WO2005029054A1 - 人工脂質二重膜を有する電流測定装置 - Google Patents

人工脂質二重膜を有する電流測定装置 Download PDF

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WO2005029054A1
WO2005029054A1 PCT/JP2004/013671 JP2004013671W WO2005029054A1 WO 2005029054 A1 WO2005029054 A1 WO 2005029054A1 JP 2004013671 W JP2004013671 W JP 2004013671W WO 2005029054 A1 WO2005029054 A1 WO 2005029054A1
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solution tank
lipid bilayer
artificial lipid
current measuring
membrane
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PCT/JP2004/013671
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Toru Ide
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Japan Science And Technology Agency
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48728—Investigating individual cells, e.g. by patch clamp, voltage clamp

Definitions

  • the present invention relates to a current measuring device having an artificial lipid bilayer membrane, and more particularly to an artificial lipid bilayer membrane that only measures channel current in a single ion channel using a human lipid bilayer membrane.
  • the present invention relates to a current measuring device capable of optically observing a multilayer film.
  • An ion channel is a protein that penetrates a biological membrane based on a lipid bilayer membrane as a basic structure, regulates the flow of ions in response to a stimulus, and generates an electric signal or a calcium signal in a cell. That is, ion channels are important protein molecules that convert stimuli into intracellular signals.
  • Such an ion channel is composed of a pore as a path for ions and a gate for controlling the opening and closing of the channel, and the gate is opened and closed by sensing a membrane potential or a physiologically active substance.
  • This opening and closing function can be confirmed by measuring the ionic current when passing through the ionic force on-channel.
  • the patch clamp method is used as a method of measuring the ion current of a single ion channel, but the ion current is also measured by a lipid planar membrane method.
  • lipid planar membrane method In order to deepen the correlation study of the structure and function of ion channels, it is necessary to conduct experiments with a simple reconstructed system. In this case, a lipid planar membrane method is used. This lipid planar membrane method provides a minimal simple system of ion, water, artificial lipid bilayer, and ion channels. Further, development of a sensor using a system of the lipid planar membrane method is also actively carried out at present (for example, Non-Patent Document 1 and the like).
  • an ion channel 112 is incorporated in an artificial lipid bilayer membrane 111, and a current flowing through the ion channel 112 is measured.
  • the artificial lipid bilayer membrane 111 is formed in a small hole 115 formed in a partition plate 114 such as a plastic plate that partitions the aqueous solution tank 113.
  • An electrode 116 is supplied to one of the tanks 113, and a current measuring device 117 is provided via the electrode 116.
  • An electrode 118 is put into the other tank, and an earth 119 is made to the aqueous solution tank 113 via the electrode 118!
  • methods for forming the artificial lipid bilayer membrane 111 in the small holes 115 include the following (A) a vertical painting method, (B) a vertical bonding method, and (C) a horizontal method. Either of the methods can be mentioned.
  • the lipid solution 110 is applied to the small holes 115 with a thin glass tube or the like. In this state, the lipid solution 110 is raised so as to protrude from both surfaces of the partition plate 114 in a state of closing the small holes 115.
  • This lipid solution 110 is a solution obtained by dissolving lipid in an organic solvent such as decane. After the application, the lipid solution 110 moves on the surface of the partition plate 114 as shown on the right side of FIG.
  • the term “thinning” refers to a process in which an organic solvent or the like at the center of the painted lipid solution 110 moves and a lipid double membrane is formed at the center.
  • a lipid monomolecular film 121 is developed at a gas-liquid interface in an aqueous solution tank 113 (not shown in FIG. 9). I do.
  • the gas-liquid interface is set at the same position as the lower end of the small hole 115 formed in the partition plate 114.
  • the liquid surface (gas-liquid interface) in one of the two aqueous solution tanks 113 is raised to separate the monomolecular film 121 from the partition plate.
  • Spread on the surface of 114 thus, one opening of the small hole 115 is closed by the monomolecular film 121.
  • the liquid surface (gas-liquid interface) in the other tank (left side in the figure) of the aqueous solution tank 113 divided into two is raised, whereby the monomolecular film 121 is formed. It is spread on the surface of the partition 114. As a result, the other opening of the small hole 115 is also in a state where the monomolecular film 121 is closed. As a result, the monomolecular film 121 is attached to both the openings of the small holes 115, and finally the artificial lipid bilayer membrane 111 is formed.
  • the aqueous solution tank 113 shown in FIG. It will be cut off.
  • the small holes 115 formed in the partition plate 114 are closed with the lipid solution 110, and the lipid solution 110 is naturally thinned to form the artificial lipid bilayer 111.
  • the waiting force as shown in FIG. 10 (b), raises the water pressure in the tank above the small holes 115, thereby causing the lipid solution 110 to swell downward and thinner, thereby forming the artificial lipid bilayer membrane 111.
  • the artificial lipid bilayer membrane 111 is used. Formation cannot be artificially controlled at all. Therefore, thinning may take several hours or more.
  • the thin portion that becomes the “lipid bilayer membrane” and the ring surrounding the perimeter are formed. A thick part called the Balta phase occurs. Therefore, the artificial lipid bilayer 111 obtained by this method is based on the physical equilibrium of each of the above-mentioned parts. The bilayer 111 tears quickly. Also, since it is difficult to accurately control the pressure difference between the upper and lower tanks in the aqueous solution tank 113, the resulting artificial lipid bilayer membrane 111 is more likely to be unstable.
  • This current measuring device includes two solution tanks, an upper solution tank 101 and a lower solution tank 102, as shown in FIG.
  • a film 103 having a small hole 105 in the center is attached to the bottom of the upper solution tank 101.
  • the lower solution tank 102 has an opening 104 on the bottom surface, and a cover glass 106 is fixed with an adhesive.
  • An agarose gel layer (not shown) is formed on the cover glass 106.
  • the upper solution tank 101 is provided with an electrode 116 in the same manner as in the system of the lipid planar membrane method, and a current measuring device 117 is provided via the electrode 116. Also, an electrode 118 is put into the lower solution tank 102, and an earth 119 is made to the lower solution tank 102 via the electrode 118!
  • a thick film of the lipid solution is formed in the small holes 105 by moving the lower part of the upper solution tank 101 in the lipid solution. Thereafter, the upper solution tank 101 is put into the lower solution tank 102, and the upper solution tank 101 is lowered until the thick film formed in the small hole 105 contacts the agarose gel layer formed on the cover glass 106.
  • the thick membrane is thinned to form an artificial lipid bilayer membrane.
  • Non-patent document 2 Ide'T., Takeuchi'U., Yanagida'T. Development of an Experimental Apparatus for Simultaneous Observation of Optical and Electrical Signals from Single Ion Cannels, Single Mol. 3 (2002) l, 33-42
  • the conventional current measuring devices described above still have insufficient points in terms of stability and miniaturization of the artificial lipid bilayer membrane, and current measuring devices having higher performance are demanded.
  • the artificial lipid bilayer membrane 111 formed in the small holes 105 of the film 103 is attached to the agarose on the cover glass 106. Being supported by the sgel layer 108, it is stable in the vertical direction.
  • both the upper solution tank 101 and the lower solution tank 102 are open systems, when the pressure of the upper solution tank 101 is increased, the direction parallel to the bottom surface of the upper solution tank 101 (not shown in FIG. 12) ( In the direction of arrow H), the artificial lipid bilayer membrane 111 becomes unstable due to vibration caused by the flow of the aqueous solution.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned conventional problems, and has as its object to quickly form a stable artificial lipid bilayer membrane, to reduce the size,
  • An object of the present invention is to provide a current measuring device having an artificial lipid double membrane, which can be suitably used for simultaneously measuring the structure and function of a channel.
  • the current measurement device that works in the present invention is a current measurement device that can measure a current flowing through an artificial lipid bilayer membrane, and includes an upper solution tank that can store an aqueous solution, An upper solution tank is provided below the upper solution tank. An opening is formed, and a support layer for supporting the artificial lipid bilayer membrane is provided on the bottom surface of the lower solution tank. The artificial lipid bilayer formed in the membrane formation opening of the upper solution tank is provided.
  • the current measurement device further includes a bottom plate on which the support layer is mounted on a surface, and a spacing member for keeping a predetermined spacing between the upper solution tank and the bottom plate.
  • the lower solution tank is formed below the upper solution tank by being surrounded by the bottom plate and the spacing member, and is provided below the artificial lipid bilayer formed at the film forming opening of the upper solution tank.
  • the artificial lipid bilayer membrane is brought into contact with a support layer in a thinned state by being expanded toward the solution tank side, and is supported on the support layer.
  • FIG. 1 is a sectional view showing a schematic configuration of a current measuring device according to the present invention.
  • FIG. 2 (a) is a partial cross-sectional view showing a state where a lipid solution is applied to small holes of an upper solution tank in the current measuring device shown in FIG. 1, and (b) is an artificial lipid bilayer membrane.
  • FIG. 4 is a partial cross-sectional view showing a state in which a thin film is in contact with a support layer.
  • FIG. 3 is a partial exploded view showing each member constituting a lower solution tank in the current measuring device shown in FIG. 1.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view showing another schematic configuration of the current measuring device according to the present invention.
  • FIG. 5 is a partial cross-sectional view showing a more specific configuration of a negative pressure suction unit in the current measuring device shown in FIG. 4.
  • FIG. 6 (a) is a partial cross-sectional view showing a state in which a lipid solution is applied to small holes of an upper solution tank in the current measuring device shown in FIG. 1, and (b) is an artificial lipid bilayer membrane.
  • FIG. 4 is a partial cross-sectional view showing a state in which a thin film is in contact with a support layer.
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing a conventional lipid planar membrane method.
  • FIG. 8 is a drawing showing a conventional vertical painting method.
  • FIG. 9 is a drawing showing a conventional vertical bonding method.
  • FIG. 10 is a drawing showing a conventional method for forming an artificial lipid bilayer membrane by a horizontal method.
  • FIG. 11 is a drawing showing a conventional current measuring device having an artificial lipid bilayer membrane.
  • FIG. 12 is a drawing showing a conventional artificial lipid bilayer formed on a polymer gel layer.
  • FIG. 13 is a photograph showing a state in which thinning of the artificial lipid bilayer membrane is completed in [Example 1].
  • FIG. 14 is a drawing showing a current trace measured in [Example 1].
  • FIG. 15 is a drawing showing the measured membrane potential and current characteristics in [Example 1].
  • FIG. 16 (a) is a drawing showing a fluorescence image of fluorescently labeled aramethicin observed in [Example 2]
  • FIG. 16 (b) is a drawing showing a current trace measured in [Example 2]. is there
  • FIG. 17 (a) is a drawing showing current traces measured or observed in [Example 3] before ryanodine addition, and (b) is a diagram measured or observed in [Example 3].
  • FIG. 2 is a drawing showing a fluorescent image of a ryanodine receptor channel
  • (c) is a drawing showing a fluorescent image of ryanodine measured or observed in [Example 3]
  • (d) is a drawing showing a fluorescent image of the ryanodine receptor channel.
  • 3E is a drawing showing the observed current trace after the addition of ryanodine, and (e) is a drawing showing a fluorescent image of the ryanodine receptor channel measured or observed in [Example 3]; 3 is a drawing showing a fluorescent image of ryanodine measured or observed in [Example 3].
  • FIG. 1 is a sectional view showing a schematic configuration of a current measuring device according to the present invention.
  • Figures 2 (a) and (b) show how an artificial lipid bilayer is formed in the current measurement device shown in Figure 1.
  • FIG. FIG. 3 is an exploded view of the current measuring device shown in FIG. In FIG. 3, the upper solution tank is shown not as a whole but as a bottom.
  • the current measuring device 1 includes an artificial lipid bilayer membrane 2, an upper solution tank 3, a support layer 5, a bottom plate 6, a spacing member 7a, A current measuring unit 13 and a grounding unit 14 are provided.
  • the artificial lipid bilayer membrane 2 is formed in a small hole (opening for membrane formation) 4 provided on the bottom surface 9 of the upper solution tank 3.
  • the lower solution tank 8 is formed below the upper solution tank 3 by being surrounded by the bottom plate 6 and the spacing member 7a.
  • the current measuring device 1 thins the artificial lipid bilayer 2 by expanding the artificial lipid bilayer 2 formed in the small holes 4 of the upper solution tank 3 toward the lower solution tank 8. In this state, the support is brought into contact with the support layer 5 and is supported on the support layer 5.
  • an optical microscope (optical observation means) 17 is provided below the bottom plate 6.
  • the lower solution tank 8 is not an open system, vibration caused by the flow of the aqueous solution is suppressed, and the artificial lipid bilayer membrane 2 formed in the small holes 4 is It is possible to maintain stability even in a direction parallel to the bottom surface.
  • the artificial lipid bilayer membrane 2 is formed in the small hole 4 opened in the bottom surface 9 of the upper solution tank 3 as described above. As described later, the artificial lipid bilayer membrane 2 is formed by applying a lipid solution to the pores 4 and then lowering the pressure inside the lower solution tank 8 so that the upper part of the artificial lipid bilayer membrane 2 The aqueous solution in the tank 3 is caused to flow into the lower solution tank 8, and the artificial lipid bilayer membrane 2 is swollen downward and is formed by contact with the support layer 5.
  • the artificial lipid bilayer membrane 2 simulates a biological membrane including an ion channel through which ions are opened and closed by opening and closing the gate. It is possible to provide a model channel that has been ridden. The details of the ion channel will be described later.
  • the lipid is not particularly limited as long as it forms the artificial lipid bilayer 2, but phospholipids are preferably used. Specifically, for example, phosphatidylcholine, diphthalylphosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine and the like can be mentioned. [0033]
  • the two hydrocarbon chains in these phospholipids may be saturated hydrocarbons, or may be unsaturated hydrocarbons. These lipids may be used pure or may be a mixture of at least two kinds of lipids. Further, for example, cholesterol or the like may be added as needed to maintain the activity of the ion channel.
  • the lipid solution is a solution obtained by dispersing the lipid in an organic solvent.
  • the organic solvent used is not particularly limited as long as it is a non-polar organic solvent.
  • a saturated hydrocarbon such as decane, hexadecane, and hexane is suitably used.
  • the lipid concentration is preferably 5 mgZmL or more and 40 mgZmL or less, more preferably 15 mgZmL or more and 20 mgZmL or less.
  • the configuration of the upper solution tank 3 is not particularly limited as long as it is a container having a small hole 4 formed in the bottom surface 9 and capable of storing an aqueous solution. With such a configuration, the artificial lipid bilayer membrane 2 can be formed in the small hole 4 as described later.
  • the small hole 4 may be formed in the bottom surface 9 of the upper solution tank 3, but is more preferably formed in the center of the bottom surface. Thereby, optical observation from below can be easily performed. Further, the small holes 4 may be formed directly on the bottom surface 9, or an opening may be provided on the bottom surface 9 of the upper solution tank 3, and a film having the small holes 4 may be bonded to the opening. You may.
  • the pores 4 preferably have a diameter of 10 / zm or more and 500 m or less, more preferably 50 / zm or more and 200 m or less. Thereby, an artificial lipid bilayer membrane can be favorably formed.
