CN101591640B - 一种利用穿透型干细胞转录因子诱导体细胞重编程的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种将胚胎干细胞特异的转录因子导入体细胞的方法，包括将细胞穿透肽与胚胎干细胞特异的转录因子融合，获得融合蛋白；将所述融合蛋白与体细胞共孵育，从而胚胎干细胞特异的转录因子被导入体细胞内。本发明还公开了所述方法获得的细胞。
Description
技术领域
本发明属于基因工程与组织工程领域，更具体的，本发明涉及一种利用细胞穿透型转录因子诱导体细胞重编程的方法。
背景技术
诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem cell，iPS)是指将成体分化细胞经人为诱导转变成多能性干细胞。
2006年8月，日本京都大学的Yamanaka课题组首次在Cell上报道，小鼠成纤维细胞内共表达Oct3/4、Sox2、C-myc和Klf4等四种转录因子，可诱发产生类似胚胎干细胞的iPS。目前，相关的研究已经扩展到了iPS的适用物种、可被诱导细胞类型、诱导因子、筛选方法、干细胞功能与特性和移植治疗潜能等。
iPS可方便的直接取材于病人的体细胞，所获得的病人特异性iPS细胞模型可大大提高药物发现效率，并提供了用于毒性检测的工具；最后，利用iPS形成与病人具有完全免疫相容性的细胞、组织或器官，将使得基于病人个性化的药物筛选和治疗策略成为现实，其社会效益和经济前景不可限量。
但是目前iPS的研究尚处于起步阶段，仍存在许多问题和困难。例如，诱导iPS细胞的产生效率低，仅3/1000左右；病毒介导的转基因需整合入宿主细胞的基因组；干细胞相关转录因子在iPS细胞的分化后代中可被重新激活，引发诸多异常，如c-myc表达引起肿瘤形成等。这些无疑将严重阻碍iPS细胞的实际应用和研究。未来iPS应用时需要克服使用有害的癌基因、避免使用逆转录病毒和开发更强力可靠的去分化方法。
综上所述，尽管目前已经证明可以通过干细胞转录因子诱导体细胞重编程，并转分化为多能性细胞，但现行方法因基于病毒载体而导致产生了很大的不安全性和不可控性，亟需开发一种更加安全可靠的诱导方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种将胚胎干细胞特异的转录因子导入体细胞的方法以及利用所述方法获得的细胞。
在本发明的第一方面，提供一种将胚胎干细胞特异的转录因子导入体细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将细胞穿透肽(cell-penetrating peptide，CPP)与胚胎干细胞特异的转录因子融合，获得融合蛋白；
(2)将(1)的融合蛋白与体细胞共孵育，从而胚胎干细胞特异的转录因子被导入体细胞内。
在另一优选例中，所述的转录因子选自：Oct4、Sox2、c-Myc、n-Myc、Klf4、Nanog或Lin28。较佳的，所述的转录因子选自Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Nanog。更佳的，所述的胚胎干细胞特异的转录因子是：Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4。
在另一优选例中，所述的转录因子是人、猪、牛或羊的转录因子。
在另一优选例中，所述的体细胞是：成纤维细胞，上皮细胞，胃肠道细胞，神经细胞。较佳的所述的体细胞是成纤维细胞。
在另一优选例中，所述的细胞穿透肽选自：反式激活蛋白(Transactivator，TAT)、Penetratin、基于信号序列的肽、pVEC、Transportan、Amphiphilic modelpeptide或Arg9。
在另一优选例中，所述的细胞穿透肽是反式激活蛋白。
在另一优选例中，所述的细胞穿透肽的羧基端与胚胎干细胞特异的转录因子的氨基端融合；或者，所述的细胞穿透肽的氨基端与胚胎干细胞特异的转录因子的羧基端融合。
在另一个优选例中，所述的细胞穿透肽的羧基端与胚胎干细胞特异的转录因子的氨基端融合。
在另一个优选例中，所述的反式激活蛋白具有SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列；更佳的，所述的反式激活蛋白的编码基因具有SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的反式激活蛋白的羧基端与胚胎干细胞特异的转录因子的氨基端融合。
在另一优选例中，步骤(1)中，所述获得融合蛋白的方法包括：
(a)提供一构建物，所述的构建物中含有一基因表达盒，所述基因表达盒含有以下操作性相连的元件：细胞穿透肽编码基因与胚胎干细胞特异的转录因子编码基因；
(b)将(a)的构建物导入细胞表达系统，从而表达和纯化获得所述融合蛋白。
在另一优选例中，所述的细胞表达系统包括原核表达系统或真核表达系统。
