CN102626389B - 一种奥硝唑脂质体注射剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种奥硝唑脂质体注射剂及其制法。该脂质体注射剂由特定重量配比的奥硝唑、二月桂酰磷脂酰甘油、大豆甾醇、吐温60、海藻糖制成。本发明的脂质体注射剂具有良好的制剂稳定性，长期储存后，脂质体同样保持良好的包封率；本发明提高了制剂产品的质量，增加了药物在体循环中的保留时间，提高了药物的生物利用度，减少了毒副作用，并且制法简单，适合于工业化大生产。

Description

一种奥硝唑脂质体注射剂

技术领域

本发明涉及一种奥硝唑的新型注射剂及其制法，具体涉及一种奥硝唑脂质体注射剂及其制法，属于药物制剂技术领域。

背景技术

奥硝唑(Ornidazole)为白色或微黄色结晶性粉末，无臭，味苦，遇光色渐变黄，相对分子质量：219.63，分子式：C₇H₁₀ClN₃O₃，其化学名为1-(3-氯-2-羟丙基)-2-甲基-5-硝基咪唑；化学结构式如下：

奥硝唑为硝基咪唑类衍生物，是一种强力抗厌氧菌及抗原虫感染的药物，是疗效更高、疗程更短、耐受性更好、体内分布更广的第三代硝基咪唑类衍生物。奥硝唑的抗微生物作用是通过其分子中的硝基在无氧环境中还原成氨基，或通过自由基的形成与细胞成分相互作用，从而导致微生物的死亡。研究发现奥硝唑在抗广谱真菌感染方面也起重要作用。

目前国内上市的用于注射给药的奥硝唑产品，都只是普通的工艺制备生产的。由于奥硝唑微溶于水溶解缓慢，所以普通工艺中都会用到有机溶剂，但是增溶的同时也增大了生产的危险性，而且奥硝唑其本身对光也不稳定，所以普通工艺制备生产的产品，运输、贮存、使用过程中都会对其稳定性产生不好影响，同样也影响了临床使用的安全性。

奥硝唑临床上用于治疗由脆弱拟杆菌、狄氏拟杆菌、卵园拟杆菌、多形拟杆菌、普通拟杆菌、梭状芽胞杆菌、真杆菌、消化球菌和消化链球菌、幽门螺杆菌、黑色素拟杆菌、梭杆菌、CO2噬织维菌、牙龈类杆菌等敏感厌氧菌所引起的多种感染性疾病，手术前预防感染和手术后厌氧菌感染的治疗以及治疗消化系统严重阿米巴虫病如阿米巴痢疾、阿米巴肝脓肿等。

国外有奥硝唑注射液上市，其处方中是采用的丙二醇和无水乙醇的混合溶液作为的溶剂，相对来说生产成本降低了，但却增大了生产危险性。专利文献CN1768742A公开了一种奥硝唑的静脉给药制剂及制备方法，其中所述制剂为奥硝唑冻干制剂和注射液制剂，处方辅料虽然经过了筛选，但其产品依然逃脱不了普通制法制备注射剂，物理和化学性质稳定性差，长期存放药品质量会下降而且还会生成一些杂质，带来毒副作用等顽点，给临床使用会带来隐患。

在药物载体输送系统中，微乳、微球、纳米粒、脂质体、药质体等亚微粒的研究已经成为药物新剂型研究中非常活跃的领域。将药物包封于这些亚微粒中可以改变药物在体内的分布，增加药物在靶器官的分布量，从而提高疗效，减轻毒副作用。

在靶向给药系统中，脂质体的研究较为广泛，脂质体在体内具有良好的靶向性和生物相容性。

脂质体(Liposome)最初是由英国学者Bangham和Standlish将磷脂分散在水中进行电镜观察时发现的。磷脂分散在水中自然形成多层囊泡，每层都是均未脂质的双分子层；囊泡中央和各层之间被水相隔开，双分子层厚度约为4nm。后来，将这种具有类似生物膜结构的双分子小囊称为脂质体。脂质体可分为多室脂质体和单室脂质体。单室脂质体又分为小单室脂质体和大单室脂质体。小单室脂质体为球形，尺寸一般为20-50纳米；大单室脂质体的尺寸为微米数量级。

