CN101568646A - 基因扩增用引物对、含有其的基因扩增用试剂及其用途 - Google Patents

基因扩增用引物对、含有其的基因扩增用试剂及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于通过基因扩增法扩增2个基因(CYP2C9基因和VKORC1基因)的引物对，所述引物对能够在同一反应体系中，同时特异且高效率地扩增所述2个基因的各目标区域。使用分别含有包括序列号5和序列号29的碱基序列的正向引物及包含序列号18和序列号38的碱基序列的反向引物的2对引物对。通过使用该引物对，能够在同一反应液中，同时特异地扩增CYP2C9基因和VKORC1基因中包含发生检测目标的多态性的位点的目标区域。

Description

基因扩增用引物对、含有其的基因扩增用试剂及其用途
技术领域
本发明涉及一种用于同时扩增CYP2C9基因和VKORC1基因的引物对、含有其的基因扩增用试剂及其用途。
背景技术
作为防止血液凝固的药物，华法林(warfarin)被广泛应用于心肌梗塞和脑梗塞的患者。华法林的合适量随人种不同差异较大，此外即使相同人种，也发现在个体间有差异。若大量地给予华法林，则有可能出现例如鼻血或皮肤内出血，或有时产生脑出血等副作用。因此，在治疗中，决定每位患者的华法林的适当量变得非常重要。
近年有报道指出：在确定华法林的该适量值时，CYP2C9基因和VKORC1基因的多态性与华法林的药效相关(非专利文献1和非专利文献2)。CYP2C9基因为编码生产华法林代谢酶的细胞色素P450的基因。VKORC1基因为编码作用于与血液凝固相关的维生素K的蛋白质的基因。因此，检测该2种基因的多态性，对于根据患者决定法华林的适量，降低副作用非常重要。
另一方面，作为在基因水平分析各种疾病的原因、个体间的疾病易患性(生病的容易度)、或个体间药效的不同等的方法，点突变，即所谓的单核苷酸多态性(SNP)的检测被广泛进行。作为点突变的一般的检测方法，可举出(1)对于样品的目标DNA，通过PCR(Polymerase chain reaction)扩增与检测对象序列相当的区域，分析其全部基因序列的直接测序(DirectSequencing)法，(2)对于样品的目标DNA，通过PCR扩增与检测对象序列相当的区域，用根据检测对象序列中目标突变的有无而切断作用不同的限制酶切断其扩增产物，通过进行电泳而进行分型的RFLP分析，(3)使用3’端区域有目标突变的引物进行PCR，通过扩增的有无来判断突变的ASP-PCR法等。
但是，这些方法由于必须进行例如从样品提取的DNA的纯化、电泳、限制酶处理等，花费劳力和成本。另外，进行PCR之后，由于必须开启一次反应容器，所述扩增产物混入随后的反应体系中，有可能降低分析准确度。此外，由于难于自动化，不能分析大量的样品。另外，前述(3)的ASP-PCR法，还有特异性低的问题。
由于这些问题，近年，作为点突变的检测方法，分析由目标核酸与探针形成的双链核酸的解链温度(Tm：meltingtemperature)的方法正在被实用化。这样的方法例如由于通过Tm分析或者前述双链的解链曲线分析来进行，因此被称为解链曲线分析。其为如下的方法。也就是说，首先，使用与含检测目标的点突变的检测对象序列互补的探针，使检测样品的目标单链DNA与前述探针形成杂交体(双链DNA)。接着，对该杂交产物实施加热处理，由吸光度等信号的变动来检测伴随温度上升的杂交体的解离(解链)。然后，基于该检测结果决定Tm值，从而判断点突变的有无。杂交产物的同源性越高则Tm值越高，同源性越低则Tm值越低。因此，预先求出含点突变的检测对象序列和与其互补的探针的杂交产物的Tm值(评价基准值)，测定检测样品的目标单链DNA和前述探针的Tm值(测定值)，若测定值与评价基准值为相同程度，则可判断为匹配，即目标DNA上存在点突变，若测定值比评价基准值低，则可判断为不匹配，即目标DNA上不存在点突变。从而，根据该方法，可使基因分析自动化。
