CN105403638B - 聚甲基丙烯酸甲酯二氧化钛开管柱及其制作方法和应用 - Google Patents

聚甲基丙烯酸甲酯二氧化钛开管柱及其制作方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种固定相为聚甲基丙烯酸甲酯连二氧化钛的液相开管柱及其制作方法和应用。本发明中，首先预处理一段200‑500μm外径，5‑20μm内径的石英毛细管，在石英毛细管内壁键合上硅烷偶联试剂3‑(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷，在所得的石英毛细管内壁聚合生成聚甲基丙烯酸甲酯，再在聚合物上原位反应生成二氧化钛颗粒；将制作好的固定相为聚甲基丙烯酸甲酯连二氧化钛的液相开管柱用于β‑casein酶解液中磷酸化肽段的富集，并利用MALDI‑TOF MS进行磷酸化肽段和非磷酸化肽段的检测。本发明的液相开管柱可作为纳升体积样品以下、甚至单细胞分析的一类色谱柱。

Description

聚甲基丙烯酸甲酯二氧化钛开管柱及其制作方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种固定相为聚甲基丙烯酸甲酯连二氧化钛的液相开管柱及其制作方法，以及在富集纳升体积样品内的磷酸化肽段与MALDI-TOF MS检测中的应用。
背景技术
在蛋白质组学中，蛋白质的翻译后修饰是一种十分重要的生物作用，蛋白质的生物功能与蛋白质翻译后修饰行为有着十分重要的关系。磷酸化是生物细胞中最普遍的翻译后修饰之一，在信号传导、基因表达、新陈代谢、细胞生长、分裂和分化中发挥着重要作用。据估算一个细胞中有30-50%的蛋白质会在任意时刻发生磷酸化，因此对于蛋白质磷酸化的探索是蛋白质组学研究中的重大课题。在蛋白质的酶解液中，翻译后修饰的磷酸化肽段含量较低，大量的非磷酸化肽段会严重削弱磷酸化肽段的质谱信号。因此，在蛋白质的酶解液中富集磷酸化肽段，是一种十分重要的技术手段。
经过大量研究发现，二氧化钛对蛋白质酶解液中的磷酸化肽段有十分优秀的富集作用，具有富集高效，洗脱简易方便的特点。目前，二氧化钛被广泛应用于磷酸化肽段的富集。
在蛋白质组学中，单细胞分析是未来的一个重要发展方向。单个细胞中的蛋白质含量极少，处于amol~zmol水平，同时单个细胞中的蛋白质成分复杂，在质谱分析前必须对细胞溶出物进行分离。由于单个细胞中蛋白质的绝对量极少，而常规色谱柱内径太大，因此无法对其进行有效分离。相比于液相填充柱、液相整体柱，由于液相开管柱内径可以达到20μm及以下，通透性好，柱压低，因此，可成作为纳升体积样品以下、甚至单细胞分析的一类色谱柱。
发明内容
本发明的目的在于利用石英毛细管液相开管柱内径小的优势，实现对纳升体积样品（如:1-100 nL）中的磷酸化肽段进行富集和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）检测。
本发明首先提供一种固定相为聚甲基丙烯酸甲酯连二氧化钛的液相开管柱及其制作方法，然后将固定相为聚甲基丙烯酸甲酯连二氧化钛的液相开管柱用于对纳升体积样品中的磷酸化肽段进行富集和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测。
本发明是通过以下技术方案来实现的:
先预处理一段200-500 μm外径，5-20 μm内径的石英毛细管，在石英毛细管内壁键合上硅烷偶联试剂3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷，在所得的石英毛细管内壁聚合生成聚甲基丙烯酸甲酯，再在聚合物上原位反应生成二氧化钛颗粒；将制作好的固定相为聚甲基丙烯酸甲酯连二氧化钛的液相开管柱用于β-casein酶解液中磷酸化肽段的富集，并利用MALDI-TOF MS进行磷酸化肽段和非磷酸化肽段的检测。
本发明的具体步骤如下：
（1）对5-30 cm长、200-500 μm外径、5-20 μm内径的石英毛细管进行清洗处理（例如室温下，依次用0.1-1 mol/L NaOH、水、0.1-1 mol/L HCl、水、CH3CN分别冲洗5-30 min）；
（2）将硅烷偶联试剂3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷（20-40%，v/v）通入步骤（1）处理的石英毛细管中，在100-150 ℃下加热反应5-24 h；
（3）将聚合液甲基丙烯酸甲酯（20-40%，v/v）通入步骤（2）所得石英毛细管中，70-90 ℃下加热反应5-24 h；
（4）将5-100 mg/mL的Ti(SO4)2溶液通入步骤（3）所得石英毛细管中，90-120 ℃下水热反应5-24 h，得到固定相为聚甲基丙烯酸甲酯连二氧化钛的液相开管柱；
（5）β-casein首先溶于NH4HCO3水溶液中（25-30 mM），再加入胰蛋白酶溶液（1.5-2.5%，w/w）后，在37 ℃下于酶解仪内混旋酶解15-18 h，用0.1-1% TFA溶液稀释100倍待用；
（6）将1-100 nL的步骤（5）所得β-casein酶解液通入制作好的石英毛细管液相开管柱，分别用0.1-1% TFA溶液和4-400 mmol/L氨水洗脱，洗脱液进入MALDI-TOF MS分析鉴定；