1971年英国莱门等人开始将脂质体用于药物载体，主要作用机理是将药物粉末或溶液包裹在脂质体双层脂质膜所封闭的水相中或嵌入脂质体双层脂质膜中，这种微粒具有类细胞结构，进入人体内主药被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中积蓄，从而提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。

近年来，随着生物技术的不断进展，脂质体制备工艺逐步完善，脂质体作用机制进一步阐明，加之脂质体适合体内降解、无毒性和无免疫原性，特别是大量试验数据证明脂质体作为药物载体可以提高药物治疗指数、降低药物毒性和减少药物副作用，并减少药物剂量等优点。

专利文献CN101632639A公开了本发明提供一种替硝唑脂质体注射剂及其制备方法，由如下重量份组分制成：替硝唑1份，磷脂2～10份，胆固醇0.5～3份，吐温802～5份，脱氧胆酸钠1～2份。但是并未很好解决其包封率的问题。

本发明人将脂质体技术用于奥硝唑，解决了普通注射剂的不足。不过，制备脂质体的挑战在于选择适当的脂质体组成成分和制法。由于脂质体的性质如稳定性、包封率、起效时间、在体内的循环时间、生物利用度和毒副作用等与其组成直接地密切相关，而所用组份又与所要包封的药物性质直接地密切相关，因此，选择什么样的成份形成具有良好品质的脂质体是亟待解决的课题。

发明内容

为了形成品质优良的奥硝唑脂质体注射剂，重要的是寻找能与奥硝唑良好相容从而将其良好包封且不渗漏的成膜材料，以及寻找能使脂质体形成稳定注射液的赋形剂成分。

为了实现上述目的，本发明人进行的大量研究和实现，发现特定重量配比的奥硝唑、二月桂酰磷脂酰甘油、大豆甾醇、吐温60、海藻糖能制成奥硝唑脂质体注射剂，其中，作为药物活性成分的奥硝唑的包封率高，脂质体粒径小且分布均匀，与现有技术中的奥硝唑注射液相比，本发明制剂的药物活性成分在体循环中的保留时间显著延长，药物的生物相容性高，生物利用度明显提高，疗效明显提高。

本发明的目的是提供一种奥硝唑脂质体注射剂，其主要由以下重量配比的成份制成：

优选地：吐温60与大豆甾醇的重量之和与二月桂酰磷脂酰甘油之间的重量比为2∶3～1∶2。

作为本发明一优选实施方案，所述的奥硝唑脂质体注射剂，主要由以下重量配比的成份制成：

优选地：吐温60与大豆甾醇的重量之和与二月桂酰磷脂酰甘油之间的重量比为1∶1。

作为用于形成脂质体的磷脂，可以使用天然磷脂和合成磷脂。在本发明中，作为药物活性成分的奥硝唑，其水溶不好。针对奥硝唑的特点，本发明人通过研究发现二月桂酰磷脂酰甘油特别适于作为基础磷脂成膜材料。

二月桂酰磷脂酰甘油(phosphatidyl ethanolamine，PE)作为一种合成磷脂，其含量高，价格相对便宜。二月桂酰磷脂酰甘油的相变温度高，容易于形成稳定的脂质体膜。

当使用其他磷脂时，难以形成品质优良的脂质体，脂质体的包封率、稳定性、和渗漏率等性质下降。

为了改善脂质体的稳定性，所用二月桂酰磷脂酰甘油的纯度为98％以上。

在本发明的奥硝唑脂质体注射剂中，相对于1重量份的奥硝唑而言，二月桂酰磷脂酰甘油的用量为2-3重量份。如果二月桂酰磷脂酰甘油的用量低于2重量份，则形成的脂质体的稳定性会大幅度降低；反之，如果二月桂酰磷脂酰甘油的用量高于3重量份，则作为药物活性成分的奥硝唑的包封率也会随之下降，注射液的品质以及疗效降低。

