CN102552149B - 一种注射用肝素钙脂质体制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种注射用肝素钙脂质体制剂及其制法。该脂质体注射剂由特定重量配比的肝素钙、胆固醇、磷脂酰甘油、卵磷脂、聚氧乙烯40氢化蓖麻油、海藻糖、山梨醇和聚乙烯吡咯烷酮制成。本发明的脂质体注射剂具有良好的制剂稳定性，冷冻过程中脂质体不会因脱水、融合、冰晶而破裂，长期储存后，脂质体同样保持良好的包封率和稳定性；本发明提高了肝素钙的溶解度，提高了制剂产品的质量，减少了毒副作用，增加了药物在体循环中的保留时间，提高了药物的生物利用度，疗效明显提高；并且制备方法简单，适合于工业化大生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种脂质体注射剂及其制法，具体涉及一种注射用肝素钙脂质体制剂及其制法，属于医药技术领域。
背景技术
肝素钙，又名低分子肝素钙，其化学名称：硫酸氨基葡聚糖钙。抗血栓药物包括肝素类、非肝素抗血小板凝集药物、酶类及其他四个小亚类，肝素类和酶类基本上以生化药物为主。其中肝素类占有最大的市场份额，在肝素类中又以肝素类药物占主导，肝素钙和低分子肝素钠分别占有整个抗血栓类药物20％和7％的市场份额。生物活性肝素自被发现虽已有80余年的历史，但由于到目前为止还没有一种能完全替代它的产品，所以它仍然是最重要的生化药物之一，其在临床的应用已有60余年的历史，它是预防手术后血栓形成和治疗急性静脉血栓的首选药物。除此之外，肝素或其衍生物还用于调血脂、抗炎、抗过敏以及免疫调节等方面。
普通肝素是含多种氨基葡聚糖苷的混合物。肝素钙在体内外均能延缓或阻止血液凝固。其抗凝机理复杂，对凝血的各个环节均有作用，包括抑制凝血酶原转变为凝血酶、抑制凝血酶活性，妨碍纤维蛋白原转变为纤维蛋白、防止血小板聚集。肝素钙还可降低血脂，改变血液粘稠度，改善冠状动脉循环等作用。肝素钙的抗FIIa作用较肝素钠强，抗FXa作用较肝素钠弱。由于其是以钙盐形式在体内发挥作用，经皮下注射后，在血液循环中缓慢扩散，不会减少局部细胞间毛细血管的钙胶质，也不改变血管通透性，几乎无肝素钠皮下注射可引起局部出血的副作用。适用于预防和治疗血栓-栓塞性疾病以及血栓形成。肝素钙还具有较明显的抗肾素和抗醛固酮活性，故亦适用于人工肾、人工肝和体外循环使用。近年来的研究发现，肝素钙还有调血脂、抗炎、抗补体、抗过敏、免疫调节等多种非抗凝方面的药理作用。
目前上市的肝素钙剂型主要为注射液和冻干粉针，即低分子量肝素钙注射液和注射用低分子量肝素钙，普通工艺所制备的肝素钙注射剂，物理和化学性质稳定性差，长期存放药品质量会下降而且还会生成一些杂质，带来毒副作用，给临床使用留下了隐患。冻干粉针制作周期长，费用高，价格贵。
专利CN1554671A公开了一种低亚硝酸盐含量的肝素钙的制备方法。专利CN1721464A公开了一种用生物酶法制备低分子肝素钠(钙)的方法。CN1478485A公开了一种含肝素类药物的脂质体软膏剂及其制备方法，由磷脂、胆固醇、肝素类药物、和胆酸钠制备包封有肝素类药物的脂质体混悬液。CN101249063A公开了一种应用壳聚糖制备肝素钙/钠纳米口服制剂及其制备工艺及方法，将壳聚糖溶解在0.1～20％浓度的稀醋酸溶液中，在磁力搅拌下往滤液中滴加浓度1～99％的肝素钙/钠水溶液，直至出现乳白色沉淀，将所得到的混悬液离心，取沉淀物冷冻干燥，得到所述的肝素钙/钠盐纳米脂质体。US4239754A公开了一种肝素脂质体，应用薄膜超声法制备含卵磷脂、胆固醇和磷酸鲸蜡酯或硬脂胺的正电荷脂质体，WO2011113892A公开一种含聚合糖和磷脂的肝素脂质体。