  • the material of the bottom surface 9 or the film for forming the small holes 4 is not particularly limited, but specifically, for example, a plastic such as polypropylene, polyvinyl chloride, polystyrene, or the like, Fluororesin such as polyethylene is preferably used. Further, it is preferable that the thickness of the bottom surface 9 or the film forming the small holes 4 is 0.1 mm or more and 0.3 mm or less. Further, it is more preferable to process the thickness of the bottom surface 9 or the film only around the opening of the small hole 4 smaller than the thickness of the bottom surface 9 or other portions of the film. As a result, a stable artificial lipid bilayer membrane can be rapidly formed.
  • the small holes 4 can be formed, for example, by a conventionally known method as shown below. it can. First, a stainless steel rod sharply cut in a conical shape to the very tip is heated with a gas burner or the like. Next, this is strongly pressed against the surface on which the small holes 4 are formed, and the pressing is continued until a small bulge is formed on the side opposite to the pressed surface. A small hole 4 is formed by cutting the bulge with a razor. In addition, the small holes 4 are cleaned with a form-Z form methanol to remove impurities and the like.
  • the method for forming the small holes 4 is not limited to this, and any known method can be used.
  • the shape of the upper solution tank 3 is not particularly limited, but may be, for example, a cylindrical shape.
  • the size of the upper solution tank 3 is not particularly limited, but, for example, in the case of a cylindrical shape, the inner diameter is preferably 0.5 mm or more and 20 mm or less 1.Omm or more, More preferably, it is 10 mm or less. Further, the size of the upper solution tank 3 can be reduced to a diameter of preferably 0.5 mm, more preferably 10 m. Further, the volume of the upper solution tank 3 is not particularly limited, but is preferably not less than 0.1 Olcm 3 and not more than 1.0 Ocm 3 . Further, the volume of the upper solution tank 3 can be reduced to 0.001 cm 3 . Accordingly, the current measuring device 1 according to the present invention can be formed on a small chip, and a smaller sensor can be manufactured.
  • the material of the upper solution tank 3 other than the portion forming the small holes 4 is not particularly limited, and examples thereof include glass and plastic.
  • the upper solution tank 3 is capable of storing an aqueous solution.
  • Each side of the artificial lipid bilayer 2 formed in the small hole 4 is in contact with the aqueous solution filled in the upper solution tank 3 and the lower solution tank.
  • the aqueous solution is not particularly limited as long as it does not contain a surfactant, an organic solvent and the like.
  • Preferred examples of the above aqueous solution include aqueous solutions of potassium salt, sodium salt, potassium salt and the like.
  • the upper solution tank 3 be capable of moving vertically.
  • the vertical movement of the upper solution tank 3 may be performed manually, or a device for movement may be used.
  • a device for movement a micro-multiplier or the like can be given.
  • the lower solution tank 8 is disposed below the upper solution tank 3 and may be formed by being surrounded by the bottom plate 6 and the spacing member 7a.
  • a support layer 5 for supporting the artificial lipid bilayer membrane 2 is provided on the bottom surface of the lower solution tank 8, that is, the surface of the bottom plate 6, and the artificial lipid bilayer membrane 2 formed by the small holes 4 of the upper solution tank 3 is provided. The support is made to come into contact with the support layer 5.
  • the artificial lipid bilayer membrane 2 is formed in the small holes 4 on the bottom surface 9 of the upper solution tank 3, and the formed artificial lipid bilayer membrane 2 is stably supported by the support layer 5.
  • the configuration of the lower solution tank 8 is not specifically limited in the current measuring device 1 according to the present invention.
  • the bottom plate 6 and the space It is preferably formed by being surrounded by the holding member 7a.
  • [0045] are not limited to particular volume of the lower solution chamber 8 but, 0. 1 mm 3 or more, 10 mm 3 preferably be less that instrument 0. 5 mm 3 or more, it 3. is 5 mm 3 or less preferable.
  • the current measuring device 1 according to the present invention can be formed on a small chip, and a smaller sensor can be manufactured.
  • the bottom plate 6 is disposed below and substantially parallel to the bottom surface of the upper solution tank 3, and a spacing member 7 a is disposed between the bottom plate 6 and the upper solution tank 3.
  • the lower solution tank 8 is formed below the upper solution tank 3 by being surrounded by the bottom plate 6 and the spacing member 7a.
  • the configuration of the bottom plate 6 is not particularly limited as long as the support layer 5 can be placed on the surface. Therefore, the shape, size, surface condition, etc. of the bottom plate 6 are not particularly limited, either.The appropriate shape depends on the configuration of the finally obtained current measuring device 1 and the support layer 6 to be formed. , Size, surface condition, etc. may be selected.
  • the material and the like of the bottom plate 6 are not particularly limited.
  • a material having a light-transmitting property is preferable. Rustic and the like. Thus, the downward force can be observed by the optical microscope 17.
  • the thickness of the bottom plate 6 is not particularly limited, but is preferably 0.1 mm or more and 1.0 mm or less. Thereby, good mechanical strength is obtained.
  • the thickness of the bottom plate 6 is not particularly limited as long as an appropriate thickness is selected according to the conditions of the optical observation (for example, the working distance of the objective lens). Although not required, it is more preferably 0.1 mm or more and 0.17 mm or less. This makes it possible to favorably perform optical observation using an objective lens having a high numerical aperture.
  • the support layer 5 for supporting the artificial lipid bilayer membrane 2 is formed on the surface of the bottom plate 6 on the side facing the upper solution tank 3, that is, on the bottom surface of the lower solution tank 8. Have been.
  • the support layer 5 is not particularly limited as long as it can permeate an aqueous solution and can support the artificial lipid bilayer membrane 2.
  • Specific examples of the support layer 5 include a polymer gel and a porous film such as a cellulose film. Above all, it is more preferable that the support layer 5 also has a polymer gel force.
  • the high molecular gel is not specifically limited, polysaccharides such as agarose and hydrophilic resins such as polyacrylamide can be preferably used. By using these, the support layer 5 can be easily formed using an inexpensive and highly reliable material.
  • the thickness of the support layer 5 is not particularly limited, but is preferably 50 nm or more and 2 mm or less, more preferably 100 nm or more and 1 mm or less. This makes it possible to manufacture a current measuring device having a suitable size.
  • the thickness of the support layer 5 is not particularly limited as long as it is smaller than the working distance of the objective lens, but may be 50 nm or more and 20 m or less. More preferably, it is more than 10 Onm and less than 20 m. Thereby, it becomes possible to favorably perform optical observation using an objective lens having a high numerical aperture.
  • the distance between the artificial lipid bilayer membrane and the objective lens is preferable to reduce the distance between the artificial lipid bilayer membrane and the objective lens.
  • the artificial lipid bilayer membrane 2 is placed on the support layer 5 side of the bottom plate 6. It is preferably located at a position of 20 / zm or less from the surface. This allows the objective lens to work effectively.
  • the thickness of the support layer 5 is more preferably 100 nm or more and 200 nm or less. This makes it possible to observe the fluorescent substance in the solution well.
  • the artificial lipid bilayer membrane 2 be located at a position of 100 nm or more and 200 nm or less from the surface of the bottom plate 6 on the support layer 5 side. Thereby, optical observation using near-field light can be favorably performed.
  • the method for forming the support layer 5 is not particularly limited, and a conventionally known method may be used.
  • a dispersion of agarose is prepared and heated to dissolve the agarose.
  • a method of applying it to the bottom plate 6 and drying it at room temperature can be used.
  • the artificial lipid bilayer membrane 2 formed in the small hole 4 of the upper solution tank 3 is expanded toward the lower solution tank 8, so that the artificial lipid bilayer membrane 2 is thinned onto the support layer 5. It can be brought into contact and supported on the support layer 5. Thereby, even when there is a pressure difference between the upper solution tank 3 and the lower solution tank, the artificial lipid bilayer membrane 2 is supported by the support layer 5 and stabilized vertically.
  • the spacing member 7a is arranged between the upper solution tank 3 and the bottom plate 6, as shown in FIGS. 1 to 3, and holds a predetermined distance between the upper solution tank 3 and the bottom plate 6.
  • the lower solution tank 8 is formed below the upper solution tank 3 by being surrounded by the bottom plate 6 and the spacing member 7a, as described above.
  • the spacing member 7a is not particularly limited as long as it has a shape capable of holding a predetermined spacing between the upper solution tank 3 and the bottom plate 6 and forming the lower solution tank 8,
  • the lower solution tank 8 is hermetically sealed by the spacing member 7a, the upper solution tank 3, the bottom plate 6, and the artificial lipid bilayer 2.
  • the lower solution tank 8 is a closed space, even when there is a pressure difference between the upper solution tank 3 and the lower solution tank 8, the artificial solution is stable in a direction parallel to the bottom plate 6. Lipid bilayer 2 can be formed. This is because in the closed lower solution tank 8, the aqueous solution does not flow when both the upper and lower solution tanks are release systems (see FIG. 12).
  • the spacing member 7a used in the present embodiment has an open upper and lower part, and has a hollow cylindrical or prismatic shape inside.
  • the gap held by the gap holding member 7a that is, the height of the cylinder or prism, is such that the artificial lipid bilayer membrane 2 formed on the bottom surface 9 of the upper solution tank 3 swells toward the lower solution tank side, and the bottom plate 6 Any height may be used as long as it can contact the support layer 5 formed at the bottom.
  • the spacing member 7a more preferably has a cylindrical shape, and the inner diameter thereof is preferably not less than 0.25 mm and not more than 2.5 mm. It is more preferable that it is 1.5 mm or less.
  • the volume of the lower solution tank 8 can be set within the above range.
  • the difference between the inner diameter and the outer diameter, that is, the thickness of the side surface of the lower solution tank 8 is preferably 0.05 mm or more and 0.5 mm or less. More preferably, it is 0.1 mm or more and 0.3 mm or less. Thereby, the lower solution tank 17 can be sealed more sufficiently.
  • the spacing member 7a used in the present embodiment is capable of changing the distance between the upper solution tank 3 and the bottom plate 6, and the change in the distance causes the small holes 4 of the upper solution tank 3 to change.
  • the formed artificial lipid bilayer 2 can be expanded toward the lower solution tank 8.
  • the lipid solution 12 is applied to the small holes 4 of the upper solution tank 3 with the interval held by the interval holding member 7a reduced. Thereafter, as shown in FIG. 2 (b), when the above interval is increased, the aqueous solution in the upper solution tank 3 flows into the lower solution tank 8 from above the artificial lipid bilayer 2, and the artificial lipid bilayer 2 moves downward. And swells into contact with the support layer 5. In this state, the artificial lipid bilayer membrane 2 is supported by the support layer 5. As described above, the artificial lipid bilayer membrane 2 can be quickly formed by changing the interval held by the interval holding member 7a.
  • the interval holding member 7a capable of changing the interval is not particularly limited as long as the interval to be held can be changed. It may have such a configuration, or may be capable of such a change depending on the properties of the material of the spacing member 7a.
  • a preferred example is the example
  • the elastic body for example, various elastomers can be preferably used, and among them, silicone rubber is more preferable in terms of durability and stability.
  • the method for forming lower solution tank 8 using spacing member 7a and bottom plate 6 and sealing lower solution tank 8 with bottom surface 9 of upper solution tank 3 is not particularly limited.
  • a method in which the above three members are closely attached to each other and screwed thereto, or a method in which the above three members are pressure-bonded using a fixing means such as a clip can be used.
  • the current measuring section (current measuring means) 13 is electrically connected to the upper solution tank 3 and can measure a current flowing through an ion channel incorporated in the artificial lipid bilayer membrane 2. If there is, it is not particularly limited.
  • an electrode 15 put into the upper solution tank 3 an amplifier 18 connected to this electrode 15, A configuration including an ammeter (not shown) electrically connected to 18 can be given.
  • the electrode 15 include an Ag—AgCl electrode, but are not particularly limited.
  • the amplifier 18 and the ammeter are not particularly limited, and known devices can be used.
  • the earth portion (earth means) 14 used at this time is not particularly limited, and may be any means that is electrically connected to the lower solution tank 8.
  • the electrode 16 can be the same as the electrode 15 described above.
  • the specific method of measuring the current by the current measuring unit 13 is not particularly limited, but includes, for example, a patch clamp method, a method of measuring the current embedded in a lipid bilayer membrane, and the like. be able to. This makes it possible to observe the function of the ion channel, and to identify and quantify the analyte from the shape, magnitude and frequency of the current change.
  • an optical microscope (optical observation means) 17 is provided on the side opposite to the side on which the layer 5 is formed. This makes it possible to optically observe the ion channel simultaneously with the measurement of the current flowing through the ion channel.
  • any means other than the optical microscope 17 can be suitably used as long as the means can optically observe the ion channel (optical observation means).
  • a near-field light excitation fluorescence microscope and the like are mentioned, but there is no particular limitation.
  • the observation by the optical microscope 17 includes, for example, a change in the fluorescence intensity of the fluorescently labeled ion channel due to the opening and closing of the gate, a movement of the ion channel, a change in the spectrum due to an energy transition between two fluorescent dyes, and the like. Observation. Further, the formation of the artificial lipid bilayer membrane 2 can be confirmed by the optical microscope 17. Furthermore, the movement of lipid molecules can also be observed using an artificial lipid bilayer membrane 2 using fluorescently labeled lipids. Of course, the optical measurement is not limited to these, and any conventionally known method can be applied.
  • the current measuring device of the present invention can be suitably used for the purpose of simultaneously measuring the structure and function of the ion channel. That is, using an artificial lipid bilayer membrane 2 incorporating an ion channel, the current flowing through the ion channel is measured, and the current is inhibited or activated by binding to a physiologically active substance or a sample as a stimulus S ion channel. This makes it possible to observe dangling and to measure the concentration of a physiologically active substance or a specimen.
  • the ion channel incorporated into the artificial lipid bilayer membrane 2 may be isolated and purified from a biological membrane, or may be prepared by a genetic engineering technique or the like. There is no particular limitation as long as it is artificially synthesized. Specific examples include a Na + channel, a K + channel, a Ca 2+ channel, an aramethicin channel, a ryanodine receptor channel, and a hemolysin channel.
  • the method of embedding the ion channel in the artificial lipid bilayer membrane can be a conventionally known method, and is not particularly limited. Specifically, for example, a membrane fraction containing an ion channel is solubilized with a surfactant, reconstituted into a membrane vesicle, and melted into an artificial lipid bilayer membrane. And a method of combining them.
  • the spacing member 7a has a configuration in which the spacing between the upper solution tank 3 and the bottom plate 6 can be changed. Therefore, when an elastic body is employed as the space holding member 7a, a procedure for changing the above-mentioned space by utilizing the expansion and contraction of the elastic body in the vertical direction and thereby rapidly forming the artificial lipid bilayer 2 will be described. I do.
  • the upper solution tank 3 and the lower solution tank 8 are filled with the above aqueous solution.
  • the lipid solution 12 is applied to the small holes 4 in a state where the spacing member 7a is contracted.
  • the upper solution tank 3 is gradually pulled up, so that the aqueous solution of the upper solution tank 3 enters the lower solution tank 8 of the artificial lipid bilayer membrane 2 and the artificial lipids.
