CN101571529A

CN101571529A - 一种毛细管整体柱喷针及其制备和应用

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Publication number: CN101571529A
Application number: CNA2008100112374A
Authority: CN
Inventors: 邹汉法; 王方军; 叶明亮; 董靖
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2008-04-30
Filing date: 2008-04-30
Publication date: 2009-11-04

Abstract

本发明涉及微柱液相色谱与质谱的接口，具体说是一种毛细管整体柱喷针，包括毛细管，毛细管内填充有整体材料，毛细管的一端延伸有一用于电喷雾的针头，构成毛细管整体柱喷针，然后用一个二通把它接到毛细管分离柱的末端并在二通上面施加用于电喷雾的电压。该发明的主要优点是消除了微柱液相色谱与质谱联用中存在与电喷雾喷针中的死体积，从而消除了该死体积对色谱峰的搅乱和混合作用，极大的提高了微柱液相色谱的分离能力和重复性，在定量蛋白质组学中表现出比商品化毛细管电喷雾喷针更优越的性能。另外，由于毛细管整体柱喷针中存在整体柱材料，解决在分离分析过程中电喷雾喷针容易阻塞的问题，大大提高了电喷雾喷针的使用寿命。

Description

一种毛细管整体柱喷针及其制备和应用

技术领域

本发明涉及液质联用接口，具体地说是一种应用于微柱液相色谱与质谱联用系统的毛细管整体柱喷针及其制备和应用。

背景技术

微柱液相色谱(μ-LC)是色谱微型化的一个重要方向，指内径为10μm到1mm的色谱柱的液相色谱分析方法。与常规液相色谱法相比具有柱效高、流动相试剂消耗低、易于实现多维色谱分离及易与质谱联用而提高分析灵敏度等优点，广泛应用于生物类样品的分离分析，特别适用是蛋白组学方面的分析(Ivanov，A.R.，ect，Anal.Chem.，2003，75，5306)。而微柱液相色谱与质谱联用技术也成为蛋白质组学研究中的核心技术，已经在蛋白质组的大规模鉴定，蛋白质组的大规模定量比较等方面有了重要的进步，被广泛应用与生物标记物的寻找，病人与正常人蛋白组的差异比较等许多研究领域(Aebersold，R.，ect，Nature 2003，422，198)。

“shotgun”蛋白质组学研究是一种高通量、高灵敏度的蛋白质组学技术，其核心技术就是将蛋白混合物的酶解产物用微柱液相色谱与质谱联用系统进行分离和鉴定(Ye，M.L.，ect，Trends Anal.Chem.2007，26，80)。在商品化的液质联用系统中，起分离功能的毛细管柱和起电喷雾功能的喷针往往以一个二通进行连接，并且在二通上面施加喷雾电压。由于在微柱系统中商品化的电喷雾喷针都是用空毛细管柱拉制而成，喷针中的死体积不可避免的要带来分离色谱峰的展宽和混合，从而大大降低分离的效果(Meiring，H.D，ect，J.Sep.Sci.2002，25，557)。特别是对无标记的“shotgun”定量蛋白质组学来说，其定量的准确性取决于色谱分离的效果，因为这种方法定量就是通过色谱峰的强度进行定量的，当色谱峰被混合和搅乱后就会在很大程度上影响定量的准确性(Silva，J.C.，ect，Anal.Chem.2005，77，2187)。对于稳定同位素标记的定量方法来说，其定量是通过具有不同标记的来自不同样品的同种肽段在色谱上的出峰时间一致，然后根据其在质谱上的不同相应信号来实现精确定量的(Gygi，S.P.，ect，Nat.Biotechnol.1999，17，994)。因此，如果分离得到的色谱峰被搅乱和混合后，其在质谱上的相应也会变得更加复杂并出现偏差，因此电喷雾喷针对稳定同位素标记的定量方法来说也是有很大的影响的。