李广武，聚糖孵育低分子肝素钙脂质体的制备及其包封率测定，《中国药房》，2007年34期，采用薄膜分散法制备低分子肝素钙的胆固醇与大豆磷脂的脂质体，以壳聚糖溶液孵育低分子肝素钙脂质体，使低分子肝素钙脂质体的包封率大幅地提高，可能是由于壳聚糖与游离的低分子肝素钙形成纳米粒所致，导致该肝素钙脂质体可能为低分子肝素钙脂质体和低分子肝素钙-壳聚糖的混合物。
翟光喜等，低分子肝素纳米脂质体的制备以及大鼠口服吸收，《中国药科大学学报》2002.06.25；33(3)：200～202)报道用超声波分散法制备低分子肝素纳米脂质体，所得脂质体平均粒径为89.6nm，包封率为36.1％；翟光喜等，低分子肝素脂质体的研究，《中国药学杂志》，2001，36(5)：316；翟光喜等，低分子肝素柔性纳米脂质体的研究，《山东大学学报》(医学版)，2002，40(3)：240；汪龙江等，低分子肝素微乳及其纳米脂质体作大鼠口服抗凝效果的比较，江苏药学与临床研究，2005.04.20；13(2)：4～6)报道用逆相蒸发法制备低分子肝素纳米脂质体，所得脂质体平均粒径83.1纳米，包封率为23.6％，并按三元相图摸索微乳区，以螺旋振荡制备低分子肝素微乳制剂，微乳平均粒径52.8纳米。由于上述方法制得的低分子肝素纳米脂质体包封率均较低，无法达到《中国药典》规定的80％的标准。
因此目前还未见有关注射用肝素钙脂质体制剂的文献报道，更没有注射用肝素钙脂质体制剂投放市场。由于肝素钙注射剂的不足，目前对于注射用肝素钙脂质体制剂存在需求。
在药物载体输送系统中，微乳、微球、纳米粒、脂质体、药质体等亚微粒的研究已经成为药物新剂型研究中非常活跃的领域。将药物包封于这些亚微粒中可以改变药物在体内的分布，增加药物在靶器官的分布量，从而提高疗效，减轻毒副作用。在靶向给药系统中，脂质体的研究较为广泛，脂质体在体内具有良好的靶向性和生物相容性。
脂质体(Liposome)最初是由英国学者Bangham和Standlish将磷脂分散在水中进行电镜观察时发现的。磷脂分散在水中自然形成多层囊泡，每层均未脂质的双分子层；囊泡中央和各层之间被水相隔开，双分子层厚度约为4nm。后来，将这种具有类似生物膜结构的双分子小囊称为脂质体。脂质体可分为多室脂质体和单室脂质体。单室脂质体又分为小单室脂质体和大单室脂质体。小单室脂质体为球形，尺寸一般为20-50纳米；大单室脂质体的尺寸为微米数量级。
1971年英国莱门等人开始将脂质体用于药物载体，主要作用机理是将药物粉末或溶液包裹在脂质体双层脂质膜所封闭的水相中或嵌入脂质体双层脂质膜中，这种微粒具有类细胞结构，进入人体内主药被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中积蓄，从而提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。
近年来，随着生物技术的不断进展，脂质体制备工艺逐步完善，脂质体作用机制进一步阐明，加之脂质体适合体内降解、无毒性和无免疫原性，特别是大量试验数据证明脂质体作为药物载体可以提高药物治疗指数、降低药物毒性和减少药物副作用，并减少药物剂量等优点。
作为一种新型药物制剂，脂质体制剂具有以下优点：(1)具有缓释作用：活性成分缓慢释放，延缓肾排泄和代谢，从而延长作用时间，提高质量效果；(2)降低药物毒性；(3)增加药物的溶解性，提高制剂质量；(4)具有靶向性：脂质体所载的药物在肝、脾网状内皮系统脏器局部维持高浓度，从而起到药物器官靶向性作用；(5)具有对活性药物成分的保护作用。
由于脂质体的性质如稳定性、包封率、起效时间、在体内的循环时间、生物利用度和毒副作用等与脂质体的组成直接地密切相关，而脂质体的组成与所要包封的药物性质直接地密切相关，因此，制备脂质体的挑战在于选择适当的脂质体组成成分和制法，因而选择什么样的成分以形成具有良好品质的肝素钙脂质体是亟待解决的课题。
发明内容