  • the double membrane 2 swells downward. In this way, the artificial lipid bilayer 2 comes into contact with the support layer 5 and becomes thinner.
  • the artificial fat double membrane 2 can be formed in a few seconds by expanding and contracting the spacing member 7a to change the spacing. Further, it is possible to form the artificial lipid bilayer membrane 2 more stable than in the conventional case where the pressure of the upper solution tank 3 is increased and the artificial lipid bilayer membrane 2 is expanded toward the lower solution tank side.
  • the curvature of the artificial lipid bilayer membrane 2 is not constant, particularly in the release system.
  • the lipid on the bottom surface 9 around the annular Balta phase and the subsequent pores 4 diffuses laterally, and the artificial lipid bilayer membrane 2 bulges excessively laterally, and the curvature increases with time. This leads to destabilization of the artificial lipid bilayer 2.
  • the method of expanding and contracting the spacing member 7a since the pressure of the lower solution tank 8 is reduced, the anxiety due to the lateral diffusion of lipid does not occur.
  • a large pressure is required to determine the curvature of the artificial lipid bilayer membrane 2 having a small area. It is. That is, it is necessary to store more water solution in the upper solution tank in order to increase the water pressure in the upper solution tank. For example, to determine the curvature of an artificial lipid bilayer membrane with a diameter of 500 m, an aqueous solution depth of about 3-5 mm is required. In this case, the depth of the aqueous solution must be 20mm or more. Therefore, there is a problem that the apparatus becomes large in order to form the artificial lipid bilayer membrane 2 having a small area.
  • the artificial lipid bilayer membrane 2 having a small area without increasing the size of the upper solution tank 3 can be formed because the above problem does not occur. Further, since the artificial lipid bilayer 2 can be made smaller, electric noise can be reduced.
  • the lower solution tank 8 is sealed by the artificial lipid bilayer membrane 2, the bottom surface 9 of the upper solution tank 3, the spacing member 7a, and the bottom plate 6. System. Therefore, the artificial lipid bilayer membrane 2 is stabilized in a direction parallel to the bottom plate 6, which was conventionally unstable, so that the durability of the artificial lipid bilayer membrane 2 can be further improved.
  • the present invention also includes a method of forming the artificial lipid bilayer membrane 2 by the above procedure.
  • an opening (small hole 4) for forming a membrane is formed on the bottom surface 9 of the upper solution tank 3 and the lower solution tank 8.
  • the lower solution tank 8 is disposed below the upper solution tank 3 and has a bottom plate 6 on which a support layer 5 supporting the artificial lipid bilayer membrane 2 is placed on the surface, and a predetermined distance between the upper solution tank 3 and the bottom plate 6.
  • the spacing member 7a can change the spacing between the upper solution tank 3 and the bottom plate 6.
  • the surfaces of the upper solution tank 3 side and the lower solution tank 8 side of the above-mentioned membrane forming opening (small hole 4) are brought into contact with an aqueous solution, A lipid solution application step of applying the lipid solution 12 with the above-mentioned interval reduced, and a lipid that is brought into contact with the support layer 5 with the artificial lipid bilayer membrane 2 thinned by increasing the above-mentioned interval. Film thinning step.
  • the formed artificial lipid bilayer membrane 2 can be more stable, and therefore, even when the ion channel is incorporated in the artificial lipid bilayer membrane 2.
  • the structure and function of the ion channel can be simultaneously measured in a sufficiently stable state.
  • Ion channel proteins are distributed in almost all cells of various types. Therefore, these are proteins that are likely to cause disease, and it is said that 30-40% of drug discovery targets are ion channel proteins.
  • the effect is measured by administering a reagent to an experimental animal, but if a stable artificial lipid bilayer membrane 2 is formed, it is possible to directly investigate the effect on the target ion channel protein in drug discovery. Screening can be performed.
  • drugs that act on the nervous system such as psychotropic drugs
  • the current measuring device of the present invention can be used for visualization analysis of protein-protein (drug) interaction on the artificial lipid bilayer 2. Furthermore, by changing the type of ion channel, it can be applied to the detection of various substances.
  • FIGS. 4 and 6 Another embodiment of the present invention will be described with reference to FIGS. 4 and 6.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view showing a schematic configuration of another current measuring device according to the present invention.
  • FIG. 5 is a sectional view showing a more specific configuration of the negative pressure forming section shown in FIG. 6 (a) and 6 (b) are cross-sectional views showing how an artificial lipid bilayer membrane is formed in the current measuring device shown in FIG.
  • the current measuring device basically has the same configuration as that of the current measuring device described in the first embodiment, but has a spacing member. 7b Force The pressure is not configured to be variable, and a negative pressure forming unit (negative pressure forming means) 10 for forming a negative pressure is provided in the lower solution tank 8.
  • the basic configuration of the spacing member 7b used in the present embodiment is the same as that of the spacing member 7a in the first embodiment, but has a configuration that cannot be changed in the vertical direction. . Therefore, the material is not particularly limited as long as it is a material that can be in close contact with the upper solution tank 3 and the bottom plate 6 and can seal the lower solution tank 8. Specifically, silicone rubber such as polydimethylsiloxane (PDMS), epoxy resin, latex rubber and the like can be preferably used.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • epoxy resin epoxy resin
  • latex rubber latex rubber
  • the negative pressure forming section 10 is not particularly limited as long as the pressure inside the lower solution tank 8 formed by being surrounded by the bottom plate 6 and the spacing member 7b can be made lower than the pressure of the upper solution tank 3.
  • the more specific configuration of the negative pressure forming section 10 is not particularly limited.
  • a suction port 21 connected to the outside of the measuring device from the lower solution tank 8 is provided in the spacing member 7b, and further connected to the suction port 21 and the current measuring device is connected to the lower solution tank 8 from the lower solution tank 8.
  • a configuration in which a drawn-out tube 22 is provided outside and a suction unit (suction means, not shown) is connected via the tube 22 can be given. Thereby, the aqueous solution is sucked from the lower solution tank 8 through the suction port 21 and the tube 22 by the suction unit, and the pressure inside the lower solution tank 8 can be reduced.
  • the specific configuration of the suction port 21 is not particularly limited.
  • the diameter of the suction port 21 is such that the aqueous solution inside the lower solution tank 8 can be sucked out so that the pressure inside the lower solution tank 8 can be favorably reduced. What is necessary is just a structure which has.
  • the method of forming the suction port 21 is not particularly limited, either, and an appropriate method may be selected according to the material and size of the spacing member 7b.
  • the specific configuration of the tube 22 is not particularly limited either, and the tube 22 may have a strength, a diameter, and a length enough to sufficiently suck out the aqueous solution inside the lower solution tank 8 by suction of the suction unit.
  • the material of the tube 22 is not particularly limited, but specific examples thereof include fluorine resin such as polytetrafluoroethylene and silicone. Etc.
  • the specific configuration of the suction unit is not particularly limited as long as it can suck the aqueous solution in the lower solution tank 8 through the suction port 21 and the tube 22.
  • Specific examples include, for example, pipettes, spoids, syringes, and the like.
  • the material of the suction unit is not particularly limited, and an appropriate material may be selected according to the specific configuration of the suction unit.
  • a silicone rubber spoid can be particularly preferably used.
  • the specific configuration of the negative pressure forming section is not limited to the above configuration, and any known means can be suitably used as long as the inside of the lower solution tank 8 can be depressurized. it can.
  • the upper solution tank 3 and the lower solution tank 8 are filled with the above aqueous solution.
  • the lipid solution 12 is applied to the small holes 4.
  • the aqueous solution is transferred from the lower solution tank 8 through a suction port 21 connected to the outside from the lower solution tank 8 using a tube 22 (not shown) connected to the suction port 21 and a suction unit. Aspirate.
  • the aqueous solution in the upper solution tank 3 enters the lower solution tank 8 from the upper force of the artificial lipid bilayer membrane 2, and the artificial lipid bilayer membrane 2 swells downward. In this way, the artificial lipid bilayer 2 comes into contact with the support layer 5 and becomes thinner.
  • the artificial lipid bilayer membrane 2 can be formed in a few seconds as compared with the case where there is no pressure difference. Also, in comparison with the case where the pressure of the upper solution tank 3 is increased to provide a pressure difference, the method of the present embodiment makes it possible to easily provide the pressure difference. Further, as described in the above [Embodiment 1] (2), compared to the case where the pressure of the upper solution tank 3 is increased to inflate the artificial lipid bilayer 2 toward the lower solution tank, The morphological method can form a stable artificial lipid bilayer membrane 2 and increase the size of the device to form an artificial lipid bilayer membrane 2 with a small area. There is no problem.
  • the lower solution tank 8 is a system closed by the artificial lipid bilayer membrane 2, the bottom surface 9 of the upper solution tank 3, the spacing member 7a, and the bottom plate 6. Has become. Therefore, the artificial lipid bilayer membrane 2 is stabilized in a direction parallel to the bottom plate 6 which was conventionally unstable, and the durability of the artificial lipid bilayer membrane 2 can be further improved.
  • the present invention also includes a method for forming the artificial lipid bilayer membrane 2 by the above procedure.
  • an opening (small hole 4) for forming a membrane is formed on the bottom surface 9 of the upper solution tank 3 and the lower solution tank 8.
  • the lower solution tank 8 is arranged below the upper solution tank 3 and has a predetermined distance between the bottom plate 6 on which the support layer 5 for supporting the artificial lipid bilayer membrane 2 is placed and the upper solution tank 3 and the bottom plate 6. It has a spacing member 7b for holding, and is formed by being surrounded by the bottom plate 6 and the spacing member 7b.
  • the lower solution tank 8 is provided with a negative pressure forming means (negative pressure forming section 10) for reducing the pressure inside the lower solution tank 8.
  • the method of forming an artificial lipid bilayer membrane according to the present invention is performed by bringing the surfaces of the upper solution tank 3 side and the lower solution tank 8 side of the membrane formation opening (small hole 4) into contact with the aqueous solution.
  • the current measuring device according to the present embodiment can also be used for the same applications as in the first embodiment.
  • the spacing member 7b in the present embodiment may be provided with only the negative pressure forming part 10, but as in the first embodiment, the upper solution tank 3 and the bottom plate are provided. 6 may be combined with a variable configuration. That is, the spacing member 7b may be an elastic body, and the pressure in the lower solution tank 8 may be reduced and the spacing may be variable.
  • the current measuring device shown in Fig. 5 and working for the present invention was used.
  • the upper solution tank 3 was made of polypropylene having a volume of 0.1 cm 3 and a bottom surface 9 having a thickness of 0.2 mm-0.3 mm.
  • a small hole 4 having a diameter of 0.15 mm was formed in the bottom surface 9.
  • the bottom plate 6 a square glass plate having a thickness of 0.17 mm and a side of 18 mm is used, and an agarose gel layer having a thickness of 100 nm is formed as the support layer 5 on the side of the bottom plate 6 facing the solution tank 3. did.
  • the agarose gel layer was formed by preparing a dispersion of agarose (manufactured by Sigma), heating it to dissolve the agarose, applying it to the bottom plate 6, and drying it at room temperature.
  • a member having an opening at an upper portion and a lower portion and having a hollow cylindrical shape inside was used as the spacing member 7b.
  • the inner diameter of the gap holding member 7b was 1. Omm, and the height was 0.2 mm.
  • the spacing member 7b used also has a silicone rubber force.
  • the spacing member 7b was provided with a suction port 21 and a polytetrafluoroethylene tube 22 connected to the suction port 21 and having a diameter of 50 ⁇ m or less.
  • a silicone rubber spoid was connected to the polytetrafluoroethylene tube 22 as a suction part.
  • the electrode 16 an Ag-AgCl electrode made of Ag foil was used in each of the upper and lower solution tanks, and the Ag-AgCl electrode of the lower solution tank 8 used was one embedded in silicone rubber during silicone rubber molding.
  • the channel current was measured using a patch clamp amplifier (CEZ-2400, manufactured by Nihon Kohden) and recorded on a DAT tape using a DAT recorder.
  • the upper solution chamber 3 and the lower solution chamber 8 lOOmM KC1, 10- 9 M CaCl, lOmM He
  • the pes (pH 7.4) aqueous solution was filled.
  • the current measuring device of the present invention was fabricated by incorporating the film into the film 2. The current was measured over time using the prepared current measuring device.
  • a current measuring device was prepared in the same manner as above, and the current was measured.
  • FIG. 13 shows a state where the formed artificial lipid bilayer membrane 2 has been thinned. The completion of the thin film was completed by the visual recognition of the boundary between the artificial lipid bilayer 2 (indicated as “double membrane” in the figure) and the circular Balta phase surrounding it (indicated as "balta phase” in the figure). Can be confirmed.
  • Fig. 14 shows the obtained current trace
  • Fig. 15 shows the membrane potential-current characteristics.
  • FIG. 14 (a) if the aqueous solution is LOOmM KC1, including 10- 9 M CaCl
  • FIG. 14 (b) the aqueous solution is 100m
  • Cy3 Aramechishin fluorescently labeled (Amersham full Alma made shear) (manufactured Sigma) in methanol at a final concentration of the upper solution chamber 3 so that the order of 10- 8 M Added to the aqueous solution.
  • Aramethicin adds glycine to its C-terminus, kit, manufactured by Pharmacia) to bind to Cy3 for fluorescent labeling.
  • Arameticisin is an amphipathic peptide, and migrates spontaneously to the artificial lipid bilayer 2 from the liquid phase to form an ion channel.
  • an aqueous solution to be filled in the upper and lower solution tanks an aqueous solution of 100 mM KC1 and 10 mM Hepes (pH 7.4) was used.
  • the fluorescence image and the ion current due to aramethicin were simultaneously observed and measured.
  • the fluorescence image was measured using a self-made objective lens type total reflection fluorescence microscope.
  • FIG. 16 (a) shows the obtained fluorescent image of fluorescent alamethicin and the locus of Brownian motion in the film
  • FIG. 16 (b) shows the current trace.
  • the upper solution tank 3 and the lower solution tank 8 were filled with 500 mM Na-methanesulfonic acid, 40 mM Hepes (pH 7.4), 0.01-0 .: LM Ca 2+ aqueous solution.
  • a phosphatidylcholine 20mgZml decane solution was applied to the small holes 4 on the bottom surface 9 of the upper solution tank 3, and the aqueous solution inside the lower solution tank 8 was aspirated using the above-mentioned spoid, and the artificial lipid double membrane was formed. 2 was expanded toward the lower solution tank 8 to form an artificial lipid bilayer membrane 2.
  • a cell membrane vesicle prepared from porcine myocardium was fused with this artificial lipid bilayer, and the ryanodine receptor channel (Ca-channel) on the vesicle membrane was incorporated into the artificial lipid bilayer 2.
  • the ryanodine receptor channel on the vesicle membrane was labeled with a fluorescent dye Cy5 (manufactured by Amarsham Pharmacia) in advance, and then the cell membrane vesicle was fused to the artificial lipid bilayer 2.
  • the fluorescent labeling of the ryanodine receptor channel was performed by labeling a specific monoclonal antibody thereto with Cy5, and binding the labeled antibody to the ryanodine receptor channel.