但是，即使通过这种利用Tm分析的检测方法，也和前述的(1)～(3)的分析方法同样地存在无法在一个反应液中分析多个序列的问题。如前所述，由于华法林的效果与CYP2C9基因的多态性和VKORC 1基因的多态性相关，希望对两者的基因分析多态性，基于这些结果来综合地判断华法林的处方。但是，由于各基因存在同工酶，在PCR中，除目标的基因之外，有可能连同工酶的编码基因也被扩增。因此，在以往的方法中，例如，为调查CYP2C9基因和VKORC1基因的各多态性，必须在各自的反应体系中分别扩增各基因的目标区域，分别分析所得的扩增产物。这样，在以往的方法中，仅以这2个基因作为模板且特异地仅扩增各基因的各目标区域非常困难。因此，这样即使分析一个样品也要花费大量的劳力，在分析大量的样品上存在不实用的问题。
非专利文献1：Simone Rost等，Nature Vol.427 2004 letters tonature
非专利文献2：Mark J.Rieder等，The New England Journalof Medicine 353；22，2005
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种引物对，其为用于通过基因扩增法扩增2种基因(CYP2C9基因和VKORC1基因)的引物对，所述引物对能够在同一反应体系中，同时特异且高效率地扩增所述2种基因的各目标区域。
为了实现上述目的，本发明的引物对为用于通过基因扩增法同时扩增2种基因的引物对，所述2种基因为CYP2C9基因和VKORC1基因，
所述引物对包括下述(1)和(2)2种引物对：
引物对(1)：
包含含有下述(F1)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R1)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对：
(F1)至少一种与序列号1的碱基序列中第466位的腺嘌呤碱基(A)为第一位碱基向着5’方向到第14～18位碱基的区域序列相同的寡核苷酸，该寡核苷酸以所述腺嘌呤碱基(A)为3’端；
(R1)至少一种与序列号1的碱基序列中第631位的胸腺嘧啶碱基(T)为第1位碱基向着3’方向到第19～36位碱基的区域互补的寡核苷酸，该寡核苷酸以与所述第631位的胸腺嘧啶碱基(T)互补的腺嘌呤碱基(A)为3’端；
引物对(2)：
包含含有下述(F2)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R2)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对：
(F2)至少一种与序列号2的碱基序列中第440位的腺嘌呤碱基(A)为第一位碱基向着5’方向到第21～27位碱基的区域序列相同的寡核苷酸，该寡核苷酸以所述腺嘌呤碱基(A)为3’端；
(R2)至少一种与序列号2的碱基序列中第541位的腺嘌呤碱基(A)为第1位碱基向着3’方向到第18～25位碱基的区域互补的寡核苷酸，该寡核苷酸以与所述第541位的腺嘌呤碱基(A)互补的胸腺嘧啶碱基(T)为3’端。
另外，本发明的基因扩增用试剂，其特征在于，其为用于通过基因扩增法扩增2种基因的试剂，所述2种基因为CYP2C9基因和VKORC1基因，所述基因扩增用试剂含有所述本发明的基因扩增用引物对。
本发明的扩增产物的制备方法，其特征在于，其为通过基因扩增法制备2种基因的扩增产物的方法，所述2种基因为CYP2C9基因和VKORC1基因，
所述方法包含下述(I)步骤：
(I)以样品中的核酸为模板，使用本发明的基因扩增用引物对，在同一反应液中同时进行所述CYP2C9基因和VKORC1基因的扩增的步骤。
本发明的多态性分析方法，其特征在于，其为分析基因中的检测对象位点的多态性的方法，
所述基因为CYP2C9基因和VKORC1基因，
所述方法包含下述(i)～(iv)步骤：
(i)按照本发明的扩增产物的制备方法，在同一反应液中同时扩增CYP2C9基因的含检测对象位点的区域和VKORC1基因的含检测对象位点的区域的步骤；
(ii)准备反应液的步骤，所述反应液含有所述(i)步骤中的CYP2C9基因的扩增产物和VKORC1基因的扩增产物、以及能够分别与所述各基因的各检测对象位点杂交的探针；
(iii)改变所述反应液的温度，测定所述各扩增产物和所述各探针的各杂交产物显示解链状态的信号值的步骤；