本发明人经过锐意研究意外发现，通过选用特定重量配比的肝素钙、胆固醇、磷脂酰甘油、卵磷脂、聚氧乙烯40氢化蓖麻油、海藻糖、山梨醇和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，可以形成品质优异的注射用肝素钙脂质体制剂，从而完成本发明。
本发明的目的是提供一种注射用肝素钙脂质体制剂，其由包括以下重量配比的药物和赋形剂成分制成：
优选地，根据本发明的注射用肝素钙脂质体制剂由包括以下重量配比的药物和赋形剂成分制成：
进一步优选地，根据本发明的注射用肝素钙脂质体制剂由包括以下重量配比的药物和赋形剂成分制成：
本发明的另一目的是提供上述注射用肝素钙脂质体制剂的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)将胆固醇、磷脂酰甘油、卵磷脂和聚氧乙烯40氢化蓖麻油置于梨形瓶中，加入有机溶剂，加热搅拌使其溶解，然后于旋转蒸发器上减压除去有机溶剂，在瓶壁上形成均匀透明的磷脂膜；
(2)在氮气保护下，向瓶中加入肝素钙和PVP的水溶液，搅拌，使磷脂膜洗脱并充分溶胀水合，水化完全后在100bar到600bar做梯度均质4～6遍，0.22μm微孔滤膜过滤，制得肝素钙质体；
(3)无菌条件下，将海藻糖和山梨醇溶于注射用水中，然后加入到肝素钙脂质体中，加注射用水定容，经0.45μm微孔滤膜过滤，灌装，然后进行冻干，即得注射用肝素钙脂质体制剂。
本发明的脂质体达到了以下要求：(1)脂质体形态圆整且不聚集，并有效控制了粒径范围；(2)脂质体稳定性高，可以长期放置；(3)脂质体具有较高的包封率和载药量；(4)脂质体容易实现灭菌或无菌操作。
本发明的脂质体注射剂减少了毒副作用，提高了制剂产品质量，具有良好的制剂稳定性，冷冻过程中脂质体不会因脱水、融合、冰晶等发生破裂，水合复溶后，外观均匀，脂质体不聚集物结晶，长期储存后，脂质体同样保持良好的包封率和稳定性。
通过本发明方法制得的注射用肝素钙脂质体制剂，提高了肝素钙的溶解度，提高了制剂产品的质量，减少了毒副作用，增加了药物在体循环中的保留时间，提高了药物的生物利用度，疗效明显提高；并且制备方法简单，适合于工业化大生产。
附图说明
图1是注射用肝素钙脂质体制剂的血药浓度-时间曲线，表示市售肝素钙注射剂(上市例)、实施例1-3中制备的注射用肝素钙脂质体制剂、和对比例1-3中制备的注射用肝素钙脂质体制剂的血药浓度与时间的关系曲线。
其中：
具体实施方式
以下通过具体实施方式本发明进行进一步说明，本发明的特点和优点将随着这些说明而变得更为清楚。
为了形成品质优良的注射用肝素钙脂质体制剂，重要的是寻找能与肝素钙良好相容从而将其良好包封且不渗漏的成膜材料，以及寻找能使脂质体形成稳定注射剂的赋形剂成分。
为了实现上述目的，本发明人进行的大量研究和实现，发现特定重量配比的肝素钙、胆固醇、磷脂酰甘油、卵磷脂、聚氧乙烯40氢化蓖麻油、海藻糖和PVP能制成注射用肝素钙脂质体制剂，其中，作为药物活性成分的肝素钙的包封率高，脂质体粒径小且分布均匀，与现有技术中的肝素钙注射剂相比，本发明制剂的药物活性成分在体循环中的保留时间显著延长，药物的生物相容性高，生物利用度明显提高，疗效明显提高。
一方面，本发明提供一种注射用肝素钙脂质体制剂，其由包括以下重量配比的药物和赋形剂成分制成：
优选地，根据本发明的注射用肝素钙脂质体制剂由包括以下重量配比的药物和赋形剂成分制成：
进一步优选地，根据本发明的注射用肝素钙脂质体制剂由包括以下重量配比的药物和赋形剂成分制成：
