CN101590018A - 依托泊苷固体脂质纳米粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种可用于注射和口服的依托泊苷固体脂质纳米粒。它的特点是用脂质材料、乳化剂将依托泊苷包封制得粒径小、包封率高、稳定性好、毒性低的依托泊苷固体脂质纳米粒。本发明制备的依托泊苷固体脂质纳米粒提高了依托泊苷的溶解度和稳定性，并降低其血管刺激性，延长药物在血液中的循环时间，从而提高了药物的疗效，使本固体脂质纳米粒制成的制剂在临床应用上具有低毒性、低刺激性和高效性的特点。本发明还涉及依托泊苷固体脂质纳米粒的制备方法，该制备工艺简单、成本低廉，适合工业化生产。

Description

依托泊苷固体脂质纳米粒及其制备方法

技术领域

本发明属于药剂学领域，具体涉及含有抗肿瘤活性成分依托泊苷的固体脂质纳米粒及其制备方法。

背景技术

固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles，SLN)是在20世纪90年代初发展起来的一种可替代乳剂、脂质体和聚合物纳米粒的新型胶体给药系统，它是以天然的或人工合成的脂质材料为载体，将药物吸附或包裹于脂质材料中制成的纳米给药体系。它所含有的脂质成分机体可利用、可生物降解，与聚合物纳米粒相比，它的毒性更低。与脂质体相比，由于药物被包封在脂质骨架中，不存在药物在贮存过程中的泄漏问题。SLN还具有缓释、控释、靶向作用。SLN的水分散系统可以进行高压灭菌或辐射灭菌，具有长期的物理化学稳定性，也可通过冷冻干燥或喷雾干燥制成固体制剂，同时，可采用高压均质机进行制备，实现工业化生产。

依托泊苷为鬼臼毒素的糖代谢产物，属于细胞周期特异性抗肿瘤药物，具有广谱抗癌活性和相当高的治疗指数，主要用于治疗肺癌、淋巴癌、急性白血病、睾丸癌，尤其对早期扩散、预后恶劣的小细胞癌症效果良好，是治疗小细胞肺癌和睾丸癌的最强活性单体。依托泊苷通过抑制哺乳类动物DNA拓扑异构酶II的活性发挥抗肿瘤效应，是拓扑异构酶的嵌入性抑制剂，它作用于DNA拓扑酶，使单链或双链DNA断裂，双链DNA断裂数是单链断裂数的2-3倍，表明细胞毒性机制是该药的作用机制，这使该药的毒副作用也很大，其主要毒性为骨髓抑制、嗜中性白细胞的严重减少、恶心呕吐等消化道毒性、过敏反应如寒战、发热、心动过速、支气管痉挛、呼吸困难和低血压等。

目前，用于临床的依托泊苷有两种剂型：注射液和口服软胶囊，剂量为每支50-100mg和每粒50-100mg。血管给药的剂量是每3-5天300-600mg/m²。临床上使用的注射液是采用无水乙醇及聚乙二醇400等助溶剂制备的非水溶液系统，患者用药后对血管刺激性大，且聚乙二醇易透过人红细胞膜使红细胞变性和溶血，易引起血压下降或支气管痉挛，甚至可致死亡；该注射液静脉给药时，一般先用生理盐水稀释，由于其在5％葡萄糖溶液中不稳定，可能析出形成细微沉淀，造成病人局部血管堵塞；口服软胶囊的应用限于非急症患者，其绝对生物利用度低，仅50％，血中浓度仅为静脉注射的52±8％，不同患者之间口服生物利用度差异大(25％-75％)，主要原因是依托泊苷的水溶性差及在酸性和碱性介质中分解成无活性产物，为延长有效血药浓度，势必要增加服药次数或增大服药剂量，导致毒副作用增加。

为使依托泊苷更好发挥临床疗效，提高其抗肿瘤活性和稳定性，降低其刺激性和毒副作用，国内外药学工作者致力于依托泊苷新给药系统的研究和开发。中国专利文献(申请号：200610109406.9)公开了依托泊苷静脉注射乳剂，获得高生物利用度和抗肿瘤效果；唐星等人(申请号：200610169149.8)将依托泊苷包裹于油相和界面膜中制备成依托泊苷脂微球注射液，提高了依托泊苷的稳定性，降低了其血管刺激性及毒性，增强其疗效；中国专利文献(申请号：200410101404.6)公开了一种依托泊苷的药物组合物，含有机酸、聚乙二醇、丙二醇、赋性剂，将此药物组合物制备成冻干粉针，增强了依托泊苷的稳定性，改善现有剂型的不足；也有单位研制了依托泊苷的肠溶缓控释固体分散体制剂(专利号：ZL02153962.6)，该制剂临床疗效好，毒副反应低，口服生物利用度高。尽管对依托泊苷制剂的研究取得了长足进展，但目前这些新剂型多数处于实验室的研究阶段，大都不符合用药的安全性和工业化生产的要求，至今未见上临床、上市的报道。因此，急需寻求一种有效的制剂，可以提高药物的稳定性、溶解度及抗肿瘤效果，减少药物的血管刺激性和毒副作用，增强依托泊苷的临床应用性。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种性质稳定且可采用现有技术工业化生产的依托泊苷固体脂质纳米粒，本发明将依托泊苷包裹于内脂核中，增加了依托泊苷的水溶性，阻止药物析出，具有长期物理化学稳定、可控制药物释放、靶向定位释放等优点，既能消除现有制剂的血管刺激性，减少依托泊苷自身的毒性反应，又能提高依托泊苷的生物利用度及其治疗指数；