在本发明的奥硝唑脂质体注射剂中，大豆甾醇以及吐温60用于调节脂质体的膜稳定性。

大豆甾醇(soybean sterol，SS)能调节二月桂酰磷脂酰甘油膜的稳定性。是大豆甾醇葡萄糖苷去葡萄糖残基的水解产物，所述大豆甾醇葡萄糖苷是从经提炼豆油的大豆残渣中分离出来的甾醇葡萄糖苷的混合物。作为一种天然产物，大豆甾醇来源丰富，价格便宜。

本发明人经过研究发现，大豆甾醇与吐温60的重量之和与二月桂酰磷脂酰甘油重量比为1∶1时，能形成稳定的奥硝唑脂质体。当与大豆甾醇的重量之和与二月桂酰磷脂酰甘油重量比高于1∶1时，膜稳定性降低，奥硝唑易于渗漏；当与大豆甾醇的重量之和与二月桂酰磷脂酰甘油重量比低于1∶1时，奥硝唑脂质体膜流动性过高，被包裹在脂质体内的奥硝唑易于释放。此外，研究发现，当大豆甾醇与吐温60的重量之和与二月桂酰磷脂酰甘油重量比为1∶1时，所形成的脂质体毒性最低。

研究表明，脂质体的稳定性与生物利用度有密切的对应关系。颗粒小稳定性高，生物利用度越高。因此，本发明的奥硝唑脂质体注射剂的稳定性高颗粒小，是导致药物生物利用度高的因素之一。

另一方面，本发明人研究发现，在本发明的奥硝唑脂质体注射剂中，相对于1重量份的奥硝唑而言，二月桂酰磷脂酰甘油的用量为2-3重量份，大豆甾醇为1-2重量份，且与大豆甾醇的重量之和与二月桂酰磷脂酰甘油重量比为1∶1时，所形成的奥硝唑脂质体注射剂的包封率高。

在本发明的奥硝唑脂质体注射剂中，使用吐温60来进一步改进脂质体膜的稳定性。吐温60(聚山梨醇60)是一种非离子表面活性剂，当用于二月桂酰磷脂酰甘油双层膜中时，能提高该双层膜之间的化学能，从而提高脂质体在水性液体中的化学稳定性，进而提高奥硝唑脂质体注射剂的稳定性。

在本发明的奥硝唑脂质体注射剂中，相对于1重量份的奥硝唑而言，吐温60的用量为0.5-1重量份。如果吐温60的用量低于0.5重量份，则由于其用量过低导致对奥硝唑脂质体注射剂的稳定性改进不够，反之，如果吐温60的用量高于1重量份，则用于其用量过高而导致脂质体膜易于泄露。

研究发现，当使用上述特定量的奥硝唑、二月桂酰磷脂酰甘油、大豆甾醇和吐温60时，可以得到品质优良的奥硝唑脂质体，其包封率和稳定性都很高，毒性低，生物利用度高。

在本发明的奥硝唑脂质体注射剂中，使用海藻糖作为赋形剂，用于形成稳定的注射液。

海藻糖是由两个葡萄糖分子以α，α，1，1-糖苷键构成的非还原性糖，自身性质非常稳定，它最明显的性质是在无水的条件下有保护生物膜的能力，使脂质体即使在脱水的情况下也保持形态完整。

在本发明的奥硝唑脂质体注射剂中，海藻糖能有效保护脂质体颗粒的形态和稳定性，进一步提高脂质体注射剂的稳定性。

本发明的奥硝唑脂质体注射剂，其中奥硝唑注射液的规格为10ml∶0.5g、5ml∶0.5g、5ml∶0.25g(注射液体积∶奥硝唑重量)，无菌粉注射剂规格为0.25g。