(iv)由随温度变化的所述信号值的变动，决定所述各检测对象位点的多态性的步骤。
根据本发明的引物对，能够在同一反应液中同时且特异地扩增CYP2C9基因和VKORC1基因的各自的目标区域(含存在检测目标多态性位点的区域)。因此，与如前所述的以往方法不同，能够降低扩增目标区域所需的处理和成本。另外，由于这样能够在同一反应液中分别特异地扩增2种基因的各目标区域，例如通过使用与各目标区域中的检测对象序列互补的探针，可使用前述反应液直接进行Tm分析，能对各基因的多态性进行分型。另外，由于能够在一个反应液中进行扩增和分型，使操作的自动化成为可能。此外，如果使用本发明的引物对，例如即使是含杂质的样品(例如，全血或口腔粘膜等)，由于可省略前处理，可更加迅速且简便地进行扩增反应。另外，如果使用本发明的引物对，由于可以用比以往更优良的增幅效率进行扩增反应，还可缩短扩增反应。因此，根据本发明的引物对和含其的试剂，及使用它们的扩增产物的制造方法，可迅速且简便地分析CYP2C9基因和VKORC1基因的各自的多态性，因此本发明在医疗领域中非常有效。
附图说明
图1为表示本发明的实施例中的Tm分析的结果的图。
图2为表示本发明的另一实施例中的Tm分析的结果的图。
图3为表示本发明的另一实施例中的Tm分析的结果的图。
图4为表示本发明的另一实施例中的Tm分析的结果的图。
图5为表示本发明的另一实施例中的Tm分析的结果的图。
图6为表示本发明的另一实施例中的Tm分析的结果的图。
具体实施方式
<基因扩增用引物对>
本发明的基因扩增用引物对如前述那样，特征在于包含2种引物对(1)及(2)。如后所述，通过本发明的引物对扩增的区域为CYP2C9基因的包含多态性的检测目标位点(序列号1中第521位)的区域、VKORC1基因的包含多态性的检测目标位点(序列2中第484位)的区域。因此，如果使用本发明的引物对扩增各基因的目标区域，可比以往更高效率地分析这2种基因的多态性。并且，以下将正向引物称为F引物，反向引物称为R引物。
首先，对用于扩增CYP2C9基因的引物对(1)进行说明。如前所述，引物对(1)为包含含有下述(F1)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R1)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对(以下，也称为“CYP2C9基因用引物对”)。
(F1)至少一种与序列号1的碱基序列中第466位的腺嘌呤碱基(A)为第一位碱基向着5’方向到第14～18位碱基的区域序列相同的寡核苷酸，该寡核苷酸以所述腺嘌呤碱基(A)为3’端
(R1)至少一种与序列号1的碱基序列中第631位的胸腺嘧啶碱基(T)为第1位碱基向着3’方向到第19～36位碱基的区域互补的寡核苷酸，该寡核苷酸以与所述第631位的胸腺嘧啶碱基(T)互补的腺嘌呤碱基(A)为3’端
序列号1所示的碱基序列为人细胞色素P450家族2亚族C多肽9(CYP2C9)的全长序列的部分序列。所述碱基序列具体为例如NCBI数据库：登录为No.AY702706的CYP2C9的全长序列中的52,001～53,000的区域。
前述CYP2C9基因用引物对为用于扩增含有序列号1中的第467位～630位的区域的DNA链及其互补链的引物对。已知该区域内第521位的碱基(序列号1中的第521位碱基)和第522位的碱基(序列号1中的第522位碱基)存在影响CYP2C9功能的点突变(A521C，T522C)。
521C的多态性被称为CYP2C9*3，相对地，野生型的序列一般被称为CYP2C9*1。显示出如下的多态性：若521位的碱基为A，则当CYP2C9基因被翻译成蛋白质时氨基酸359位为异亮氨酸(Ile)，若521位的碱基为C，则氨基酸359位为亮氨酸(Leu)。在本发明中，该位点的多态性，当为纯合子时可以CYP2C9*1/*1(521A/A)、CYP2C9*3/*3(521C/C)表示，当为杂合子时可以CYP2C9*1/*3(521A/C)表示。另外，522C的多态性被称为CYP2C9*4，相对地，野生型的序列一般被称为CYP2C9*1。显示出如下的多态性：若522位的碱基为T，则当CYP2C9基因被翻译成蛋白质时，氨基酸359位为异亮氨酸(Ile)，若522位的碱基为C，则氨基酸359位为苏氨酸(Thr)。在本发明中，该位点的多态性，当为纯合子时可以CYP2C9*1/*1(522T/T)、CYP2C9*4/*4(522C/C)表示，当为杂合子时可以CYP2C9*1/*4(522T/C)表示。以下，将该引物对(1)也称为“CYP2C9用引物对”。