作为用于形成脂质体的磷脂，可以使用天然磷脂和合成磷脂。天然磷脂包括磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、蛋黄卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、蛋黄磷脂酰甘油、蛋黄磷脂酰丝氨酸、蛋黄磷脂酰肌醇、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、氢化卵磷脂、卵磷脂酰甘油、卵磷脂酰丝氨酸和卵磷脂酰肌醇等。合成磷脂为二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酸磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二豆蔻酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油和聚乙二醇衍生化磷脂例如二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-mPEG2000)；二软酯酰胆磷脂-聚乙二醇2000(DPPG-mPEG2000)；氢化大豆磷脂酰胆碱-聚乙二醇2000(HSPC-mPEG2000)；二油酰磷脂酰胆碱-聚乙二醇2000(DOPC-mPEG2000等。
在本发明中，作为药物活性成分的肝素钙，其水溶性差，脂溶性良好。针对肝素钙的特点，本发明人通过研究发现磷脂酰甘油特别适于作为基础磷脂成膜材料。磷脂酰甘油作为一种天然负电荷磷脂，其含量非常高，容易获得，价格低廉。磷脂酰甘油的相变温度较高，易于形成稳定的脂质体膜并可防止脂质体聚集。为了改善脂质体的稳定性，所用磷脂酰甘油的纯度为98％以上，优选99％以上。磷脂酰甘油与卵磷脂结合可用于形成品质优良的肝素钙脂质体。当使用其他磷脂时，难以形成品质优良的脂质体，脂质体的包封率、稳定性、和渗漏率等性质差。
在本发明的注射用肝素钙脂质体制剂中，相对于100重量份的肝素钙而言，磷脂酰甘油的用量为80-300重量份。如果磷脂酰甘油的用量低于80重量份，则无法形成稳定的脂质体；反之，如果磷脂酰甘油的用量的用量高于300重量份，则作为药物活性成分的肝素钙的包封率下降，注射剂的品质以及疗效降低。
在本发明的注射用肝素钙脂质体制剂中，胆固醇和卵磷脂以及聚氧乙烯40氢化蓖麻油用于调节脂质体的膜稳定性。
胆固醇是一种双亲性分子，与磷脂酰甘油相结合，阻止其凝聚成晶体结构。胆固醇掺入磷脂酰甘油双层，类似于“缓冲剂”一样起到调节膜结构“流动性”的作用。当低于相变温度时，胆固醇可以使膜减少有序排列，增加流动性；当高于相变温度时，胆固醇可以增加膜的有序排列，从而降低膜的流动性。胆固醇能使脂质体双分子层膜固化，从而减少自由基的生成，降低氧化水平，使脂质体稳定性显著增强。
卵磷脂是一种天然产物，营养高，来源丰富，价格便宜。与胆固醇类似，卵磷脂也能调节磷脂酰甘油膜的稳定性，且其对稳定性的调节作用效果优于胆固醇。
研究表明，脂质体的稳定性与生物利用度有密切的对应关系。稳定性越高，生物利用度越高。因此，本发明的注射用肝素钙脂质体制剂的稳定性高，是导致药物生物利用度高的因素之一。
另一方面，本发明人经过研究发现，磷脂酰甘油、卵磷脂的重量与胆固醇三者之间的配比需在一定的范围，方可形成稳定的肝素钙脂质体。否则所形成的肝素钙脂质体或者膜流动性过高，或者膜稳定性降低，导致肝素钙易于渗漏。
优选地，在本发明的注射用肝素钙脂质体制剂中，相对于100重量份的肝素钙而言，磷脂酰甘油的用量为100-200重量份，胆固醇为75-125重量份，卵磷脂为25-45重量份，所形成的注射用肝素钙脂质体制剂稳定且包封率高，毒性低。
特别优选地，在本发明的注射用肝素钙脂质体制剂中，相对于100重量份的肝素钙而言，磷脂酰甘油的用量为150-180重量份，胆固醇为90-100重量份，卵磷脂为30-40重量份，所形成的注射用肝素钙脂质体制剂的包封率和稳定性最高。
