CN101406828A - 一种涂敷纳米二氧化钛的开管电泳柱的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种涂敷纳米二氧化钛的开管电泳柱的制备方法及其应用。在经过蚀刻处理的毛细管柱中采用水(溶剂)热法制备涂覆纳米二氧化钛的开管毛细管电泳柱，具有制备方法简单，涂覆层不易脱落等特点，适宜于复杂生物样品中功能化磷酸化多肽与蛋白质的选择性富集与分离。二氧化钛分子与毛细管内壁表面硅羟基通过化学键结合，纳米二氧化钛微粒颗粒均匀，涂覆完全，能有效减少对蛋白质等大分子样品的非特异性吸附作用。涂覆层表面性质和微孔结构可通过改变水热混合物的中致孔剂的种类和比例方便的进行控制，得到孔径、比表面积可调的磷酸化多肽毛细管柱。
Description
【技术领域】
本发明涉及开管电泳柱技术领域，具体地说，是一种涂敷纳米二氧化钛的开管电泳柱的制备方法及其应用。
【背景技术】
蛋白质的磷酸化修饰在生命活动中具有重要的调控作用，因此也是目前翻译后修饰蛋白质组研究中的热点。但大规模分析磷酸化蛋白质在技术上还很具有挑战性，主要的技术挑战是分析灵敏度。
由于生物体内磷酸化蛋白质的含量少、化学计量值低，因此细胞内多数蛋白质中仅有少部分被磷酸化，一般一个发生磷酸化的蛋白质其磷酸化的部分仅占其总量10％，所以即使蛋白质的表达量处于相对较高的水平，该蛋白质的磷酸化部分的分析也很困难。目前采用的分析方法远远不能达到对复杂组织中的磷酸化蛋白质规模化检测及位点分析的要求，所以磷酸化蛋白质谱的分析不同于一般蛋白质表达谱的分析方法，需要建立更有效的分离手段、更特异的富集方法和更灵敏的检测技术。目前已经发展了各种各样的富集方法和色谱填料，如抗体亲和色谱、固定化金属亲和色谱、强阳离子交换色谱等方法以及石墨碳、二氧化钛、二氧化锆等填料。
二氧化钛是近年来发展起来的一种新型高性能材料，其表面能和表面张力随粒径的下降急剧增大而使其具有特殊的量子尺寸效应、体积效应、表面效应和宏观隧道效应。与常规材料相比，纳米二氧化钛具有比表面积大、表面活性大、热导性好，分散性好等独特性能。此外，纳米二氧化钛还具有水油两亲和性，属“超双亲性界面材料”，二氧化钛与磷酸根之间存在路易斯酸碱作用，能够选择性地富集蛋白质酶解产物中的磷酸化多肽。毛细管电色谱开管柱主要通过涂布、键合和溶胶凝胶等方法在柱内壁制备薄层固定相。开管柱避免了繁琐的颗粒填充过程，也免去了制备塞子所以制备过程简单，并且毛细管电色谱开管柱在生物样品的分离、手性体的拆分等方面获得了应用。毛细管二氧化钛开管柱能够选择性地富集和分析蛋白质酶解产物中的磷酸化多肽，与电喷雾质谱联用，可高通量、自动化分析蛋白质酶解产物中的磷酸化多肽的信息。
通常采用的溶胶-凝胶法、化学沉淀法气相法制备纳米二氧化钛的方法都需要后期锻烧，除了极易导致粉体团聚，从而使其的性能指标大受影响以外，也不适于应用于毛细管开管柱的制备。水(溶剂)热法是制备纳米二氧化钛的新方法，具有结晶好、团聚少、纯度高、粒度分布窄以及形貌可控等特点。它反应温度较低，能够合成出绝大多数的氧化物。在溶液中加入某种能缓慢生成沉淀剂的物质，使溶液中的沉淀均匀出现，称为均匀沉淀法。均匀沉淀法既改进了直接沉淀法制备粉体中存在的反应物混合不均匀，反应速率不可控制等缺点，又克服了溶胶一凝胶法使用的金属醇盐成本高的缺点。它还具有工艺简单、操作简便、对设备要求不高、产物纯度高、粒度和组成均匀等优点在超细(纳米)粉末的各种制备方法中，水热法被认为是环境污染少、成本较低、易于商业化的一种具有较强竞争力的方法。
【发明内容】
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种涂敷纳米二氧化钛的开管电泳柱的制备方法及其应用。
本发明的构思为：一种可对磷酸化多肽和蛋白质选择性富集与分离的内壁涂覆纳米二氧化钛的毛细管电泳开管柱制备方法；毛细管内壁均匀化学键和纳米级二氧化钛微粒，具有特殊的表面量子尺寸效应、体积效应、表面效应和宏观隧道效应及高表面活性；为获得均匀键和的高比表面积毛细管开管柱，一般用HF对毛细管内壁进行蚀刻，并用NaOH对表面的硅羟基进行活化，以增强硅羟基与二氧化钛的结合能力。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种涂敷纳米二氧化钛的开管电泳柱的制备方法，包含步骤为，