本发明的另一目的是提供上述依托泊苷固体脂质纳米粒的制备方法，而且制备方法灵活多样，均采用常规的工艺设备，可工业规模、高效率生产，产品质量保持稳定，可直接或二次加工制备注射或口服制剂。

本发明的又一目的是提供一种依托泊苷固体脂质纳米粒固体制剂，该固体制剂是上述依托泊苷固体脂质纳米粒加入支架剂并采用冷冻干燥或喷雾干燥的工艺制成的。

本发明的再一目的是提供一种依托泊苷注射剂或口服制剂，其是由上述的依托泊苷固体脂质纳米粒制备而成的。

本发明的依托泊苷固体脂质纳米粒由包含以下重量份的原料制备而成：

依托泊苷：1份

脂质材料：5-60份

乳化剂：4-50份。

优选地，本发明的依托泊苷固体脂质纳米粒由包含以下重量份的原料制备而成：

依托泊苷：1份

脂质材料：5-50份

乳化剂：4-30份。

上述的脂质材料是指在SLN中作为载体材料、生物相容性好、且室温下呈固态或液态的类脂材料，选自甘油脂(单硬脂酸甘油酯、双硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、三肉豆蔻酸甘油酯、单棕榈酸甘油酯、双棕榈酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯、单山嵛酸甘油酯、双山嵛酸甘油酯、三山嵛酸甘油酯、三月桂酸甘油酯、三油酸甘油酯及其混合物)、脂肪酸(硬脂酸、棕榈酸、山嵛酸、癸酸及其混合物)、类固醇(胆固醇)、蜡脂(鲸蜡醇棕榈酸酯、鲸蜡醇十六酸酯、微晶石蜡及其混合物)、十八醇及其混合物。

所述的乳化剂是具有乳化、稳定、分散作用的药用辅料，可以为脂溶性乳化剂和水溶性乳化剂，选自磷脂、胆酸盐、脱氧胆酸盐、短链醇、泊洛沙姆、聚山梨醇酯、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯脂肪酸酯及其混合物。其中磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺及大豆磷脂、卵磷脂和氢化卵磷脂及其混合物；胆酸盐选自胆酸钠、甘胆酸钠和牛磺胆酸钠及其混合物；脱氧胆酸盐选自脱氧胆酸钠和脱氧牛磺胆酸钠及其混合物；短链醇选自甘油和丙二醇及其混合物；泊洛沙姆优选Poloxamer-108和Poloxamer-188及其混合物；聚山梨醇酯优选吐温-80；聚氧乙烯脂肪醇醚优选Brij 78、Brij 35和Brij 30及其混合物；聚氧乙烯脂肪酸酯优选Myrj 53和Myrj 59及其混合物。

所述的依托泊苷固体脂质纳米粒的粒径小于1000nm，优选粒径小于500nm。

本发明提供上述依托泊苷固体脂质纳米粒的制备方法。

该制备方法可以使用以下几种方法中的任意一种：

方法一：乳化-沉淀法制备，称取处方量的依托泊苷、脂质材料、脂溶性乳化剂溶于有机溶剂得有机相，称取水溶性乳化剂溶于水中得水相；有机相和水相分别加热至相同温度，搅拌下将有机相和水相混合，减压蒸发除去有机溶剂，进行超声或高压均质处理，即可得到固体脂质纳米粒。或

方法二：乳化挥发-低温固化法制备，即将依托泊苷、脂质材料、脂溶性乳化剂按比例溶于有机溶剂得有机相；称取水溶性乳化剂溶于水中得水相；有机相和水相分别加热至相同温度，搅拌下将有机相和水相混合，减压蒸发除去有机溶剂，并使体系浓缩，将浓缩液迅速混于2-50倍体积的0-4℃低温水相中，搅拌降温，然后可进行超声或高压均质处理得到依托泊苷固体脂质纳米粒。或

方法三：薄膜-分散法制备，称取处方量的依托泊苷、脂质材料、脂溶性乳化剂溶于有机溶剂中，在20-60℃水浴中减压蒸干成膜，加入一定量含水溶性乳化剂的水溶液，超声或高压均质即得到依托泊苷固体脂质纳米粒。或