本发明还提供一种奥硝唑脂质体注射剂的制法，具体包括如下制备步骤：

(1)将二月桂酰磷脂酰甘油、大豆甾醇、海藻糖和吐温60溶于70％乙醇水溶液中，混合均匀，于旋转薄膜蒸发器上减压除去有机溶剂，得到类脂膜；

(2)向瓶中加入缓冲溶液适量，振摇30分钟，转速为400-700r/min，使磷脂膜完全水化，用组织捣碎机高速匀质乳化10-15分钟，转速8000r/min，用0.45μm微孔滤膜过滤，制得脂质体混悬液；

(3)无菌条件下，脂质体混悬液中加入奥硝唑震摇均匀；然后在100bar到800bar做梯度均质5～6遍；

(4)快速冷冻，然后恢复到室温，定容搅拌均匀0.22μm微孔滤膜过滤，灌装，即得奥硝唑脂质体注射剂；

其中，步骤(4)包括：

(a)快速冷冻，然后恢复到室温，定容搅拌均匀0.22μm微孔滤膜过滤，灌装，即得奥硝唑脂质体注射液；

(b)快速冷冻，然后恢复到室温，定容搅拌均匀0.22μm微孔滤膜过滤，灌装，冷冻干燥，即得奥硝唑脂质体冻干粉针剂；

上述所述的制法，其中步骤(2)所述的缓冲盐溶液选自盐酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、枸橼酸盐缓冲溶液和硼酸盐缓冲溶液中的一种，优选为pH6.8的磷酸盐缓冲溶液。

上述所述的制法，其中(4)步骤(a)或(b)中所述的快速冷冻的温度为约-40℃。

对载药脂质体来说，脂质体大小均匀适当、结构材料的包封率高、材料形成的质体不漏出活性成分等都是个挑战。

本发明人筛选适当的材料成分、采用合适的制备工艺，获得了脂质体粒径小，粒径分布均匀，包封率高，稳定性高的品质优良的奥硝唑脂质体注射剂。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1是奥硝唑脂质体注射剂的血药浓度-时间曲线。

其中：

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，但绝不是对本发明范围的限制。下面参照实施例进一步详细阐述本发明，但是本领域技术人员应当理解，本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法。而且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替换、组合、改良或修饰，但这些都将包括在本发明的范围内。

实施例1  奥硝唑脂质体注射剂的制备

处方：(1000瓶)

制备工艺：

(1)将二月桂酰磷脂酰甘油1500g、大豆甾醇1000g、海藻糖500g和500g吐温60溶于2500ml的70％乙醇水溶液中，混合均匀，于旋转薄膜蒸发器上减压除去有机溶剂，得到类脂膜；

(2)向瓶中加入缓冲溶液适量，振摇30分钟，转速为400-700r/min，使磷脂膜完全水化，用组织捣碎机高速匀质乳化10-15分钟，转速8000r/min，用0.45μm微孔滤膜过滤，制得脂质体混悬液；

(3)无菌条件下，脂质体混悬液中加入奥硝唑500g震摇均匀；然后在100bar到800bar做梯度均质5～6遍；

(4)快速冷冻，然后恢复到室温，定容到10L搅拌均匀0.22μm微孔滤膜过滤，灌装10ml/瓶，即得奥硝唑脂质体注射液；

实施例2  奥硝唑脂质体注射剂的制备

处方：(1000瓶)

制备工艺：

(1)将二月桂酰磷脂酰甘油1000g、大豆甾醇500g、海藻糖500g和500g吐温60溶于2000ml的70％乙醇水溶液中，混合均匀，于旋转薄膜蒸发器上减压除去有机溶剂，得到类脂膜；

(2)向瓶中加入缓冲溶液，振摇30分钟，转速为400-700r/min，使磷脂膜完全水化，用组织捣碎机高速匀质乳化10-15分钟，转速8000r/min，用0.45μm微孔滤膜过滤，制得脂质体混悬液；

(3)无菌条件下，脂质体混悬液中加入奥硝唑500g震摇均匀；然后在100bar到800bar做梯度均质5～6遍；

(4)快速冷冻，然后恢复到室温，定容到5L搅拌均匀0.22μm微孔滤膜过滤，灌装5ml/瓶，即得奥硝唑脂质体注射液；

实施例3  奥硝唑脂质体注射剂的制备

处方：(1000瓶)