在本发明的注射用肝素钙脂质体制剂中，使用聚氧乙烯40氢化蓖麻油来进一步改进脂质体膜的稳定性。聚氧乙烯40氢化蓖麻油是一种非离子表面活性剂，当用于磷脂酰甘油双层膜中时，能提高该双层膜之间的化学能，从而提高脂质体在水性液体中的化学稳定性，进而提高注射用肝素钙脂质体制剂的稳定性。
在本发明的注射用肝素钙脂质体制剂中，相对于40重量份的肝素钙而言，聚氧乙烯40氢化蓖麻油的用量为10-60重量份。如果聚氧乙烯40氢化蓖麻油的用量低于10重量份，则由于其用量过低导致对注射用肝素钙脂质体制剂的稳定性改进不够，反之，如果聚氧乙烯40氢化蓖麻油的用量高于60重量份，则用于其用量过高而导致脂质体膜易于泄露。
研究发现，当使用上述特定量的肝素钙、磷脂酰甘油、胆固醇、卵磷脂和聚氧乙烯40氢化蓖麻油时，可以得到品质优良的肝素钙脂质体，其包封率和稳定性都很高，毒性低，生物利用度高。
在本发明的注射用肝素钙脂质体制剂中，使用海藻糖、山梨醇和聚乙烯吡咯烷酮作为赋形剂，用于形成稳定的注射剂。
目前上市的各种脂质体产品中，大多为液体制剂。然而，脂质体在水性介质中易发生聚集、融合、磷脂水解及药物渗漏等一系列问题，导致储存期缩短。尤其是，水溶性药物与脂质体膜之间的相互作用较弱，这使得药品的长期稳定性问题更为突出。
为了提高脂质体的稳定性，1978年Vanleberghe(药物冻干制剂技术的设计及应用)首次报道了采用冷冻干燥法提高脂质体的贮存稳定性。自此，研发人员开始尝试对其它药物用脂质体包裹并进行冻干保护。然而，在脂质体在冷冻过程中发现，冰晶的形成、渗透压的改变、相分离及相转变等因素均可导致脂质膜析叠、融合、破裂及药物渗漏，水溶性药物由于其与脂质体膜之间的相互作用较弱，冻干过程中更容易渗漏，因此从技术上更难实现冻干。
为了解决脂质体混悬液稳定性差，冻干过程中容易造成脂质体渗漏，包封率降低的难题，研发人员发现在冻干前加入适当的冻干保护剂，可以防止脂质体在冷冻干燥过程中芯材的渗漏及粒子间的相互聚集融合。因此寻找合适的冻干保护剂，实现脂质体以冻干形式的长期稳定保存，成为脂质体领域的研究热点之一。
本申请通过将海藻糖与山梨醇配伍组合，获得了良好的效果，将其组合用于本申请的冻干方法，圆满地解决了上述问题，获得了意外的效果。
海藻糖是由两个葡萄糖分子以α，α，1，1-糖苷键构成的非还原性糖，自身性质非常稳定，它最明显的性质是在无水的条件下有保护生物膜的能力，使脂质体即使在脱水的情况下也保持形态完整。山梨醇(Sorbitolum)山梨醇是一种用途广泛的化工原料，在食品、日化、医药等行业都有极为广泛的作用，可作为甜味剂、保湿剂、赋形剂、防腐剂等使用，同时具有多元醇的营养优势。同时也用作药片的赋形剂及固体、液体的稀释剂，尤其能为冻干粉针剂提供良好的成型支撑。作为一种天然产物，山梨醇来源丰富，价格便宜。在本发明的注射用肝素钙脂质体制剂中，海藻糖和山梨醇能有效保护脂质体颗粒的形态和稳定性，进一步提高脂质体注射剂的稳定性。
聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是高分子化合物，熔点高，在水和有机溶剂中的溶解性均良好，毒性低，生理相容性良好，具有分散药物的作用，由于它的存在可使水相粘稠度增加，包封在脂质体中间的水膜中使水溶性药物具有较高的包封率，并且能使药物在储存中稳定。
本发明的注射用肝素钙脂质体制剂，按干燥品计算，每1mg肝素钙效价不低于100IU，抗Xa活性与抗IIa活性的比率不小于2.5，因此肝素钙的规格一般可为5000IU、7500IU、10000IU。
另一方面，本发明还提供一种注射用肝素钙脂质体制剂的制备方法，具体包括如下制备步骤：
(1)将胆固醇、磷脂酰甘油、卵磷脂和聚氧乙烯40氢化蓖麻油置于梨形瓶中，加入有机溶剂，加热搅拌使其溶解，然后于旋转蒸发器上减压除去有机溶剂，在瓶壁上形成均匀透明的磷脂膜；