  • FIG. 17 shows a current trace (a) before addition of ryanodine (shown as “current” in the figure and the same in (d) described later), and a fluorescence image of the ryanodine receptor channel (b) (in the figure, Shows "channel", The same applies to (e) described later) and the fluorescence image of ryanodine (c) (indicated as “ligand” in the figure, the same applies to (f) described later), and the current trace after ryanodine addition (d), A fluorescent image of a ryanodine receptor channel (e) and a fluorescent image of ryanodine (f) are shown.
  • the current measuring device is a current measuring device capable of measuring a current flowing through an artificial lipid bilayer membrane, and is capable of storing an aqueous solution!
  • An upper solution tank and a lower solution tank disposed below the upper solution tank are provided.
  • An opening for film formation is formed on the bottom surface of the upper solution tank, and a bottom surface of the lower solution tank is formed on the bottom surface of the lower solution tank.
  • a bottom plate for mounting the support layer on the surface, and a spacing member for maintaining a predetermined spacing between the upper solution tank and the bottom plate are provided, and the lower solution tank is provided on the bottom plate and the spacing member. By being surrounded, it is formed below the upper solution tank, and the film forming opening of the upper solution tank is formed.
  • the artificial lipid bilayer membrane formed in step 2 is expanded toward the lower solution tank so that the artificial lipid bilayer membrane is brought into contact with the support layer in a thinned state and is supported on the support layer. .
  • the current measuring device is a current measuring device capable of measuring a current flowing through an artificial lipid bilayer membrane, capable of accumulating an aqueous solution, and has a bottom surface for forming a membrane.
  • An upper solution tank having an opening formed therein; and a lower solution tank disposed below the upper solution tank and capable of storing the aqueous solution, wherein the lower solution tank includes a bottom plate, an upper solution tank, and a bottom.
  • the bottom surface of the upper solution tank and the bottom plate are in close contact with each other so as to maintain a predetermined distance between the plates, and the bottom plate is constituted by a space holding member, and the bottom plate supports the artificial lipid bilayer membrane. May be provided.
  • the artificial lipid bilayer formed in the membrane-forming opening of the upper solution tank is expanded toward the lower solution tank so that the artificial lipid bilayer is thinned.
  • the current measuring device includes negative pressure forming means for reducing the pressure inside the lower solution tank formed by being surrounded by the bottom plate and the spacing member.
  • the negative pressure forming means includes a suction port formed on the spacing member and connected to an external force of the lower solution tank, and a suction means connected to the suction port for suctioning an aqueous solution inside the lower solution tank. Is preferred.
  • the interval holding member can change the interval between the upper solution tank and the bottom plate, and the change in the interval causes the opening for film formation in the upper solution tank.
  • the artificial lipid bilayer formed in the section may be expanded toward the lower solution tank.
  • the spacing member also has elasticity and is capable of extending and contracting up and down.
  • the polymer gel in which the support layer preferably has a polymer gel force. Further, the thickness of the polymer gel layer is preferably 50 nm or more and 2 mm or less.
  • the artificial lipid bilayer membrane is supported by the polymer gel layer and is vertically stabilized.
  • the diameter of the opening for forming a film is 10?
  • the bottom plate is made of a light-transmitting material, and the artificial lipid bilayer membrane on the support layer can be observed below the bottom plate. It is preferable that observation means be provided.
  • the current measuring device may further include a current measuring means electrically connected to the upper solution tank and a ground means electrically connected to the lower solution tank.
  • the artificial lipid bilayer preferably includes an ion channel.
  • the use of the current measuring device according to the present invention makes it possible to obtain an artificial lipid bilayer membrane that is stable and durable even in a direction parallel to the bottom surface 9 of the upper solution tank 3. 2 can be easily formed in a short time.
  • the ion channel can be optically observed simultaneously with the measurement of the channel current.
  • miniaturization is possible, and by manufacturing on a small chip, a smaller sensor can be manufactured.
  • the current measuring device of the present invention can be used, for example, for screening in drug discovery using ion channel proteins involved in diseases.
  • Ion channel proteins are distributed in almost all types of cells. Therefore, these are proteins that are likely to cause disease, and it is said that 30-40% of drug discovery targets are ion channel proteins.
  • the effect is measured by administering a reagent to an experimental animal, but if a stable artificial lipid bilayer membrane 2 is formed, it is possible to directly investigate the effect on the target ion channel protein in drug discovery. Screening can be performed.
  • drugs that act on the nervous system such as psychotropic drugs
  • the current measuring device that is effective in the present invention is a protein measuring device on the artificial lipid bilayer membrane 2. It can be used for visualization analysis of protein (drug) interaction. Furthermore, by changing the type of ion channel, it can be applied to the detection of various substances.

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Abstract

　電流測定装置は、上溶液槽（３）と、底面に支持層（５）が形成された下溶液槽（８）とを備え、上溶液槽（３）の小孔（４）に形成された人工脂質二重膜（２）を介して流れる電流を測定する電流測定装置において、下溶液槽（８）が底板（６）および間隔保持部材（７ａ）に囲まれることにより、上溶液槽（３）の下方に形成されている。下溶液槽（８）の内部の圧力を低下させることにより、小孔（４）で形成した人工脂質二重膜（２）を下溶液槽（８）側に膨らませて薄化させ、人工脂質二重膜（２）を薄化した状態で支持層で支持する。

Description

明 細 書
人工脂質二重膜を有する電流測定装置
技術分野
[0001] 本発明は、人工脂質二重膜を有する電流測定装置に関するものであり、特に、人 ェ脂質二重膜を用いた単一のイオンチャネルにおけるチャネル電流を測定するだけ でなぐ人工脂質二重膜を光学的に観察することが可能な電流測定装置に関するも のである。
背景技術
[0002] イオンチャネルは、脂質二重膜を基本構造として生体膜を貫通して存在するタンパ ク質で、刺激に応じてイオンの出入りを調節し、細胞に電気信号やカルシウム信号を 発生させる。すなわち、イオンチャネルは刺激を細胞内信号に変換する重要なタンパ ク質分子である。
[0003] このようなイオンチャネルは、イオンの通り道であるポアとチャネルの開閉を制御す るゲートとから構成され、ゲートは膜電位や生理活性物質を感受することにより開閉 する。この開閉機能は、イオン力 オンチャネルを透過するときのイオン電流を測定 すること〖こよって確認することができる。単一のイオンチャネルのイオン電流を測定す る方法としてパッチクランプ法が用いられるが、脂質平面膜法によりイオン電流を測 定することも行われている。
[0004] イオンチャネルの構造機能の相関研究を深めるためには、単純な再構成系で実験 を行う必要がある。この場合に脂質平面膜法が用いられる。この脂質平面膜法は、ィ オン、水、人工脂質二重膜、イオンチャネルという最小限の単純系を提供するもので ある。また、脂質平面膜法の系を用いたセンサーの開発も現在盛んに行われている（ 例えば、非特許文献 1等)。
[0005] 脂質平面膜法の系について具体的に説明すると、図 7に示すように、人工脂質二 重膜 111にイオンチャネル 112を組み込み、イオンチャネル 112を介して流れる電流 を計測する。上記人工脂質二重膜 111は、水溶液槽 113を仕切るプラスティック板等 の仕切り板 114に開けられた小孔 115に形成されて!ヽる。 2つに仕切られた水溶液 槽 113の一方の槽には、電極 116が投入され、この電極 116を介して電流計測器 11 7が設けられている。他方の槽には、電極 118が投入され、この電極 118を介して水 溶液槽 113に対してアース 119がなされて!/、る。
[0006] ここで、上記小孔 115に人工脂質二重膜 111を形成する方法としては、以下の (A) 垂直型ペインティング法、（B)垂直型貼り合わせ法、（C)水平型法のいずれかの方 法が挙げられる。
