CN101923079A - 一种带喷头的混合型毛细管色谱柱及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种带有喷头的混合型毛细管色谱柱及其制备方法，将不同内径和长度的毛细管通过预处理后，根据需要在喷头端合成不同长度的聚合物整体材料，合成后在毛细管剩余部分，采用匀浆装柱法填充制备好的高效颗粒填料，并根据需求改变填充填料的种类、颗粒的大小、填充长度以及选择在尾端合成同样的材料，并在制备完成后用甲醇等试剂在高压恒流泵体系中压实、老化。制备好色谱柱在进行柱效评价后，应用于液-质联用系统中，可以有效解决传统的带喷头填充柱由于柱喷头随着毛细管色谱柱使用过程中因压力过大而导致部分填充颗粒填料破碎，在使用过程中脱出或堵塞毛细管色谱柱喷头的问题。

Description

一种带喷头的混合型毛细管色谱柱及其制备方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，是一种新型带有喷头的混合型毛细管色谱柱的制备方法。

背景技术

液相色谱一质谱联用技术(LC-MS)是结合了色谱的分离性能及质谱的定性性能于一体的一种分析方法。LC-MS技术具有很高的选择性、灵敏度、分离度和分析速度。近年来，由于新技术的不断发展和完善，LC-MS成为现代分析手段中不可缺少的组成部分。已经成为小分子及复杂生物样本中生物大分子定性、定量分析的有力工具。

目前，应用于LC-MS中的毛细管色谱柱的主要问题是：尽管带锥形喷头的毛细管色谱柱与先前直接使用空心毛细管喷头比较，可使灵敏度显著提高，但是这种色谱柱的喷头端一般没有筛板，随着喷头部位的填料承受压力的逐渐增大和使用时间的延长，靠近喷头的部位的空隙会被破碎的色谱填料堵塞，影响毛细管的使用性能，甚至使毛细管色谱柱报废。因此对喷头处的改进成为带有喷头的混合型毛细管色谱柱制备的主要问题。

整体柱由单体、交联剂和致孔剂等通过自由基引发聚合反应，形成具有贯通孔及微孔结构的连续床固定相，具有制备过程简便，聚合物结构均匀，孔径大小可通过反应混合物的比例进行调整，色谱性能稳定，通透性和重现性良好，无需制作筛板等优点。另外，在采用整体柱的分离过程中，由于流动相可直接流过贯通孔，反向柱压低，故在常规的分析型高效液相色谱以及毛细管色谱和毛细管电色谱分离氨基酸、多肽和蛋白质等生物大分子的过程中广泛使用。

发明内容：

本发明的目的是提供一种带有喷头的混合型毛细管色谱柱，其喷头部分具有合成聚合材料形成的筛板。

作为筛板的聚合材料其理化性能和孔径与所填填料色谱类型相近，可采用原位聚合方法合成。如将毛细管色谱柱进行预处理，使其内表面暴露硅羟基；再进行双官能团试剂的连接，根据需求选择单体、交联剂和致孔剂，在软质塑料套管中进行聚合反应。反应后填充球型填料颗粒即制得混合型毛细管色谱柱，根据需要也可在填充后于色谱柱尾端依照同样方法制备整体材料作为筛板。

本发明的另一目的是提供混合型毛细管色谱柱的制备方法，采用的技术方案包括以下步骤：

(1)将毛细管进行表面硅羟基的活化预处理，并将双官能团试剂连接在暴露的羟基上；

(2)将混合好的聚合物反应液吸入毛细管中并控制适当长度；

(3)在一定温度条件下引发聚合反应，制备聚合材料筛板；

(4)冲洗出未反应的混合物，将剩余部分填充球型高效填料颗粒至所需要的长度；

(5)在需要的情况下，用同样方法根据需求制备毛细管色谱柱另一端的筛板；

(6)将制备好的色谱柱压实、老化，经评价后在液质联用系统中用于生物大分子的分离分析。

一般来说，所用毛细管为内径为15～75μm、喷头的喷口内径≤15μm，长度为5～50cm的毛细管；预处理时可采用普通酸或碱进行活化；制作筛板的聚合物反应液长度为0.5～10cm，既可利用虹吸现象，也可以采用吸取的方式使反应液上升到所要求的长度；聚合反应在室温到70℃范围加热进行；剩余的柱体中可填充粒径≤10μm的球形或无定形色谱填料。