本发明中，引物对(1)的F1引物和R1引物只要起决定DNA聚合酶的扩增起始点的作用的3’端的碱基满足前述的条件即可。这样，通过固定各引物的3’端的碱基，可充分防止引物对(1)与例如类似的其他同工酶的基因(例如CYP2C8、CYP2C17、CYP2C18、CYP2C19基因等)结合。
这样，F1引物和R1引物由于只要其3’端的碱基固定即可，各引物的长度本身无特别限制，可适当调整为一般的长度。作为引物长度的一例，例如为13～50mer的范围，优选为14～45mer，更优选为15～40mer。作为具体例，前述F1引物优选为至少一种与序列号1的碱基序列中第466位的腺嘌呤碱基(A)为第一位碱基向着5’方向到第14～18位碱基(优选为14～17位碱基，更优选为15～17位碱基)的区域序列相同的寡核苷酸。并且，所述R1引物优选为至少一种与序列号1的碱基序列中第631位的胸腺嘧啶碱基(T)为第1位碱基向着3’方向到第19～36位碱基(优选为22～30位碱基，更优选为23～29位碱基)的区域互补的寡核苷酸。并且，由于F1引物与R1引物的3’端被固定，从引物开始延伸的区域虽为例如如前所述的序列号1中第467位～630位的区域，但所得的扩增产物的整体长度可根据所使用的引物的长度变化。
另外，R1引物可以是不与序列号1中所示的碱基序列完全互补的寡核苷酸，F1引物也可以是不与前述碱基序列的互补链的碱基序列完全互补的寡核苷酸。即，各引物中，除3’端的碱基外的部分与完全互补的寡核苷酸可有例如1～5个碱基不同。
以下，虽示出F1引物和R1引物的具体例，但本发明不限于此。另外，虽然这些F1引物和R1引物的组合并无特别限制，但其中特别优选为包含含有序列号5的寡核苷酸的F1’引物和含有序列号18的寡核苷酸的R1’引物的引物对(1’)。另外，下述表中的“Tm(℃)”为下述表的序列和与其完全互补的序列进行杂交时的Tm(℃)，根据MELTCALC软件(http://www.meltcalc.com/)，将参数设为寡核苷酸浓度0.2μM，Na当量(Na eq.)50mM算出的值(以下，同样)。前述Tm值例如可通过以往公知的MELTCALC软件(http://www.meltcalc.com/)等算出，或者也可通过邻接法(Nearest Neighbor Method)决定(以下同样)。
表1
然后，对用于扩增VKORC1基因的引物对(2)进行说明。如前所述，上述引物对(2)为包含含有下述(F2)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R2)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对。以下，将该引物对(2)也称为“VKORC1基因用引物”。
(F2)至少一种与序列号2的碱基序列中第440位的腺嘌呤碱基(A)为第一位碱基向着5’方向到第21～27位碱基的区域序列相同的寡核苷酸，该寡核苷酸以所述腺嘌呤碱基(A)为3’端；
(R2)至少一种与序列号2的碱基序列中第541位的腺嘌呤碱基(A)为第1位碱基向着3’方向到第18～25位碱基的区域互补的寡核苷酸，该寡核苷酸以与所述第541位的腺嘌呤碱基(A)互补的胸腺嘧啶碱基(T)为3’端。
序列号2所示的碱基序列为编码人维生素K环氧化物还原酶复合体的亚基1(Homo sapiens vitamin K epoxide reductasecomplex，subunit 1：VKORC1)的VKORC1基因的全长序列的部分序列。所述碱基序列具体而言为NCBI数据库：登录为No.AY587020的VKORC1基因的全长序列中的6001位～7000位的区域。