毛细管整体柱被人们广泛的应用于微柱液相色谱的分离中，由于它具有很高的渗透性，操作压力比填充柱小很多。而且毛细管整体柱还具有多孔结构，传质速度快，可进行快速分析，具有在酸碱中的稳定性高，生物分子兼容性好，易于制作等诸多优点(Zou，H.F.，ect，J.Chromatogr.A，2002，954)。吴仁安等人制作了一种强疏水性的毛细管整体柱，应用的功能单体为十二烷基甲基丙烯酸酯(LMA)，这种整体柱被成功的应用于毛细管电色谱中分离离子性化合物(Wu，R.A.，ect，Anal.Chem.2001，73，4918)。迄今为止，毛细管整体柱都是作为一种新型的色谱分离柱而被引进微柱液相色谱系统的。

发明内容

本发明旨在制作一种含有整体材料的毛细管整体柱喷针，从而在电喷雾喷针中消除死体积的影响，达到提高分离效率和重复性的作用。并将这种毛细管整体柱喷针应用于定量蛋白质组学研究，提高蛋白定量的重复性和可信性。本发明的这种毛细管整体柱喷针是国内外首次报道的电喷雾喷针，它既具有普通电喷雾喷针的特点，可以方便应用于微柱液相色谱和质谱联用系统，又具有消除了死体积影响，可以提高分离的色谱峰容量和重复性，提高了微柱液相色谱和质谱联用系统在定量蛋白质组学中所得到的可靠信息的数量，并且具有容易制作，可以避免喷针阻塞等诸多优势。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种毛细管整体柱喷针，包括毛细管，毛细管内填充有整体材料，毛细管的一端延伸有一用于电喷雾的针头，构成毛细管整体柱喷针，即在一根毛细管柱内部含有整体材料并且在一端具有拉制出的用于电喷雾的针头；用于电喷雾的针头的内径可根据系统压力限制调整。

所述毛细管整体柱喷针的制备：

1)按常规方法于一毛细管内填充入或制作整体材料，制作一根具有疏水固定相的毛细管整体柱；整体柱的长度可以根据需要而改变；

2)采用液相色谱泵于毛细管整体柱内通入水溶液，在水溶液通过的情况下用丁烷焰灼烧整体柱的出水端，同时用另一根毛细管在烧软的整体柱出水端拉制一个电喷雾针头，最后在含有针头的一端根据需要截取所需长度的毛细管整体柱，即为毛细管整体柱喷针。针头内径的大小可以通过在显微镜下切割而控制，基于电喷雾喷针压力方面的考虑，对于75μm内径的电喷雾喷针其针头控制在5μm左右，而对于25μm内径的电喷雾喷针其针头控制在10μm左右。

在喷针内部填充的整体材料为原位合成的是疏水有机整体材料。

所述疏水有机整体材料可为甲基丙烯酸酯类或聚苯乙烯-二乙烯基苯类的整体材料。

毛细管整体柱制备前应先对毛细管内壁表面进行接双键活化，然后再在毛细管内部原位合成疏水性的整体材料。

如先在毛细管柱管内原位合成含C12烷基的疏水性整体材料，然后再按照上述的方法制作成电喷雾喷针。然后用一个二通将该毛细管整体柱喷针连接到微柱液相色谱毛细管分离柱的末端并在二通上面施加用于电喷雾的电压。

所述毛细管整体柱喷针可应用于微柱液相色谱分离并与质谱联用的系统中，可对流出液体进行电喷雾；所述系统为应用含有毛细管整体柱喷针的毛细管液相色谱与质谱联用进行定量蛋白质组学研究系统；所述进行的定量蛋白质组学研究为无标记蛋白质定量，并且是基于酶解后的肽段的定量分析来得到蛋白质的含量信息。

在液质联用分析中，色谱分离开的分析物经毛细管整体柱喷针喷雾进入质谱进行定性定量检测。由于在喷针中合成有疏水性的整体材料，有效的避免了死体积对分离后物质的搅乱和混合作用，抑制了色谱峰的分裂和展宽，从而提高了峰容量和分离效率。也大大提高了分离的重复性，在定量蛋白质组学研究中表现出比商品话毛细管喷针更优越的性能。