方法四：热熔分散法制备，称取处方量的依托泊苷、脂质材料、脂溶性乳化剂在60-90℃下加热至熔融，作为油相。将水溶性乳化剂溶于水中加热至相同温度作为水相。在搅拌下将油相、水相混合，经超声或高压均质，即可制得固体脂质纳米粒。

上述制备方法中所述的有机相和水相温度为20-80℃，优选温度为60-80℃；所说的有机溶剂选自氯仿、乙醚、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮中的一种及其混合溶剂；为减小固体脂质纳米粒的粒径，可采用超声或高压均质工艺。其中，超声功率为100-1000W，超声时间为10-40min；高压均质压力为10000-25000psi，高压均质次数为3次-10次。

为延长依托泊苷固体脂质纳米粒的存放时间，便于运输，可将本发明的依托泊苷固体脂质纳米粒通过喷雾干燥或冷冻干燥工艺制成固体制剂；为防止干燥工艺中固体脂质纳米粒的聚集需加入支架剂，可以选择的支架剂为氨基酸、麦芽糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖、海藻糖、阿拉伯胶、木糖醇、山梨醇、果糖及其混合物，其用量按脂质材料和乳化剂总重量计为1份总重量加入0.05-4份冻干支架剂。

本发明的依托泊苷固体脂质纳米粒能够以注射或口服方式给药，其中注射方式可以为静脉输注、静脉注射，优选静脉输注方式给予患者。

本发明以脂质材料为载体材料将依托泊苷制成具有适宜粒径的固体脂质纳米粒，不仅增加药物的稳定性，提高药物在载体中的分散程度和生物利用度，而且可以改变药物的体内过程，增加靶向性。选择口服给药，依托泊苷固体脂质纳米粒可以增强对肠道内皮细胞的亲和性并可通过细胞内吞、融合和派伊尔结转运等途径吸收，有效提高生物利用度；通过注射给药，依托泊苷固体脂质纳米粒可以提高血药浓度，延长药物在血液中的循环时间，且具有靶向性，能选择性到达病变部位、组织或细胞，从而提高药物的治疗指数，减少毒副作用。

采用本发明方法所制备的依托泊苷固体脂质纳米粒不使用聚乙二醇和乙醇等溶剂，不仅能降低血管刺激性和毒副作用，而且可以提高药物化学稳定性和疗效，因而具有一定创新性和实用性；其平均粒径在1000nm以下，包封率大于80％；所得制剂稳定性好；且该制剂制备工艺成熟，方法简便易行，材料来源广，成本低，便于工业化生产。

附图说明

图1为依托泊苷固体脂质纳米粒中药物释放图。

具体实施方式：

下面再以实施例对本发明作进一步说明，给出本发明的实施细节。

实施例1：

称取100mg依托泊苷、500mg硬脂酸和500mg卵磷脂溶于20ml的二氯甲烷中，在50℃下减压蒸干，形成脂质膜，加入10ml的吐温-80(2.5％)，超声分散30min(超声功率600W)，即得固体脂质纳米粒混悬液，于2℃保存备用。其平均粒径为230nm，全部粒子均在500nm以下，粒径分布狭窄，表明固体脂质纳米粒大小较为均一；该固体脂质纳米粒混悬液可在室温下稳定数天并在4℃下稳定12个月，贮存期间观察不到沉淀。

实施例2：

称取100mg依托泊苷、800mg单硬脂酸甘油酯、500mg大豆磷脂加入50ml具塞锥形瓶中，加10ml乙醇∶丙酮(1∶1)混合溶剂，超声使其充分溶解并加热至75℃，构成有机相。另取200mg Poloxamer-188溶于30ml重蒸水中，构成水相。用注射器将有机相缓慢注入1000r/min搅拌的75℃水相中，继续搅拌至形成半透明体系。40℃下减压蒸发除去有机溶剂，降至室温，得到固体脂质纳米粒混悬液。

实施例3：

取200mg依托泊苷、2000mg三棕榈酸甘油酯、400mg十八醇、600mg二棕榈酰磷脂酰胆碱溶解于乙醇10ml，超声溶解并加热至(80±2)℃构成有机相。另取1000mg myrj53加入30ml双蒸水中，超声使其充分溶解，构成水相。将有机相缓慢注入1000r/min搅拌的(80±2)℃的恒温水相中形成初乳，继续搅拌约2～3h，使有机溶媒完全蒸发并使体系浓缩至约5ml。将所得的半透明乳剂快速混于另一0～2℃的1000r/min搅拌的15ml冰水相中，继续搅拌2小时，然后于高压均质机中乳匀5次(均质压力为15000psi)，即得固体脂质纳米粒混悬液。

实施例4

取300mg依托泊苷、4000mg山嵛酸、500mg胆固醇、3000mg二硬脂酰磷脂酰甘油置于25ml梨形瓶中，于(75±2)℃的恒温水浴上加热使其充分熔融，构成油相；另取500mg胆酸钠溶于10ml水中，水浴加热至与有机相相同的温度，构成水相。将油相在1000r/min搅拌下注入水相中，搅拌4h，温度保持在(75±2)℃，形成O/W型初乳。将所得乳剂在搅拌(1000r/min)下快速混于0～2℃20ml水中，继续搅拌2h，然后于800W功率下超声处理30min，即得固体脂质纳米粒混悬液。