在另一优选例中，所述的细胞穿透肽编码基因的3’端与胚胎干细胞特异的转录因子编码基因的5’端融合；或者，所述的细胞穿透肽编码基因的5’端与胚胎干细胞特异的转录因子编码基因的3’端融合。较佳的，所述的细胞穿透肽编码基因的3’端与胚胎干细胞特异的转录因子编码基因的5’端融合。
在另一优选例中，采用原核细胞表达系统(优选大肠杆菌)表达所述的融合蛋白，采用0.8±0.2mmol/L(较佳的0.8±0.1mmol/L)异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)，32±2℃(较佳的32±1℃)诱导4±2小时(较佳的4±1小时)。
在另一优选例中，尿素的浓度是8±2mol/L；更佳的是8±1mol/L。
在另一优选例中，并采用尿素变性方法对表达获得的融合蛋白包涵体进行变性，采用Ni-NTA亲和层析纯化；并且：
在进行尿素变性前，用1±0.3(较佳的1±0.2；更佳的1±0.1)mol/L的尿素(含尿素的缓冲液)洗涤包涵体；或
采用250±50mmol/L咪唑(含咪唑的缓冲液)洗脱所述融合蛋白。
在本发明的第二方面，提供一种利用所述的方法获得的细胞。
在另一优选例中，所述的细胞表达胚胎干细胞标记分子；更特别的，所述的细胞表达Oct4、Nanog和Fgf4。
在本发明的第三方面，提供一种诱导体细胞表达干细胞标记分子的方法，所述的方法包括以下步骤：
(1)将细胞穿透肽(cell-penetrating peptide，CPP)与胚胎干细胞特异的转录因子融合，获得融合蛋白；
(2)将(1)的融合蛋白与体细胞共孵育，从而融合蛋白进入体细胞内，诱导体细胞表达干细胞标记分子。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1：人ES细胞RNA提取电泳图，M为DNA Marker，1，2为两个细胞样本，从电泳可以看出2号样品的提取效果较好，适于后续实验。
图2A：1为Oct4PCR产物电泳图，片段大小为1096bp；2为Sox2PCR产物电泳图，片段大小为956bp；M为DNA Marker。
图2B：1为C-myc PCR产物电泳图，片段大小为1372bp。M为DNA Marker。
图2C：1为Klf4PCR产物电泳图，片段大小为1438bp；M为DNA Marker。
图3：1-4依次为pETs、pETc、pETo和pETk转染BL21表达菌株后经IPTG诱导表达的产物，5为未转染质粒的BL21表达菌株，6为IPTG诱导未转染质粒的BL21表达菌株，M为蛋白分子量标准。
图4：M为蛋白质分子量标记；1-4，5-8依次为含尿素浓度为1，2，3，4mol/l的缓冲液洗涤结果，其中1-4为洗涤离心后上清样品；5-8为洗涤离心后沉淀样品；箭头所指为目的蛋白Sox2分子量大小约为40kD。
图5A：纯化Oct4重组蛋白电泳结果图，1为上样液，2为流穿液，3-10为洗脱峰不同时段样品；
图5B：纯化Sox2重组蛋白电泳结果图，1为上样液，2，3为流穿液，4-12为洗脱峰不同时段样品；
图5C：纯化C-myc重组蛋白电泳结果图，1为上样液，2，3为流穿液，4-13为洗脱峰不同时段样品；
图5D：纯化Klf4重组蛋白电泳结果图，1为流穿液，2为上样液，3-9为洗脱峰不同时段样品；M为蛋白质分子量标记；图中箭头所指即所需目的蛋白，Oct4、Sox2、C-myc和Klf4分子量大小依次约为46kD、40kD、58kD和60kD。
图6：A Oct4基因检测图谱，片段大小为143bp，1-5依次为ES细胞样品，阴性对照，正常人成纤维细胞，蛋白处理后两天细胞样本，蛋白处理后6天细胞样本，M为DNA marker B Nanog基因检测图谱，片段大小为389bp，样品顺序同上C Fgf4基因检测图谱，片段大小为369bp，样品顺序同上。
图7：诱导细胞蛋白检测电泳图。1为诱导第1天细胞样本；2为诱导第2天细胞样本；M为蛋白分子量标记；3为诱导第2天细胞样本；4为人成纤维细胞。
图8：A为人成纤维细胞，B为经重组蛋白诱导后形成干细胞样的细胞。
图9：pET 28b TAT v1质粒图谱。
具体实施方式
本发明人经过广泛的研究，通过选择合适的穿膜蛋白(优选反式激活蛋白)，结合蛋白转导技术，将一类蛋白(包括Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4)转入到细胞内。所述的穿膜蛋白与Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4分别融合后，可有效地将这些蛋白同时转入到细胞内，且良好地保留了它们的生物活性。
细胞穿透肽
如本文所用，所述的“细胞穿透肽”是指一类具有细胞穿透作用的多肽，其自身或其与其它蛋白的融合蛋白可通过细胞膜进入到细胞内。所述的细胞穿透肽包括：反式激活蛋白(TAT)、Penetratin、基于信号序列的肽、pVEC、Transportan、Amphiphilic model peptide和Arg9等。