[0007] (A)垂直型ペインティング法では、まず、図 8の左側に示すように、水溶液槽 113 ( 図 8には図示せず)を仕切る仕切り板 114等の支持体に形成されている小孔 115に、 脂質溶液 110を細いガラス管等で塗りつける。この状態では脂質溶液 110は、小孔 1 15をふさぐ状態で、仕切り板 114の表面側双方に突出するように盛り上がつている。 この脂質溶液 110は、デカン等の有機溶媒に脂質を溶解してなる溶液である。塗り つけた後、図 8の右側に示すように、脂質溶液 110が仕切り板 114の表面を移動する ことにより、自然に薄化した人工脂質二重膜 111が得られる。なお、薄化とは、塗りつ けられた脂質溶液 110の中心部力 有機溶媒等が移動して、該中心部にて脂質二 重膜が形成される過程を ヽぅ。
[0008] 次に、（B)垂直型貼り合わせ法では、図 9の上段に示すように、水溶液槽 113 (図 9 には図示せず）における気液界面に脂質の単分子膜 121を展開する。このとき気液 界面は、仕切り板 114に形成されている小孔 115の下方側の端部と同じ位置として おく。その後、図 9の中段に示すように、 2つに仕切られた水溶液槽 113の一方の槽（ 図中右側）における液面 (気液界面)を上昇させることにより、単分子膜 121を仕切り 板 114の表面に展開させる。これにより、小孔 115の一方の開口が単分子膜 121に より塞がれた状態になる。さらにその後、図 9の下段に示すように、 2つに仕切られた 水溶液槽 113の他方の槽（図中左側）における液面 (気液界面）を上昇させることに より、単分子膜 121を仕切り板 114の表面に展開させる。これにより、小孔 115の他 方の開口も単分子膜 121が塞がれた状態となる。その結果、小孔 115の双方の開口 において、単分子膜 121が貼り合わせられ、最終的に人工脂質二重膜 111が形成さ れる。
[0009] 次に、（C)水平型法では、図 7に示す水溶液槽 113が仕切り板 114により上下に仕 切られた状態となる。このとき、図 10 (a)に示すように、仕切り板 114に形成した小孔 115を脂質溶液 110で塞ぎ、該脂質溶液 110が自然に薄化して人工脂質二重膜 11 1となるのを待つ力、図 10 (b)に示すように、小孔 115より上側の槽の水圧を上げるこ とにより脂質溶液 110を下方に膨らませて薄化させることにより人工脂質二重膜 111 を形成する。
[0010] し力しながら、上記の何れの人工脂質二重膜の形成方法であっても、安定した人工 脂質二重膜 111を迅速に形成することが困難となっている。すなわち、上記 (A)垂直 型ペインティング法では、脂質溶液 110が仕切り板 114の表面を移動し、十分に薄 化して人工脂質二重膜 111となるまでに数分力も数十分を要する。また、（B)垂直型 貼り合わせ法では、人工脂質二重膜 111を形成する前に小孔 115をスクアレン等の 有機溶媒で前処理することが必須であり、工程の増加により形成方法が煩雑化する だけでなぐ複数回、液面を上下しないと人工脂質二重膜 111が形成されていないこ とがほとんどである。
[0011] さらに、（C)水平型法のうち、小孔 115を塞いだ脂質溶液 110が自然に薄化するの を待つ場合 (図 10 (a)の場合）には、人工脂質二重膜の形成が人為的には全く制御 できない。それゆえ、薄化に数時間以上を要する場合がある。また、小孔 115より上 側の槽の水圧を上げることにより薄化する場合には、得られる人工脂質二重膜 111 において、「脂質二重膜」となる薄い部分と、その周囲を取り囲む環状バルタ相という 厚い部分とが生じる。したがって、この方法で得られる人工脂質二重膜 111は、上記 各部分の物理ィ匕学的な平衡の上に成り立っているため、水溶液の流動などによる振 動でこの平衡が崩れると、人工脂質二重膜 111はすぐに破れる。し力も、水溶液槽 1 13における上下各槽の圧力差を正確にコントロールするのは難しいため、得られる 人工脂質二重膜 111はより不安定になりやす 、。
[0012] このように、脂質平面膜法を用いた場合、安定で耐久性のある人工脂質二重膜を 形成することが克服すべき大きな課題となって 、る。
[0013] ところで、イオンチャネルのゲートの開閉時には、イオンの透過と同時に、イオンチ ャネル分子の構造の変化がおこって 、ると考えられる。このイオンチャネル分子の構 造および機能の関係を明らかにするためには、イオンチャネル分子の構造と機能を 同時に測定できる測定装置が不可欠である。
[0014] そこで、本発明者等は、従来の人工脂質二重膜の上記問題点を改善するとともに、 イオンチャネル分子の構造と機能を同時に測定できる電流測定装置を提案している (例えば、非特許文献 2等)。この電流測定装置は、図 11に示すように、上溶液槽 10 1および下溶液槽 102の 2つの溶液槽を備えている。上溶液槽 101の底面には中心 部に小孔 105が開けられたフィルム 103が貼り付けられている。また、下溶液槽 102 は底面に開口部 104があり、カバーガラス 106が接着剤で固定されている。そしてこ のカバーガラス 106にはァガロースゲル層（図示せず）が形成されている。なお、上 溶液槽 101には、脂質平面膜法の系と同様に、電極 116が投入され、この電極 116 を介して電流計測器 117が設けられている。また、下溶液槽 102には、電極 118が 投入され、この電極 118を介して下溶液槽 102に対してアース 119がなされて!/、る。
[0015] この電流測定装置では、まず、脂質溶液中で上溶液槽 101の下方部を移動させる ことにより、小孔 105に脂質溶液の厚い膜を形成する。その後、上溶液槽 101を下溶 液槽 102に投入し、小孔 105に形成された厚い膜がカバーガラス 106に形成された ァガロースゲル層に接するまで上溶液槽 101を下降させる。ここで上溶液槽 101の 圧力 (水圧)を高くすることによって、厚い膜を薄化させ人工脂質二重膜を形成する。
[0016] この電流測定装置では、上溶液槽 101の圧力を高くすることにより、人工脂質二重 膜の形成 (厚い膜の薄化）に時間を要することがない。また、形成された人工脂質二 重膜は、ァガロースゲル層に支持されるので、上溶液槽 101から圧力がかけられて いても人工脂質二重膜は上下方向に安定化する。さらに、ァガロースゲル層を薄くす れば、開口数 (NA)の大きなレンズ 107で人工脂質二重膜を観察することができるの で、人工脂質二重膜にイオンチャネルが含まれている場合でも、イオンチャネルその ものの観察が可能となる。これにより、チャネル電流の測定と、イオンチャネルの構造 の観察を同時に行うことができる。
[0017] 〔非特許文献 1〕
Bayley.H., し remer'P. Stochastic sensors inspired by biology,
Nature413,226-230(2001)
〔非特許文献 2〕 Ide'T., Takeuchi'U., Yanagida'T. Development of an Experimental Apparatus for Simultaneous Observation of Optical and Electrical Signals from Single Ion Cannels, Single Mol.3(2002)l, 33-42
しかしながら、上記従来の電流測定装置は、人工脂質二重膜の安定性、小型化の 点で未だ不十分な点を有しており、より高い性能を有する電流測定装置が嘱望され ている。
[0018] 具体的には、まず、上記従来の電流測定装置では、図 12に示すように、フィルム 1 03の小孔 105に形成された人工脂質二重膜 111は、カバーガラス 106上のァガロー スゲル層 108に支持されて上下方向には安定となる。ところが、上溶液槽 101および 下溶液槽 102がともに解放系であるため、上溶液槽 101の圧力を高くした場合、上 溶液槽 101 (図 12には図示せず)の底面に平行な方向（矢印 H方向）では、水溶液 の流動などによる振動で人工脂質二重膜 111が不安定となる。
[0019] したがって、上記従来の電流測定装置では、人工脂質二重膜 111の曲率を厳密に 保持することが困難となる。そのため、上述した (C)水平型法のうち、小孔 115より上 側の槽の水圧を上げることにより薄化する場合 (図 10 (b)参照）と同様に、人工脂質 二重膜 111と環状バルタ相の物理ィ匕学的な平衡が崩れてしま!、、人工脂質二重膜 1 11は破れることになる。
[0020] さらに、上記従来の電流測定装置では、 2つの溶液槽を用いているため、電流測定 装置の小型化が難しい。そのため、例えば、小型のチップ上に人工脂質二重膜を作 製することは事実上できな 、。
発明の開示
[0021] 本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、安定した 人工脂質二重膜を迅速に形成でき、小型化が可能であるとともに、例えば、単一チヤ ネルの構造と機能を同時に測定する用途に好適に用いることが可能な、人工脂質二 重膜を有する電流測定装置を提供することにある。
[0022] 本発明に力かる電流測定装置は、人工脂質二重膜を介して流れる電流を測定可 能とする電流測定装置であって、水溶液を蓄積可能となっている上溶液槽と、該上 溶液槽の下方に配置される下溶液槽とを備えており、上溶液槽の底面には膜形成用 開口部が形成されているとともに、下溶液槽の底面には、人工脂質二重膜を支持す る支持層が設けられており、上溶液槽の膜形成用開口部で形成した人工脂質二重 膜を支持層上に接触させて支持する電流測定装置において、さらに、上記支持層を 表面に載置する底板と、上溶液槽および底板の間に所定の間隔を保持する間隔保 持部材とを備えており、上記下溶液槽は、底板および間隔保持部材に囲まれること により、上溶液槽の下方に形成され、上溶液槽の膜形成用開口部で形成した人工脂 質二重膜を下溶液槽側に膨らませることにより、該人工脂質二重膜を薄化した状態 で支持層に接触させ、支持層上で支持することを特徴として 、る。
[0023] 上記の構成によれば、下溶液槽が解放系ではないため、水溶液の流動による振動 が抑えられ、上溶液槽の底面に平行な方向においても安定な人工脂質二重膜を形 成することが可能となる。
[0024] 本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十 分わ力るであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白にな るであろう。
図面の簡単な説明
[0025] [図 1]本発明にかかる電流測定装置の概略構成を示す断面図である。
[図 2] (a)は、図 1に示す電流測定装置において、脂質溶液を上溶液槽の小孔に塗 布した状態を示す部分断面図であり、（b)は、人工脂質二重膜が支持層に接触して 薄化した状態を示す部分断面図である。
[図 3]図 1に示す電流測定装置において、下溶液槽を構成する各部材を示す部分分 解組立図である。
[図 4]本発明にかかる電流測定装置の他の概略構成を示す断面図である。
[図 5]図 4に示す電流測定装置において、陰圧吸引部のより具体的な構成を示す部 分断面図である。
[図 6] (a)は、図 1に示す電流測定装置において、脂質溶液を上溶液槽の小孔に塗 布した状態を示す部分断面図であり、（b)は、人工脂質二重膜が支持層に接触して 薄化した状態を示す部分断面図である。
[図 7]従来の脂質平面膜法を示す模式図である。 [図 8]従来の垂直型ペインティング法を示す図面である。
[図 9]従来の垂直型貼り合わせ法を示す図面である。
[図 10]従来の水平型法の人工脂質二重膜形成方法を示す図面である。
[図 11]従来の人工脂質二重膜を有する電流測定装置を示す図面である。
[図 12]従来の高分子ゲル層上に形成された人工脂質二重膜を示す図面である。
[図 13]〔実施例 1〕において、人工脂質二重膜の薄化が完了した状態を撮影した図面 である。
[図 14]〔実施例 1〕において、測定された電流トレースを示す図面である。
[図 15]〔実施例 1〕において、測定された膜電位 電流特性を示す図面である。
[図 16] (a)は〔実施例 2〕において観察された蛍光標識したァラメチシンの蛍光像を示 す図面であり、 (b)は〔実施例 2〕において測定された電流トレースを示す図面である
[図 17] (a)は〔実施例 3〕において測定または観察された、リアノジン添加前の電流トレ ースを示す図面であり、（b)は〔実施例 3〕において測定または観察された、リアノジン 受容体チャネルの蛍光像を示す図面であり、 (c)は〔実施例 3〕において測定または 観察された、リアノジンの蛍光像を示す図面であり、（d)は〔実施例 3〕において測定 または観察された、リアノジン添加後の電流トレースを示す図面であり、（e)は〔実施 例 3〕において測定または観察された、リアノジン受容体チャネルの蛍光像を示す図 面であり、（f)は〔実施例 3〕において測定または観察された、リアノジンの蛍光像を示 す図面である。
発明を実施するための最良の形態
[0026] 〔実施の形態 1〕
本発明における実施の一形態にっ 、て、図 1な 、し図 3に基づ 、て説明すれば、 以下の通りである。なお、言うまでもないが、本発明は、特に本実施の形態の記載内 容にのみ限定されるものではない。
[0027] (1)人工脂質二重膜を有する電流測定装置の一例
図 1は本発明にかかる電流測定装置の概略の構成を示す断面図である。図 2 (a) · (b)は、図 1に示す電流測定装置において、人工脂質二重膜が形成される様子を示 す断面図である。図 3は、図 1に示す電流測定装置の分解組立図である。なお、図 3 にお!/、て、上溶液槽は全体を示さず底面のみを示して 、る。
[0028] 本発明にかかる電流測定装置 1は、図 1に示すように、人工脂質二重膜 2と、上溶 液槽 3と、支持層 5と、底板 6と、間隔保持部材 7aと、電流計測部 13と、アース部 14と を備えている。人工脂質二重膜 2は、上溶液槽 3の底面 9に設けられている小孔 (膜 形成用開口部) 4に形成されている。上記下溶液槽 8は、底板 6および間隔保持部材 7aに囲まれることにより、上溶液槽 3の下方に形成されている。そして、上記電流測 定装置 1は、上溶液槽 3の小孔 4で形成した人工脂質二重膜 2を下溶液槽 8側に膨ら ませることにより、該人工脂質二重膜 2を薄化した状態で支持層 5に接触させ、支持 層 5上で支持している。なお、底板 6の下方には、光学顕微鏡 (光学観察手段） 17が 設けられて 、ることが好ま U、。
[0029] 上記構成によれば、下溶液槽 8が解放系ではないため、水溶液の流動による振動 が抑えられるため、小孔 4に形成される人工脂質二重膜 2は、上溶液槽 3の底面に平 行な方向にぉ ヽても安定とすることが可能となる。
[0030] <人工脂質二重膜 >
上記人工脂質二重膜 2は、上記のように、上溶液槽 3の底面 9に開けられた小孔 4 に形成される。人工脂質二重膜 2は、後述するように、小孔 4に脂質溶液を添塗した 後、下溶液槽 8の内部の圧力を低下させることにより、人工脂質二重膜 2上部より、上 溶液槽 3の水溶液を下溶液槽 8に流入させ、人工脂質二重膜 2を下に膨らませて支 持層 5と接触させることにより形成する。
[0031] 上記人工脂質二重膜 2は、そのゲートの開閉によってイオンを通すイオンチャネル を含む生体膜を模したものであり、単一又は希望する組成の脂質混合物を用いるこ とにより、単純ィ匕したモデルチャネルを提供することが可能となる。なお、イオンチヤネ ルの詳細については後述する。
[0032] 上記脂質としては、人工脂質二重膜 2を形成するものであれば特に限定されな 、が 、リン脂質が好適に用いられる。具体的には、例えば、ホスファチジルコリン、ジフイタ ノィルホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールァミン、ホスファチジルセリン等 が挙げられる。 [0033] これらのリン脂質における 2本の炭化水素鎖は、飽和炭化水素であってもよ!/ヽし、不 飽和炭化水素であってもよい。これらの脂質は純粋なものを用いてもよいし、少なくと も 2種類の脂質を混合したものであってもよい。また、イオンチャネルの活性維持のた めに、必要に応じて、例えば、コレステロール等を添加してもよい。
[0034] 上記脂質溶液とは、上記脂質を有機溶媒に分散させたものを!ヽぅ。用いられる有機 溶媒としては、非極性有機溶媒であれば特に限定されるものではない。具体的な一 例としては、例えば、デカン、へキサデカン、へキサン等の飽和炭化水素等が好適に 用いられる。また、脂質濃度は 5mgZmL以上、 40mgZmL以下であることが好まし く、 15mgZmL以上、 20mgZmL以下であることがより好ましい。
[0035] <上溶液槽>