实施例5：

称取200mg依托泊苷、5000mg三月桂酸甘油酯、1200mg二棕榈酰磷脂酰丝氨酸混合均匀，85℃加热使熔融，作为油相。将600mg脱氧胆酸钠、800mg甘油加注射用水40ml，搅拌溶解，迅速加热到85℃作为水相。在搅拌下将水相趁热滴加到同温度油相中，20000rpm下高速搅拌30min后改用超声分散，室温，功率600W，超声时间10min，即制得依托泊苷固体脂质纳米粒混悬液。

实施例6

称取200mg依托泊苷、6000mg三肉豆蔻酸甘油酯、1000mg二油酰磷脂酰胆碱混合均匀，85℃加热使溶解，作为油相。将1000mg脱氧牛磺胆酸钠、1000mg丙二醇加注射用水40ml，搅拌溶解，迅速加热到85℃作为水相。在搅拌下将水相趁热滴加到同温度油相中，继续搅拌1h后，转至高压均质机中，经20000psi压力乳匀10次，即可制得依托泊苷固体脂质纳米粒混悬液。

实施例7

精密称取依托泊苷300mg、双山嵛酸甘油酯3000mg、3000mg氢化卵磷脂，600mg二月桂酰磷脂酰胆碱于1000ml圆底烧瓶中，加入50ml氯仿溶解，40℃下旋转蒸发除去氯仿，在烧瓶壁上形成一层薄膜。加入5％甘胆酸钠溶液20ml，600W功率下水浴超声20min，即得依托泊苷固体脂质纳米粒。

实施例8

称取依托泊苷300mg、三油酸甘油酯4000mg、鲸蜡醇十六酸酯1000mg、二硬脂酰磷脂酰胆碱3000mg，在通氮气条件下加热至(80±5)℃，然后在搅拌条件下加入相同温度含0.5％甘油和0.5％牛磺胆酸钠的水溶液20ml，制成粗乳；在(80±5)℃通氮气条件下在高压乳匀机上25000psi压力下乳匀5次，充氮气分装后，迅速冷却形成固体脂质纳米粒混悬液。在4℃密封保存，供试验用。

实施例9

称取二油酰磷脂酰乙醇胺3g、棕榈酸6g和依托泊苷0.3g加入10ml乙醚超声使之溶解完全，然后在磁力搅拌下用6号针头注入30ml 0.5％brij78溶液中。1000rpm搅拌30min后，转移至旋转蒸发仪中，42℃旋转减压蒸发除去有机溶剂，直至形成乳白色悬浊液，加入山梨醇2g、甘氨酸1g经超声处理(超声功率600W)20min，药液于喷雾干燥机中干燥，喷雾干燥条件为：进风温度120℃，进料速度50ml/min，旋风分离器压差50mm水，雾化盘转速2500r/min，收集得到依托泊苷固体脂质纳米粒喷雾干燥制剂。

实施例10

精密称取Poloxamer-1080.4g、甘油0.2g，在高速磁力搅拌条件下，加入到已加热至(60±5)℃的10ml蒸馏水中，待完全溶解作为水相；另称双硬脂酸甘油酯5g、二棕榈酰磷脂酰甘油0.4g、依托泊苷0.1g加热熔融作为油相；将油相缓慢滴加至水相中，高速剪切(Fluko，12000rpm)5min，制成O/W型乳剂后，改用水浴式超声仪超声分散(室温，功率600W，超声时间20min)，即得乳光明显的澄明的固体脂质纳米粒混悬液。加入1.5g甘露醇和1g葡萄糖超声溶解，于-40℃预冻6h后，以-40℃，8h；-30℃，8h；-20℃，8h；-10℃，6h；20℃，8h的程序冷冻干燥，即得依托泊苷固体脂质纳米粒冻干制剂。

实施例11

精密称取单棕榈酸甘油酯300mg、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺400mg、依托泊苷50mg，加入乙酸乙脂10ml，超声使完全溶解。将所得的混合物溶液加入到含1％brij 35溶液20ml中，高速搅拌(20000rpm)5min，得SLN混悬液。加入1000mg乳糖、500mg葡萄糖、500mg海藻糖超声溶解后，于微型喷雾干燥器中喷雾干燥(进口温度130-140℃，出口温度50-60℃，空气压力1.2Atm，加料速度60ml/min)，即得依托泊苷固体脂质纳米粒喷雾干燥制剂。