为便于操作，冲洗毛细管时均使用微量进样泵，并可以保证清洗溶液及洗脱溶液流速的稳定性。

为提高操作的自动化水平，该混合型毛细管柱可以接在液质联用系统中，实现自动在线对生物大分子的分离分析。

传统的带喷头的毛细管填充色谱柱没有筛板，喷头部位仅靠填料的单纯堆积形成筛板，随着球型填料颗粒在喷头部分承受压力的逐渐增大，喷头的部位的空隙会容易被破碎的色谱填料堵塞，影响毛细管的使用性能和寿命。发明使用的混合型毛细管色谱柱，其内合成的聚合材料具有良好的通透性，将喷端合成聚合材料形成筛板后再进行球形颗粒填料的填充，可以有效解决传统毛细管填充柱没有筛板的缺陷，又能使球型颗粒与填料接触的部位均匀分布压力，解决了毛细管柱由于无筛板以及压力过大填料破碎而导致堵塞的问题。新制备的混合型色谱柱具有整体柱和填充柱的优点，可在液-质联用系统中达到对生物大分子样本的高效分离分析之目的。

本发明提供的技术方案具有以下优点：

1、操作简便，适用范围广。本发明制备的混合型带喷头毛细管色谱柱适用于点喷雾源的质-联用仪中，因而具有很广泛的应用前景；解决了在常规填充型毛细管色谱柱使用中经常遇到的堵塞或填料脱出等使得色谱柱寿命缩短的问题。

2、成本较低，重现性好。本发明所使用的聚合试剂价廉易得，混合柱的整个合成过程简单、方便，经色谱评价后显示其重现性好。

附图说明：

图1是本发明技术方案的聚合物反应流程图。(a)为经过酸碱处理的毛细管内壁活性官能团示意图；(b)为双官能团试剂的化学结构；(c)毛细管柱内壁上连接了双官能团试剂后的化学结构；(d)聚合反应单体化学结构；(e)聚合后的在毛细管内部形成的聚合物化学结构示意图。

图2制备的带有喷头的混合型毛细管色谱柱结构示意图。

Monolithic part为聚合物整体柱喷头部分(约1cm)；packed part为高效球形颗粒填料的填充部分(约10cm)；MS表示质谱。

图3两种色谱柱分别分离BSA样本的质谱图。其中A图为单纯的带喷头的毛细管填充柱分离BSA胰酶酶切混合物的色谱图，而B图为制备带喷头的混合型毛细管色谱柱分离BSA胰酶酶切混合物的色谱图，洗脱梯度：0-60min，0-45％B；60-65min，45％-100％B；65-75min 100％B；75-80min，100％-0％B；80-95min，0％B。每次进行色谱分离前，首先用100％A相平衡整个色谱系统30min，再进行样品的洗脱与分离。

图4带喷头混合型毛细管色谱柱分离酵母全蛋白胰酶酶切液的色谱图。对复杂样本体系，所采用的洗脱梯度为0-80min，0-45％B；80-85min，45％-100％B；85-95min 100％B；95-100min，100％-0％B；100-115min，0％B。每次进行色谱分离前，首先用100％A相平衡整个色谱系统30min，再进行样品的洗脱与分离。

图5混合型毛细管色谱柱与传统填充柱的柱压变化趋势图。

具体实施方式

实施例1

将0.1M HCl溶液用微量进样泵推入带喷头的毛细管柱，以1μL/min的流速冲洗1h，然后用注射器注入超纯水冲洗至流出液pH 7.0，再将0.1M NaOH溶液注入毛细管柱，以1μL/min左右流速冲洗1h，再用超纯水洗至流出液pH 7.0左右。

将50％的γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)/甲醇溶液(v/v)推入毛细管中，末端用硅橡胶封口，喷端插入带有γ-MAPS/甲醇溶液的套管中，密封，并将毛细管浸入45℃水浴中加热12h。然后将γ-MAPS溶液推出，用甲醇溶液冲洗毛细管柱，氮气吹干。

用注射器快速将聚合物反应混合溶液推入毛细管柱中，封住末端，喷头同样插入带有聚合反应液的套管中并密封，在70℃下孵育12h。反应完成后用甲醇溶液冲洗毛细管，氮气吹干备用。

称取10mg的高效ODS颗粒填料，加入2.5ml甲醇中，并在底端放入磁力转子，在磁力搅拌器的搅拌下，利用氮气填充方法将ODS混悬溶液压入毛细管中，直至ODS颗粒充满剩余的柱体。

