CN101607981A

CN101607981A - 集成柱色谱分离与纯化黄姜中甾体皂甙的方法

Info

Publication number: CN101607981A
Application number: CNA2009100629262A
Authority: CN
Inventors: 彭月娥; 杨志华; 王焰新
Original assignee: China University of Geosciences
Current assignee: China University of Geosciences
Priority date: 2009-06-30
Filing date: 2009-06-30
Publication date: 2009-12-23

Abstract

本发明涉及一种用集成柱色谱技术分离与纯化黄姜中甾体皂甙的方法，包括以下步骤：将黄姜干粉用乙醇浸提，减压浓缩，得浸膏；往浸膏中加水分散，静置、离心分离、烘干后依次用石油醚、氯仿和甲醇回流提取，提取物减压浓缩至干，得粗甾体皂甙；将粗甾体皂甙通过硅胶柱，用氯仿与甲醇洗脱；收集含甾体皂甙洗脱液，减压浓缩至干，用甲醇溶解，经ODS柱分离，分别收集10.9min、11.9min和12.8min流出液，冻干分别得到甾体皂甙A，B和C。本发明采用集成柱色谱技术，即将开放柱色谱和高压制备柱色谱技术相结合，分离、纯化黄姜中的甾体皂甙，分离时间短，分离的皂甙纯度较高(可以使甾体皂甙的纯度达到98％以上)，生物活性相对较高。

Description

集成柱色谱分离与纯化黄姜中甾体皂甙的方法

一.技术领域

本发明涉及一种用集成柱色谱技术分离与纯化黄姜中的甾体皂甙方法。

二、背景技术

黄姜(Dioscorea Zingiberensis C.H.Wright)，学名盾叶薯蓣。上世纪九十年代，黄姜实现了野转家人工栽培后，黄姜成为供应皂素生产的主要原料，黄姜皂素生产逐步发展成为了一个产业，并形成了从黄姜到甾体激素类药物的一个庞大的产业链。皂素生产方法是将黄姜中的甾体皂甙(Steroidal Saponins)通过化学或生物方法转化为皂素后再通过有机溶剂将皂素提取出来[J.W.Rothrock，P.A.Hammes，W.J.Mcaleer.Isolation of diosgenin by acid hydrolysis ofsaponin.Feberuary，49(2)：187-188]。

甾体皂甙除作为合成激素类药物和避孕药重要的原料外，同时还可用于治疗冠心病心绞痛，抗肿瘤、抗癌、治疗心血管疾病和白血病等作用[吴寿金，赵泰，秦永祺，现代中草药成分化学，中国医药科技出版社，北京，2001：541][庾石山，皂苷，化学工业出版社，北京，2005：267]。

80年代，唐世蓉就从黄姜中分离了两种水不溶性三糖皂甙和两种水溶性四糖皂甙，其方法是：浸提-沉淀-活性炭脱色和重结晶精制，以及浸提-萃取-氧化铝柱分离[唐世蓉，吴余芬，庞自洁，盾叶薯蓣甾体皂甙的分离鉴定，植物学报，1983，25(6)：556-562]。刘承来从黄姜中分离了三种甾体皂甙，其方法是：浸提-硅胶柱层析分离[刘承来，陈延镛，唐易芳等，盾叶薯蓣中甾体皂甙的分离和鉴定，植物学报，1984，16(3)：283-289]，后又采用此方法从鲜黄姜中分离出了一种新四糖甾体皂甙[刘承来，陈延镛，鲜盾叶薯蓣中原始皂甙的分离和鉴定，植物学报，1985，27(1)：8-74]。2006年，钱士辉等采用回流提取-硅胶柱层析的方法从黄姜中分离得到了5种甾体皂甙[钱士辉，袁丽红，杨念云等，盾叶薯蓣中甾体类化合物的分离与结构鉴定，中药材，2006.29(11)：1174-1176]。以上分离法都是采用传统的浸提-开放柱层析来分离黄姜中的甾体皂甙，由于开放柱柱压小，填料粒径大，相对于高压柱来说柱效要低很多，分离时间也较长，分离的皂甙纯度不高，生物活性相对较低。

三.发明内容

本发明的目的提供一种集成柱色谱分离与纯化黄姜中甾体皂甙的方法，分离的皂甙纯度较高。

本发明提供的技术方案是：集成柱色谱分离与纯化黄姜中甾体皂甙的方法，包括以下步骤：

(1)溶剂浸提

将过20目筛的黄姜干粉用体积百分比70-80％的乙醇浸提，提取液减压浓缩，得浸膏；往浸膏中加1-5倍体积的水分散，静置沉降后，离心分离，得离心液和固体两部分；将固体50-70℃烘干后依次用石油醚、氯仿和甲醇回流提取；经甲醇回流提取物减压浓缩至干，得粗甾体皂甙；

