提到的操作。对于每个单独的LED 14或样品，在每个循环中获得的确定值连同对循环编号的分配一起被分别储存，并且所述确定值被评估以分析样品。
在与上述方法相比被修改过的用于定量实时分析的方法中，LED14不是单独并且顺序地被控制，而是成对地被控制，即在每个连续间隔期间，总是一对LED14被控制，从而与上述方法相比测量时间减半。因此，执行对LED对的控制，使得一个LED14被时钟脉冲序列控制，而另一个LED14通过反向时钟脉冲序列来控制，其中反向时钟脉冲序列是偏移一个脉冲周期的时钟脉冲序列。因此，如在图2中所示，仅仅在原理上并且不作为电路的一个特定示例，一个LED 14被直接控制，而另一个LED14经由反相器29被时钟脉冲序列控制。在间隔末端，下一个LED由脉冲计数器25的每个时间脉冲分配给时钟脉冲发生器23。如在相对于图1做了修改的图2的控制单元24中示例性地显示的，能够借助于电子开关31开启各LED14，电子开关31将直流电压源30的直流电压连接到LED14，持续每个时钟脉冲长度。相应地被分配到LED对的开关对例如经由复用器32进行顺序供电，时钟脉冲发生器23的输出端连接至复用器32，并且其控制输入端与脉冲计数器25的计数器输出端连接。利用在脉冲计数器25的计数器输出端处的每个时间脉冲，时钟脉冲序列被复用器32施加到随后的电开关31对的控制输入端，即直接施加在一个电开关31的控制输入端，并且在另一电开关31的控制输入端处被反相器29反向。
除示例性描述的涉及DNA分析的应用领域之外，本发明能够用于其中样品含量的增长或增加被定量检测和评价的其它分析方法。

Claims (7)

1.一种用于定量实时分析荧光样品的方法，其中，所述样品被样品单用的光源(12)激励而发荧光，并且测量荧光样品发出的光的强度，其特征在于：在所定义的连续间隔内，所述荧光样品中的两个成对地被处理：通过具有恒定脉冲频率的时钟脉冲序列使所述荧光样品中的两个的分配的光源(12)周期性地被开启和关闭，以1∶2的占空比产生所述时钟脉冲序列，从而使该对分配的光源中的一个光源(12)被时钟脉冲序列控制，而另一个分配的光源(12)被反向时钟脉冲序列控制，并且对于成对地被处理的样品的各个样品单用的光源(12)仅仅在分配的样品单用的光源(12)的开启阶段测量相应的发射光的强度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：为了测量强度，所述发射光被转换成电模拟信号，所述电模拟信号在通过时钟脉冲所确定的时间点处被采样，模拟采样值被数字化，包含在一个间隔内的所有数字采样值被相加，以及所述数字采样值之和的平均值作为光强度的度量而被输出。
3.根据权利要求2的方法，其特征在于：所述电模拟信号被高通滤波、电流/电压转换并且随后被频带限制地放大。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：近似在每个时钟脉冲的脉冲周期中心进行模拟信号的采样。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：高通滤波的下截止频率小于时钟脉冲序列的脉冲频率，并且带通放大的上截止频率被设定为脉冲频率的5-10倍。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：带有可结合的荧光染料的DNA分子被用作样品。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：发光二极管(14)被用作光源，其发射处于蓝光光谱中的单色光。
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