实施例12

取依托泊苷300mg、双棕榈酸甘油酯3000mg、癸酸1000mg和甲醇∶丙酮(1∶1)20ml加入25ml梨形瓶中，超声使其充分溶解，加入3000mg二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱，微热使溶成有机相。另取500mg mrij59溶于水20ml中构成水相。将有机相在(1000r/min)搅拌下注入(75±2)℃的水相中，继续搅拌4h，使有机溶媒完全蒸发并使体系浓缩至约5ml。将所得的半透明体系搅拌下(1000r/min)快速混于另一0～2℃的15ml水相，继续搅拌2h，即得依托泊苷固体脂质纳米粒混悬液。该混悬液加入1000mg阿拉伯胶、2000mg甘露醇超声溶解后，于-40℃预冻6小时，于冷冻干燥机中冻干，冻干程序为-40℃，8小时；-30℃，6小时；-20℃，6小时；-10℃，5小时；0℃，5小时；15℃，5小时。

实施例13

称取依托泊苷300mg、三山嵛酸甘油酯4000mg、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺1000mg，在通氮气条件下加热至(80±5)℃，然后在搅拌条件下加入相同温度含0.5％甘油和0.5％吐温-80的水溶液20ml，制成粗乳；在(80±5)℃通氮气条件下在高压乳匀机(Avestin，C5)上10000psi压力下乳匀5次，形成固体脂质纳米粒混悬液。该混悬液加入3000mg木糖醇、2000mg果糖于-40℃预冻10小时，于冷冻干燥机(labconco)中冻干(冻干程序为-40℃，10小时；-20℃，8小时；0℃，8小时；20℃，5小时)，即得依托泊苷固体脂质纳米粒冻干制剂。

实施例14

取实施例3中所述的依托泊苷固体脂质纳米粒进行理化性质研究。

取依托泊苷固体脂质纳米粒混悬液适量，加水稀释，然后滴加在覆盖碳膜的铜网上，在透射电镜下观察纳米粒形态并拍摄照片。

另取依托泊苷固体脂质纳米粒样品，加水稀释到适量，用激光散射粒度测定仪在温度25℃、波长633.0nm条件下的粒径。

结果：电镜下观察固体脂质纳米粒呈类球形实体粒子，且粒径均匀，无聚集和粘连。

实验测得的依托泊苷固体脂质纳米粒的粒径分布较窄，平均粒径为130nm。

实施例15

实施例3中依托泊苷固体脂质纳米粒包封率测定

依托泊苷固体脂质纳米粒混悬液经超滤结合高速离心法(膜截留分子量10000D，4000rpm，10min)分离游离的依托泊苷，用RP-HPLC测定游离依托泊苷含量。色谱条件如下：色谱柱：Inertsil ODS23柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-pH值4.0醋酸盐缓冲液(32∶68)；柱温：25℃；检测波长：254nm；流速：1.0ml/min；进样20μl，按下列公式计算包封率。

包封率＝(1-M_游离/M_总)×100％。

结果：测得固体脂质纳米粒的包封率为87.36％。

实施例16

实施例4中依托泊苷固体脂质纳米粒包封率测定

包封率通过葡聚糖凝胶柱层析法结合HPLC测定。层析条件为：Sephadex-G50柱(30cm×2cm)，洗脱液为蒸馏水，流速1ml/min，室温下层析。移取固体脂质纳米粒混悬液0.5ml上柱，以柱层析条件洗脱，每2ml收集1管，被包封药物量采用高效液相色谱测定。色谱条件如下：色谱柱：Inertsil ODS23柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-pH值4.0醋酸盐缓冲液(32∶68)；柱温：25℃；检测波长：254nm；流速：1.0ml/min；进样20μl，按下列公式计算包封率。

包封率＝(M_包/M_总)×100％

式中，M_包表示被固体脂质纳米粒包封的药物量，M_总表示固体脂质纳米粒中的总含药量。

结果：测得固体脂质纳米粒的包封率为85.44％。

实施例17

实施例5中依托泊苷固体脂质纳米粒理化性质研究。

1、形态学研究

取少量固体脂质纳米粒混悬液滴加在覆盖碳膜的铜网上，用2.0％磷钨酸钠溶液染色，在透射电镜下观察粒径大小和形态并拍摄照片，可见其外观为圆整的球形。

2、粒径和Zeta电位测定

取固体脂质纳米粒混悬液适量加水稀释，用多功能Zeta电位粒度分析仪在633.0nm下测定粒径、粒度分布及Zeta电位。结果：测得样品的平均粒径为251.2nm，多分散指数为0.181；平均Zeta电位-25.6mV。

3、包封率考察

取固体脂质纳米粒混悬液1ml进行低温超速离心(4℃，12000rpm，60min)，精密量取上清液0.5ml，甲醇稀释定容至10ml，用高效液相色谱法测定得依托泊苷的峰面积为A_游，同法将固体脂质纳米粒混悬液稀释后测得依托泊苷的峰面积为A_总。