制备工艺：

(1)将二月桂酰磷脂酰甘油750g、大豆甾醇500g、海藻糖250g和250g吐温60溶于1500ml的70％乙醇水溶液中，混合均匀，于旋转薄膜蒸发器上减压除去有机溶剂，得到类脂膜；

(2)向瓶中加入缓冲溶液，振摇30分钟，转速为400-700r/min，使磷脂膜完全水化，用组织捣碎机高速匀质乳化10-15分钟，转速8000r/min，用0.45μm微孔滤膜过滤，制得脂质体混悬液；

(3)无菌条件下，脂质体混悬液中加入奥硝唑250g震摇均匀；然后在100bar到800bar做梯度均质5～6遍；

(4)快速冷冻，然后恢复到室温，定容到5L搅拌均匀0.22μm微孔滤膜过滤，灌装5ml/瓶，即得奥硝唑脂质体注射液；

实施例4  奥硝唑脂质体注射剂的制备

处方：(1000瓶)

制备工艺：

(1)将二月桂酰磷脂酰甘油750g、大豆甾醇500g、海藻糖250g和250g吐温60溶于1500ml的70％乙醇水溶液中，混合均匀，于旋转薄膜蒸发器上减压除去有机溶剂，得到类脂膜；

(2)向瓶中加入缓冲溶液，振摇30分钟，转速为400-700r/min，使磷脂膜完全水化，用组织捣碎机高速匀质乳化10-15分钟，转速8000r/min，用0.45μm微孔滤膜过滤，制得脂质体混悬液；

(3)无菌条件下，脂质体混悬液中加入奥硝唑250g震摇均匀；然后在100bar到800bar做梯度均质5～6遍；

(4)快速冷冻，然后恢复到室温，定容到2L搅拌均匀0.22μm微孔滤膜过滤，灌装2ml/瓶，冷冻干燥即得奥硝唑脂质体冻干粉针剂。

对比例1-4  奥硝唑脂质体注射剂的制备

分别采用与实施例1-4中相同的生产工艺，将如下表1中所示的对比例1-4中的成分分别制成奥硝唑脂质体注射剂：

表1对比例1-4中所用成分

其中，“/”表示未使用。

试验例1  脂质体粒径的测定

室温条件下，取实施例1-4和对比例1-4中的奥硝唑脂质体注射剂，置于SubmicronParticle Sizer Model 370粒径检测仪的样品管中，测定粒径大小分布及平均粒径；用投射电子显微镜观察粒子形态。结果示于下表2中。

表2脂质体粒径检测结果

从表2可知，实施例1-4制得的脂质体粒径均匀，显球形，大小均一；对比例1-4制得的脂质体粒径不均匀，形状不定，大小不一。

具体而言，即使在采用同样的生产工艺时，实施例1-4中所得奥硝唑脂质体的颗粒外观及其平均粒径明显优于对比例1-4中所得的奥硝唑脂质体。说明当使用本发明所用成分以外的成分时，或者当成分用量在本发明限定的成分用量范围外时，所得奥硝唑脂质体的外观劣于本发明，平均粒径大出很多。

试验例2  包封率的测定

将实施例1-4和对比例1-4中制备的奥硝唑脂质体注射剂以5000r/min的转速高速离心，离心20分钟，取上清液，用甲醇水超声溶解，HPLC法测奥硝唑含量，计算包封率，结果示于下表3中。

表3包封率测定结果

由表3可知，实施例1-4制备的脂质体制剂的包封率显著的高于对比例1-4的脂质体制剂的包封率。说明当使用本发明所用成分以外的成分时，或者当成分用量在本发明限定的成分用量范围外时，所得脂质体的脂质体包封率低于本发明。

试验例3  稳定性考察

将本发明实施例1-4和对比例1-4制备的样品和上市的奥硝唑注射液(批号：20110310，山西普德药业股份有限公司，生产地址：山西省大同市经济技术开发区)分别置于高温40℃、相对湿度75％的条件下6个月，进行加速试验考察，实验结果示于下表4中。