（7）将500-1000 nL的步骤（5）所得β-casein酶解液进入MALDI-TOF MS进行分析鉴定。
本方法中，利用MALDI-TOF MS分析与常规分析相同，具体步骤为，取500-1000 nL洗脱液于靶板上，再在洗脱液靶点上添加500-1000 nL 20 mg/mL 2,5-二羟基苯甲酸（DHB）基质，待液体干燥后，进入机器进行分析。
本发明还涉及上述的固定相为聚甲基丙烯酸甲酯连二氧化钛的液相开管柱的使用操作方法，其步骤为：
（1）使用三氟乙酸（TFA）溶液将该开管柱活化；
（2）将β-casein酶解液通入该开管柱；
（3）使用三氟乙酸（TFA）溶液洗出该开管柱内的非磷酸化肽段；
（4）使用氨水溶液洗出该开管柱内的磷酸化肽段；
（5）使用MALDI-TOF MS对洗脱液进行检测。
相比于液相填充柱、液相整体柱，本发明制造的固定相为聚甲基丙烯酸甲酯连二氧化钛的液相开管柱，其内径可以达到20μm及以下，通透性好，柱压低，因此成为十分有潜力应用于纳升体积样品以下、甚至单细胞分析的一类色谱柱。
附图说明
图1为所得固定相为聚甲基丙烯酸甲酯连二氧化钛的液相开管柱横截面的扫描电镜图。
图2为所得β-casein酶解液的MALDI-TOF MS图。
图3为所得0.1% TFA溶液对β-casein酶解液的洗脱液的MALDI-TOF MS图。
图4为所得400 mmol/L氨水对β-casein酶解液的洗脱液的MALDI-TOF MS图。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。
实施例1：一种固定相为聚甲基丙烯酸甲酯连二氧化钛的液相开管柱的制作
（1）取一根30 cm长，365 μm外径，20 μm内径的石英毛细管，室温下依次用0.1mol/L NaOH冲洗5 min，用水冲洗5 min，用0.1 mol/L HCl冲洗5 min，用水冲洗5 min，用CH3CN冲洗5 min；
（2）将150 μL 3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷溶于350 μL N,N-二甲基甲酰胺中，将所得溶液通入步骤（1）所得石英毛细管中，在150 ℃下加热反应24 h；
（3）将150 μL甲基丙烯酸甲酯溶于350 μL N,N-二甲基甲酰胺中，将所得溶液通入步骤（2）所得石英毛细管中，70 ℃下加热反应24 h；
（4）将100 mg Ti(SO4)2溶于1 mL水中，将所得溶液通入步骤（3）所得石英毛细管中，90-120 ℃下水热反应24 h。
图1为所得固定相为聚甲基丙烯酸甲酯连二氧化钛的液相开管柱横截面的扫描电镜图。
实施例2：将实施例1所得固定相为聚甲基丙烯酸甲酯连二氧化钛的液相开管柱用于低浓度β-casein酶解液的富集与MALDI-TOF MS检测
（1）标准蛋白酶解液的制备：β-casein首先溶于NH4HCO3水溶液中（25 mM），在加入胰蛋白酶溶液（2%，w/w）后，在37 ℃下于酶解仪内混旋酶解16 h，用0.1-1% TFA溶液稀释100倍待用；
（2）洗脱液的配制：将10 μL TFA溶于10 mL水中，得到0.1% TFA溶液，将100 μL 浓度为14 mol/L的工业氨水溶于3.4 mL水中，得到400 mmol/L氨水溶液；
（3）试样的富集：先将1 μL 0.1% TFA溶液通入实施例1所得固定相为聚甲基丙烯酸甲酯连二氧化钛的液相开管柱，然后将100 nL的β-casein酶解液通入该开管柱，用0.1%TFA溶液通入该开管柱，得到1 μL洗脱液，命名为A相洗脱液，再用400 mmol/L氨水溶液洗脱，得到1 μL洗脱液，命名为B相洗脱液；
（4）点靶：分别取1 μL步骤（1）所述标准蛋白酶解液、1 μL步骤（3）所述A相洗脱液、1 μL步骤（3）所述B相洗脱液点到MALDI-TOF MS靶板上，室温下置于空气中自然干燥后，再各取500 nL浓度为20 mg/mL的2,5-二羟基苯甲酸（DHB）溶液作为基质滴于被分析物液滴上，产生薄基质层，晾干后进行MALDI-TOF MS分析；
（5）MALDI-TOF MS分析以固定相为聚甲基丙烯酸甲酯连二氧化钛的液相开管柱富集到的磷酸化肽分子：步骤（1）所述标准蛋白酶解液的质谱图中出现了三条源于β-casein蛋白的磷酸化肽峰（m/z= 3122, m/z= 2556和m/z= 2061）以及一条源于β-casein蛋白的非磷酸化肽峰（m/z= 1383），步骤（3）所述A相洗脱液的质谱图中只出现了一条源于β-casein蛋白的非磷酸化肽峰（m/z= 1383），步骤（3）所述B相洗脱液的质谱图中只出现了三条源于β-casein蛋白的磷酸化肽峰（m/z= 3122, m/z= 2556和m/z= 2061）。
图2为所得β-casein酶解液的MALDI-TOF MS图。
图3为所得0.1% TFA溶液对β-casein酶解液的洗脱液的MALDI-TOF MS图。
图4为所得400 mmol/L氨水对β-casein酶解液的洗脱液的MALDI-TOF MS图。

