CN109106403A - 基于色谱棒的微米级采样针及制备方法 - Google Patents

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Abstract

基于色谱棒的微米级采样针及制备方法，涉及微米级采样针。所述采样针设有毛细管和色谱棒，毛细管内填充预聚体切割液段，预聚体切割液段为预聚体通过切割方式得到的液段，色谱棒固定于毛细管管口内，在色谱棒内设有固化反应物储备液段，所述固化反应物储备液段呈棒状，所述色谱棒为微米级色谱棒。通过液段切割，生成含有制备色谱棒的反应物储备液段；将反应物储备液段固化，得到微米级色谱棒；将微米级色谱棒固定于毛细管管口内，再对微米级色谱棒进行功能化修饰，即得基于色谱棒的微米级采样针。

Description

基于色谱棒的微米级采样针及制备方法
技术领域
本发明涉及微米级采样针，尤其是涉及基于色谱棒的微米级采样针及制备方法。
背景技术
微型采样技术至今仍然是热点研究领域，这是因为微型采样分析始终有着无法替代的优越性。基于微型采样技术尺寸小、微损伤的特性，能够实现活体连续取样、动态观察、定量分析、采样量小、组织损伤轻等特点；并且微采样技术从样品中萃取微量的目标分析物，因此对系统的扰动几乎可以忽略，这就赋予了它独特的优势，可以用于研究系统中化学变化、监测分配平衡以及系统的状态等。由于微型采样装置尺寸微小且采样时间较短，因此可以在短时间内对样品进行多次微损伤采样，从而实现组织样品的在时间空间维度的分离分析。
目前，在科研、医疗和生产中，微型采样技术具有广泛的应用，因此发展新型微型采样技术具有重要价值。非连续流微流控技术是近年来发展迅速的一种新型液体控制技术，该技术通过控制不相容的两相，可精准形成一定形状和尺寸的微型化学反应器或储存器。基于非连续流微流控技术，可精准制备出具有一定尺寸和化学成分的色谱棒，再利用毛细管与色谱棒进行组装，可构建出具有广阔的应用前景的微米级采样针。
发明内容
本发明的目的是提供可实现尺寸和化学性质精准控制的基于色谱棒的微米级采样针及制备方法。
所述基于色谱棒的微米级采样针设有毛细管和色谱棒，所述毛细管内填充预聚体切割液段，预聚体切割液段为预聚体通过切割方式得到的液段，所述预聚体由2-双(三甲氧基硅基)乙烷(BTME)、四甲氧基硅烷(TMOS)、聚乙二醇(PEG)、尿素和乙酸组成；所述色谱棒固定于毛细管管口内，在色谱棒内设有固化反应物储备液段，所述固化反应物储备液段呈棒状，所述色谱棒为微米级色谱棒，所述微米级色谱棒的长度为10～1000μm，直径为1～500μm；所述固化反应物储备液段由反应单体、交联剂、致孔剂、引发剂、乳化稳定剂和油溶性表面活性剂等反应物组成并通过切割方式得到的液段。
所述色谱棒可采用功能化修饰的色谱棒。
所述毛细管的材质可采用无机材料或有机聚合物材料，所述无机材料可选自石英、金属等无机材料，所述有机聚合物材料可选自聚醚醚酮(PEEK)、聚四氟乙烯(Teflon)等中的一种；毛细管的内径可为300μm。
所述功能化修饰的目的可以是使微米级采样针具有更好的生物兼容性，或为了赋予微米级采样针更多的特殊功能，所述特殊功能包括但不限于特异选择性、机械性能提升、化学稳定性提升等。
所述基于色谱棒的微米级采样针的制备方法包括以下步骤：
1)基于微流控技术平台，通过液段切割的方式，生成含有制备色谱棒所需的反应单体、交联剂、致孔剂、引发剂、乳化稳定剂和油溶性表面活性剂等反应物储备液段，所述反应物储备液段具有棒状尺寸和外形；
2)将反应物储备液段固化，得到微米级色谱棒；