作为本发明的特别优选的方式，所述的细胞穿透肽是TAT。TAT来源于人类免疫缺陷病毒(HIV)，其是HIV复制和基因表达所必须的，又称为反式激活因子。本发明人意外地发现，TAT可特别有效地将Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4导入到同一体细胞内。
作为本发明的优选方式，所述的TAT的氨基酸序列可以与SEQ ID NO：15所示的序列基本上相同；更佳的，TAT的核苷酸序列可以与SEQ ID NO：16所示的序列或其简并分子基本上相同。
转录因子
所述的细胞穿透肽，特别是反式激活蛋白(TAT)可将胚胎干细胞特异的转录因子携带到细胞内。所述的胚胎干细胞特异的转录因子可以是Oct4、Sox2、c-Myc、n-Myc、Klf4、Nanog或Lin28等。特别优选的，所述的胚胎干细胞特异的转录因子是Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4。
Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4等转录因子是本领域已知的胚胎干细胞特异的转录因子，例如可从人ES细胞基因组DNA中通过PCR扩增获得。Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4的序列分别参见GenBank登录号NM_013633(Oct4)、NM_003106(Sox2)、K02276(c-Myc)、NM_004235(Klf4)。
本发明还提供了一种融合蛋白，所述的融合蛋白含有胚胎干细胞特异的转录因子和TAT。
将胚胎干细胞特异的转录因子导入体细胞的方法
本发明还提供了将胚胎干细胞特异的转录因子导入体细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(1)将TAT与胚胎干细胞特异的转录因子融合，获得融合蛋白；(2)将(1)的融合蛋白与体细胞共孵育，从而胚胎干细胞特异的转录因子被导入体细胞内。优选的，所述的胚胎干细胞特异的转录因子是Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4。
尽管以往有利用TAT来携带某些蛋白进入细胞的先例，然而TAT并非适合于携带所有种类的蛋白进入到细胞，适合的蛋白受到蛋白长度、性质、空间结构等因素的限制。并且，针对同一细胞，TAT是否可同时将几种蛋白携带入细胞内且保留蛋白的功能或活性也是不可知的。
而本发明人特别意外地发现，所述的TAT分别与Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4融合后，构成4种融合蛋白，所述4种融合蛋白与体细胞共孵育后，可同时被转入到细胞内，从而使得细胞内同时存在该4种融合蛋白。并且，Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4在同时被导入到细胞后，仍然保留有作为转录因子的蛋白活性。
获得融合蛋白的方法包括：(a)提供一构建物，所述的构建物中含有一基因表达盒，所述基因表达盒含有以下操作性相连的元件：细胞穿透肽编码基因与胚胎干细胞特异的转录因子编码基因；(b)将(a)的构建物导入细胞表达系统，从而表达和纯化获得所述融合蛋白。
所述的细胞表达系统没有特别的限制，可以是原核表达系统或真核表达系统。作为本发明的一种优选方式，所述的细胞表达系统是原核表达系统，例如采用大肠杆菌系统表达。
作为本发明的优选方式，采用尿素变性方法对表达获得的融合蛋白包涵体进行变性，采用Ni-NTA亲和层析纯化。通常，尿素被溶解于缓冲液中制备成变性液，缓冲液的配制是本领域人员熟知的。较佳的，尿素的浓度是8±2mol/L；更佳的是8±1mol/L。
作为本发明的优选方式，在进行尿素变性前，用1±0.3(较佳的1±0.2；更佳的1±0.1)mol/L的尿素(含尿素的缓冲液)洗涤包涵体。在变性前洗涤包涵体可有效地去除杂蛋白，然而需要选择适合的洗涤液才能达到较好的杂蛋白去除效果。本发明人采用了多种浓度的尿素洗涤包涵体并比较杂蛋白的去除效果，结果发现采用含有1±0.3mol/L尿素的缓冲液洗涤可洗出最多的杂蛋白，效果最优异。
作为本发明的优选方式，在蛋白与亲和层析柱上的Ni离子结合后(即被吸附于亲和层析柱后)，采用250±50mmol/L咪唑(含咪唑的缓冲液)洗脱所述融合蛋白。本发明采用了含有多种浓度咪唑的缓冲液洗过所述融合蛋白，结果发现约250mmol/L咪唑洗脱效果最为理想，其使得4种重组蛋白均可获得特异性的纯化效果。
本发明还提供了采用所述将胚胎干细胞特异的转录因子导入体细胞的方法获得的细胞，所述的细胞表达胚胎干细胞标记分子。更特别的，所述的胚胎干细胞标记分子是Oct4、Nanog和Fgf4。
本发明还提供了一种诱导体细胞表达干细胞标记分子的方法，所述的方法包括以下步骤：(1)将细胞穿透肽(cell-penetrating peptide，CPP)与胚胎干细胞特异的转录因子融合，获得融合蛋白；(2)将(1)的融合蛋白与体细胞共孵育，从而融合蛋白进入体细胞内，诱导体细胞表达干细胞标记分子。
