CN101579318A - 草乌甲素脂质体冻干粉针剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种草乌甲素脂质体冻干粉针剂及其制备方法。原料的主要成份的重量比为：草乌甲素∶磷脂∶胆固醇∶冻干保护剂＝1∶1－60∶1－10∶1－360。所制成的冻干粉针剂既能显著提高贮存稳定性，又能使草乌甲素脂质体冻干粉在加入注射用水后重新溶散，包封率为75％－90％。制备的草乌甲素脂质体冻干粉针剂临床使用刺激性较已有草乌甲素注射剂轻或无刺激性，并较普通制剂具有缓释特性。

Description

草乌甲素脂质体冻干粉针剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及药品技术领域，具体为含草乌甲素的脂质体冻干粉针剂及其制备方法。

背景技术

草乌甲素(Bulleyaconitione A)又曾称为滇西嘟拉碱甲或粗茎乌头碱甲，分子式C₃₅H₄₉O₁₀N，分子量643.77，为无色棱状晶体。可溶于乙醚、醇、酸水，不溶于水，具有较强的镇痛及明显的抗炎作用。实验证明，本品的镇痛作用是中枢性的，并与脑内5-羟色胺的水平有密切联系，起效时间比吗啡慢(平均37.8min)，但维持时间长(平均9.3h)，且无成瘾性。其抗炎作用不通过肾上腺体系，而与抑制PG水平有关；本品尚有解热和局部麻醉作用。用药后对患者心电、脑电、肝肾功能及尿常规检查与用药前比较无异常改变。临床上本品对风湿性关节炎、类风湿性关节炎、腰肌劳损、肩周炎、四肢扭伤、挫伤等有较好的疗效，还可用于癌痛、带状疱疹。治疗剂量下本品对心、肝、肾、肺、脾、胃功能无损害，也无明显毒副作用。

草乌甲素注射液因在生产过程中需热压灭菌，而草乌甲素为二萜双酯型生物碱，酯键在高温和碱性水溶液中较易水解，而迅速产生降解产物。肖若兰等在名为“草乌甲素降解动力学”的研究论文中，阐述了草乌甲素降解动呈伪一级动力学，主要受OH^-离子催化，温度升高，草乌甲素降解速率增加。申请号为03031018.4的“草乌甲素粉针剂及其生产方法”以及申请号为200410079538.2的“草乌甲素新粉针剂及其生产方法”，公开了草乌甲素的两种冻干粉针剂及制备方法，虽然两种冻干粉针剂制备方法避开了草乌甲素注射液经热压灭菌后草乌甲素会迅速降解的致命工艺缺点，对草乌甲素注射液的质量有了较大的改善，但是仍然不可规避草乌甲素存在治疗窗窄，毒性大，注射时皮肤刺激性强的问题。申请号为200610024926.X的专利公开了一种草乌甲素多泡脂质体及其制备方法，该脂质体与普通草乌甲素制剂相比具有明显的缓释作用，但是该产品未克服脂质体稳定性的问题，无法应用于工业化大生产。该专利说明书亦未提及制备的脂质体临床使用的皮肤刺激性问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种临床适用的草乌甲素脂质体注射用冻干粉针，既能显著提高产品贮存的稳定性，又能明显降低临床使用时因草乌甲素引起的皮肤刺激性，延长药物作用时间，从而最大限度地提高药物生物利用度和降低临床用药的不安全因素。

本发明的另一目的是提供草乌甲素脂质体注射用冻干粉针剂的制备方法。

本发明的技术方案为：草乌甲素脂质体冻干粉针剂主要药物原料为：草乌甲素、磷脂、胆固醇、冻干保护剂，它们的重量比为：草乌甲素∶磷脂∶胆固醇∶冻干保护剂＝1∶1-60∶1-10∶1-360。其较好的比例为：草乌甲素1份、磷脂49-60份、胆固醇5-10份，冻干保护剂60～360份。此外还含有pH调节剂。