包封率(％)＝(1-A_游/A_总)×100％

结果：测得依托泊苷固体脂质纳米粒的包封率为84.50％。

实施例18

取实施例6中的依托泊苷固体脂质纳米粒在4、25℃下放置四周，于0、8、12、16、20、24和28天取样，用HPLC法测定依托泊苷含量，其含量测定方法为：取固体脂质纳米粒混悬液0.5ml于10ml容量瓶，甲醇定容，进样测定，以外标法计算依托泊苷含量。结果见表1。

表1

结果表明，依托泊苷固体脂质纳米粒在4℃放置一个月，含量基本不变；在室温条件下存放1月，含量下降近2％，表明依托泊苷固体脂质纳米粒稳定性较好。

实施例19

取实施例6中的依托泊苷固体脂质纳米粒混悬液放置于室温和4℃冰箱内，观察1个月、3个月、5个月、6个月时其外观及4000r/min离心15min混悬液是否出现分层或沉淀。

结果表明，放置于4℃冰箱内的样品，6个月内无沉淀及药物结晶析出，且4000r/min离心15min未出现分层现象，表明该体系具有一定的稳定性。而室温下的部分样品5个月时出现少量沉淀，部分敞口于空气中的样品表面出现小片灰褐色霉斑。

实施例20

取实施例9中的依托泊苷固体脂质纳米粒喷雾干燥制剂加水10ml分散，转至透析袋(截留分子量10000)中，置于250ml pH7.4磷酸盐缓冲液中，(37±0.5)℃，100rpm磁力搅拌，定时吸取介质6ml，加氯仿4ml，充分提取，离心，吸取氯仿层，将其挥干，加入甲醇4ml溶解，测定吸光度，并按标准曲线方程计算累积释放百分率。结果见图1。

结果表明，在释放条件下，前10小时释药速率较快，随后释放速度减慢，经过48小时药物释放约84％，表明依托泊苷制成固体脂质纳米粒后具有缓释效果。

实施例21

取实施例10中的冻干品适量，密封，于冰箱4℃放置，于0、1、2、3、6、12月对粒径、包封率、含量等指标进行测定，评价依托泊苷固体脂质纳米粒冻干品的稳定性。结果见表2。

表2

表2说明，依托泊苷固体脂质纳米粒冻干品在冰箱4℃放置12个月，其粒径、包封率、含量等质量指标基本不变，表明依托泊苷固体脂质纳米粒冻干制剂稳定性良好。

实施例22

取上述实施例中的依托泊苷固体脂质纳米粒制剂进行刺激性实验。

(1)对家兔耳缘静脉血管刺激试验：

将依托泊苷注射液的两种不同剂型按临床用药量(100mg/次)进行体表面积换算得出实验兔用剂量(5.2mg/kg)。实验前按2ml/kg的给药量用无菌生理盐水注射液新鲜配制。选用体重2.5-3.0kg的健康新西兰白兔6只，雌雄兼有。注射部位用碘酊和乙醇消毒后，3只白兔于右耳耳缘静脉注射依托泊苷注射液，左耳注射相同体积无菌生理盐水注射液作对照；另3只白兔于右耳耳缘静脉注射依托泊苷固体脂质纳米粒，左耳注射相同体积无菌生理盐水注射液作对照，注射速度为1ml/min(相当于人临床注射速度)。每日一次，连续3天，末次给药24小时后，由耳缘静脉注入空气处死白兔，肉眼观察注射部位的反应情况，并解剖兔耳血管及周围组织作石蜡切片(注射部位下向心段1cm及5cm处)，染色，光镜检查。肉眼观察注射部位反应情况。结果见表2。

表3

结果，如表3所示，依托泊苷固体脂质纳米粒血管刺激性明显弱于依托泊苷注射液。

(2)肌肉刺激性试验

依托泊苷注射液的剂量换算、药物配制、新西兰白兔的选择同上(共4只，每种剂型2只)。剪去白兔两侧股四头肌部位的兔毛，用碘酊和乙醇消毒后，分别在右侧股四头肌注射依托泊苷固体脂质纳米粒和依托泊苷注射液1ml，左侧股四头肌注射等量无菌生理盐水注射液作对照，注射48小时后，由耳缘静脉注入空气处死白兔，解剖股四头肌，纵向切开，观察注射部位肌肉组织的反应情况，确定反应级数。

0级：无变化

1级：轻度充血，其范围在0.5cm×1.0cm以下

2级：中度充血，其范围在0.5cm×1.0cm以上

3级：重度充血，伴有肌肉变性

4级：出现坏死，有褐色变性

5级：出现广泛性坏死

然后算出4块股四头肌反应级数总和，如果股四头肌反应级数的最高值与最低值之差大于2，则应另取2只白兔重新实验。得到结果后，若四块股四头肌反应级数总和小于10，则认为供试品的局部刺激性实验符合规定。