在本发明的实施例中，为检测所诱导的人成纤维细胞中干细胞标记的表达情况，本发明人利用RT-PCR分析了诱导后干细胞标记分子oct4、nanog和fgf4的表达情况，发现三种标记的均有表达且特征相同。
本发明的主要优点在于：
采用本发明的方法，在不向宿主细胞内引入外源基因、不改变受体细胞的基因组的情况下将外源蛋白导入细胞，从而更安全，更具有可控性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
I.试验材料
1.1菌种、细胞株和实验动物
人ES细胞获自上海第二医科大学健康科学研究所。
1.2质粒载体及引物
质粒pEGFP-N1，pcDNA 3购自Invitrogen公司，PCR引物合成及测序由上海英骏生物公司完成。质粒pET 28b TAT v1(下称pET)获自Howard HughesMedical Institute。
1.3主要试剂材料
各种限制性内切酶购自NEB公司，LB培养基及其琼脂购自Clontech公司，DMEM，DMEM/F12，L-Glu，FBS，胰酶，血清替代物购自Gibco公司，非必需氨基酸，bFGF，DMSO，青霉素，链霉素购自SIGMA公司，Taq酶购自Takara公司，其它普通化学试剂购自上海生工公司或invitrogen公司，各类细胞培养板(瓶)是Nunc和Costar公司的产品，各类因子抗体购自chemicon公司，其余辣根过氧化物酶标记的二抗购自鼎国生物工程有限公司。
1.4主要试剂的配制
LB培养基：
TE缓冲液(pH 8.0)：
1×TAE：
1×TBE：
质粒抽提溶液I：
质粒抽提溶液II：
质粒抽提溶液III：
SOB培养液：
退火缓冲液：
Ni柱再生缓冲液：
Tris-甘氨酸电泳缓冲液：
SDS-PAGE染色液：
SDS-PAGE脱色液：
TBS：
2×SDS上样缓冲液：
Western-blot转膜液：
TBST：
封闭液：
人成纤维细胞培养基础培液：
胚胎干细胞培养液：
PBS缓冲液：
II.实施例
实施例1.融合蛋白的克隆与表达载体构建
用Trizol试剂分别提取人ES细胞的总RNA，主要包括：氯仿抽提，异丙醇沉淀，75％乙醇洗涤，使沉淀完全溶于20μl RNase Free ddH2O水中。经OD260/OD280的比值(UV 754)和电泳检测结果检测RNA的纯度和质量，并计算RNA含量(RNAμg/ml＝OD260×40×稀释倍数)，样品置于-70℃保存。RNA质量分析见图1。
cDNA合成期间，反应体系中含3μg总RNA，4μl MgCl2(25mmol/l)，2μl 10×RNA PCR缓冲液，2μl dNTP Mixture，0.5μl RNA酶抑制剂(40U/μl)，1μl AMV逆转录酶(5U/μl)，1μl随机引物(Oligo dT)，以RNase Free ddH2O补至总体积为20μl，混匀，合成条件为50℃45min，99℃5min，然后终止反应。取2μl逆转录产物进行PCR反应，其余-20℃保存。
表1各因子PCR引物及双酶切位点
PCR扩增过程为：各取2μl cDNA模板，加入2μl MgCl2(25mmol/l)，2.5μl 10×RNA PCR缓冲液，0.25μl TaKaRa Taq聚合酶，上下游引物各1μl，以ddH2O补至总体积25μl。混匀离心后进行PCR反应。扩增25个循环。PCR反应条件为：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec，退火30sec，72℃延伸1min，共进行30循环；最后72℃延伸5min(引物序列和退火温度见表1)。PCR结果表明，获得了相应的与预期大小相符的目的片段，见图2。根据产物Qiagen公司回收试剂盒对PCR产物进行回收。
各因子回收产物经双酶切(酶切位点见表1)后，定向克隆入经过同样酶切的pET 28b TAT v1载体中，构成pET重组质粒(连接入Sox2、Oct4、C-myc、Klf4基因的重组载体分别称为pETs、pETo、pETc和pETk)。送测序鉴定，结果表明其中的人Oct4、Sox2、C-myc和Klf4基因序列与GenBank中相应的序列一致。
实施例2.蛋白原核表达
将实施例1中获得的pET重组质粒pETs、pETo、pETc和pETk分别转入大肠杆菌BL21(DE3)中，形成重组蛋白表达菌。
挑取含有目的质粒的菌落接种于4ml含有50mg/ml kana的LB培养基中，37℃，250rpm摇菌。当菌液浓度为OD600＝0.6-0.8，加入IPTG，使其终浓度分别为0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L，37℃，250rpm摇菌3、4或5h。取1ml菌液离心，10000rpm，1min，收集菌体后加入0.1ml预冷PBS重悬，保存以备检测。最终确定这四种蛋白的表达条件均为：IPTG终浓度为0.8mmol/L、37℃诱导4h。样品蛋白的SDS-PAGE分析，结果见图3。