(2)在氮气保护下，向瓶中加入肝素钙和PVP的水溶液，搅拌，使磷脂膜洗脱并充分溶胀水合，水化完全后在100bar到600bar做梯度均质4～6遍，0.22μm微孔滤膜过滤，制得肝素钙质体；
(3)无菌条件下，将海藻糖和山梨醇溶于注射用水中，然后加入到肝素钙脂质体中，加注射用水定容，经0.45μm微孔滤膜过滤，灌装，然后进行冻干，即得注射用肝素钙脂质体制剂。
上述所述的制备方法，所述的有机溶剂选自苯甲醇、甲醇、正丁醇、异丙醇、丙酮、乙腈、乙醇、乙醚、正己烷、氯仿和二氯甲烷中的一种或几种，优选为乙醇。
上述所述的制备方法，其中步骤(3)中所述的冻干为：在-40℃～-50℃预冻2～3小时，接着在-20℃～-25℃冷冻6～8小时，再经18～34小时升华至20℃～25℃，最后在30℃～35℃干燥1～3小时。制备脂质体的挑战在于如何使脂质体膜形成适当大小、适当结构材料的包封率高的囊泡。而且这些材料在形成脂质体不漏出。
本发明人通过选择适当的材料成分、采用合适的制备工艺，获得了品质优良的注射用肝素钙脂质体制剂，脂质体粒径小，粒径分布均匀，包封率高，稳定性高。
研究发现，脂质体的大小是影响脂质体在体内分布和停留时间的主要因素，脂质体的粒径越小，体内停留时间越长。通过本发明方法制备的肝素钙脂质体颗粒小，粒径大小分布均匀，这是其在体内代谢率低、生物利用度高的因素之一。
实施例
以下通过具体优选的实施例对本发明进行进一步说明。这些实施例仅是说明性的，并不应理解为对本发明的限制。
实施例1注射用肝素钙脂质体制剂的制备
所用原辅料成分及其重量如下(1000瓶)：
采用制备工艺制备注射用肝素钙脂质体制剂：
(1)将90g胆固醇、150g磷脂酰甘油、30g卵磷脂和20g聚氧乙烯40氢化蓖麻油置于梨形瓶中，加入10000ml乙醇，加热搅拌使其溶解，然后于旋转蒸发器上减压除去有机溶剂，在瓶壁上形成均匀透明的磷脂膜；
(2)在氮气保护下，向瓶中加入100g肝素钙和30gPVP溶于1200ml注射用水中的溶液，搅拌，使磷脂膜洗脱并充分溶胀水合，水化完全后在100bar到600bar做梯度均质4～6遍，0.22μm微孔滤膜过滤，制得肝素钙质体；
(3)无菌条件下，将20g海藻糖和30g山梨醇溶于600ml注射用水中，然后加入到肝素钙脂质体中，加注射用水定容至2000ml，经0.45μm微孔滤膜过滤，灌装，然后在-40℃～-50℃预冻2～3小时，接着在-20℃～-25℃冷冻6～8小时，再经18～34小时升华至20℃～25℃，最后在30℃～35℃干燥1～3小时，即得注射用肝素钙脂质体制剂。
实施例2注射用肝素钙脂质体制剂的制备
所用原辅料成分及其重量如下(1000瓶)：
采用制备工艺制备注射用肝素钙脂质体制剂：
(1)将95g胆固醇、165g磷脂酰甘油、35g卵磷脂和30g聚氧乙烯40氢化蓖麻油置于梨形瓶中，加入10000ml乙醇，加热搅拌使其溶解，然后于旋转蒸发器上减压除去有机溶剂，在瓶壁上形成均匀透明的磷脂膜；
(2)在氮气保护下，向瓶中加入100g肝素钙和55gPVP溶于1200ml注射用水中的溶液，搅拌，使磷脂膜洗脱并充分溶胀水合，水化完全后在100bar到600bar做梯度均质4～6遍，0.22μm微孔滤膜过滤，制得肝素钙质体；
(3)无菌条件下，将35g海藻糖和45g山梨醇溶于600ml注射用水中，然后加入到肝素钙脂质体中，加注射用水定容至2000ml，经0.45μm微孔滤膜过滤，灌装，然后在-40℃～-50℃预冻2～3小时，接着在-20℃～-25℃冷冻6～8小时，再经18～34小时升华至20℃～25℃，最后在30℃～35℃干燥1～3小时，即得注射用肝素钙脂质体制剂。
实施例3注射用肝素钙脂质体制剂的制备
所用原辅料成分及其重量如下(1000瓶)：
采用制备工艺制备注射用肝素钙脂质体制剂：
(1)将50g胆固醇、90g磷脂酰甘油、20g卵磷脂和20g聚氧乙烯40氢化蓖麻油置于梨形瓶中，加入6000ml乙醇，加热搅拌使其溶解，然后于旋转蒸发器上减压除去有机溶剂，在瓶壁上形成均匀透明的磷脂膜；