(2)集成柱色谱分离

a.开放柱分离

将粗甾体皂甙通过硅胶柱，用氯仿与甲醇体积比为10∶4的洗脱剂洗脱；取样用A试剂显色，若变黄色，则说明含有甾体皂甙；收集含甾体皂甙洗脱液，减压浓缩至干，得浓缩物；

b.制备色谱分离纯化

将步骤a中处理后得到浓缩物用甲醇溶解，经制备柱分离，制备柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)，分别收集10.9min、11.9min和12.8min流出液，冻干分别得到如下式所示的甾体皂甙A，B和C。

甾体皂甙A 甾体皂甙B

甾体皂甙C

上述步骤(1)中的乙醇浸提次数为三次，每次浸提时间为3天，提取液为三次浸提的合并液。

上述步骤(2)a中的洗脱液采用A试剂显色法检测甾体皂甙，每收集25-50mL洗脱液检测一次，甾体皂甙遇A试剂显黄色。A试剂配制：0.5g香草醛溶于100mL硫酸乙醇溶液，其中硫酸(质量比为95-98％)与乙醇的体积比为4∶1。

上述步骤(2)b中采用的洗脱剂为甲醇和水体积比90∶10的洗脱剂，检测器为紫外检测器，检测波长为203m，进样量为1mL，流速3.0ml/min。

本发明采用集成柱色谱技术，即将开放柱色谱和高压制备柱色谱技术相结合，分离、纯化黄姜中的甾体皂甙，分离时间短，分离的皂甙纯度较高(可以使甾体皂甙的纯度达到98％以上)，生物活性相对较高。

四.附图说明

图1为本发明开放柱分离皂甙薄层层析图；

图2为本发明皂甙A液相色谱图；

图3为本发明皂甙B液相色谱图；

图4为本发明皂甙C液相色谱图。

五、具体实施方式

实施例1

称取黄姜干粉200g加70％(体积百分比)乙醇1L冷浸3次，每次3天，离心出乙醇液，合并，共计2.6L。提取液70℃，0.07MPa减压浓缩，得浸膏约0.7L。往浸膏中加水0.7L分散，静置24h，离心分离(4000r/min，10min)，浸膏再加等体积水洗涤，离心，合并离心液约1.5L，固体约125g。将固体50-70℃烘干后依次用石油醚、氯仿和甲醇萃取24h。甲醇部分减压浓缩至干，得干粉4g。

选用层析柱尺寸3×100cm，装填硅胶柱床高约80cm。将以上干粉用洗脱剂氯仿∶甲醇(10∶4，v∶v)溶解，上样，用洗脱剂氯仿∶甲醇(10∶4，v∶v)洗脱。A试剂检验，收集含甾体皂甙洗脱液。减压浓缩至干，甲醇溶解后上制备柱分离。

上述试剂检验采用A试剂显色法检测，每隔25mL取样用A试剂显色，若变黄色，则说明含有甾体皂甙。收集含甾体皂甙洗脱液，减压浓缩至干，甲醇溶解后上制备柱分离。A试剂配制：0.5g香草醛溶于100mL硫酸乙醇溶液，其中浓硫酸(质量比为95-98％)与乙醇的体积比为4∶1。

制备柱选用ODS柱(10.0×250mm，粒径5μm)，甲醇∶水(90∶10，v∶v)作为流动相洗脱，进样量为1mL，流速3.0ml/min，紫外检测波长203nm，甾体皂甙A，B，C的流出时间分别为10.9，11.9，12.8min。冻干后，甾体皂甙A，B，C得率分别为0.2g，0.2g，30mg。

结构鉴定：皂甙A，B，C遇A试剂显色说明为甾体皂甙，皂甙经酸水解以后都得到薯蓣皂苷元，说明其骨架为薯蓣皂苷元。皂甙经LC-MS测定其分子量分别为1046，884和722。根据LC-MS二级质谱碎片峰可判断皂甙A，B，C分别为四糖，三糖和二糖皂甙。

皂甙A，ESI-MSm/z：1046(M)，1069(M+Na)，923(M+Na-146)，723(M+H-162-146)，577(M+H-162-146-146)，415(M+H-162-146-146-162)。数据显示其分子量为1046，为四糖皂甙，与相关文献报道的相同。923为皂甙去掉一个鼠李糖的离子峰，723为皂甙失去一个鼠李糖和一个葡萄糖的离子峰，577为皂甙失去一个葡萄糖和两个鼠李糖后的离子峰，415为皂甙失去两个葡萄糖和两个鼠李糖后的离子峰。说明皂甙连接的糖分子中有两个鼠李糖和两个葡萄糖。