挑取含有目的质粒的菌落接种于20ml含有50mg/ml kana的LB培养基中，37℃，250rpm摇菌过夜。按照1∶100接种过夜的含有目的质粒的菌液于含有50mg/ml kana的LB培养基，37℃，250rpm，3h。加入IPTG，使其终浓度为0.8mmol/l，37℃，250rpm摇菌3h，3000g，10min离心，收获菌体。用100ml预冷PBS重悬菌体，3000g，10min离心，收获菌体，如此重复3遍，菌体可储存于-80℃备用。
实施例3.蛋白的纯化
1、蛋白样品前期处理方法摸索
(1)每克细菌湿重加入3ml的裂解液。细菌裂解后，沉淀重新用原体积的裂解缓冲液悬起。
(2)分4管，取200μl，12,000g，4℃离心10min，收集沉淀，分别用裂解缓冲液含有1、2、3和4mol/l的尿素和0.5％Triton X-100，室温混匀10min。
(3)同上离心，收集沉淀，并重悬于200μl H2O中。上清保留，并进行SDS-PAGE分析。
(4)加入等体积的2×SDS-PAGE缓冲液。沸水煮5min后，进行SDS-PAGE分析，见图4。
2、Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白洗脱条件摸索
(1)将含有目的蛋白的菌体用预冷的裂解液2-5ml/g重悬，涡旋震荡；
(2)加入溶菌酶1mg/ml，冰上放置30min；
(3)将裂解的菌体放置在冰上，超声，强度60W，间隔2s，超声30min；
(4)10000g，30min，离心，取上清，置于冰上备用；
(5)用裂解缓冲液平衡柱子，0.5ml/min，使其光吸收平稳于基线处；
(6)取3)中的上清用0.45μm的过滤器过滤后上样，上样速度0.5ml/min；
(7)上样结束后，用裂解液洗柱子，去除未结合于介质以及结合力较弱的杂蛋白，直至紫外吸收值平稳，不再下降；
(8)同时用裂解液和缓冲液A洗柱子，从0-100％A梯度洗脱，0.5ml/min，洗脱总体积为50ml，收集所需洗脱液；
(9)100％A缓冲液继续洗脱直至紫外吸收值降到100mAU，合并大于250mAU的所有收集的洗脱液，其中即含有目的蛋白；
(10)用无菌去离子水冲洗5柱体积后用20％乙醇封柱，保存于4℃；
(11)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western-blotting检测各峰中的蛋白组分。
裂解液：
缓冲液A：
3、Ni-NTA目的蛋白变性纯化
(1)-(7)和上述相同，裂解液中含有8mol/l尿素，然后用梯度洗脱中最适宜的咪唑洗脱浓度来洗脱目的蛋白，至紫外吸收值降到100mAU，合并大于250mAU的所有收集的洗脱液，其中即含有目的蛋白。其余步骤与上述相同。见图5。
4、Ni柱再生
1)用2倍柱体积的再生缓冲液冲洗柱子；
2)5倍柱体积水冲洗柱子；
3)3倍柱体积2％SDS冲洗柱子；
4)1倍柱体积25％乙醇冲洗柱子；
5)1倍柱体积50％乙醇冲洗柱子；
6)1倍柱体积75％乙醇冲洗柱子；
7)1倍柱体积100％乙醇冲洗柱子；
8)1倍柱体积75％乙醇冲洗柱子；
9)1倍柱体积50％乙醇冲洗柱子；
10)1倍柱体积25％乙醇冲洗柱子；
11)1倍柱体积水冲洗柱子；
12)5倍柱体积0.1mol/l EDTA(PH＝8.0)冲洗柱子；
13)水冲洗柱子；
14)2倍柱体积0.1mol/l NiSO4冲洗柱子；
15)2倍柱体积水冲洗柱子；
16)2倍柱体积再生缓冲液冲洗柱子；
17)2倍柱体积适宜缓冲液冲洗柱子，后用于纯化。
5、盐沉法粗纯蛋白
1)用等体积的PBS稀释菌体裂解后的可溶蛋白；
2)缓慢加入饱和硫酸铵溶液，硫酸铵的最终饱和度分别为10％，15％，20％，25％，30％，40％，50％，60％和70％，混匀30min；
3)放入4℃冰箱沉淀过夜；
4)4℃，10000rpm离心30min；
5)吸除上清，将沉淀溶于最少量的PBS，分别检测上清与沉淀样品。
6、离子交换法纯化
1)用平衡液将离子交换柱平衡5柱体积，使其光吸收平稳于基线处
2)以1mL/min流速将样品泵入交换柱，以相同流速用平衡液冲洗柱子，去除未结合于介质以及结合力较弱的杂蛋白，约3柱体积后吸光度可平稳于基线
3)在平衡液中加入洗脱液形成盐浓度梯度用于洗脱结合于介质的蛋白，条件：流速1mL/min，盐浓度范围0.4～1mol/l NaCl，200min达到最大盐浓度。收集所有洗脱峰
4)4mol/l NaCl清洗层析柱
5)柱的还原与保养：待高盐溶液之后，用0.5mol/L NaOH清洗柱子，使介质上结合较紧的蛋白被变性洗出，并防止微生物留于柱内进行繁殖。
6)用无菌去离子水冲洗5柱体积后用20％乙醇封柱，保存于4℃
7)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western-blotting检测各峰中的蛋白组分
平衡液：
磷酸盐缓冲液：
配制时，常先配制0.2mol/L的NaH2PO4和0.2mol/L的Na2HP04，两者按一定比例混合即成0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，根据需要可配制不同浓度的PB。