3)将微米级色谱棒固定于毛细管管口内，再对微米级色谱棒进行功能化修饰，即得基于色谱棒的微米级采样针。
在步骤1)中，所述基于微流控技术平台可采用水动力法、电动法、气动法、光控法等微流控技术。所述储备液段的生成可采用单道或多道芯片方式，用于高通量制备储备液段；所述反应单体可选自苯乙烯类、丙烯酸类、丙烯酸酯类、环氧烯烃类、聚乙烯醇类、四甲氧基硅烷、四乙氧基硅烷、正辛基三乙氧基硅烷等可聚合反应或水解反应的以应单体；所述交联剂可选自二乙烯基苯、双烯及三烯类的长交联剂或双功能基团交联剂等；所述引发剂可选自偶氮类引发剂、过氧化引发剂等中的一种；所述致孔剂可选自惰性溶剂、线型聚合物、无机粉末致孔剂等中的一种；所述乳化稳定剂可选自聚乙烯醇、明胶、十二烷基硫酸钠、羟乙基纤维素等中的一种；所述油溶性表面活性剂可选自非离子型表面活性剂、离子型表面活性剂、两亲性嵌端共聚物等中的一种，油溶性表面活性剂优选失水山梨醇脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、两亲嵌端共聚物等中的至少一种，油可采用矿物油、硅油、十六烷、氟化油等中的一种；所述色谱棒可先用硅胶基质、聚合物基质、无机-有机杂化基质等中的一种；色谱棒可采用多孔型、无孔型、壳-核型等中的一种，且可以通过分散相中致孔剂的含量来控制色谱棒的孔隙度和孔径分布；色谱棒的尺寸可以通过微流控平台参数调节液段的尺寸控制，所述色谱棒的长度可为10～1000μm，色谱棒的直径可为1～500μm。
在步骤2)中，所述将反应物储备液段固化可利用热或/和光引发聚合。
在步骤3)中，所述将微米级色谱棒固定于毛细管管口内，可采用对微米级色谱棒支撑作用的毛细管，用于实现与液相色谱分离检测平台联用；所述色谱棒固定于毛细管管口的方式可以是物理的机械固定，也可以是基于化学反应的粘合固定；所述毛细管的材质可采用无机材料或有机聚合物材料，所述无机材料可选自石英、金属等无机材料，所述有机聚合物材料可选自聚醚醚酮(PEEK)、聚四氟乙烯(Teflon)等中的一种；所述对微米级色谱棒进行功能化修饰的目的可以是使微米级采样针具有更好的生物兼容性，或为了赋予微米级采样针更多的特殊功能，所述特殊功能包括但不限于特异选择性、机械性能提升、化学稳定性提升等。
本发明利用微流控技术生成反应物储备液段，液段的大小和生成频率可以通过微流控平台参数精准控制。
本发明所采用的技术方案是：首先将预聚体和另外一种与其不相溶的液体同时引入微流控平台，预聚体被“切割”形成液段，利用毛细管收集液段，并在毛细管内反应固化生成色谱棒，将固化的色谱棒与毛细管组装，并对色谱棒进行必要的功能性(化学)修饰制得微米级采样针。
附图说明
图1为本发明所述微米级色谱棒制备方法的流程示意图。
图2为本发明所述基于色谱棒的微米级采样针的结构组成示意图。
图3为实施例2中苯系物分离色谱图。
图4为实施例3中采样针采样示意图。
图5为实施例3中大鼠肝脏蛋白质组学分析谱图。
具体实施方式
下面结合附图和几种可选实施例对本发明进一步说明。实施例中未注明具体技术和条件者，按照本领域内文献所描述的技术和条件或按照产品说明书进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购得到的常规产品。