(2)在氮气保护下，向瓶中加入50g肝素钙和40gPVP溶于600ml注射用水中的溶液，搅拌，使磷脂膜洗脱并充分溶胀水合，水化完全后在100bar到600bar做梯度均质4～6遍，0.22μm微孔滤膜过滤，制得肝素钙质体；
(3)无菌条件下，将25g海藻糖和30g山梨醇溶于300ml注射用水中，然后加入到肝素钙脂质体中，加注射用水定容至1000ml，经0.45μm微孔滤膜过滤，灌装，然后在-40℃～-50℃预冻2～3小时，接着在-20℃～-25℃冷冻6～8小时，再经18～34小时升华至20℃～25℃，最后在30℃～35℃干燥1～3小时，即得注射用肝素钙脂质体制剂。
对比例1-3注射用肝素钙脂质体制剂的制备
采用与分别与实施例1-3中相同的生产工艺，将如下表1中所示的对比例1-3中的原辅料成分分别制成注射用肝素钙脂质体制剂：
表1对比例1-3中所用原辅料成分
其中，“/”表示未使用。
试验例1脂质体粒径的测定
室温条件下，取实施例1-3和对比例1-3中的注射用肝素钙脂质体制剂，置于Submicron ParticleSizer Model 370粒径检测仪的样品管中，测定粒径大小分布及平均粒径；用投射电子显微镜观察粒子形态。结果示于下表2中。
表2脂质体粒径检测结果
从表2可知，实施例1-3制得的固体脂质纳米粒粒径均匀，显球形，大小均一；对比例1-3制得的固体脂质纳米粒粒径不均匀，形状不定，大小不一。
具体而言，即使在采用同样的生产工艺时，实施例1-3中所得肝素钙脂质体的颗粒外观及其平均粒径明显优于对比例1-3中所得的肝素钙脂质体。说明当使用本发明所用成分以外的成分时，所得肝素钙脂质体的外观劣于本发明，平均粒径明显大出很多。当成分用量在本发明限定的成分用量范围外时，得到的肝素钙脂质体也不如权利要求范围内制得的肝素钙脂质体好。
试验例2包封率的测定
将实施例1-3和对比例1-3中制备的注射用肝素钙脂质体制剂以5000r/min的转速高速离心，离心20分钟，取上清液，用甲醇溶解，HPLC法测肝素钙含量，计算包封率，结果示于下表3中。
表3包封率测定结果
由表3可知，实施例1-3制备的脂质体制剂的包封率显著的高于对比例1-3的脂质体制剂的包封率。说明当使用本发明所用成分以外的成分时，或者当成分用量在本发明限定的成分用量范围外时，所得脂质体的脂质体包封率低于本发明。
试验例3稳定性考察
将本发明实施例1-3制备的样品，对比例1-3制备的样品和上市肝素钙注射液(批号：20101211，深圳赛保尔生物药业有限公司)分别置于高温40℃、相对湿度75％的条件下6个月，进行加速试验考察，实验结果示于下表4中。
表4加速试验结果
由表4可知，加速6月时，上市制剂含量降低，有关物质升高；而本发明的样品性状、含量和有关物质变化均不明显，说明本发明的产品稳定性好。
试验例4渗漏率试验
取试验例1-3和对比例1-3制备的样品，在室温条件下，分别于0天、30天、60天、90天和180天，定期检查，测定包封率，与0天包封的药量比较，计算渗漏率，结果示于下表5中。
表5渗漏率试验结果
由表5可知，长期储存时，本发明实施例1-3中制备的注射用肝素钙脂质体制剂渗漏率变化不大，而对比例1-3中制备的注射剂渗漏率逐渐增大，脂质体渗漏严重，这说明本发明制备的注射用肝素钙脂质体制剂具有更高的稳定性。
试验例5血药浓度的测定
将56只大鼠随机分成7组，每组分别注射给药实施例1-3及对比例1-3中制备的注射剂，以及市售肝素钙注射液(批号：20101211，深圳赛保尔生物药业有限公司)，注射量为1.00mg肝素钙。给药后分别于0.5h、1h、2h、4h、6h、10h、15h、20h和30h，采血，血样经处理后，以HPLC-MS法测定血药浓度。绘制实施例1-3中制备的注射用肝素钙脂质体制剂、对比例1-3中制备的注射用肝素钙脂质体制剂和市售肝素钙注射剂(上市例)的血药浓度与时间的关系曲线，示于附图1中。