实施例2

在完全相同的试验条件下，用自动进样系统设置上样量，比较填充柱和混合柱分离标准蛋白酶切液的效果，见附图3。传统的毛细管填充色谱柱分离分析BSA胰酶酶切溶液，三次的覆盖率均值为64.36％，RSD％＝2.62；信号强度为9.39E9，而混合毛细管色谱柱的覆盖率均值为58.90％，RSD％＝0.81；信号强度为8.81E9。

实施例3

分3批依照同样的方法制备混合型色谱柱，分别依照相同的分离条件分析BSA胰酶酶切溶液样本，并记录各个批次的峰容量，选取其中质量数为1163.5的肽段，记录其保留时间及信号强度，作为考察色谱柱重现性的指标。结果显示3个批次的峰容量分别为27、29、30；选取肽段的保留时间分别为44.22、43.59、44.11min。而信号强度的范围均在E8数量级。

实施例4

在使用带喷头混合型毛细管色谱柱的过程中，记录使用时柱压，并对柱压力升高随时间的变化趋势作图，与同样条件下的填充柱的比较。如图5所示，混合柱的平均柱压低于相同进样次数后填充柱的柱压，压力变化范围的SD％＜3.0％，两种色谱柱均能显示出比较稳定的柱压，从压力变化趋势上看，传统填充柱的压力上升趋势要大于混合柱柱压上升趋势。

实施例5

将从酵母样本中提取的蛋白质进行胰酶酶切，将酶切样本稀释至蛋白质浓度0.05pmol/μL，在LCQ离子阱质谱仪上分析并考察分析结果中酵母样本的覆盖率。当上样量为500fmol时，填充柱所检测到的肽段数量(三次重复)分别为246、233、230，而混合柱检测到的肽段数量分别做三次重复得到的结果为244、248、235，结果显示的重现性良好。

实施例6

用强阳离子交换色谱法预分离的鼠肝提取全蛋白胰酶酶切液，所收集的28个馏分分别应用混合型毛细管色谱柱与LCQ离子阱质谱仪在线分离分析，使用70次后，混合型毛细管色谱柱的柱仍能保持较低的柱压(远小于40.0bar的额定压力)和较高的柱效，表明该混合型毛细管色谱柱具有较长的使用寿命。

Claims (10)

1.一种带喷头的混合型毛细管色谱柱，其特征为喷头部分具有合成聚合材料形成的筛板。

2.根据权利要求1所述的混合型毛细管色谱柱，其特征为聚合材料的理化性能和孔径与所填填料色谱类型相近。

3.根据权利要求2所述的混合型毛细管色谱柱，其特征为聚合材料由单体、交联剂或致孔剂，以原位聚合方法合成。

4.一种权利要求1所述混合型毛细管色谱柱的制备方法，其特征包括以下步骤：

(1)将毛细管进行表面硅羟基的活化预处理，并将双官能团试剂连接在暴露的羟基上；

(2)将混合好的聚合物反应液吸入毛细管中并控制适当长度；

(3)在一定温度条件下引发聚合反应，制备聚合材料筛板；

(4)冲洗出未反应的混合物，将剩余部分填充球型高效填料颗粒至所需要的长度；

(5)在需要的情况下，用同样方法根据需求制备毛细管色谱柱另一端的筛板；

(6)将制备好的色谱柱压实、老化，经评价后在液质联用系统中用于生物大分子的分离分析。

5.根据权利要求4所述混合型毛细管色谱柱的制备方法，其特征为所用毛细管内径15～75μm、长度5～50cm、带有喷头且喷口内径≤15μm。

6.根据权利要求4所述混合型毛细管色谱柱的制备方法，其特征为预处理时采用普通酸或碱进行活化。

7.根据权利要求4所述混合型毛细管色谱柱的制备方法，其特征为聚合物反应液长度为0.5～10cm，利用虹吸或吸取的方式吸入。

8.根据权利要求4所述混合型毛细管色谱柱的制备方法，其特征为聚合反应温度在室温到70℃范围。

9.根据权利要求4所述混合型毛细管色谱柱的制备方法，其特征为冲洗毛细管时使用微量进样泵。

10.根据权利要求4所述混合型毛细管色谱柱的制备方法，其特征为剩余柱体中填充粒径≤10μm的球形或无定形色谱填料。

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