上記上溶液槽 3は、底面 9に小孔 4が形成され、水溶液を蓄積可能となっている容 器であればよぐその構成は特に限定されるものではない。このような構成であれば、 後述するように、上記小孔 4に人工脂質二重膜 2を形成することができる。
[0036] 上記小孔 4は上記上溶液槽 3の底面 9に形成されていればよいが、底面の中心に 形成されて ヽることがより好ま Uヽ。これにより下方よりの光学観察を容易に行うことが できる。また、上記小孔 4は上記底面 9に直接形成されていてもよいし、上記上溶液 槽 3の底面 9に開口部を設け該開口部に小孔 4を形成したフィルムを接着したもので あってもよい。小孔 4は、直径が 10 /z m以上、 500 m以下であることが好ましぐ 50 /z m以上、 200 m以下であることがさらに好ましい。これにより、人工脂質二重膜を 良好に形成することができる。
[0037] 上記小孔 4を形成する底面 9又はフィルムの材質としては、特に限定されるものでは ないが、具体的には、例えば、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン等のプラ スティック、ポリテトラフルォロエチレン等のフッ素榭脂等が好適に用いられる。また、 上記小孔 4を形成する底面 9又はフィルムの厚さは 0. 1mm以上、 0. 3mm以下であ ることが好ましい。さらに、小孔 4の開口部周辺のみで、底面 9又はフィルムの厚さを、 底面 9又はフィルムの他の部分の厚さよりも薄く加工することがより好ま 、。これによ り安定な人工脂質二重膜を迅速に形成することができる。
[0038] 上記小孔 4は、例えば、以下に示すような従来公知の方法によって形成することが できる。まず、ごく先端まで円錐形に鋭利に削ったステンレス棒をガスバーナー等で 熱する。次にこれを、上記小孔 4を形成する面に強く押し付け、押し付けた面と反対 側にわずかに膨らみができるところまで押し付けを続ける。この膨らみを剃刀で切り取 ることで小孔 4が形成される。なお、小孔 4はクロ口ホルム Zメタノールで洗浄すること により不純物等を取り除く。もちろん、小孔 4を形成する方法は、これに限定されるも のではなぐ公知のあらゆる方法を用いることができる。
[0039] 上記上溶液槽 3の形状は特に限定されるものではないが、例えば、円筒形のものが 挙げられる。また、上記上溶液槽 3の大きさは特に限定されるものではないが、例え ば円筒形である場合、その内径は 0. 5mm以上、 20mm以下であることが好ましぐ 1. Omm以上、 10mm以下であることがより好ましい。さらに、上記上溶液槽 3の大き さは、好ましくは上記内径が 0. 5mm、より好ましくは 10 mまで小型化することがで きる。また、上溶液槽 3の容積は特に限定されるものではないが、 0. Olcm3以上、 1. Ocm3以下であることが好ましい。さらに、上溶液槽 3の容積は 0. OOlcm3まで小型化 することができる。これにより、本発明にかかる電流測定装置 1を、小型のチップ上に 作成することが可能となり、より小型のセンサーを製造することが可能となる。
[0040] さらに、上記上溶液槽 3の上記小孔 4を形成する部分以外の材質も、特に限定され るものではないが、例えば、ガラス、ブラスティック等が挙げられる。
[0041] 上記上溶液槽 3は、水溶液を蓄積可能となって 、る。そして小孔 4に形成される人 工脂質二重膜 2は、上溶液槽 3および下溶液槽に満たされた水溶液に各側が接して いる。これは、人工脂質二重膜 2の下溶液槽 8側が、後述する支持層 5に接触してい る場合も同様であり、人工脂質二重膜 2は支持層 5を浸透した水溶液に接している。 上記水溶液は、界面活性剤、有機溶媒等を含むものでなければ特に限定されるもの ではない。上記水溶液の好ましい一例としては塩ィ匕カリウム、塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カ ルシゥム等の水溶液が挙げられる。
[0042] また、上記上溶液槽 3は、上下方向に移動することができるものであることが好まし い。上記上溶液槽 3の上下移動は、手動で行ってもよいし、移動のための装置を用 いてもよい。移動のための装置としては、具体的には、一例として、マイクロマ-ュピレ 一ター等が挙げられる。 [0043] <下溶液槽>
上記下溶液槽 8は、上溶液槽 3の下方に配置されており、底板 6および間隔保持部 材 7aに囲まれることにより形成されていればよい。下溶液槽 8の底面すなわち底板 6 の表面には、人工脂質二重膜 2を支持する支持層 5が設けられており、上溶液槽 3の 小孔 4で形成した人工脂質二重膜 2を支持層 5上に接触させて支持するようになって いる。
[0044] 上記下溶液槽 8は、上溶液槽 3の底面 9の小孔 4に人工脂質二重膜 2を形成すると ともに、形成された人工脂質二重膜 2を支持層 5で安定に支持するために設けられる 槽となっている。この観点から見れば、本発明に力かる電流測定装置 1においては、 下溶液槽 8の構成は具体的に限定されるものではな ヽが、本実施の形態で示すよう に、底板 6および間隔保持部材 7aで囲まれることにより形成されることが好ましい。
[0045] 下溶液槽 8の容積は特に限定されるものではないが、 0. 1mm3以上、 10mm3以下 であることが好ましぐ 0. 5mm3以上、 3. 5mm3以下であることが好ましい。これにより 、本発明にかかる電流測定装置 1を、小型のチップ上に作成することが可能となり、よ り小型のセンサーを製造することが可能となる。
[0046] 次に、下溶液槽 8を形成する底板 6、間隔保持部材 7aについて具体的に説明する
[0047] <底板 >
上記底板 6は、上溶液槽 3の下方に、その底面に略平行に配置され、間隔保持部 材 7aが底板 6と上溶液槽 3の間に配置される。この底板 6および間隔保持部材 7aに 囲まれることにより、上溶液槽 3の下方に下溶液槽 8が形成される。上記底板 6の構成 は特に限定されるものではなぐ支持層 5を表面に載置できる構成であればよい。し たがって、底板 6の形状や大きさ、表面の状態等も特に限定されるものではなぐ最 終的に得られる電流測定装置 1や形成される支持層 6の構成に応じて、適切な形状 、大きさ、表面の状態等を選択すればよい。
[0048] 上記底板 6の材質等も特に限定されるものではな 、が、例えば、下方、すなわち、 底板 6の上溶液槽 3に面する側の反対側から、光学観察を行う場合には、透光性を 有する材質であることが好ましぐ具体的には、例えば、ガラスやポリスチレン等のプ ラスティック等が挙げられる。これにより下方力も光学顕微鏡 17による観察が可能とな る。
[0049] また、底板 6の厚さも特に限定されるものではないが、 0. 1mm以上、 1. Omm以下 であることが好ましい。これにより、良好な機械的強度が得られる。また、例えば下方 力 光学観察を行う場合には、底板 6の厚さは、光学観察の条件 (例えば、対物レン ズの作動距離等）に応じて、適切な厚さを選択すればよく特に限定されるものではな いが、 0. 1mm以上、 0. 17mm以下であることがより好ましい。これにより、高開口数 の対物レンズを用いた光学観察を良好に行うことができる。
[0050] また、上記底板 6における上溶液槽 3に面する側の表面、すなわち下溶液槽 8の底 面には、上述したように、人工脂質二重膜 2を支持する支持層 5が形成されている。
[0051] 上記支持層 5は、水溶液が浸透することができ、且つ、人工脂質二重膜 2を支持す ることができるものであれば特に限定されるものではない。上記支持層 5としては、具 体的には、例えば、高分子ゲル、セルロース膜等の多孔質膜等を挙げることができる 。中でも、上記支持層 5は高分子ゲル力もなるものであることがより好ましい。上記高 分子ゲルとしては具体的には特に限定されるものではないが、ァガロース等の多糖 類や、ポリアクリルアミド等の親水性榭脂を好ましく用いることができる。これらを用い ることにより、安価かつ信頼性の高い材料を用いて簡単に支持層 5を形成することが できる。
[0052] 上記支持層 5の厚さは、特に限定されるものではないが、 50nm以上、 2mm以下で あることが好ましぐ lOOnm以上、 1mm以下であることがさらに好ましい。これにより、 好適な大きさの電流測定装置を製造することが可能となる。また、例えば、光学観察 を行う場合には、上記支持層 5の厚さは、対物レンズの作動距離よりも小さければ特 に限定されるものではないが、 50nm以上、 20 m以下であることがより好ましぐ 10 Onm以上、 20 m以下であることがさらに好ましい。これにより、高開口数の対物レ ンズを用いる光学観察を良好に行うことが可能となる。すなわち、高開口数の対物レ ンズを用いる光学観察においては、人工脂質二重膜と対物レンズとの距離を小さく することが好ましい。例えば、イオンチャネル 1分子を蛍光観察するために、開口数 1 . 4程度の対物レンズを用いる場合には、人工脂質二重膜 2が底板 6の支持層 5側の 表面から 20 /z m以下の位置にあることが好ましい。これにより、上記対物レンズを有 効に働力せることができる。さらに、例えば、近接場光を用いる場合には、上記支持 層 5の厚さは、 lOOnm以上、 200nm以下であることがより好ましい。これにより、溶液 中の蛍光物質を良好に観察することが可能となる。また、近接場光を用いる場合には 、人工脂質二重膜 2が底板 6の支持層 5側の表面から lOOnm以上、 200nm以下の 位置にあることが好ましい。これにより、近接場光を用いる光学観察を良好に行うこと ができる。
[0053] また、支持層 5の形成方法は特に限定されるものではなぐ従来公知の方法を用い ればよい。例えば、具体的な一例としては、支持層 5として、高分子ゲルであるァガロ ースを用いる場合には、ァガロースの分散液を調製し、これを加熱してァガロースを 溶解させた後、これを底板 6に塗布して、室温で乾燥する方法が挙げられる。
[0054] 上溶液槽 3の小孔 4で形成した人工脂質二重膜 2を下溶液槽 8側に膨らませること により、該人工脂質二重膜 2を薄化した状態で上記支持層 5に接触させ、上記支持 層 5上で支持することができる。これにより、人工脂質二重膜 2は、上溶液槽 3と下溶 液槽との間で圧力差がある場合でも、上記支持層 5に支持されて上下方向に安定す る。
[0055] <間隔保持部材>
間隔保持部材 7aは、図 1ないし図 3に示すように、上溶液槽 3と底板 6との間に配置 され、上溶液槽 3および底板 6の間に所定の間隔を保持する。そして底板 6および間 隔保持部材 7aに囲まれることにより、上述したように、上溶液槽 3の下方に下溶液槽 8が形成される。
[0056] 上記間隔保持部材 7aは、上溶液槽 3および底板 6の間に所定の間隔を保持し、下 溶液槽 8を形成できるような形状であれば特に限定されるものではな 、が、本実施の 形態では、例えば、内部が中空となっており、この中空の部分に、下溶液槽 8に満た す水溶液を蓄積可能となって 、る構成を挙げることができる。そして下溶液槽 8は上 記間隔保持部材 7aと上溶液槽 3と底板 6と人工脂質二重膜 2とで密閉されることとな る。このように、下溶液槽 8が閉じた空間となることにより、上溶液槽 3と下溶液槽 8との 間に圧力差がある場合であっても、底板 6に平行な方向に安定した人工脂質二重膜 2の形成が可能となる。これは、密閉された下溶液槽 8では、上下溶液槽がともに解 放系である場合におこる水溶液の流動が起こらないためである（図 12参照)。
[0057] 本実施の形態で用いられる上記間隔保持部材 7aは、上部と下部とが開口して 、る とともに、内部が中空の円柱または角柱の形状を有している。上記間隔保持部材 7a により保持される間隔、すなわち上記円柱または角柱の高さは、上溶液槽 3の底面 9 に形成された人工脂質二重膜 2が、下溶液槽側に膨らんで、底板 6に形成された支 持層 5に接触することができる高さであればよい。また、間隔保持部材 7aは、図 3に 示すように、円柱の形状を有することがより好ましぐその内径は、 0. 25mm以上、 2 . 5mm以下であることが好ましぐ 0. 5mm以上、 1. 5mm以下であることがより好ま しい。これにより下溶液槽 8の容積を上述した範囲内とすることができる。また間隔保 持部材 7aが、円柱の形状を有する場合の内径と外径との差、すなわち下溶液槽 8の 側面の厚さは、 0. 05mm以上、 0. 5mm以下であることが好ましぐ 0. 1mm以上、 0 . 3mm以下であることがより好ましい。これにより、下溶液槽 17の密閉をより十分なも のとすることができる。
[0058] 本実施の形態で用いられる間隔保持部材 7aは、上記上溶液槽 3および底板 6の間 隔を変化可能となっており、該間隔の変化により、上溶液槽 3の小孔 4で形成した人 工脂質二重膜 2を下溶液槽 8側に膨らませることができるものとなっている。
[0059] 具体的には、図 2 (a)に示すように、間隔保持部材 7aにより保持される間隔を小さく した状態で、脂質溶液 12を上溶液槽 3の小孔 4に塗布する。その後、図 2 (b)に示す ように、上記間隔を大きくすると、人工脂質二重膜 2上部より上溶液槽 3の水溶液が 下溶液槽 8側に流入し、人工脂質二重膜 2が下方に膨らみ支持層 5と接触する。この 状態で人工脂質二重膜 2は支持層 5により支持される。このように、間隔保持部材 7a が保持する間隔を変化させることにより、人工脂質二重膜 2を迅速に形成することが 可能となる。
[0060] したがって、上記間隔を変化可能な間隔保持部材 7aとしては、保持する間隔を変 ィ匕させることが可能な構成であれば、特に限定されるものではなぐ間隔保持部材 7a が機械的にそのような構成を有するものであってもよいし、間隔保持部材 7aの材質 の性質によりそのような変化が可能なものであってもよい。好ましい一例としては、例 えば、弾性体力もなつており、上下に伸縮可能となっている構成を挙げることができる 。上記弾性体としては、例えば、各種エラストマ一を好ましく用いることができ、中でも 耐久性や安定性の点力もシリコーンゴムがより好ましい。
[0061] また、図 3に示すように、間隔保持部材 7aおよび底板 6を用いて下溶液槽 8を形成 し、該下溶液槽 8を上溶液槽 3の底面 9で密閉する方法は特に限定されるものではな ぐ例えば、上記 3つの部材を密着させてネジ止めする方法や、クリップ等の固定手 段を用いて圧着させる方法が挙げられる。
[0062] <電流計測部.アース部 >
上記電流計測部 (電流計測手段） 13は上溶液槽 3に電気的に接続されおり、人工 脂質二重膜 2に組み込まれたイオンチャネルを介して流れる電流を計測可能となつ て 、る構成であれば特に限定されるものではな 、。
[0063] 電流計測部 13のより具体的な構成としては、例えば、図 1に示すように、上溶液槽 3に投入される電極 15と、この電極 15に接続される増幅器 18と、該増幅器 18に電気 的に接続される電流計（図示せず)とを含む構成を挙げることができる。電極 15として は、例えば、 Ag— AgCl電極等が挙げられるが特に限定されるものではない。増幅器 18および電流計についても特に限定されるものではなぐ公知の装置を用いることが できる。
[0064] 上記電流計測部 13を上溶液槽 3に電気的に接続する場合には、下溶液槽 8を必 ずアースする。このとき用いられるアース部（アース手段） 14としては特に限定される ものではなく、下溶液槽 8に電気的に接続される手段であればよい。例えば、図 1〖こ 示すように、下溶液槽 8に電極 16を投入し、この電極 16にアースを接続する構成と なっていればよい。なお、電極 16は上記電極 15と同じものを用いることができる。
[0065] また、上記電流計測部 13により電流を測定する具体的な手法についても、特に限 定されるものではないが、例えばパッチクランプ法や、脂質二重膜に埋め込み測る方 法等を挙げることができる。これにより、イオンチャネルの機能の観察が可能となり、ま た、電流変化の形、大きさ、頻度から、分析物の同定と定量が可能となる。
[0066] <光学顕微鏡 >
本発明にかかる電流測定装置においては、底板 6の下方、すなわち底板 6の支持 層 5が形成されている側と反対側に光学顕微鏡 (光学観察手段） 17が設けられてい ることが好ましい。これにより、イオンチャネルを介して流れる電流の測定と同時に、ィ オンチャネルを光学的に観察することが可能となる。もちろん本発明では、光学的に イオンチャネルを観察できる手段 (光学観察手段)であれば、光学顕微鏡 17以外の 構成を好適に用いることができる。具体的には、例えば、近接場光励起蛍光顕微鏡 等が挙げられるが特に限定されるものではない。