前述VKORC1基因用引物对为用于扩增含有序列号2中第441～540位的区域的DNA链及其互补链的引物对。已知该区域内第484位的碱基(序列号2中的第484位碱基)存在点突变(484C、484T)。这些多态性，例如，当为纯合子时可以484C/C或484T/T表示，当为杂合子时可以484C/T表示。另外，当这些多态性为纯合子时，例如，基于全长的碱基编号，可以6484C/C、6484T/T、6484C/T表示(以下这样表示)。并且，一般而言，关于6484位碱基的多态性，有报告称欧美人多为C，日本人多为T。
与前述CYP2C9基因用引物对的理由相同，VKORC1基因用引物对的F2引物和R2引物只要起决定DNA聚合酶的扩增起始点的作用的3’端的碱基满足前述的条件即可。因此，F2引物和R2引物的长度本身无特别限制，可示例与前述相同的长度。作为具体例，前述F2引物优选为至少一种与序列号2的碱基序列中第440位的腺嘌呤碱基(A)为第一位碱基向着5’方向到第21～27位碱基(优选为第22～26位碱基，更优选为第23～25位碱基)的区域序列相同的寡核苷酸。并且，所述R2引物优选为至少一种与序列号2的碱基序列中第541位的腺嘌呤碱基(A)为第1位碱基向着3’方向到第18～25位碱基(优选为18～23位碱基，更优选为19～22位碱基)的区域互补的寡核苷酸。此外，由于F2引物与R2引物的3’端被固定，从引物开始延伸的区域虽为例如如前所述的序列号2的第441～540位的区域，但所得的扩增产物的整体长度可根据所使用的引物的长度变化。
另外，R2引物可以为不与序列号2所示的碱基序列完全互补的寡核苷酸，F2引物也可以为不与前述碱基序列的互补链的碱基序列完全互补的寡核苷酸。即，在各引物中，除3’端的碱基外的部分可以与完全互补的寡核苷酸有1个～5个碱基不同。
以下，示出F2引物和R2引物的具体例，但本发明不限于此。另外，虽然这些F2引物和R2引物的组合并无特别限制，但其中特别优选包含含有序列号29的寡核苷酸的F2’引物和含有序列号38的寡核苷酸的R2’引物的引物对(2’)。
表2
Figure A20088000129000171
另外，例如为了缩短反应时间，前述的引物对(1)和引物对(2)的各引物也可在5’端连接以往公知的任意序列。
含有这样的引物对(1)和引物对(2)的本发明的基因扩增用引物对，优选在同时扩增全血样品等生物样品中的CYP2C9基因和VKORC1基因时使用。特别是，在与后述的多态性检测用探针一同使用时，优选在基因扩增用反应液中的全血样品的添加比例为0.1～0.5体积％的基因扩增法中使用。关于这方面，如后所述。
<基因扩增用试剂>
如前所述，本发明的基因扩增用试剂，其特征在于，其为用于通过基因扩增法扩增2种基因的试剂，所述2种基因为CYP2C9基因和VKORC1基因，所述基因扩增用试剂含有本发明的基因扩增用引物对。本发明的基因扩增用试剂，其特征在于，含有本发明的引物对，对其以外的组成等并无任何限制。
例如为了检测通过使用本发明的引物对的基因扩增法而获得的扩增产物，本发明的基因扩增用试剂可进一步含有与CYP2C9基因的检测对象位点杂交的探针、及与VKORC1基因的检测对象位点杂交的探针中的至少一种。特别优选含有两种探针。如前所述，通过本发明的引物对，能够通过基因扩增法特异性地扩增2种基因(CYP2C9基因和VKORC1基因)的各自的目标区域。因此，通过使与CYP2C9基因和VKORC1基因的目标区域的检测对象序列互补的2种探针共存，例如，能通过后述的方法检测各目标区域的扩增的有无、检测目标的多态性等。关于这种探针或其利用方法，将在后面的多态性分析方法中进行说明。另外，本发明的基因扩增用试剂优选在扩增全血等生物样品中的前述2种基因的情况下使用，尤其是与前述这类探针一同使用时，优选在基因扩增用反应液中的全血样品的添加比例为0.1～0.5体积％的基因扩增法中使用。并且，在本发明中，“检测对象序列”是指包含存在多态性的位点(检测对象位点)的序列。
本发明的基因扩增用试剂的形态无特别限制，例如既可为含有本发明的基因扩增用引物对的液体试剂，也可为使用前以溶剂悬浮的干燥试剂。并且，本发明的基因扩增用引物对的含有量也无特别限制。
<扩增产物的制备方法>