由图1可知，与对比例1-3中制备的注射用肝素钙脂质体制剂和市售肝素钙脂质体注射液相比，本发明实施例1-3中制备的注射用肝素钙脂质体制剂具有以下优点：在体内的消除速度减缓，在体循环中分布时间延长，达到了改进的缓释效果，生物利用度增加。
工业实用性
由上述实施例以及实验例的结果可知，本发明的肝素钙脂质体具有良好的外观，颗粒小，粒径均匀，包封率高，稳定性高，渗漏率低，在体内的停留时间长，生物利用度高，具有良好的工业应用价值。
以上通过具体实施方式和实施例对本发明进行了详细说明，不过应理解，这些说明并不对本发明的范围构成任何限制，在不偏离本发明的精神和保护范围的情况下，可以对本发明的技术方案及其实施方式进行多种修饰、改进和替换，这些均因落入本发明的保护范围内。
本申请中提及或引用的各个参考文献，在此全文引入作为参考。
Claims (7)
1.一种注射用肝素钙脂质体制剂，其由包括以下重量配比的药物和赋形剂成分制成：
2.根据权利要求1所述的注射用肝素钙脂质体制剂，其由包括以下重量配比的药物和赋形剂成分制成：
3.根据权利要求1所述的注射用肝素钙脂质体制剂，其由包括以下重量配比的药物和赋形剂成分制成：
4.根据权利要求1-3中任一项所述的注射用肝素钙脂质体制剂，其中肝素钙的规格为5000IU、7500IU、10000IU。
5.一种制备根据权利要求1-3中任一项所述的注射用肝素钙脂质体制剂的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将胆固醇、磷脂酰甘油、卵磷脂和聚氧乙烯40氢化蓖麻油置于梨形瓶中，加入有机溶剂，加热搅拌使其溶解，然后于旋转蒸发器上减压除去有机溶剂，在瓶壁上形成均匀透明的磷脂膜；
（2）在氮气保护下，向瓶中加入肝素钙和PVP的水溶液，搅拌，使磷脂膜洗脱并充分溶胀水合，水化完全后在100bar到600bar做梯度均质4～6遍，0.22μm微孔滤膜过滤，制得肝素钙脂质体；
（3）无菌条件下，将海藻糖和山梨醇溶于注射用水中，然后加入到肝素钙脂质体中，加注射用水定容，经0.45μm微孔滤膜过滤，灌装，然后进行冻干，即得注射用肝素钙脂质体制剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述的有机溶剂为乙醇。
7.根据权利要求5所述的注射用肝素钙脂质体制剂的制备方法，其特征在于步骤（3）中所述的冻干过程为：在-40℃～-50℃预冻2～3小时，接着在-20℃～-25℃冷冻6～8小时，再经18～34小时升华至20℃～25℃，最后在30℃～35℃干燥1～3小时。
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Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 570216 HAIKOU, HAINAN PROVINCE TO: 856100 LHOKA PREFECTURE, TIBET AUTONOMOUS REGION |
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| TR01 | Transfer of patent right |
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Granted publication date: 20130320 Termination date: 20160302 |
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