表4

结果(见表4)表明，依托泊苷固体脂质纳米粒的肌肉刺激性明显弱于依托泊苷注射液

实施例23过敏试验

给药方法取适量依托泊苷注射液用生理盐水稀释一定倍数，为样品A；取自制依托泊苷固体脂质纳米粒用生理盐水稀释一定倍数，为样品B。依托泊苷给药剂量为2.5mg/kg。取豚鼠12只，分成A、B两组，分别以供样品A和B进行过敏性试验用。每组豚鼠6只，体重250～350g。隔天ip供试品0.5ml，连续3次。然后将A、B组豚鼠再分别平均分成A1、A2及B1、B2组，其中A1、B1组于首次注射后的第14天由后脚掌外侧静脉注入供试品1ml进行攻击，观察注射后动物有无用爪搔鼻、喷嚏、竖毛、抽搐、呼吸困难、大小便失禁、休克、死亡等反应，A2、B2组于首次注射后的第21天同样由后脚掌外侧静脉注入供试品并进行观察。

结果：依托泊苷注射液：多次抓鼻、多次颤抖、喷嚏、竖毛、抽搐、呼吸困难，两例动物出现大小便失禁；依托泊苷固体脂质纳米粒：竖毛、少数动物颤抖。

根据豚鼠过敏反应级数标准表，对本试验进行评定，反应级数达2级以上(包括2级)时，可认为该供试品过敏反应试验阳性。

结果：A组为3级，B组为1级。即A组(市售依托泊苷注射液)可导致明显的过敏反应，为阳性，而B组(自制依托泊苷固体脂质纳米粒)过敏试验为阴性。

实施例24溶血性实验

自新西兰白兔的颈总动脉取血20ml，置于烧瓶内，用玻璃棒轻轻搅动数分钟后，除去纤维蛋白，取出血液，加等量生理盐水注射液，离心(1500rpm，10min)，除去上清液；沉淀的红细胞再加生理盐水注射液清洗。如此反复直到上清液透明，按红细胞的容量用生理盐水配成2％的混悬液。

取干净试管7支，分别编号，依次加入下表内各液，第6管不加供试品作空白对照管，第7管用蒸馏水代替生理盐水，摇匀，置于37℃水浴中，分别于0.5、1、2、3小时观察是否有溶血现象发生。结果见表5和表6。

表5

表6

结果表明，依托泊苷注射液和依托泊苷固体脂质纳米粒都未见溶血发生，两种剂型的溶血性实验均合格。

实施例25大鼠体内药代动力学

HPLC色谱条件：Diamonsil C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-pH4.0醋酸盐缓冲液(40∶60)；流速：1.0ml·min^-1；柱温：25℃；检测波长：254nm；进样量：20μl。

药代动力学实验将12只大鼠随机分成2组，每组6只，实验前禁食。分别于右后股静脉注射依托泊苷注射液(将依托泊苷注射液用生理盐水稀释至1mg·ml^-1)和本发明依托泊苷固体脂质纳米粒混悬液(1mg·ml^-1)，给药剂量为10mg·kg^-1。分别于5、15、30、45min和1、2、4、6、8、12、24h眼眶取血。将血样置预先肝素化的1.5ml尖底离心试管中，4000r·min^-1离心10min，分离出血浆于-20℃冰箱保存待测。

血浆样品处理方法血浆样品200μl，加入4μg·ml^-1对羟基苯甲酸丙酯内标溶液10μl，氯仿3ml，涡旋震荡1min，4000r·min^-1离心10min，取有机相2ml。置离心管中，于40℃水浴中氮气吹干，残留物用50μl流动相溶解后20μl进样分析。

数据分析将主要药代动力学参数进行统计分析，用SPSS 1110软件按配对t检验进行处理，评价依托泊苷固体脂质纳米粒与依托泊苷注射液的药代动力学参数有无差异。

表7

^*P＜0.05；^**P＜0.01。

以依托泊苷注射液为对照，考察依托泊苷固体脂质纳米粒在大鼠体内的药代动力学行为。用3P97药代动力学程序处理依托泊苷固体脂质纳米粒和注射液的平均血药浓度数据。根据AIC和拟合度判断两者的模型归属。结果表明，依托泊苷固体脂质纳米粒和注射液的血药浓度数据均符合双隔室模型。依托泊苷固体脂质纳米粒的MRT、AUC_0-24和AUC_0-∞分别是依托泊苷注射液的3.99、4.79和4.66倍，具有显著差异，CL是参比制剂的0.50倍，具有极显著差异，这说明在同样剂量条件下，依托泊苷被制成固体脂质纳米粒后延长了依托泊苷在血液中的滞留时间，使依托泊苷在体内消除速度较慢并保持了较高的血药浓度，从而发挥长效作用。依托泊苷固体脂质纳米粒改变了依托泊苷在大鼠体内的药动学性质，具有一定的缓释和长循环特征。

Claims (11)