[0067] 上記光学顕微鏡 17による観察としては、例えば、ゲートの開閉に伴う蛍光標識した イオンチャネルの蛍光強度の変化、イオンチャネルの動き、 2つの蛍光染料間のエネ ルギ一転移によるスペクトルの変化等の観察が挙げられる。また、人工脂質二重膜 2 が形成されていることを光学顕微鏡 17により確認することも可能である。さらに、蛍光 標識した脂質を用いた人工脂質二重膜 2を用いて脂質分子の動きを観察することも できる。もちろん光学測定はこれらに限定されるものではなぐ従来公知のあらゆる方 法が適用されうる。
[0068] <イオンチャネル >
本発明に力かる電流測定装置は、上記人工脂質二重膜 2にイオンチャネルを組み 込むことによって、イオンチャネルの構造と機能を同時に測定する用途に好適に用い ることができる。すなわち、イオンチャネルを組み込んだ人工脂質二重膜 2を用いて、 イオンチャネルを介して流れる電流を計測し、刺激としての生理活性物質又は検体 力 Sイオンチャネルに結合して電流を阻害又は活性ィ匕することを観測したり、生理活性 物質又は検体の濃度を測定したりすることが可能となる。
[0069] 上記人工脂質二重膜 2に組み込まれるイオンチャネルは、生体膜から単離 ·精製さ れたものでもよいし、また、遺伝子工学的手法等により作製されたものでもよいし、ま た人工的に合成されたものでもよぐ特に限定されるものではない。具体的には、例 えば、 Na+チャネル、 K+チャネル、 Ca2+チャネル、ァラメチシンチャネル、リアノジン 受容体チャネル、へモリシンチャネル等が挙げられる。
[0070] イオンチャネルを上記人工脂質二重膜に埋め込む方法も、従来公知の方法を用い ることができ、特に限定されるものではない。具体的には、例えばイオンチャネルを含 む膜分画を界面活性剤で可溶ィ匕し、膜べシクルへ再構成し、人工脂質二重膜に融 合させる方法が挙げられる。
[0071] (2)人工脂質二重膜形成の手順
次に、本発明にかかる電流測定装置において、上溶液槽 3の底面に形成されてい る小孔 4に人工脂質二重膜 2を形成する手順を図 2に基づいて説明する。
[0072] 具体的には、本実施の形態では、上記間隔保持部材 7aが、上溶液槽 3および底板 6の間隔を変化可能な構成となっている。そこで、該間隔保持部材 7aとして弾性体を 採用した場合に、弾性体の上下方向の伸縮を利用して上記間隔を変化させ、これに より人工脂質二重膜 2を迅速に形成する手順について説明する。
[0073] 最初に、上溶液槽 3および下溶液槽 8を上記水溶液で満たしておく。次に図 2 (a) に示すように、間隔保持部材 7aを収縮させた状態で、小孔 4に上記脂質溶液 12を添 塗する。その後、図 2 (b)に示すように、上溶液槽 3を徐々に引き上げることにより、上 溶液槽 3の水溶液が人工脂質二重膜 2の上側力ゝら下溶液槽 8に入り込み、人工脂質 二重膜 2が下方に膨らむ。このようにして、人工脂質二重膜 2が支持層 5と接触して薄 化する。
[0074] このように、間隔保持部材 7aを伸縮させて上記間隔を変化させることにより、人工脂 質二重膜 2を数秒間で形成することができる。また従来のように上溶液槽 3の圧力を 高くして人工脂質二重膜 2を下溶液槽側に膨らませる場合と比べて安定した人工脂 質二重膜 2を形成することができる。上溶液槽 3の圧力を高くする方法では、特に解 放系において、人工脂質二重膜 2の曲率が一定しない。加えて環状バルタ相及びそ れに続く小孔 4周辺の底面 9の脂質が側方に拡散して、人工脂質二重膜 2が過度に 側方に膨らみ、時間と共に曲率が増大する。これが人工脂質二重膜 2の不安定化に つながる。これに対して、間隔保持部材 7aを伸縮させる方法では、下溶液槽 8の圧 力を低下させるため、脂質の側方への拡散による不安化が起こらない。
[0075] さらに、上溶液槽 3の圧力を高くする方法では、特に解放系において、曲率を制御 する場合、面積の小さい人工脂質二重膜 2の曲率を決めるには、力なり大きな圧力 が必要である。すなわち上溶液槽の水圧を大きくするために上溶液槽により多くの水 溶液を蓄積することが必要である。例えば、直径が 500 mの人工脂質二重膜の曲 率を決めるためには水溶液の深さが 3— 5mm程度必要である力 直径が 50 μ mの 場合は水溶液の深さが 20mm以上必要である。そのため、面積の小さい人工脂質二 重膜 2を形成するためには装置が大きくなつてしまうという問題点がある。これに対し 、下溶液槽 8の圧力を低下させる場合には、上記問題点がないため、上溶液槽 3を 大きくすることなぐ面積の小さい人工脂質二重膜 2を形成することができる。また、人 工脂質二重膜 2を小さくすることができるため、電気ノイズを減少させることができる。
[0076] また、上溶液槽 3が解放系であるのに対し、下溶液槽 8は、人工脂質二重膜 2と上 溶液槽 3の底面 9と間隔保持部材 7aと底板 6とにより密閉された系となっている。その ため、従来では不安定であった底板 6に平行な方向で、人工脂質二重膜 2が安定す るので、人工脂質二重膜 2の耐久性をより一層向上することができる。
[0077] したがって、本発明には、上記の手順で、人工脂質二重膜 2を形成する方法も含ま れる。具体的には、本発明にかかる人工脂質二重膜の形成方法では、底面 9に膜形 成用開口部 (小孔 4)が形成されて!ヽる上溶液槽 3と下溶液槽 8とを用いる。下溶液槽 8は、上溶液槽 3の下方に配置され、人工脂質二重膜 2を支持する支持層 5を表面に 載置する底板 6並びに上溶液槽 3および底板 6の間に所定の間隔を保持する間隔保 持部材 7aを備えており、該底板 6および間隔保持部材 7aに囲まれることにより形成さ れて 、る。ここで上記間隔保持部材 7aは上溶液槽 3および底板 6の間隔を変化可能 となっている。本発明にかかる人工脂質二重膜の形成方法は、上記膜形成用開口 部 (小孔 4)の上溶液槽 3側および下溶液槽 8側の表面を水溶液と接した状態とした 上で、上記間隔を小さくした状態で、脂質溶液 12を添塗する脂質溶液添塗工程と、 上記間隔を大きくすることにより、人工脂質二重膜 2を薄化した状態で支持層 5に接 触させる脂質膜薄化工程とを含む。
[0078] (3)本発明の用途
このように本発明に力かる電流測定装置にお 、ては、形成した人工脂質二重膜 2を より安定ィ匕させることができるので、イオンチャネルを人工脂質二重膜 2に組み込ん だ状態でも、十分に安定した状態でイオンチャネルの構造と機能を同時に測定する ことができる。
[0079] 本発明にかかる電流測定装置の具体的な用途の一例について説明すると、例えば 、疾患に関与するイオンチャネルタンパク質を用いた創薬におけるスクリーニングに 用!/、ることができる。
[0080] イオンチャネルタンパク質は、種類も多ぐ殆どすベての細胞に分布している。従つ て、これらは、疾患の原因にもなりやすいタンパク質であり、創薬のターゲットの 30— 40%がイオンチャネルタンパク質であると言われている。一般に薬理実験は、試薬を 実験動物に投与して効果をみるものであるが、安定な人工脂質二重膜 2ができれば 、標的となるイオンチャネルタンパク質に対する効果を直接調べながら、創薬におけ るスクリーニングを行うことが可能となる。特に、向精神薬など神経系に作用する薬は
、イオンチャネルタンパク質に直接働くものが多ぐこの分野の創薬に好適に用いるこ とができる。また、農薬の創薬に際しては、逆に、人間のイオンチャネルに作用しない ものを選択するために用いることができる。
[0081] また、本発明に力かる電流測定装置は、人工脂質二重膜 2の膜上のタンパク質-タ ンパク質 (薬物)相互作用の可視化解析に用いることができる。さらには、イオンチヤ ネルの種類を変えることにより、様々な物質の検出に応用することができる。
[0082] 〔実施の形態 2〕
本発明における実施の他の形態にっ 、て、図 4な 、し図 6に基づ 、て説明すれば
、以下の通りである。なお、本発明は、本実施の形態の記載内容にのみ限定されるも のではない。また、前記実施の形態 1において説明した部材等と同じ機能や作用を 有する部材等については、その説明を省略する。
[0083] 図 4は、本発明にかかる他の電流測定装置の概略の構成を示す断面図である。図
5は、図 4に示す陰圧形成部のより具体的な構成を示す断面図である。図 6 (a) · (b) は、図 4に示す電流測定装置において、人工脂質二重膜が形成される様子を示す 断面図である。
[0084] (1)人工脂質二重膜を有する電流測定装置の他の例
本実施の形態に力かる電流測定装置は、図 4に示すように、基本的には、前記実 施の形態 1で説明した電流測定装置と同様の構成を有しているが、間隔保持部材 7b 力 その間隔を変化できる構成とはなっておらず、下溶液槽 8内に陰圧を形成する陰 圧形成部（陰圧形成手段） 10が設けられて 、る構成となって 、る。
[0085] <間隔保持部材> 本実施の形態で用いられる間隔保持部材 7bは、基本的な形状は、前記実施の形 態 1における間隔保持部材 7aと同様であるが、上下方向に変化可能となっていない 構成となっている。したがって、その材質は、上溶液槽 3および底板 6と密着し、下溶 液槽 8を密閉することが可能な材質であれば特に限定されるものではない。具体的に は、ポリジメチルシロキサン（PDMS)等のシリコーンゴム、エポキシ榭脂、ラテックスゴ ム等を好ましく用いることができる。
[0086] <陰圧形成部 >
陰圧形成部 10は、底板 6および上記間隔保持部材 7bに囲まれて形成される下溶 液槽 8の内部の圧力を、上溶液槽 3の圧力より低くできる構成であれば特に限定され るものではないが、例えば、図 4に示すように、上記間隔保持部材 7bの側壁に孔を 形成し、ここ力も下溶液槽 8内部を吸引することによって陰圧を形成する構成を挙げ ることがでさる。
[0087] 上記陰圧形成部 10のより具体的な構成は特に限定されるものではない。例えば、 図 5に示すように、間隔保持部材 7bに、下溶液槽 8から測定装置の外部につながる 吸引口 21を設け、さらに、該吸引口 21に接続し下溶液槽 8から電流測定装置の外 部に引き出されたチューブ 22を設け、このチューブ 22を介して吸引部（吸引手段、 図示せず)を接続する構成を挙げることができる。これにより、吸引部で、吸引口 21 およびチューブ 22を介して下溶液槽 8から水溶液を吸引し、下溶液槽 8の内部の圧 力を低下させることができる。
[0088] 上記吸引口 21の具体的な構成は特に限定されるものではなぐ下溶液槽 8内部の 圧力を良好に低下できるように、下溶液槽 8内部の水溶液を外部に吸い出せる程度 の径を有する構成であればよい。また、吸引口 21を形成する方法も特に限定される ものではなぐ間隔保持部材 7bの材質や大きさ等に応じて適切な方法を選択すれば よい。
[0089] 上記チューブ 22の具体的な構成も特に限定されるものではなぐ吸引部の吸引に より下溶液槽 8内部力 水溶液を十分に吸い出せる程度の強度ゃ径ゃ長さを有する 構成であればよい。チューブ 22の材質としては、特に限定されるものではないが、具 体的な一例としては、例えば、ポリテトラフルォロエチレン等のフッ素榭脂、シリコーン 等を挙げることができる。
[0090] 上記吸引部の具体的な構成も特に限定されるものではなぐ吸引口 21 ·チューブ 2 2を介して下溶液槽 8内部の水溶液を吸引することができる構成であればよい。具体 的な一例としては、例えば、ピペット、スポイド、シリンジ等が挙げられる。吸引部の材 質も特に限定されるものではなぐ吸引部の具体的な構成に合わせた適切な材質を 選択すればよい。例えば、本発明では、シリコーンゴム製のスポイドを特に好適に用 いることがでさる。
[0091] もちろん陰圧形成部の具体的な構成は、上記構成に限定されるものではなぐ下溶 液槽 8内部を減圧できる構成であれば、どのような公知の手段でも好適に用いること ができる。
[0092] (2)人工脂質二重膜形成の手順
次に、本実施の形態に力かる電流測定装置において、上溶液槽 3の底面に形成さ れている小孔 4に人工脂質二重膜 2を形成する手順を図 6 (a) · (b)に基づいて説明 する。
[0093] まず、上溶液槽 3および下溶液槽 8を上記水溶液で満たしておく。次に、図 6 (a)に 示すように、小孔 4に上記脂質溶液 12を添塗する。その後、図 6 (b)に示すように、下 溶液槽 8から外部につながる吸引口 21を介して、吸引口 21に接続された図示しない チューブ 22および吸引部を用いて下溶液槽 8から水溶液を吸引する。これにより、上 溶液槽 3の水溶液が人工脂質二重膜 2の上側力ゝら下溶液槽 8に入り込み、人工脂質 二重膜 2が下方に膨らむ。このようにして、人工脂質二重膜 2が支持層 5と接触して薄 化する。
[0094] このように、上溶液槽 3および下溶液槽 8に圧力差を設けることにより、圧力差のな い場合に比べ、人工脂質二重膜 2を数秒間で形成することができる。また、上溶液槽 3の圧力を高くして圧力差を設ける場合と比べて、本実施の形態の方法では、簡単 に圧力差を設けることが可能となる。さらに、上記〔実施の形態 1〕（2)で説明したよう に、上溶液槽 3の圧力を高くして人工脂質二重膜 2を下溶液槽側に膨らませる場合と 比べて、本実施の形態の方法では安定した人工脂質二重膜 2を形成することができ るとともに、面積の小さい人工脂質二重膜 2を形成するために装置が大きくなつてしま うという問題点もない。さらに、上溶液槽 3が解放系であるのに対し、下溶液槽 8は、 人工脂質二重膜 2と上溶液槽 3の底面 9と間隔保持部材 7aと底板 6とにより密閉され た系となっている。そのため、従来では不安定であった底板 6に平行な方向で、人工 脂質二重膜 2が安定するので、人工脂質二重膜 2の耐久性をより一層向上すること ができる。
[0095] したがって、本発明には、上記の手順で、人工脂質二重膜 2を形成する方法も含ま れる。具体的には、本発明にかかる人工脂質二重膜の形成方法では、底面 9に膜形 成用開口部 (小孔 4)が形成されて!ヽる上溶液槽 3と下溶液槽 8とを用いる。下溶液槽 8は上溶液槽 3の下方に配置され、人工脂質二重膜 2を支持する支持層 5を表面に 載置する底板 6並びに上溶液槽 3および底板 6の間に所定の間隔を保持する間隔保 持部材 7bを備えており、該底板 6および間隔保持部材 7bに囲まれることにより形成さ れている。ここで下溶液槽 8には、下溶液槽 8の内部の圧力を低下させる陰圧形成手 段 (陰圧形成部 10)が備えられて ヽる。本発明にカゝかる人工脂質二重膜の形成方法 は、膜形成用開口部 (小孔 4)の上溶液槽 3側および下溶液槽 8側の表面を水溶液と 接した状態とした上で、脂質溶液 12を添塗する脂質溶液添塗工程と、陰圧形成手段 (陰圧形成部 10)を用いて下溶液槽 8の内部の圧力を低下させることにより、人工脂 質二重膜 2を薄化した状態で支持層 5に接触させる脂質膜薄化工程とを含む。
[0096] このように本実施の形態においても、前記実施の形態 1と同様に、迅速な人工脂質 二重膜 2の形成が可能となるとともに、形成された人工脂質二重膜 2をより安定させた ものとすることができる。それゆえ、本実施の形態にかかる電流測定装置も、前記実 施の形態 1と同じ用途に利用することができる。
[0097] なお、本実施の形態における上記間隔保持部材 7bは、上記陰圧形成部 10のみを 備えたものであってもよいが、前記実施の形態 1と同様に、上溶液槽 3および底板 6 の間隔を変化可能な構成と組み合わせた構成となっていてもよい。すなわち、上記 間隔保持部材 7bは弾性体であり、下溶液槽 8内を減圧するとともに、上記間隔を変 化可能になっていてもよい。
〔実施例〕
以下、実施例、図 3、図 5および図 13ないし図 17により、本発明をさらに詳細に説 明する力 本発明はこれに限定されるものではない。
[0098] 本実施例においては、図 5に示される本発明に力かる電流測定装置を用いた。図 5 に基づいて説明すると、上溶液槽 3としては、容積が 0. 1cm3で、底面 9が厚さ 0. 2m m— 0. 3mmのポリプロピレンからなるものを用いた。底面 9には、直径 0. 15mmの 小孔 4を形成した。底板 6としては、厚さが 0. 17mmで、 1辺 18mmの正方形のガラ ス板を用い、底板 6の上溶液槽 3に面する側に lOOnmの厚さのァガロースゲル層を 支持層 5として形成した。ァガロースゲル層は、ァガロース (Sigma製)の分散液を調整 し、これを加熱してァガロースを溶解させた後、これを底板 6に塗布して室温で乾燥 することにより形成した。間隔保持部材 7bとしては、図 3に示すように、上部と下部と が開口しているとともに、内部が中空の円柱の形状を有しているものを用いた。間隔 保持部材 7bの内径は 1. Ommで、高さは 0. 2mmであった。また、間隔保持部材 7b は、シリコーンゴム力もなるものを用いた。間隔保持部材 7bには、吸引口 21と、吸引 口 21に接続して直径が 50 μ m以下のポリテトラフルォロエチレンチューブ 22とを設 けた。該ポリテトラフルォロエチレンチューブ 22には、シリコーンゴム製のスポイドを吸 引部として接続した。電極 16としては、上下溶液槽のいずれにおいても、 Agホイルを Agメツキした Ag— AgCl電極を用い、下溶液槽 8の上記 Ag— AgCl電極は、シリコー ンゴム成形時にシリコーンゴムに埋め込んだものを用いた。チャネル電流の測定には 、パッチクランプアンプ（CEZ— 2400、日本光電製）を用い、 DATレコーダーを用い て DATテープに記録した。