本发明具有以下优点：

1.基本消除了电喷雾喷针中的死体积，提高了整个分离系统的分离能力，可以得到更高的分离峰容量；

2.使色谱系统的分离的重复性得到提高，在定量蛋白质组学研究中能得到更好的效果；

3.由于整体材料的存在，消除了针头阻塞带来的影响，提高了电喷雾喷针的使用寿命；

4.容易制作，可以一次制作1-2米长的整体柱，同时制作出20个左右的7cm长的毛细管电喷雾喷针。

附图说明

图1为毛细管整体柱喷针示意图；其中1为疏水整体材料，2为电喷雾喷针；

图2为毛细管整体柱喷针和商品化喷针在微柱液相色谱质谱联用分析BSA酶解物时所得到的肽段选择离子色谱图；其中，(A)75μm内径的毛细管电喷雾喷针；(B)75μm内径的整体柱电喷雾喷针；(C)25μm内径的商品化毛细管电喷雾喷针；(D)25μm内径的整体柱电喷雾喷针。

图3毛细管整体柱喷针和商品化喷针在定量蛋白质组学中所得到的蛋白定量比较图；其中：A)25μm内径的商品化毛细管电喷雾喷针；(B)25μm内径的整体柱电喷雾喷针。

具体实施方式

由于整体柱中的聚合物材料具有优良的渗透性，发明人先在毛细管内部制作聚合物整体材料，整体柱的长度可以根据需要而改变。然后再用液相色谱泵使水溶液通过该毛细管整体柱，用丁烷焰灼烧整体柱的出水端，同时用另一根空毛细管将烧软的整体柱出水端拉伸而得到电喷雾针头，针头内径的大小可以通过在显微镜下切割而控制，对于75μm内径的电喷雾喷针其针头控制在5μm左右，而对于25μm内径的电喷雾喷针其针头控制在10μm左右。以下实施实例以制备基于C12基团的反相整体聚合物材料为例，但本发明并不局限于此，本发明的特征是在电喷雾喷针内部引入了整体聚合物材料，从而消除死体积，提高了分离效率和重复性。

实施例1

一.疏水聚合物整体柱的制备

在75或者25μm内径，150厘米长的毛细管中合成具有强疏水保留机理的C12烷基聚合物整体柱：

1.毛细管预处理

首先用0.1M NaOH溶液冲洗毛细管空柱1h，再用去离子水冲洗毛细管至流出液体pH值为7.0，接着用0.1M HCl溶液冲洗毛细管4h，再用去离子水冲洗毛细管至流出液体pH值为7.0，然后用甲醇溶液冲洗毛细管柱10min，用氮气吹干。往毛细管中注入甲醇与甲基丙烯酰氧丙基-三甲氧基硅烷的混合物。在20度至70度温度下反应5-24小时。然后用甲醇及水冲洗。最后用氮气吹干待用。

2.C12烷基强疏水性整体材料在毛细管中的聚合

合成该材料所采用的原料及配比来自于吴仁安等人合成的基于十二烷基甲基丙烯酸酯(LMA)的强疏水性整体柱材料(Wu，R.A.，ect，Anal.Chem.2001，73，4918)，并且为了提高其在反相梯度分离中的分离能力，我们对该配比进行了优化，在制作毛细管整体柱喷针中所用的就是优化后的配比。

(2.1)以十二烷基甲基丙烯酸酯为功能单体，二甲基丙烯酸乙二酯为交联剂，正丙醇，1，4-丁二醇和水为制孔剂，单体、交联剂、致孔剂按体积百分比分别为20％、20％和60％均匀混合，所加引发剂的用量为聚合物单体用量(质量)的1％，将混合液用超声振荡15min，制得聚合液。