所述的磷脂为磷脂S100；pH调节剂为柠檬酸盐、磷酸盐、碳酸盐等。

所述的冻干保护剂为：甘露醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖、右旋糖苷。

草乌甲素脂质体冻干粉针剂的制备方法如下：

步骤①：按重量比取磷脂S100和胆固醇，溶于适量乙醇和/或甲醇和或氯仿溶剂中，在40-50℃减压旋蒸除去溶剂，成干的薄膜后，加入pH3-5的柠檬酸盐缓冲溶液，振摇使膜全部洗脱下来，得到大粒径的空白脂质体，用高剪切发散乳化机高速剪切3-10分钟，于700-900bar高压乳匀8-20次，得到小粒径的空白脂质体，用碳酸盐溶液调节外相pH为7-8，备用；

步骤②：将草乌甲素，溶于pH5.8的磷酸盐缓冲液中，制备草乌甲素的过饱和溶液，过滤，备用；

步骤③：将步骤①和②所得的溶液按照体积比为1∶1～9∶1混合，20-60℃孵化10-60分钟；

步骤④：加入磷脂用量1-6份的冻干保护剂，搅拌使其全部溶解，过滤，分装到西林瓶中，冷冻干燥，即得。

每支草乌甲素脂质体冻干粉剂含草乌甲素0.2-0.8mg。其较好的规格为0.2-0.4mg。

一、草乌甲素脂质体冻干粉针剂的含量测定：

1、仪器与试药试剂

Shmiadzu LC-10高效液相色谱仪：包括Shmiadzu LC-10AVP泵，FCV-10ALVP+DGU-12A组合成在线脱气装置，SIL-10ADVP自动进样器，SPD-M10AVP二级管阵列检测器，CTO-10ASVP柱温箱，CLASS-VP工作站。色谱柱：Luna C18 250×4.6mm。乙腈、磷酸为色谱级、HPLC用水是重蒸蒸馏水；Triton X-100，盐酸、三乙胺为分析级。

草乌甲素对照品；批号：100530-200501；中国药品生物制品检定所提供；

草乌甲素，批号：20080505，20080506，20080507，昆明制药集团股份有限公司。

2、色谱条件

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.2％三乙胺水溶液(用磷酸调节pH值至3.1±0.1)(35∶65)为流动相；检测波长为260nm。理论板数按草乌甲素峰计算应不低于3000。

3、测定法

取本品内容物适量，相当于含草乌甲素约2mg，精密称定，置100ml量瓶中，加聚乙二醇辛基苯基醚破乳，溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另取草乌甲素对照品约20mg，溶解并稀释制成每1ml含20μg的溶液，作为对照品溶液；精密量取上述两种溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。

二、草乌甲素脂质体的包封率测定方法：

采用Millipore的分子量为100K的超滤管：具体方法是取0.5ml制备的脂质体，放入超滤管中，把超滤管放入配套的离心管中，5000rpm离心3min，用离心液测定游离药物的浓度。另取脂质体1ml，加入1-2ml的10％TritonX100破乳，用蒸馏水稀释到适当的体积，测定总的药物浓度。

包封率的计算公式：EE％＝(1-游离药物的浓度/总的药物浓度)×100％。

三、草乌甲素脂质体刺激性试验：

取体重约为2.5kg的家兔4只，2只注射自配的草乌甲素水溶液，2只注射制备的草乌甲素脂质体。每只兔子的左耳耳缘静脉和左腿股四头肌注射生理盐水作为对照，右耳耳缘静脉和右腿股四头肌注射制备的样品，考察对血管和肌肉的刺激性。

静脉注射：按市售浓度，给药1ml/次，1次/天，注射3次；

肌肉注射：按市售浓度，给药1ml，注射一次。

注射的生理盐水与药物溶液的体积相同。

观察：每次耳缘静脉注射后，下一次注射前观察给不同制剂的耳朵，发现药物组与生理盐水对照组均无明显差异。给药完成后第二天静脉注射空气处死家兔。剪下耳朵，浸泡于10％的福尔马林中；解剖家兔腿部观察股四头肌，发现注射草乌甲素水溶液的股四头肌有范围约为1×1.5cm的红斑，为中度充血，为2级刺激性反应。注射薄膜法制备的脂质体的股四头肌有范围小于0.5×1cm的红斑，为轻度充血，为1级刺激反应。而注射主动载药法制备的脂质体和生理盐水的股四头肌没有红斑，为0级刺激性反应。观察后浸泡于福尔马林中。