参见图1和2，所述基于色谱棒的微米级采样针设有毛细管A和色谱棒B，所述毛细管A内填充预聚体切割液段，预聚体切割液段为预聚体通过切割方式得到的液段，所述预聚体由2-双(三甲氧基硅基)乙烷(BTME)、四甲氧基硅烷(TMOS)、聚乙二醇(PEG)、尿素和乙酸组成；所述色谱棒B固定于毛细管A管口内，在色谱棒B内设有固化反应物储备液段，所述固化反应物储备液段呈棒状，所述色谱棒B为微米级色谱棒，所述微米级色谱棒的长度为10～1000μm，直径为1～500μm；所述固化反应物储备液段由反应单体、交联剂、致孔剂、引发剂、乳化稳定剂和油溶性表面活性剂等反应物组成并通过切割方式得到的液段。
所述色谱棒B采用功能化修饰的色谱棒。
所述毛细管的材质采用无机材料或有机聚合物材料，所述无机材料选自石英、金属等无机材料，所述有机聚合物材料选自聚醚醚酮(PEEK)、聚四氟乙烯(Teflon)等中的一种；毛细管的内径为300μm。
所述功能化修饰的目的可以是使微米级采样针具有更好的生物兼容性，或为了赋予微米级采样针更多的特殊功能，所述特殊功能包括但不限于特异选择性、机械性能提升、化学稳定性提升等。
所述基于色谱棒的微米级采样针的制备方法包括以下步骤：
1)基于微流控技术平台，通过液段切割的方式，生成含有制备色谱棒所需的反应单体、交联剂、致孔剂、引发剂、乳化稳定剂和油溶性表面活性剂等反应物储备液段，所述反应物储备液段具有棒状尺寸和外形；所述基于微流控技术平台采用水动力法、电动法、气动法、光控法等微流控技术。所述储备液段的生成采用单道或多道芯片方式，用于高通量制备储备液段；所述反应单体选自苯乙烯类、丙烯酸类、丙烯酸酯类、环氧烯烃类、聚乙烯醇类、四甲氧基硅烷、四乙氧基硅烷、正辛基三乙氧基硅烷等可聚合反应或水解反应的以应单体；所述交联剂选自二乙烯基苯、双烯及三烯类的长交联剂或双功能基团交联剂等；所述引发剂选自偶氮类引发剂、过氧化引发剂等中的一种；所述致孔剂选自惰性溶剂、线型聚合物、无机粉末致孔剂等中的一种；所述乳化稳定剂选自聚乙烯醇、明胶、十二烷基硫酸钠、羟乙基纤维素等中的一种；所述油溶性表面活性剂选自非离子型表面活性剂、离子型表面活性剂、两亲性嵌端共聚物等中的一种，油溶性表面活性剂优选失水山梨醇脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、两亲嵌端共聚物等中的至少一种，油采用矿物油、硅油、十六烷、氟化油等中的一种；所述色谱棒先用硅胶基质、聚合物基质、无机-有机杂化基质等中的一种；色谱棒可采用多孔型、无孔型、壳-核型等中的一种，且可以通过分散相中致孔剂的含量来控制色谱棒的孔隙度和孔径分布；色谱棒的尺寸可以通过微流控平台参数调节液段的尺寸控制，所述色谱棒的长度为10～1000μm，色谱棒的直径为1～500μm。
2)将反应物储备液段固化，得到微米级色谱棒；所述将反应物储备液段固化可利用热或/和光引发聚合。
3)将微米级色谱棒固定于毛细管管口内，再对微米级色谱棒进行功能化修饰，即得基于色谱棒的微米级采样针。所述将微米级色谱棒固定于毛细管管口内，是采用对微米级色谱棒支撑作用的毛细管，用于实现与液相色谱分离检测平台联用；所述色谱棒固定于毛细管管口的方式是物理的机械固定，也可以是基于化学反应的粘合固定；所述毛细管的材质采用无机材料或有机聚合物材料，所述无机材料选自石英、金属等无机材料，所述有机聚合物材料选自聚醚醚酮(PEEK)、聚四氟乙烯(Teflon)等中的一种；所述对微米级色谱棒进行功能化修饰的目的可以是使微米级采样针具有更好的生物兼容性，或为了赋予微米级采样针更多的特殊功能，所述特殊功能包括但不限于特异选择性、机械性能提升、化学稳定性提升等。
以下给出具体实施例。
实施例1：反相C18修饰微米级采样针的制备
1、预聚体的制备