0.2mol/L的NaH2PO4；称取NaH2PO4·2H2O 31.2g加重蒸水至1000ml溶解；
0.2mol/L的Na2HPO4；称取Na2HPO4·7H2O 53.65g加重蒸水至1000ml溶解。
7、纯化蛋白Western-blot鉴定
(1)SDS-PAGE电泳；
(2)转膜：由下往上依次排放3层Waterman 3mm滤纸(先用转膜缓冲液浸泡，大小：8.2cm×5.2cm)-硝酸纤维素膜(先用去离子水浸泡)-胶-3层Waterman 3mm滤纸(先用转膜缓冲液浸泡)，12V(＜15V)、100mA、45min条件下转膜。转膜后用丽春红染色，看转膜情况。将膜用TBST清洗两遍，每次5min；
(3)清洗过后的膜再用封闭液4℃过夜。取出膜用TBST冲洗三遍，每次5min；
(4)一抗反应：1.5μl一抗+5ml封闭液，温育1h，取出膜用TBST冲洗5min，重复2遍。二抗反应：1.5μl二抗+5ml封闭液，温育1h，取出膜用TBST冲洗5min，重复2遍；
(5)DAB(3，3-二氨基联苯胺，diaminobenzidine)一片(5mg)溶于10ml去离子水中，再加10μl 30％H2O2，用于显色。
观察四种蛋白的诱导表达结果，发现重组蛋白有很明显的特异表达，虽然绝大多数在包涵体中，但仍有部分以可溶形式存在，为了更好的保证目的蛋白纯化后的体外活性，决定首先对可溶性蛋白进行纯化。依据pET载体中含有一段his序列，所以本发明人选择了Ni-NTA亲和层析纯化。首先，本发明人首先用浓度为250mmol/l咪唑洗脱液进行洗脱，但是电泳分析表明没有起到目的蛋白的富集作用，洗脱峰里杂蛋白很多，没有纯化的效果。因此本发明人选用咪唑梯度洗脱进行纯化，试图找出目的蛋白合适的咪唑浓度进行洗脱，但是无论调整结合缓冲液中的咪唑浓度至5mmol/L、10mmol/L和15mmol/L，还是调整其pH至8.0和7.5的条件下，均不能使重组蛋白成功结合到介质上。随后调整菌体裂解条件，如添加溶菌酶(1mg/ml)、DNase(5ug/ml)和RNase(10ug/ml)等方法以提高菌体裂解效率或降低裂解液粘稠度等，也未能解决这一问题。随后本发明人对四种蛋白利用盐沉淀方法进行蛋白粗纯，虽然Sox2蛋白在硫酸铵浓度为10％有较好的纯化效果，但在10％-70％的硫酸铵浓度范围内，Klf4和C-myc完全没有粗纯效果。从蛋白的等电点入手，两个等电点偏碱性蛋白Sox2和Klf4，其等电点分别为9.74和8.76，利用SP阳离子交换层析用来纯化这两种蛋白，但发现缓冲液pH在5.0、6.0、7.0和8.0的等各种结合条件下，重组蛋白均大量从流穿液中穿出，不能特异与介质相结合。
鉴于上述实验结果，无论本发明人怎么改变实验条件，始终无法从可溶状态纯化出目的蛋白，因此最终选择以尿素变性方法进行目的蛋白的纯化，发现在变性条件下，重组蛋白能够很好的与Ni离子结合。首先，对包涵体进行前期处理，用含1、2、3和4mol/L尿素的裂解缓冲液洗涤，除去杂蛋白，最好的洗缓冲液为洗涤上清中含有最多的杂蛋白，很少或无目的蛋白。电泳结果，发现1mol/l尿素洗涤样品时上清中的目的蛋白最少，起到了洗除杂蛋白的作用，且效果最好。样品前期处理之后，利用咪唑浓度线性梯度分别对四种蛋白的咪唑洗脱浓度进行确定，发现咪唑浓度为250mmol/l时，四种重组蛋白(TAT-Oct4、TAT-Sox2、TAT-C-myc和TAT-Klf4)均可获得特异性的纯化效果，结果见图5。
实施例4.蛋白的复性
1.在柱复性
1)通过变性纯化方法将含有His标签的重组蛋白吸附在Ni-NTA介质上；
2)尿素浓度线性递减的平衡液冲洗，尿素浓度从8mol/l递减至0mol/l，流速为0.3ml/min，共10柱体积；
3)用缓冲液(20mmol/l Na3PO4，0.5mol/l NaCl，250mmol/l咪唑，pH 7.5)洗脱，经超滤浓缩，缓冲液替换为(20mmol/l Na3PO4，0.5mol/l NaCl，10％甘油，pH 7.5)，-20℃保存。
2.透析复性
1)4℃下变性纯化的重组蛋白蛋白依次经含4mol/l、2mol/l、1mol/l、0mol/l尿素的50倍体积透析缓冲液透析，时间间隔为3h。
2)用不含尿素的透析液中过夜透析，次日收集蛋白，-20℃保存。
透析缓冲液：
3.目的蛋白浓缩
超滤浓缩：将目的蛋白放入millipore MWCO 10000的超滤管中3000g离心30min，管内约余1-2ml蛋白溶液后，吸出蛋白溶液，-80℃保存；
PEG浓缩：将目的蛋白放入透析袋中，将其埋入PEG8000中，每过1h观察，待袋内剩余体积适当时将其中液体吸出，-80℃保存。
4.目的蛋白的定量
蛋白浓度测定参照《DC Protein Assay Instruction Manual》。
1)取标准浓度的BSA样品，依次稀释至5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml、0.313mg/ml。再依次取无菌去离子水及1×，2×，4×蛋白样品；