病理切片，HE染色的结果：在耳部取扎针处(A)，离取扎针处1-2cm的远端区(C)，离取扎针处1-2cm的近耳跟部(F)切片，做腊片保存，HE染色观察并拍照。肌肉取目视刺激性最严重的部位切片，做腊片，HE染色，拍照。

结果：耳缘静脉注射照片，样品与生理盐水均无明显的差异。肌肉注射后，可以看出有明显的不同，情况如下：

生理盐水：肌肉无出血点，排列有规则。

草乌甲素水溶液：肌肉特别松散、紊乱，出血、坏死面积较大，盐细胞坏死。

制备的草乌甲素脂质体：肌肉无出血点，排列有规则，无肌肉坏死现象。

结论：制备的脂质体与草乌甲素水溶液比较，刺激性明显降低，观看到的刺激反应和切片后染色照片与生理盐水无明显差异，从而说明这种方法制备的脂质体能降低草乌甲素注射剂对肌肉的刺激性。

四、草乌甲素脂质体体外释放度测定：

取草乌甲素脂质体冻干粉剂内容物适量，用生理盐水稀释，将所得溶液置于37℃恒温摇床(转速15rpm)中，在预定时间点取出等量的样品，并补充等量的空白介质，将样品以6000rpm离心分离上清液和沉淀，依法测定上清液中草乌甲素的含量，每个时间点的药物释放百分比用以下公式计算：

药物释放百分比％＝上清液中游离的草乌甲素的量/草乌甲素脂质体冻干粉剂包封的草乌甲素×100。结果表明在第3天(72小时)，药物释放达到80％以上，包封的草乌甲素基本完全释放，制备草乌甲素脂质体冻干粉剂具有明显的缓释效果，参见图5。

五、冻干后的质量评价：

外观：均匀、平整、冻干饼与西林瓶底部完全脱离；取冻干后的样品，每瓶加入2ml复溶后可见较好的乳光；测定粒径和包封率，与冻干前比较没有显著的变化。

六、草乌甲素脂质体冻干粉针剂稳定性考察：

将样品放于干燥器中五个月，考察其外观、复溶情况、粒径、包封率、载药量。

结论：冻干样品九个月的稳定性良好。

本发明的草乌甲素脂质体及其注射用冻干粉针既能显著提高产品贮存的稳定性，又能使草乌甲素脂质体冻干粉在加入注射用水后重新溶散，包封率为75％-90％。并且明显降低临床使用时因草乌甲素引起的皮肤刺激性，并较普通制剂具有缓释特性，延长药物作用时间，从而最大限度地提高药物生物利用度和降低临床用药的不安全因素。

附图说明

图1是草乌甲素脂质体冻干粉针剂HPLC色谱图；

图2是草乌甲素脂质体冻干粉针剂对肌肉的刺激性病理切片图；

图3是草乌甲素水溶液对肌肉的刺激性病理切片图；

图4是生理盐水对肌肉的刺激性病理切片图；

图5是草乌甲素脂质体冻干粉针剂体外释放度曲线图。

具体实施方式

实施例1：

处方(100个制剂单位)：

磷脂S100                    2g

胆固醇                      0.3g

草乌甲素                    40mg

乙醇                                90ml

pH4.0的0.15mol/L柠檬酸盐缓冲液      100ml

0.10mol/L碳酸钠水溶液               若干ml

甘露醇                              10g

配制方法：取处方量磷脂S100和胆固醇，溶于适量乙醇中，在48℃减压旋蒸除去溶剂，成干的薄膜后，加入pH4.0的柠檬酸盐缓冲溶液，振摇使膜全部洗脱下来，得到大粒径的空白脂质体。用高剪切发散乳化机高速剪切5分钟，于800bar高压乳匀10次，得到小粒径的空白脂质体。用碳酸盐溶液调节外相pH为7-8，得样品1；称取处方量草乌甲素，溶于pH5.8的磷酸盐缓冲液中，制备草乌甲素的过饱和溶液，过滤，得样品2；将样品1和样品2所得的溶液按照体积比为9∶1混合，25℃孵化30分钟；加入处方量甘露醇，轻摇使其全部溶解，过滤，按分装100支的体积分装到西林瓶中，冷冻干燥。