100μL1,2-双(三甲氧基硅基)乙烷(BTME)和400μL四甲氧基硅烷(TMOS)加入到含0.17g聚乙二醇(PEG)和0.16g尿素的0.01M乙酸(2.0mL)，0℃下搅拌40min形成均匀溶液。
2、反应物储存液段的制备
如图1所示微米级色谱棒生成示意图，将步骤1中的预聚体(分散相)1和含有5％EM90的矿物油(连续相)2分别以5μL/min和7μL/min的流速依次有序注入微流控平台3，形成分散相的液段，并通过毛细管4将产生的液段导出并收集在液段储存管5内。
3、液段的固化
将收集的液段在40℃下反应24h，随后在120℃下反应4.5h。生成色谱棒6的尺寸为300μm×800μm，扫描电镜显示色谱棒为多孔结构。
4、微米级采样针的组装与C18修饰
将生成的色谱棒与内径为300μm的石英毛细管组装，并利用微量预聚体作为粘合剂，加热后将毛细管与色谱棒牢固连接。随后利用注射泵将10％(v/v)的三氯(十八烷基)硅烷甲苯溶液压送入探针，压送24h，随后一次用甲苯、甲醇清洗，得到C18修饰后的微米级采样针。
实施例2：反相C18修饰微米级采样针的样品富集能力评价
利用实施例1中所得C18修饰微米级采样针，对5种多肽混合物溶液(分子质量分别为883.1Da、917.1Da、1271.4Da、1282.5Da和1296.5Da)溶液进行富集，并将微米级采样针作为进样器连接在毛细管色谱柱进样端，在214nm紫外光条件下检测多肽混合物。流动相配比为ACN/H2O＝60/40，体积流速为200nL/min，所得色谱图如图3所示。
实施例3：微米级采样针在面向蛋白质组学采样中的应用
1、对实施例1中未修饰的采样针进行胰蛋白酶负载，
利用注射泵，在微米级采样针A中连续12h泵入含10％(v/v)戊二醛的150mmol/L的Na2HPO4溶液，随后用150mmol/L的Na2HPO4溶液冲洗60min；在4℃下连续24h泵入含4mg/mL的胰蛋白酶、0.15mol/L苯甲脒和10mg/mL的氰基-硼氢化钠的150mmol/L的Na2HPO4溶液；随后再用含有20％乙腈(v/v)的150mmol/L的Na2HPO4溶液冲洗采样针，则蛋白酶负载的微米级采样针制作完成。
2、对组织进行采样并进行蛋白质组学分析
首先利用注射针在新鲜大鼠肝脏B中扎一定深度的针孔，在将微米级采样针A放置入大鼠肝脏B的针孔内(如图2和4所示)，5min后，取出微米级采样针A；将微米级采样针A整合入NanoLC-MS蛋白质组学分析平台，对所采集样品进行蛋白质组学分析，所得蛋白质组学图谱如图5所示，对其进行蛋白质鉴定，共鉴定出1047个蛋白质和4367个多肽。

Claims (10)

1.基于色谱棒的微米级采样针，其特征在于设有毛细管和色谱棒，所述毛细管内填充预聚体切割液段，预聚体切割液段为预聚体通过切割方式得到的液段，所述预聚体由2-双(三甲氧基硅基)乙烷、四甲氧基硅烷、聚乙二醇、尿素和乙酸组成；所述色谱棒固定于毛细管管口内，在色谱棒内设有固化反应物储备液段，所述固化反应物储备液段呈棒状，所述色谱棒为微米级色谱棒，所述微米级色谱棒的长度为10～1000μm，直径为1～500μm；所述固化反应物储备液段由反应单体、交联剂、致孔剂、引发剂、乳化稳定剂和油溶性表面活性剂反应物组成并通过切割方式得到的液段。
2.如权利要求1所述基于色谱棒的微米级采样针，其特征在于所述色谱棒采用功能化修饰的色谱棒。
3.如权利要求1所述基于色谱棒的微米级采样针，其特征在于所述毛细管的材质采用无机材料或有机聚合物材料，所述无机材料选自石英、金属无机材料，所述有机聚合物材料选自聚醚醚酮、聚四氟乙烯中的一种；毛细管的内径为300μm。