(2.2)将(2.1)中所配制的聚合液用氮气压入活化吹干后的毛细管，氮气的压力控制在0.03-0.1兆帕；

(2.3)将毛细管两端用硅橡胶封口，然后放入60℃水浴反应12个小时；

(2.4)取出毛细管，接在高效液相色谱泵上，以甲醇为流动相冲去未反应完全的聚合单体和制孔剂。冲洗在恒压模式下进行，压力控制在20兆帕；

(2.5)用氮气在2兆帕压力下吹干毛细管整体柱，吹干时间为1小时。

3.毛细管整体柱喷针的制作

在整体柱上拉电喷雾针头的方法为谢传辉等人提出(Xie，C.H.，ect，Mol.Cell.Proteomics，2006，5，454)，即在用水溶液冲过毛细管整体柱的情况下用丁烷焰将整体柱末端1-2厘米烧软，然后用一根空的毛细管在火焰烧结将烧软后的整体柱平稳拉出。根据需要控制拉出尖端的内径，对于75μm内径的电喷雾喷针其针头控制在5μm左右，而对于25μm内径的电喷雾喷针其针头控制在10μm左右。然后在含有电喷雾针头的一端截下7cm的疏水整体柱，该含有电喷雾针头的7cm长整体柱即为毛细管整体柱喷针。至此，毛细管整体柱喷针制作完成，其示意图如图1所示。这样所得到的毛细管整体柱喷针所含有的死体积几乎可以忽略。

二.毛细管整体柱喷针在微柱液相色谱-质谱联用分析中的应用

该毛细管整体柱喷针可以应用到微柱液相色谱-质谱联用中起电喷雾的作用。

1.BSA胰蛋白酶酶解产物的分离分析

1mg的BSA溶解在1mL，50mM的Tris，8M的尿素溶液中(pH 8.2)，然后用DTT将蛋白中二硫键还原，再加入IAA将游离巯基烷基化，然后将溶液稀释8倍，按照与胰蛋白酶的质量比25∶1的比例加入胰蛋白酶进行酶解反应，反应时间为16h，酶解温度控制在37℃。获得的蛋白酶解溶液置于-30℃冰箱中保存备用。

实验中用到两种流动相，分别为：(A)0.1％甲酸水溶液；(B)0.1％甲酸乙腈溶液。由溶液A和B产生分离梯度，0-40％乙腈梯度为30分钟；40-90％乙腈梯度为2分钟，在90％乙腈梯度持续5分钟后，整个分离系统用100％甲酸水平衡13分钟。

500mM的BSA胰蛋白酶酶解物作为分析样品，对比75和25μm内径的整体柱电喷雾喷针和毛细管电喷雾喷针对分离效果的影响。其中25μm内径毛细管电喷雾喷针为商品化喷针(ThermoFinnigan)，其它都为自制。为了比较分离效果，四个BSA肽段的离子峰被选择性提取出来，如图2所示。我们可以看到，当75μm内径毛细管喷针被使用时，四个峰的峰宽最大，而且前三个峰还有分裂的趋势，这都是由于喷针内部死体积的混合搅动作用引起的。而当75μm整体柱喷针喷针被使用时，四个峰的峰型都变平滑，而且峰宽都有降低。25μm内径毛细管电喷雾喷针的效果虽然比75μm整体柱喷针喷针的效果好一些，但是仍然不如25μm内径的整体柱电喷雾喷针。当25μm内径的整体柱电喷雾喷针被使用时，四个峰的峰宽最小，峰型最好，而且第二个和第三个峰都实现了基线分离。然后我们将15个BSA肽段的离子峰选择性提取出来，测量除了在0.613峰高处的峰宽值W_0.613，每个值都是三次平行分析的平均结果，所有结果都列在表1中。从表中我们可以看出整体柱电喷雾喷针的RSD都要小于毛细管电喷雾喷针，这说明了当使用整体柱电喷雾喷针时能得到更好的分离重复性。而且更重要的是，当毛细管电喷雾喷针被取代为整体柱电喷雾喷针后，15个肽段的平均W_0.613值分别降低了19.0％(75μm)和12.8％(25μm)，这也就意味着峰容量提高了19.0％和12.8％。