表4加速试验结果

由表4可知，加速6月时，对比例及上市制剂含量降低，有关物质升高；而本发明的样品性状、含量和有关物质变化均不明显，说明本发明的产品稳定性好。

试验例4  渗漏率试验

取试验例1-4和对比例1-4制备的样品，在室温条件下，分别于0天、30天、60天、90天和180天，定期检查，测定包封率，与0天包封的药量比较，计算渗漏率，结果示于下表5中。

表5渗漏率试验结果

由表5可知，长期储存时，本发明实施例1-4中制备的奥硝唑脂质体注射剂渗漏率变化不大，而对比例1-4中制备的注射液渗漏率逐渐增大，脂质体渗漏严重，这说明本发明制备的奥硝唑脂质体注射剂具有更高的稳定性。

试验例5  血药浓度的测定

将28只大鼠随机分成4组，每组分别注射给药实施例1-4及对比例1-4中制备的注射液，以及市售(批号：20110310，山西普德药业股份有限公司，生产地址：山西省大同市经济技术开发区)，规格为10ml∶0.5g奥硝唑注射液。给药后分别于0.5h、1h、1.5h、2h、3h、6h、8h、12h和24h，采血，血样经处理后，以HPLC-MS法测定血药浓度。绘制实施例1-4中制备的奥硝唑脂质体注射剂、对比例1-4中制备的奥硝唑脂质体注射剂和市售注射用奥硝唑的血药浓度与时间的关系曲线，示于附图1中。

由图1可知，实施例1-4与对比例1-4中制备的奥硝唑脂质体注射剂和市售奥硝唑注射剂相比，本发明实施例1-4中制备的奥硝唑脂质体注射剂具有以下优点：体内的消除速度慢，体循环中分布时间延长，达到了缓释效果，生物利用度提高了。

工业实用性

以上通过具体实施方式对本发明进行进一步说明：根据实施例以及实验例的结果可知，本发明的奥硝唑脂质体具有良好的外观，颗粒小，粒径均匀，包封率高，稳定性高，渗漏率低，在体内的停留时间长，生物利用度高，具有良好的工业应用价值。

以上通过具体实施方式和实施例对本发明进行了详细说明，不过应理解，这些说明并不对本发明的范围构成任何限制，在不偏离本发明的精神和保护范围的情况下，可以对本发明的技术方案及其实施方式进行多种修饰、改进和替换，因这些均落入本发明的保护范围内。

Claims (2)

1.一种奥硝唑脂质体注射剂，其特征在于主要由以下重量配比的成份制成：

其中，吐温60与大豆甾醇的重量之和与二月桂酰磷脂酰甘油之间的重量比为1:1；

其中制备方法包括以下步骤：

（1）将二月桂酰磷脂酰甘油、大豆甾醇、海藻糖和吐温60溶于70%乙醇溶液中，混合均匀，于旋转薄膜蒸发器上减压除去有机溶剂，得到类脂膜；

（2）向瓶中加入缓冲溶液，振摇30分钟，转速为400-700r/min，使磷脂膜完全水化，用组织捣碎机高速匀质乳化10-15分钟，转速8000r/min，用0.45μm微孔滤膜过滤，制得脂质体混悬液；所述缓冲溶液为pH6.8的磷酸盐缓冲溶液；

（3）无菌条件下，脂质体混悬液中加入奥硝唑振摇均匀；然后在100bar到800bar做梯度均质5～6遍；

（4）快速冷冻，然后恢复到室温，定容搅拌均匀，0.22μm微孔滤膜过滤，灌装，即得奥硝唑脂质体注射剂；所述的快速冷冻的温度为-40℃。

2.根据权利要求1所述的奥硝唑脂质体注射剂，其特征在于步骤（4）中所得的奥硝唑脂质体注射剂，冷冻干燥，即得奥硝唑脂质体冻干粉针剂。