4.如权利要求1～3所述基于色谱棒的微米级采样针的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)基于微流控技术平台，通过液段切割的方式，生成含有制备色谱棒所需的反应单体、交联剂、致孔剂、引发剂、乳化稳定剂和油溶性表面活性剂反应物储备液段，所述反应物储备液段呈棒状；
2)将反应物储备液段固化，得到微米级色谱棒；
3)将微米级色谱棒固定于毛细管管口内，再对微米级色谱棒进行功能化修饰，即得基于色谱棒的微米级采样针。
5.如权利要求4所述基于色谱棒的微米级采样针的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述基于微流控技术平台采用水动力法、电动法、气动法、光控法微流控技术。
6.如权利要求4所述基于色谱棒的微米级采样针的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述储备液段的生成采用单道或多道芯片方式，用于制备储备液段。
7.如权利要求4所述基于色谱棒的微米级采样针的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述反应单体选自苯乙烯类、丙烯酸类、丙烯酸酯类、环氧烯烃类、聚乙烯醇类、四甲氧基硅烷、四乙氧基硅烷、正辛基三乙氧基硅烷可聚合反应或水解反应的以应单体；所述交联剂选自二乙烯基苯、双烯及三烯类的长交联剂或双功能基团交联剂；所述引发剂选自偶氮类引发剂、过氧化引发剂中的一种；所述致孔剂选自惰性溶剂、线型聚合物、无机粉末致孔剂中的一种；所述乳化稳定剂选自聚乙烯醇、明胶、十二烷基硫酸钠、羟乙基纤维素中的一种；所述油溶性表面活性剂选自非离子型表面活性剂、离子型表面活性剂、两亲性嵌端共聚物中的一种，油溶性表面活性剂优选失水山梨醇脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、两亲嵌端共聚物中的至少一种，油可采用矿物油、硅油、十六烷、氟化油中的一种。
8.如权利要求4所述基于色谱棒的微米级采样针的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述色谱棒采用硅胶基质、聚合物基质、无机-有机杂化基质中的一种；色谱棒采用多孔型、无孔型、壳-核型中的一种，通过分散相中致孔剂的含量控制色谱棒的孔隙度和孔径分布；色谱棒的尺寸通过微流控平台参数调节液段的尺寸控制，所述色谱棒的长度可为10～1000μm，色谱棒的直径可为1～500μm。
9.如权利要求4所述基于色谱棒的微米级采样针的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述将反应物储备液段固化利用热或/和光引发聚合。
10.如权利要求4所述基于色谱棒的微米级采样针的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述将微米级色谱棒固定于毛细管管口内，是采用对微米级色谱棒支撑作用的毛细管，用于实现与液相色谱分离检测平台联用；所述色谱棒固定于毛细管管口的方式采用物理的机械固定或基于化学反应的粘合固定；所述毛细管的材质采用无机材料或有机聚合物材料，所述无机材料选自石英、金属无机材料，所述有机聚合物材料选自聚醚醚酮、聚四氟乙烯中的一种。
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