皂甙B，ESI-MSm/z：884(M)，907(M+Na)，723(M+H-162)，577(M+H-162-146)，415(M+H-162-146-162)。皂甙分子量为884，723为皂甙失去一个葡萄糖的离子峰，577为皂甙失去一个葡萄糖和一个鼠李糖后的离子峰，415为皂甙失去一个葡萄糖和两个鼠李糖后的离子峰。由上推测皂甙为三糖皂甙，包括一个葡萄糖和两个鼠李糖。

皂甙C，ESI-MSm/z：722(M)，745(M+Na)，723(M+H)，577(M+H-146)，415(M+H-146-162)。皂甙C分子量为722，连接两个糖分子，一个为葡萄糖，另一个为鼠李糖。

纯度鉴定：图1为上述开放柱洗脱液薄层层析图(每25mL点样一次)，图中第2-5次收集的洗脱液中含有皂甙A，B，C的斑点，说明分离得到的是三种皂甙的混合物。图2-4为经制备柱分离后皂甙A，B，C的液相色谱图纯度达到98％(前面的峰为溶剂峰)。

实施例2

称取黄姜干粉500g加80％乙醇3L冷浸3次，每次3天，离心出乙醇液，合并，共计8L。提取液70℃，0.07MPa减压浓缩，得浸膏约1.8L。往浸膏中加水9L分散，静置24h，离心分离(4000r/min，10min)，浸膏再加等体积水洗涤，离心，合并离心液约3.6L，固体约300g。将固体50-70℃烘干后依次用石油醚、氯仿和甲醇萃取24h。甲醇部分浓缩至干，得干粉10g。

选用层析住尺寸3×100cm，装填硅胶柱床高约80cm。将以上干粉用洗脱剂氯仿∶甲醇(10∶4)溶解，上样，用洗脱剂氯仿∶甲醇(10∶4)洗脱。A试剂检验，收集含甾体皂甙洗脱液。减压浓缩至干，甲醇溶解后上制备柱分离。

上述试剂检验采用A试剂显色法检测，每收集50mL洗脱液检测一次，遇A试剂显黄色则说明含有甾体皂甙。A试剂配制：0.5g香草醛溶于100mL硫酸乙醇溶液，其中浓硫酸(质量比为95-98％)与乙醇的体积比为4∶1。

制备柱选用ODS柱(10.0×250mm，粒径5μm)，甲醇∶水(90∶10)作为流动相洗脱，进样量为1mL，流速3.0ml/min，紫外检测波长203nm，甾体皂甙A，B，C的流出时间分别为10.9，11.9，12.8min。冻干后，甾体皂甙A，B，C得率分别为1.0g，1.5g，0.1g。

甾体皂甙A，B，C结构及纯度鉴定数据同实施例1。

实施例3

称取黄姜干粉2kg加70％乙醇10L冷浸3次，每次3天，离心出乙醇液，合并，共计26L。提取液70℃，0.07MPa减压浓缩，得浸膏约8L。往浸膏中加水8L分散，静置24h，离心分离(4000r/min，10min)，浸膏再加等体积水洗涤，离心，合并离心液约16L，固体约1200g。将固体50-70℃烘干后依次用石油醚、氯仿和甲醇萃取24h。甲醇部分浓缩至干，得干粉50g。

选用层析住尺寸6×100cm，装填硅胶柱床高约80cm。将以上干粉用洗脱剂氯仿∶甲醇(10∶4)溶解，上样，用洗脱剂氯仿∶甲醇(10∶4)洗脱。A试剂检验，收集含甾体皂甙洗脱液。减压浓缩至干，甲醇溶解后上制备柱分离。

制备柱选用ODS柱(10.0×250mm，粒径5μm)，甲醇∶水(90∶10)作为流动相洗脱，进样量为1mL，流速3.0ml/min，紫外检测波长203nm，甾体皂甙A，B，C的流出时间分别为10.9，11.9，12.8min。冷冻干燥后，甾体皂甙A，B，C得率分别为4.5g，6g，0.5g。

甾体皂甙A，B，C结构及纯度鉴定数据同实施例1。

Claims

1.集成柱色谱分离与纯化黄姜中甾体皂甙的方法，包括以下步骤：

(1)溶剂浸提

(2)集成柱色谱分离

a.开放柱分离

b.制备色谱分离纯化

将步骤a中处理后得到浓缩物用甲醇溶解，经制备柱分离，制备柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶，分别收集10.9min、11.9min和12.8min流出液，冷冻干燥分别得到甾体皂甙A，B和C。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中的乙醇浸提次数为三次，每次浸提时间为3天，提取液为三次浸提的合并液。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(2)a中的A试剂由0.5g香草醛溶于100mL硫酸乙醇溶液得到，其中硫酸与乙醇的体积比为4∶1。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述硫酸的质量浓度为95％-98％。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(2)b洗脱剂中甲醇和水体积比9010，采用紫外检测器检测，检测波长为203nm，进样量为1mL，流速3.0ml/min；制备柱填料粒径5μm。