(一)毛细管柱的预处理
将毛细管柱依次用稀酸、稀碱冲洗10～60分钟，用水洗至中性，氮气或空气吹干后备用；
所述的毛细管柱为石英基质，内径为1微米～1毫米；
所述的稀酸选自盐酸，硫酸或者硝酸中的一种，其中，盐酸浓度为0.1mol/L；硫酸浓度为0.1mol/L；硝酸浓度为0.1mol/L；优选为盐酸；
所述的稀碱选自氢氧化钠溶液或者氢氧化钾溶液中的一种，氢氧化钠溶液浓度为1mol/L；氢氧化钾溶液浓度为1mol/L；
取50μm的毛细管柱将其充满浓度为35％～45％的氢氟酸溶液，浓度优选为40％，在室温下蚀刻120～160分钟后，时间优选为140分钟，用水清洗，将蚀刻成功的接口用1mol/L氢氧化钠溶液浸泡过夜，以中和掉残余的氢氟酸，用水洗净后N2吹干备用；
(二)开管柱的制备
(1)1ml无水乙醇加入钛酸四丁酯至1mol/L搅拌均匀；
(2)加入聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷或者聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物至0.05mol/L；
(3)通N2除去溶解的氧气；
(4)加入HCl溶液调pH 1～2，搅拌均匀；
(5)将以上溶液充入毛细管柱中，并将毛细管柱两端封口；
(6)再放入反应釜中加热至110℃～150℃，优选为130℃，反应时间11～13小时，优选为12小时；
(7)自然冷却后，用水、乙醇分别冲洗三次，除去致孔剂；
所述的致孔剂是聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷或者聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物和乙醇；
(8)最后用N2吹干；
与一般的开管柱相比，纳米二氧化钛涂层具有纳米材料特有的量子尺寸效应、体积效应、表面效应。二氧化钛与磷酸化多肽与蛋白的磷酸根以路易斯酸碱的形式结合进行选择性富集与分离。具有稳定的优点，与管壁化学键合强度好，不易发生脱落，因而使用寿命较长。色谱柱稳定性和重复性较好，并能有效的实现对复杂生物样品体系中磷酸化多肽与蛋白的选择性分离与富集。通过改变致孔剂与钛酸四丁酯的配比得到不同表面性质的电泳柱，制备方法简单易行，重复性与稳定性极佳。
与现有的二氧化钛开管毛细管柱相比，本发明制备的二氧化钛开管毛细管柱采用水(溶剂)热法，在经过蚀刻处理的毛细管柱中制备了涂覆纳米二氧化钛的开管毛细管电泳柱，用于复杂生物样品中功能化磷酸化多肽与蛋白质的选择性富集与分离。其制备方法简单，二氧化钛分子与毛细管内壁表面硅羟基通过化学键结合，涂覆层不易脱落。纳米二氧化钛微粒颗粒均匀，涂覆完全，有效减少对蛋白质等大分子样品的非特异性吸附作用。涂覆层表面性质和微孔结构可通过改变水热混合物的中致孔剂的种类和比例方便的进行控制，得到孔径、比表面积可调的磷酸化多肽毛细管柱。
本发明一种涂敷纳米二氧化钛的开管电泳柱的制备方法及其应用的积极效果是：
(1)采用水热法制备纳米二氧化钛涂层，制备方法简单，无需高温煅烧；
(2)可通过改变致孔剂和钛酸四丁酯比例控制纳米二氧化钛涂层表面性质，充分利用纳米材料特殊的量子尺寸效应、体积效应、表面效应；
(3)由于是用化学键与毛细管壁表面硅羟基结合，所以柱子稳定性较好，不会出现涂层脱落的现象；
(4)重复性好，水热法制备的纳米涂层稳定性好，重复使用多次数据较重复。
【附图说明】
图1SiO2-TiO2交叉表面扫描电镜图；
图2二氧化钛开管柱富集β-酪蛋白酶解产物色谱图；
图3α-酪蛋白(5picomoles)酶解产物经二氧化钛开管柱富集后质谱图。
【具体实施方式】
以下提供本发明一种涂敷纳米二氧化钛的开管电泳柱的制备方法及其应用的具体实施方式。
实施例1
开管电泳柱的制备：将1ml无水乙醇，钛酸四丁酯0.34g，聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷0.2875g搅拌均匀，通N2除去溶解的氧气后，加入HCl溶液调pH 1～2，反应釜中加热至130℃，反应12小时。最后用乙醇冲洗，除去致孔剂。图1为涂覆纳米二氧化钛开管电泳柱SiO2-TiO2结合表面电镜图。