2)在以上各溶液中分别加入0.05ml试剂A，再分别加入0.4ml试剂B，立刻混合均匀。室温静置15min。测定以上各溶液在750nm处的吸光度值；
3)根据标准浓度蛋白的吸光度绘制标准曲线，得其线性方程后计算蛋白溶液稀释2倍，4倍时浓度，最终换算成蛋白浓度。
根据DC蛋白定量，测得四种融合蛋白TAT-Oct4、TAT-Sox2、TAT-C-myc和TAT-Klf4的浓缩后的浓度分别为0.5mg/ml，0.4mg/ml，0.4mg/ml和0.8mg/ml。
实施例5.重组蛋白诱导效果分析
1、蛋白转导细胞实验
1)复苏人成纤维细胞；
2)将重组蛋白(TAT-Oct4、TAT-Sox2、TAT-C-myc和TAT-Klf4)加入细胞培养基，浓度均为2μmol/l，在细胞间超净工作台上，0.22μm的过滤器过滤除菌；
3)成纤维细胞长至50-60％满，PBS洗3遍后，加入2)所得培养基。37℃，5％CO2处理3h。3h后去除含有目的蛋白的培养基，用PBS洗三遍，加入人ES的细胞培养基，37℃，5％CO2培养；
4)观察并收集培养不同天数的细胞样品以备检测。
2、细胞检测试验
A.形态观察：每天观察细胞，并照相记录；
B.基因检测：将收集不同天数的细胞样品，用Trizol法进行RNA提取，1ml Trizol/105个细胞，方法同前，并将RNA逆转录为cDNA，以此为模板进行ES细胞标志性因子(Oct4，Nanog，Fgf4)的检测，检测所需引物见表2。
C.蛋白检测：细胞计数后，每个样品为105个细胞。离心样品，10000rpm，3min。50μl预冷PBS重悬，加入2×SDS上样缓冲液，超声，强度20，间隔2s，超声1min，95℃处理10min，取10μl上样。SDS-PAGE步骤同前。
表2引物序列表
| 序列 | SEQ IDNO： | |
| R oct4-5 | GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG | 9 |
| R oct4-3 | CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC | 10 |
| R nanog-5 | CAGCCCCGATTCTTCCACCAGTCCC | 11 |
| R nanog-3 | CGGAAGATTCCCAGTCGGGTTCACC | 12 |
| R fgf4-5 | CTACAACGCCTACGAGTCCTACA | 13 |
| R fgf4-3 | GTTGCACCAGAAAAGTCAGAGTTG | 14 |
细胞实验：本发明人分别收集了蛋白处理后的细胞样品，经RNA提取，逆转录后进行ES标志基因的PCR检测，结果如图6。经RT-PCR分析，诱导后的人成纤维细胞内可检测到干细胞标记分子Oct4、Nanog和Fgf4的表达，本发明人发现在选取的两个时间样本里，细胞在转导后第2天时，并没有检测到标志基因的表达，但是另外一个转导后第6天的细胞样本却已经可以检测到3种基因的明显表达，且3种标记的表达特征相同，此特征和对照ES细胞相同，见图6。
同时，将细胞进行蛋白电泳同样可以明显观察到蛋白表达也发生了改变，见图7。
继续培养细胞发现当20余天时，细胞形态变化明显，特征有：细胞贴壁性能降低，细胞形态由长锁型转变为圆形，细胞开始聚集成团，见图8。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>上海转基因研究中心；上海杰隆生物工程股份有限公司
<120>一种利用穿透型干细胞转录因子诱导体细胞重编程的方法
<130>083018
<160>16
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>1
atggatccca tggcgggaca cctggcttcg gat 33
<210>2
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>2
atgtcgacag ggcaggcacc tcagtttgaa tgc 33
<210>3
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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atggatcccc gcatgtacaa catgatggag acg 33
<210>4
<211>33
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<220>
<221>misc_feature
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<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