如前所述，本发明的扩增产物的制备方法，其特征在于，其为通过基因扩增法制备2种基因的扩增产物的方法，所述2种基因为CYP2C9基因和VKORC1基因，所述方法包含下述(I)步骤。
(I)以样品中的核酸为模板，使用本发明的基因扩增用引物对，在同一反应液中同时扩增所述CYP2C9基因和VKORC1基因的步骤
这样，通过使用本发明的引物对进行扩增反应，如前所述，能在同一反应液中，同时且特异地扩增CYP2C9基因和VKORC1基因的各自的目标区域。如前所述，通过本发明扩增出的2个目标区域为CYP2C9基因和VKORC1基因中的分别含有存在目标多态性的检测对象位点的区域。另外，本发明的扩增产物的制备方法，特征在于使用本发明的引物对，基因扩增法的种类、条件等无任何限制。
作为所述基因扩增法，如前所述无特别限制，可列举例如PCR(Polymerase Chain Reaction)法、NASBA(Nucleic acidsequence based amplification)法、TMA(Transcription-mediatedamplification)法、SDA(Strand Displacement Amplification)法等，优选为PCR法。并且，以下虽以PCR法为例对本发明进行说明，但本发明不受其限制。
作为适用本发明的样品，例如含形成模板的核酸即可，无特别限制，例如，优选适用于含杂质的样品。作为所述含杂质的样品，可列举例如全血、口腔细胞(例如，口腔粘膜)、指甲或毛发等体细胞、生殖细胞、痰、羊水、石蜡包埋组织、尿、胃液(例如，胃洗涤液)等，或这些物质的悬浮液。根据使用本发明的引物对的扩增产物的制备方法，例如，即使为含各种杂质的样品(特别是全血或口腔细胞等生物样品)，也不易受其影响，能特异地扩增2种基因(CYP2C9基因和VKORC1基因)的各自的目标区域。因此，根据本发明，即使是以往的方法难以处理的杂质较多的样品，也可不进行例如精制等前处理而直接使用。因此，从样品的前处理的观点来看，可比以往方法更迅速地制备扩增产物。
前述反应液中样品的添加比例无特别限制。作为具体例，当所述样品为生物样品(例如，全血样品)的情况下，所述反应液中添加比例的下限，例如优选为0.01体积％以上，更优选为0.05体积％以上，尤其优选为0.1体积％以上。另外，所述添加比例的上限也无特别限制，例如优选为2体积％以下，更优选为1体积％以下，尤其优选为0.5体积％以下。
另外，当如后所述以光学检测为目的的情况下，特别是使用标记探针进行光学检测的情况下，全血样品这样的生物样品的添加比例，例如优选设定为0.1～0.5体积％。在PCR反应中，通常为使DNA变性(向单链DNA的解离)而实施热处理，由于该热处理，样品中所含的糖或蛋白质等变性，有可能产生不溶的沉淀物或浑浊等。因此，当通过光学方法对扩增产物的有无或检测对象位点的基因型(多态性)进行确认的情况下，这样的沉淀物或浑浊的产生有可能影响测定精度。但是，若将反应液中全血样品的添加比例设定在前述范围内，虽机理不明，但可充分防止例如由于变性导致的沉淀物等的产生，从而提高光学方法的测定精度。另外，由于充分抑制全血样品中的杂质对PCR的抑制，可进一步提高扩增效率。因此，在使用本发明的引物对的基础上，通过进一步将全血样品等样品的添加比例设定在前述范围内，可进一步排除样品前处理的必要性。
另外，前述反应液中的全血样品的比例不以前述体积比例(例如，0.1～0.5体积％)而是以血红蛋白(以下，称为“Hb”)的重量比例表示也是可以的。此时，前述反应液中的全血样品的比例换算成Hb量，例如，优选为0.565～113g/L的范围，更优选为2.825～56.5g/L的范围，尤其优选为5.65～28.25g/L的范围。并且，前述反应液中的全血样品的添加比例，例如，即可满足前述体积比例和Hb重量比例两者，也可满足任一者。
作为全血，例如可为溶血的全血、未溶血的全血、抗凝全血、含凝固组分的全血等中的任意一种。
在本发明中，样品中所含的目标核酸例如为DNA。所述DNA，例如即可为生物样品等样品中本来含有的DNA，也可为通过基因扩增法扩增出的扩增产物DNA。在为后者的情况下，可举出从所述样品中本来含有的RNA(总RNA、mRNA等)通过逆转录反应(例如，RT-PCR(Reverse Transcription PCR))生成的cDNA。