2.毛细管整体柱喷针在定量蛋白质组学中的应用

将25μm内径的整体柱电喷雾喷针和商品化的毛细管电喷雾喷针分别应用到商品化的Waters Protein Expression System(PES)无标记蛋白定量系统中，考察两种不同电喷雾喷针在定量效果上的区别。

两种商品化的蛋白混合物的酶解物：Mxiture 1：含有alcoholdehydrogenase(ADH)，glycogen phosphorylase B(phos B)，BSA，和enolase各50pmol；Mixture 2：含有ADH，phos B，BSA，和enolase的量为50，25，400，100pmol。两种混合物被溶解到1mL 0.1％甲酸水溶液中，然后各取75μL添加到500μL蛋白含量为50ng/μL的鼠肝提取液胰蛋白酶酶解物中。然后这两种混合物Mixture 1和Mixture 2被作为测试样品来考察不同电喷雾喷针的定量效果。其中鼠肝提取物的蛋白含量用Bradford法测定，其酶解过程与BSA相同。

当使用商品化的毛细管电喷雾喷针时，四种标准化蛋白只有三种给出了定量信息。BSA，enolase，和phos B在mixture 2和Mixture 1中的相对含量为8.08，1.95，0.51(理论值8，2，0.5)。并且只有27种鼠肝蛋白也同时给出了定量信息，鼠肝蛋白的相对含量都在1左右(如图3所示)。

但当整体柱电喷雾喷针被使用时，四种标准化蛋白都可以给出定量信息，ADH，BSA，enolase，phos B的相对含量为1.04，7.46，1.92，0.51。并且同时还有65个鼠肝蛋白也给出了可靠的定量信息。因此，当整体柱电喷雾喷针被使用时，所得到的定量信息增加了130.0％(如图3所示)。

表1为毛细管整体柱喷针和商品化喷针在微柱液相色谱质谱联用分析BSA酶解物时所得到的15个肽段的W_0.613值。

Claims

1.一种毛细管整体柱喷针，包括毛细管，其特征在于：毛细管内填充有整体材料，毛细管的一端延伸有一用于电喷雾的针头，构成毛细管整体柱喷针。

2.一种权利要求1所述毛细管整体柱喷针的制备方法，其特征在于：

1)按常规方法于一毛细管内制作或填充入整体材料，制作一根毛细管整体柱；

2)于毛细管整体柱内通入水溶液，在水溶液通过的情况下用丁烷焰灼烧整体柱的出水端，同时在烧软的整体柱出水端拉制一个电喷雾针头，最后在含有针头的一端根据需要截取所需长度的毛细管整体柱，即为毛细管整体柱喷针。

3.按照权利要求2所述毛细管整体柱喷针的制备方法，其特征在于：在喷针内部填充的整体材料为原位合成的疏水有机整体材料。

4.按照权利要求2所述毛细管整体柱喷针的制备方法，其特征在于：整体柱制备前应先对毛细管内壁表面进行接双键活化，然后再在毛细管内原位合成疏水有机整体材料。

5.一种权利要求1所述毛细管整体柱喷针的应用，其特征在于：所述毛细管整体柱喷针可应用于微柱液相色谱分离并与质谱联用的系统中，可对流出液体进行电喷雾。

6.按照权利要求5所述毛细管整体柱喷针的应用，其特征在于：所述系统为应用含有毛细管整体柱喷针的毛细管液相色谱与质谱联用进行定量蛋白质组学研究系统。

7.按照权利要求6所述毛细管整体柱喷针的应用，其特征在于：所述进行的定量蛋白质组学研究为无标记蛋白质定量，并且是基于酶解后的肽段的定量分析来得到蛋白质的含量信息。