1、一种依托泊苷固体脂质纳米粒，其特征在于，由包含以下重量份的原料制备而成：

依托泊苷：1份

脂质材料：5-60份

乳化剂：4-50份。

2、根据权利要求1所述的依托泊苷固体脂质纳米粒，其特征在于，由包含以下重量份的原料制备而成：

依托泊苷：1份

脂质材料：5-50份

乳化剂：4-30份。

3、根据权利要求1或2所述的依托泊苷固体脂质纳米粒，其特征在于，所述的脂质材料为甘油脂、脂肪酸、类固醇、蜡脂、十八醇或其混合物；其中甘油脂选自单硬脂酸甘油酯、双硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、三肉豆蔻酸甘油酯、单棕榈酸甘油酯、双棕榈酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯、单山嵛酸甘油酯、双山嵛酸甘油酯、三山嵛酸甘油酯、三月桂酸甘油酯和三油酸甘油脂及其混合物；脂肪酸为硬脂酸、棕榈酸、山嵛酸、癸酸或其混合物；类固醇为胆固醇；蜡脂为鲸蜡醇棕榈酸酯、鲸蜡醇十六酸酯、微晶石蜡或其混合物。

4、根据权利要求1或2所述的依托泊苷固体脂质纳米粒，其特征在于，所述的乳化剂为磷脂、胆酸盐、脱氧胆酸盐、短链醇、泊洛沙姆、聚山梨醇酯、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯脂肪酸酯或其混合物；其中，磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂、卵磷脂、氢化卵磷脂及其混合物；胆酸盐选自胆酸钠、甘胆酸钠和牛磺胆酸钠及其混合物；脱氧胆酸盐选自脱氧胆酸钠和脱氧牛磺胆酸钠及其混合物；短链醇选自甘油和丙二醇及其混合物；泊洛沙姆选自Poloxamer-108和Poloxamer-188及其混合物；聚山梨醇酯选自吐温-80；聚氧乙烯脂肪醇醚选自Brij 78、Brij 35和Brij 30及其混合物；聚氧乙烯脂肪酸酯选自Myrj53和Myrj 59及其混合物。

5、根据权利要求1或2所述的依托泊苷固体脂质纳米粒，其特征在于，其粒径小于1000nm。

6、根据权利要求5所述的依托泊苷固体脂质纳米粒，其特征在于，其粒径小于500nm。

7、权利要求1或2所述的依托泊苷固体脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，采用以下不同方法中的任意一种：

1)乳化-沉淀法：称取处方量的依托泊苷、脂质材料、脂溶性乳化剂溶于有机溶剂得有机相，称取水溶性乳化剂溶于水中得水相；有机相和水相分别加热至相同温度，搅拌下将有机相和水相混合，然后减压蒸发除去有机溶剂，再进行超声或高压均质处理，即可得到固体脂质纳米粒；或

2)乳化挥发-低温固化法：将依托泊苷、脂质材料、脂溶性乳化剂按比例溶于有机溶剂得有机相；称取水溶性乳化剂溶于水中得水相；有机相和水相分别加热至相同温度，搅拌下将有机相和水相混合，减压蒸发除去有机溶剂，并使体系浓缩，将浓缩液迅速混于2-50倍体积的0-4℃低温水相中，搅拌降温，然后进行超声或高压均质处理得到依托泊苷固体脂质纳米粒；或

3)薄膜-分散法：称取处方量的依托泊苷、脂质材料、脂溶性乳化剂溶于有机溶剂中，在20-60℃下减压蒸干成膜，加入含水溶性乳化剂的水溶液，超声或高压均质处理即得依托泊苷固体脂质纳米粒；或

4)热熔分散法：称取依托泊苷、脂质材料、脂溶性乳化剂在60-90℃下加热至熔融，作为油相；将水溶性乳化剂溶于水中加热至相同温度作为水相；在搅拌下将油相、水相混合，经超声或高压均质处理，即可制得依托泊苷固体脂质纳米粒；

所述有机溶剂为氯仿、乙醚、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷或丙酮或其混合溶剂；所述有机相和水相的温度为20-80℃；高压均质时压力为10000-25000psi，高压均质的次数为3次-10次；超声功率为100-1000W，超声时间为10-40min。

8、根据权利要求7所述的依托泊苷固体脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，有机相和水相的温度为60-80℃。

9、一种依托泊苷固体脂质纳米粒固体制剂，其特征在于，所述固体制剂是权利要求1或2中的依托泊苷固体脂质纳米粒加入支架剂并采用冷冻干燥或喷雾干燥的工艺制成的。

10、根据权利要求9所述的依托泊苷固体脂质纳米粒固体制剂，其特征在于，所述的支架剂选自氨基酸、麦芽糖、乳糖、甘露糖、葡萄糖、海藻糖、阿拉伯胶、木糖醇、山梨醇和果糖及其混合物；并且其用量按脂质材料和乳化剂总重量计为1份总重量加入0.05-4份冻干支架剂。

11、一种依托泊苷注射剂或口服制剂，其特征在于，是由权利要求1或2中的依托泊苷固体脂质纳米粒制备而成的。

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