Claims (3)

1.一种固定相为聚甲基丙烯酸甲酯连二氧化钛的液相开管柱的制作方法，其特征在于具体步骤为：
（1）对长度为5-30 cm、外径为200-500 μm、内径为5-20 μm的石英毛细管进行清洗处理；
（2）将20-40%（v/v）硅烷偶联试剂3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷通入经步骤（1）处理的石英毛细管中，在100-150 ℃下加热反应5-24 h；
（3）将20-40%（v/v）聚合液甲基丙烯酸甲酯通入步骤（2）所得石英毛细管中，70-90 ℃下加热反应5-24 h；
（4）将5-100 mg/mL的Ti(SO4)2溶液通入步骤（3）所得石英毛细管中，90-120 ℃下水热反应5-24 h，得到固定相为聚甲基丙烯酸甲酯连二氧化钛的液相开管柱。
2.由权利要求1所述制作方法得到的固定相为聚甲基丙烯酸甲酯连二氧化钛的液相开管柱。
3.如权利要求2所述的固定相为聚甲基丙烯酸甲酯连二氧化钛的液相开管柱在富集纳升体积样品内的磷酸化肽段与MALDI-TOF MS检测中的应用，具体步骤为：
（1）将β-酪蛋白首先溶于NH4HCO3水溶液中，再加入1.5-2.5%（w/w）胰蛋白酶溶液，在37℃下于酶解仪内混旋酶解15-18 h，用0.1-1% TFA溶液稀释100倍待用；
（2）将1-100 nL的步骤（5）所得β-酪蛋白酶解液通入所述的固定相为聚甲基丙烯酸甲酯连二氧化钛的液相开管柱，分别用0.1-1% TFA溶液和4-400 mmol/L氨水洗脱，洗脱液进入MALDI-TOF MS分析鉴定；
（3）将500-1000 nL的步骤（1）所得β-酪蛋白酶解液进入MALDI-TOF MS进行分析鉴定。
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