实施例2
开管电泳柱的制备：将1ml无水乙醇，钛酸四丁酯0.34g，聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物0.63g搅拌均匀，通N2除去溶解的氧气后，加入HCl溶液调pH 1～2，反应釜中加热至150℃，反应11小时。最后用乙醇冲洗，除去致孔剂。图2为二氧化钛开管柱富集β-酪蛋白酶解产物质谱图。
实施例3
开管电泳柱的制备：将1ml无水乙醇，钛酸四丁酯0.34g，聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷0.2875g搅拌均匀，通N2除去溶解的氧气后，加入HCl溶液调pH 1～2，反应釜中加热至130℃，反应12小时。最后用乙醇冲洗，除去致孔剂。图3为二氧化钛开管柱富集α-酪蛋白(5picomoles)酶解产物质谱图。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种涂敷纳米二氧化钛的开管电泳柱的制备方法，其特征在于，包含步骤为，
(一)毛细管柱的预处理
将毛细管柱依次用稀酸、稀碱冲洗10～60分钟，用水洗至中性，氮气或空气吹干后备用；
所述的稀酸选自盐酸，硫酸或者硝酸中的一种；
所述的稀碱选自氢氧化钠溶液或者氢氧化钾溶液中的一种；
取50μm的毛细管柱将其充满浓度35％～45％的氢氟酸溶液，在室温下蚀刻120～160分钟后，用水清洗，将蚀刻成功的接口用1mol/L氢氧化钠溶液浸泡过夜，以中和掉残余的氢氟酸，用水洗净后N2吹干备用；
(二)开管柱的制备
(1)1ml无水乙醇加入钛酸四丁酯至1mol/L搅拌均匀；
(2)加入聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷或者聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物至0.05mol/L；
(3)通N2除去溶解的氧气；
(4)加入HCl溶液调pH 1～2，搅拌均匀；
(5)将以上溶液充入毛细管柱中，并将毛细管柱两端封口；
(6)再放入反应釜中加热至110℃～150℃，反应时间11～13小时；
(7)自然冷却后，用水、乙醇分别冲洗三次，除去致孔剂；
所述的致孔剂是聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷或者聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物和乙醇；
(8)最后用N2吹干。
2.根据权利要求1所述的一种涂敷纳米二氧化钛的开管电泳柱的制备方法，其特征在于，所述的毛细管柱为石英基质，内径为1微米～1毫米。
3.根据权利要求1所述的一种涂敷纳米二氧化钛的开管电泳柱的制备方法，其特征在于，在步骤(一)毛细管柱的预处理中，所述的盐酸浓度为0.1mol/L；所述的硫酸浓度为0.1mol/L；所述的硝酸浓度为0.1mol/L。
4.根据权利要求1所述的一种涂敷纳米二氧化钛的开管电泳柱的制备方法，其特征在于，在步骤(一)毛细管柱的预处理中，所述的氢氧化钠溶液浓度为1mol/L；所述的氢氧化钾溶液浓度为1mol/L。
5.根据权利要求1所述的一种涂敷纳米二氧化钛的开管电泳柱的制备方法，其特征在于，在步骤(一)毛细管柱的预处理中，所述的稀酸优选为盐酸。
6.根据权利要求1所述的一种涂敷纳米二氧化钛的开管电泳柱的制备方法，其特征在于，在步骤(一)毛细管柱的预处理中，取50μm的毛细管柱将其充满浓度优选为40％的氢氟酸溶液。
7.根据权利要求1所述的一种涂敷纳米二氧化钛的开管电泳柱的制备方法，其特征在于，在步骤(一)毛细管柱的预处理中，在室温下蚀刻140分钟后，用水清洗。
8.根据权利要求1所述的一种涂敷纳米二氧化钛的开管电泳柱的制备方法，其特征在于，在步骤(二)开管柱的制备中，再放入反应釜中加热温度优选为130℃，反应时间优选为12小时。
9.根据权利要求1所述的一种涂敷纳米二氧化钛的开管电泳柱在复杂生物样品中功能化磷酸化多肽与蛋白质的选择性富集与分离中的应用。
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