[0099] 〔実施例 1：平滑筋 Ca2+依存性 K+チャネルの電流測定〕
まず、上溶液槽 3および下溶液槽 8に、 lOOmM KC1、 10— 9M CaCl、 lOmM He
2
pes (pH7. 4)水溶液を満たした。
[0100] その後、上溶液槽 3の底面 9に形成された小孔 4に、ホスファチジルコリン (Sigma製 )を 20mgZmLとなるようにデカンに溶解した脂質溶液を添塗した。添塗後、上記ス ポイドを用いて、下溶液槽 8内部の水溶液を吸引し、人工脂質二重膜 2を下溶液槽 8 側に膨らませて、人工脂質二重膜 2を形成した。人工脂質二重膜 2が形成されている ことを顕微鏡観察により確認した。次に、ゥシ気管平滑筋より調整した細胞膜べシク ルをこの人工脂質二重膜 2と融合させ、べシクル膜上の K+チャネルを人工脂質二重 膜 2に組み込み、本発明の電流測定装置を作製した。作製された電流測定装置を用 V、て経時的に電流を測定した。
[0101] 次に、上溶液槽 3および下溶液槽 8に満たす水溶液の CaCl濃度のみを ImMに
2
変えて、上記と同様に電流測定装置を作製し、電流の測定を行った。
[0102] 図 13は、形成された人工脂質二重膜 2の薄化が完了した状態を示している。人工 脂質二重膜 2 (図中「二重膜」と表記)とその周囲を囲む環状バルタ相（図中「バルタ 相」と表記）との境界が視認できることにより、薄膜ィ匕が完了したことが確認できる。図 14に、得られた電流のトレースを、図 15に膜電位 電流特性を示す。図 14 (a)は、 水溶液が lOOmM KC1、 10— 9M CaClを含む場合、図 14 (b)は、水溶液が 100m
2
M KC1、 ImM CaClを含む場合の電流のトレースを示す。 CaCl力 10— 9Mであると
2 2
きはイオンチャネルが閉じられた状態であるのに対し、 CaCl力 ImMであるときはィ
2
オンチャネルが開く割合が増大することが確認された。得られた電流のトレースのパ ターンは、従来の実験結果より明ら力となっているパターンと同一であった。このこと より、本発明の電流測定装置を用いることにより、安定した人工脂質二重膜 2を迅速 且つ簡単に形成でき、信頼性のある測定結果が得られることが判る。また、図 15に示 される I V直線の傾きより求められた単一チャネル電流の大きさ（単一チャネルコン ダクタンス）は 220pS ( = 220 X 10— 12A/V)であった。この値は、人工膜法やパッチ クランプ法等の従来の方法により明らかになつている値と一致した。このことより、本発 明の電流測定装置を用いることにより、生体膜イオンチャネルの性質を正確に測定 できることが示される。また、人工脂質二重膜 2直下のァガロースゲル層等力イオンチ ャネルある!/、は電流測定系に影響を与えることなぐ電流を計測することができること が判る。
[0103] 〔実施例 2：抗生物質ァラメチシン (alamethidn)による、チャネルポアの形成（光学 観察）と単一チャネル電流の同時測定〕
上記実施例 1のべシクルの代わりに、 Cy3 (アマシャムフアルマシア製)で蛍光標識 したァラメチシン (Sigma製)のメタノール溶液を、最終濃度が 10— 8M程度になるように 上溶液槽 3の水溶液に添加した。ァラメチシンは、その C末端にグリシンを付加し、該 kit,フアルマシア製)を用いて Cy3を結合させることにより蛍光標識した。ァラメチシン は両親媒性ペプチドであり、液相カゝら人工脂質二重膜 2に自然に移行しイオンチヤ ネルを形成する。なお、上下溶液槽に満たす水溶液としては、 lOOmM KC1、 10m M Hepes (pH7. 4)水溶液を用いた。
[0104] 本発明の電流測定装置を用いてその蛍光像とァラメチシンによるイオン電流を同時 に観察、測定した。なお、蛍光像は、自作の対物レンズ型全反射蛍光顕微鏡を用い て測定した。
[0105] 図 16 (a)に得られた蛍光性ァラメチシンの蛍光像と膜中でのブラウン運動の軌跡を 、図 16 (b)に電流トレースを示す。このように、本発明の測定装置を用いることにより、 イオン電流の測定とイオンチャネルの光学観察を同時に行うことができる。
[0106] 〔実施例 3 :リアノジンの検出〕
まず、上溶液槽 3および下溶液槽 8に、 500mM Na—メタンスルホン酸、 40mM H epes (pH7. 4)、 0. 01—0.： L M Ca2+水溶液を満たした。
[0107] その後、上溶液槽 3の底面 9の小孔 4に、ホスファチジルコリン 20mgZmlデカン溶 液を添塗し、上記スポイドを用いて、下溶液槽 8内部の水溶液を吸引し、人工脂質二 重膜 2を下溶液槽 8側に膨らませて人工脂質二重膜 2を形成した。次に、ブタ心筋細 より調整した細胞膜べシクルをこの人工脂質二重膜と融合させ、べシクル膜上のリア ノジン受容体チャネル (Ca—チャネル)を人工脂質二重膜 2に組み込んだ。このとき、 べシクル膜上のリアノジン受容体チャネルを、あらかじめ、蛍光色素 Cy5 (アマルシャ ムフアルマシア製)で蛍光標識した後、細胞膜べシクルを人工脂質二重膜 2に融合さ せた。リアノジン受容体チャネルの蛍光標識は、これに対する特異的モノクロナール 抗体を Cy5で標識し、この標識された抗体をリアノジン受容体チャネルに結合させる ことにより行った。
[0108] 得られた本発明の電流測定装置を用いて単一チャネル電流を測定しながら、 Cy5
(アマシャムフアルマシア製)で蛍光標識した 1一 ΙΟηΜのリアノジン (Sigma製）を膜上 方より添加し、チャネルの活性ィ匕を観察した。
[0109] 図 17に、リアノジン添加前の電流のトレース（a) (図中「current」と表示、後述する（d )においても同じ）、リアノジン受容体チャネルの蛍光像 (b) (図中、「channel」と表示、 後述する（e)においても同じ)およびリアノジンの蛍光像 (c) (図中、「ligand」と表示、 後述する（f)においても同じ）、並びに、リアノジン添加後の電流のトレース（d)、リアノ ジン受容体チャネルの蛍光像 (e)、およびリアノジンの蛍光像 (f)を示す。リアノジン 受容体チャネルとリアノジンの蛍光像の観察と電流の測定とを同時に行うことで、リア ノジンが観察されるのと同時にリアノジン受容体チャネルの活性ィ匕が起こっていること が確認できる。
[0110] 以上のように、本発明にかかる電流測定装置は、人工脂質二重膜を介して流れる 電流を測定可能とする電流測定装置であって、水溶液を蓄積可能となって!/、る上溶 液槽と、該上溶液槽の下方に配置される下溶液槽とを備えており、上溶液槽の底面 には膜形成用開口部が形成されているとともに、下溶液槽の底面には、人工脂質二 重膜を支持する支持層が設けられており、上溶液槽の膜形成用開口部で形成した 人工脂質二重膜を支持層上に接触させて支持する電流測定装置において、さらに、 上記支持層を表面に載置する底板と、上溶液槽および底板の間に所定の間隔を保 持する間隔保持部材とを備えており、上記下溶液槽は、底板および間隔保持部材に 囲まれることにより、上溶液槽の下方に形成され、上溶液槽の膜形成用開口部で形 成した人工脂質二重膜を下溶液槽側に膨らませることにより、該人工脂質二重膜を 薄化した状態で支持層に接触させ、支持層上で支持することを特徴として ヽる。
[0111] また、本発明にかかる電流測定装置は、人工脂質二重膜を介して流れる電流を測 定可能とする電流測定装置であって、水溶液が蓄積可能であり、底面には膜形成用 開口部が形成されている上溶液槽と、該上溶液槽の下方に配置され上記水溶液が 蓄積可能な下溶液槽と、を備えており、上記下溶液槽は、底板と上溶液槽および底 板の間を所定の間隔に保持するように上溶液槽の底面と底板とを密着させて 、る間 隔保持部材とで構成されているとともに、上記底板には人工脂質二重膜を支持する 支持層が設けられて 、る構成であってもよ 、。
[0112] そして、上記の構成において、上溶液槽の膜形成用開口部で形成した人工脂質二 重膜を下溶液槽側に膨らませることにより、該人工脂質二重膜を薄化した状態で支 持層に接触させ、人工脂質二重膜を支持層上で支持して!/ヽる。
[0113] 上記の構成によれば、下溶液槽が解放系ではないため、水溶液の流動による振動 が抑えられ、上溶液槽の底面に平行な方向においても安定な人工脂質二重膜を形 成することが可能となる。
[0114] また、本発明にかかる電流測定装置は、底板および間隔保持部材に囲まれて形成 される下溶液槽の内部の圧力を低下させる陰圧形成手段を備えており、該陰圧形成 手段により、上溶液槽の膜形成用開口部で形成した人工脂質二重膜を下溶液槽側 に膨らませることを特徴としている。上記陰圧形成手段は、上記間隔保持部材に形 成され、上記下溶液槽力 外部につながる吸引口と、該吸引口に接続され、下溶液 槽内部の水溶液を吸引する吸引手段とを含んでいることが好ましい。
[0115] さらに、本発明にかかる電流測定装置は、上記間隔保持部材が、上溶液槽および 底板の間隔を変化可能となっており、該間隔の変化により、上溶液槽の膜形成用開 口部で形成した人工脂質二重膜を下溶液槽側に膨らませるものであってもよい。か 力る場合、上記間隔保持部材は弾性体力もなつており、上下に伸縮可能となってい ることが好ましい。
[0116] 上記の構成によれば、下溶液槽の内部の圧力を低下させることにより、人工脂質二 重膜を数秒間という短時間で迅速に、且つ、簡単に形成させることが可能となる。
[0117] また、本発明にかかる電流測定装置は、上記支持層が、高分子ゲル力もなつてい ることが好ましぐ上記高分子ゲルとして、ァガロースまたはポリアクリルアミドが用いら れることがより好ましい。さら〖こ、上記高分子ゲル層の厚さは、 50nm以上 2mm以下 であることが好ましい。
[0118] 上記の構成によれば、下溶液槽の内部の圧力を低下させても、高分子ゲル層に支 えられて、人工脂質二重膜が上下方向に安定する。
[0119] また、本発明にかかる電流測定装置は、上記膜形成用開口部の直径が、 lO ^ m 以上 500 μ m以下であることが好ましい。
[0120] さらに、本発明にかかる電流測定装置は、上記底板が透光性を有する材料からな つているとともに、底板の下方には、支持層上の人工脂質二重膜を観察可能とする 光学観察手段が設けられて 、る構成であることが好まし 、。
[0121] また、本発明にかかる電流測定装置は、上溶液槽に電気的に接続される電流計測 手段と、下溶液槽に電気的に接続されるアース手段とを備えていればよぐさらに、 本発明に力かる電流測定装置は、上記人工脂質二重膜がイオンチャネルを含むこと が好ましい。
[0122] 以上のように、本発明に力かる電流測定装置を用いれば、上溶液槽 3の底面 9に平 行な方向にお!ヽても安定で耐久性が高 、人工脂質二重膜 2を短時間で簡単に形成 することができる。また、チャネル電流の測定と同時に、イオンチャネルを光学的に観 察することができる。さらに、小型化が可能で、小型のチップ上に作成することによつ て、より小型のセンサーを製造することが可能となる。
[0123] その結果、イオンチャネルの種類を変えることにより、様々な物質の検出に応用す ることができ、疾患に関与するイオンチャネルタンパク質を用いた創薬におけるスクリ 一-ングに用いることができる。また、チャネル電流測定と光学観察を同時に行うこと により、イオンチャネルの機能と構造の関係を明らかにするためにも有用である。
[0124] 尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様また は実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような 具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなぐ本発明の精神と次に記 載する特許請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。 産業上の利用の可能性
[0125] 本発明に力かる電流測定装置は、例えば、疾患に関与するイオンチャネルタンパク 質を用いた創薬におけるスクリーニングに用いることができる。
[0126] イオンチャネルタンパク質は、種類も多ぐ殆どすベての細胞に分布している。従つ て、これらは、疾患の原因にもなりやすいタンパク質であり、創薬のターゲットの 30— 40%がイオンチャネルタンパク質であると言われている。一般に薬理実験は、試薬を 実験動物に投与して効果をみるものであるが、安定な人工脂質二重膜 2ができれば 、標的となるイオンチャネルタンパク質に対する効果を直接調べながら、創薬におけ るスクリーニングを行うことが可能となる。特に、向精神薬など神経系に作用する薬は
、イオンチャネルタンパク質に直接働くものが多ぐこの分野の創薬に好適に用いるこ とができる。また、農薬の創薬に際しては、逆に、人間のイオンチャネルに作用しない ものを選択するために用いることができる。
[0127] また、本発明に力かる電流測定装置は、人工脂質二重膜 2の膜上のタンパク質-タ ンパク質 (薬物)相互作用の可視化解析に用いることができる。さらには、イオンチヤ ネルの種類を変えることにより、様々な物質の検出に応用することができる。

Claims

請求の範囲
[1] 人工脂質二重膜を介して流れる電流を測定可能とする電流測定装置であって、水 溶液を蓄積可能となって ヽる上溶液槽と、該上溶液槽の下方に配置される下溶液槽 とを備えており、上溶液槽の底面には膜形成用開口部が形成されているとともに、下 溶液槽の底面には、人工脂質二重膜を支持する支持層が設けられており、上溶液 槽の膜形成用開口部で形成した人工脂質二重膜を支持層上に接触させて支持する 電流測定装置において、
さらに、上記支持層を表面に載置する底板と、上溶液槽および底板の間に所定の 間隔を保持する間隔保持部材とを備えており、
上記下溶液槽は、底板および間隔保持部材に囲まれることにより、上溶液槽の下 方に形成され、
上溶液槽の膜形成用開口部で形成した人工脂質二重膜を下溶液槽側に膨らませ ることにより、該人工脂質二重膜を薄化した状態で支持層に接触させ、支持層上で 支持することを特徴とする電流測定装置。
[2] 底板および間隔保持部材に囲まれて形成される下溶液槽の内部の圧力を低下さ せる陰圧形成手段を備えており、
該陰圧形成手段により、上溶液槽の膜形成用開口部で形成した人工脂質二重膜 を下溶液槽側に膨らませることを特徴とする請求項 1に記載の電流測定装置。
[3] 上記陰圧形成手段は、上記間隔保持部材に形成され、上記下溶液槽から外部に つながる吸引口と、該吸引口に接続され、下溶液槽内部の水溶液を吸引する吸引手 段とを含むことを特徴とする請求項 2に記載の電流測定装置。
[4] 上記間隔保持部材は、上溶液槽および底板の間隔を変化可能となっており、該間 隔の変化により、上溶液槽の膜形成用開口部で形成した人工脂質二重膜を下溶液 槽側に膨らませることを特徴とする請求項 1に記載の電流測定装置。
[5] 上記間隔保持部材は弾性体力 なっており、上下に伸縮可能となっていることを特 徴とする請求項 4に記載の電流測定装置。
[6] 上記支持層は高分子ゲル力 なっていることを特徴とする請求項 1一 5の何れか 1 項に記載の電流測定装置。
[7] 上記高分子ゲルとして、ァガロースまたはポリアクリルアミドが用いられることを特徴 とする請求項 6に記載の電流測定装置。
[8] 上記高分子ゲル層の厚さ力 50nm以上 2mm以下であることを特徴とする請求項
6または 7に記載の電流測定装置。
[9] 上記膜形成用開口部の直径が、 10 μ m以上 500 μ m以下であることを特徴とする 請求項 1一 8の何れか 1項に記載の電流測定装置。
[10] 上記底板が透光性を有する材料力 なっているとともに、底板の下方には、支持層 上の人工脂質二重膜を観察可能とする光学観察手段が設けられていることを特徴と する請求項 1一 9の何れか 1項に記載の電流測定装置。
[11] 上溶液槽に電気的に接続される電流計測手段と、下溶液槽に電気的に接続される アース手段とを備えていることを特徴とする請求項 1一 10の何れ力 1項に記載の電流 測定装置。
[12] 上記人工脂質二重膜がイオンチャネルを含むことを特徴とする請求項 1一 11の何 れか 1項に記載の電流測定装置。
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