冻干后的质量评价：外观平整、均匀、冻干饼与西林瓶底部完全脱离；取冻干后的样品，每瓶加入2ml复溶后可见较好的乳光；测定粒径为142.3nm和包封率87.5％。

实施例2：

处方(100个制剂单位)：

磷脂S100                          4.8g

胆固醇                            0.6g

草乌甲素                          80mg

甲醇                              50ml

pH4.0的0.15mol/L柠檬酸盐缓冲液    100ml

0.10mol/L碳酸钠水溶液             若干ml

蔗糖                              4.8g

配制方法：取处方量磷脂S100和胆固醇，溶于适量甲醇中，在40℃减压旋蒸除去溶剂，成干的薄膜后，加入pH4.0的柠檬酸盐缓冲溶液，振摇使膜全部洗脱下来，得到大粒径的空白脂质体。用高剪切发散乳化机高速剪切10分钟，于700bar高压乳匀20次，得到小粒径的空白脂质体。用碳酸盐溶液调节外相pH为7-8，得样品1；称取处方量草乌甲素，溶于pH5.8的磷酸盐缓冲液中，制备草乌甲素的过饱和溶液，过滤，得样品2；将样品1和样品2所得的溶液按照体积比为8∶1混合，30℃孵化40分钟；加入处方量蔗糖，轻摇使其全部溶解，过滤，按分装100支的体积分装到西林瓶中，冷冻干燥。

冻干后的质量评价：外观平整、均匀、冻干饼与西林瓶底部完全脱离；取冻干后的样品，每瓶加入2ml复溶后可见较好的乳光；测定粒径为141.3nm和包封率90.1％。

实施例3：

处方(100个制剂单位)：

磷脂S100                            20mg

胆固醇                              20mg

草乌甲素                            20mg

氯仿                                30ml

pH4.0的0.15mol/L柠檬酸盐缓冲液      100ml

0.10mol/L碳酸钠水溶液               若干ml

葡萄糖                              7g

配制方法：取处方量磷脂S100和胆固醇，溶于适量氯仿中，在48℃减压旋蒸除去溶剂，成干的薄膜后，加入pH4.0的柠檬酸盐缓冲溶液，振摇使膜全部洗脱下来，得到大粒径的空白脂质体。用高剪切发散乳化机高速剪切10分钟，于700bar高压乳匀10次，得到小粒径的空白脂质体。用碳酸盐溶液调节外相pH为7-8，得样品1；称取处方量草乌甲素，溶于pH5.8的磷酸盐缓冲液中，制备草乌甲素的过饱和溶液，过滤，得样品2；将样品1和样品2所得的溶液按照体积比为5∶1混合，60℃孵化400分钟；加入处方量葡萄糖，轻摇使其全部溶解，过滤，按分装100支的体积分装到西林瓶中，冷冻干燥。

冻干后的质量评价：外观平整、均匀、冻干饼与西林瓶底部完全脱离；取冻干后的样品，每瓶加入2ml复溶后可见较好的乳光；测定粒径为143.4nm和包封率80.5％。

实施例4：

处方(100个制剂单位)：

磷脂S100                            2g

胆固醇                              0.3g

草乌甲素                            60mg

乙醇                                90ml

pH4.0的0.15mol/L柠檬酸盐缓冲液      100ml

0.10mol/L碳酸钠水溶液               若干ml

乳糖                                10g

配制方法：取处方量磷脂S100和胆固醇，溶于适量乙醇中，在48℃减压旋蒸除去溶剂，成干的薄膜后，加入pH4.0的柠檬酸盐缓冲溶液，振摇使膜全部洗脱下来，得到大粒径的空白脂质体。用高剪切发散乳化机高速剪切8分钟，于900bar高压乳匀8次，得到小粒径的空白脂质体。用碳酸盐溶液调节外相pH为7-8，得样品1；称取处方量草乌甲素，溶于pH5.8的磷酸盐缓冲液中，制备草乌甲素的过饱和溶液，过滤，得样品2；将样品1和样品2所得的溶液按照体积比为2∶1混合，25℃孵化30分钟；加入处方量乳糖，轻摇使其全部溶解，过滤，按分装100支的体积分装到西林瓶中，冷冻干燥。