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atggatccca tggctgtcag cgacgcgctg ctc 33
<210>8
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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acaagcttgt gtgggtcata tccactgtct ggg 33
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<211>24
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<211>26
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<220>
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<220>
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<211>25
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<213>人工序列
<220>
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<223>引物
<400>12
cggaagattc ccagtcgggt tcacc 25
<210>13
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>13
ctacaacgcc tacgagtcct aca 23
<210>14
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>14
gttgcaccag aaaagtcaga gttg 24
<210>15
<211>24
<212>DNA
<213>人免疫缺陷病毒
<400>15
aggaagaagc ggagacagcg acga 24
<210>16
<211>8
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>16
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg
1 5
Claims (7)
1.一种将胚胎干细胞特异的转录因子导入体细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将细胞穿透肽与胚胎干细胞特异的转录因子融合，获得融合蛋白；
(2)将(1)的融合蛋白与体细胞共孵育，从而胚胎干细胞特异的转录因子被导入体细胞内；
并且，所述的转录因子选自：Oct4、Sox2、c-Myc、或Klf4；
所述的细胞穿透肽是反式激活蛋白。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的反式激活蛋白的羧基端与胚胎干细胞特异的转录因子的氨基端融合。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述获得融合蛋白的方法包括：
(a)提供一构建物，所述的构建物中含有一基因表达盒，所述基因表达盒含有以下操作性相连的元件：细胞穿透肽编码基因与胚胎干细胞特异的转录因子编码基因；
(b)将(a)的构建物导入细胞表达系统，从而表达和纯化获得所述融合蛋白；
并且，所述的转录因子选自：Oct4、Sox2、c-Myc、或Klf4；
所述的细胞穿透肽是反式激活蛋白。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，采用原核细胞表达系统表达所述的融合蛋白，采用0.8±0.2mmol/L异丙基β-D硫代半乳糖苷，32±2℃诱导4±2小时。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，采用尿素变性方法对表达获得的融合蛋白包涵体进行变性，采用Ni-NTA亲和层析纯化；并且：
在进行尿素变性前，用1±0.3mol/L的尿素洗涤包涵体；或
采用250±50mmol/L咪唑洗脱所述融合蛋白。
6.一种利用权利要求1所述的方法获得的细胞。
7.一种诱导体细胞表达干细胞标记分子的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
(1)将细胞穿透肽与胚胎干细胞特异的转录因子融合，获得融合蛋白；
(2)将(1)的融合蛋白与体细胞共孵育，从而融合蛋白进入体细胞内，诱导体细胞表达干细胞标记分子；
并且，所述的转录因子选自：Oct4、Sox2、c-Myc、或Klf4；
所述的细胞穿透肽是反式激活蛋白。
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