冻干后的质量评价：外观平整、均匀、冻干饼与西林瓶底部完全脱离；取冻干后的样品，每瓶加入2ml复溶后可见较好的乳光；测定粒径为141.7nm和包封率89.5％。

实施例5：

处方(100个制剂单位)：

磷脂S100                            3g

胆固醇                              0.5g

草乌甲素                            50mg

乙醇                                80ml

pH4.0的0.15mol/L柠檬酸盐缓冲液      100ml

0.10mol/L碳酸钠水溶液               若干ml

右旋糖苷                            18g

配制方法：取处方量磷脂S100和胆固醇，溶于适量乙醇中，在48℃减压旋蒸除去溶剂，成干的薄膜后，加入pH4.0的柠檬酸盐缓冲溶液，振摇使膜全部洗脱下来，得到大粒径的空白脂质体。用高剪切发散乳化机高速剪切8分钟，于900bar高压乳匀8次，得到小粒径的空白脂质体。用碳酸盐溶液调节外相pH为7-8，得样品1；称取处方量草乌甲素，溶于pH5.8的磷酸盐缓冲液中，制备草乌甲素的过饱和溶液，过滤，得样品2；将样品1和样品2所得的溶液按照体积比为7∶1混合，60℃孵化30分钟；加入处方量右旋糖苷，轻摇使其全部溶解，过滤，按分装100支的体积分装到西林瓶中，冷冻干燥。

冻干后的质量评价：外观平整、均匀、冻干饼与西林瓶底部完全脱离；取冻干后的样品，每瓶加入2ml复溶后可见较好的乳光；测定粒径为141.1nm和包封率83.5％。

Claims (5)

1、一种草乌甲素脂质体冻干粉针剂，其特征在于原料的主要成份的重量比为：草乌甲素∶磷脂∶胆固醇∶冻干保护剂＝1∶1-60∶1-10∶1-360。

2、根据权利要求1所述草乌甲素脂质体冻干粉剂，其特征在于：草乌甲素、磷脂、胆固醇、冻干保护剂的重量比为：草乌甲素1份、磷脂49-60份、胆固醇5-10份，冻干保护剂60～360份。

3、根据权利要求1所述草乌甲素脂质体冻干粉剂，其特征在于：磷脂为磷脂S100。

4、根据权利要求1所述的草乌甲素脂质体冻干粉剂，其特征在于：冻干保护剂为：甘露醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖、右旋糖苷中的一种或其中的混合物。

5、权利要求1所述的草乌甲素脂质体冻干粉针剂的制备方法，其特征在于，经下述步骤制备：

步骤①：按重量比取磷脂S100和胆固醇，溶于适量乙醇和/或甲醇和或氯仿溶剂中，在40-50℃减压旋蒸除去溶剂，成干的薄膜后，加入pH3-5的柠檬酸盐缓冲溶液，振摇使膜全部洗脱下来，得到大粒径的空白脂质体，用高剪切发散乳化机高速剪切3-10分钟，于700-900bar高压乳匀8-20次，得到小粒径的空白脂质体，用碳酸盐溶液调节外相pH为7-8，备用；

步骤②：将草乌甲素，溶于pH5.8的磷酸盐缓冲液中，制备草乌甲素的过饱和溶液，过滤，备用；

步骤③：将步骤①和②所得的溶液按照体积比为1∶1～9∶1混合，20-60℃孵化10-60分钟；

步骤④：加入磷脂用量1-6份的冻干保护剂，搅拌使其全部溶解，过滤，分装到西林瓶中，冷冻干燥，即得。

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