在本发明的扩增产物的制备方法中，优选在基因扩增反应开始之前，向前述反应液中添加清蛋白。这样，若添加清蛋白，例如可进一步减少如前所述的沉淀物或浑浊的发生，并且可进一步提高扩增效率。具体而言，优选在利用DNA聚合酶进行延伸链的合成步骤(扩增步骤)或向单链DNA解离的步骤之前添加清蛋白。
所述反应液中的清蛋白的添加比例，例如为0.01～2重量％的范围，优选为0.1～1重量％，更优选为0.2～0.8重量％。作为所述清蛋白并无特别限制，例如可举出牛血清蛋白(BSA)、人血清蛋白、大鼠血清蛋白、马血清蛋白等，可任选其中1种，也可2种以上同时使用。
然后，列举一例对本发明的扩增产物的制备方法进行说明，所述例子为：对于全血样品，以DNA为目标核酸，通过PCR在同一反应液中同时制备2种基因即CYP2C9基因和VKORC1基因的各扩增产物。并且，本发明特征在于使用本发明的引物对，其他的构成和条件任何限制。
首先，调制PCR反应液。本发明的引物对的添加比例虽无特别限制，但引物对(1)和(2)的F引物分别优选以0.1～2μmol/L添加，更优选为0.25～1.5μmol/L，尤其优选为0.5～1μmol/L。另外，引物对(1)和(2)的R引物分别优选以0.1～2μmol/L添加，更优选为0.25～1.5μmol/L，尤其优选为0.5～1μmol/L。各引物对中的F引物和R引物的添加比例(F∶R，摩尔比)虽无特别限制，但例如优选为1∶0.25～1∶4，更优选为1∶0.5～1∶2。
反应液中全血样品的比例虽无特别限制，但优选为前述范围。全血样品既可直接添加入反应液中，也可预先以水或缓冲液等溶剂稀释后再添加入反应液。在预先稀释全血样品的情况下，该稀释率无特别限制，例如，可设定为以使反应液中的最终的全血添加比例到达前述范围，例如100～2000倍，优选为200～1000倍。
前述反应液中其他组成成分无特别限制，可举出以往公知的成分，其比例也无特别限制。作为前述组成成分，例如可举出DNA聚合酶、核苷三磷酸及溶剂。另外，如前所述，优选前述反应液还含有清蛋白。并且，在前述反应液中，各组成成分的添加顺序无任何限制。
作为前述DNA聚合酶无特别限制，例如可使用以往公知的耐热性细菌来源的聚合酶。作为具体例，有可以商业地获得的来自栖热水生菌(Thermus aquaticus)的DNA聚合酶(美国专利第4,889,818号以及美国专利第5,079,352号)(商品名Taq聚合酶)、来自极端嗜热菌(Thermus thermophilus)的DNA聚合酶(WO 91/09950)(rTth DNA polymerase)、来自强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的DNA聚合酶(WO 92/9689)(Pfu DNApolymerase：Stratagenes公司产)、来自嗜热球菌(Thermococcus litoralis)的DNA聚合酶(EP-A 455 430)(商标Vent：New EnglandBiolabs公司产)等，其中，优选来自栖热水生菌(Thermus aquaticus)的耐热性DNA聚合酶。
前述反应液中的DNA聚合酶的添加比例无特别限制，例如为1～100U/mL，优选为5～50U/mL，更优选为20～30U/mL。并且，DNA聚合酶的活性单位(U)一般为以活化鲑鱼精子DNA作为模板引物，在活性测定用反应液(25mM TAP S缓冲液(pH9.3，25℃)，50mM KCl、2mM MgCl2、1mM巯基乙醇、200μM dATP、200μM dGTP、200μM dTTP、100μM“α-32P”dCTP和0.25mg/mL活化鲑鱼精子DNA)中，以74℃下30分钟将10nmol全核苷酸吸收到酸不溶性沉淀物中的活性为1U。
作为前述核苷三磷酸，通常可举出dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)。前述反应液中的dNTP的添加比例虽无特别限制，例如为0.01～1mmol/L，优选为0.05～0.5mmol/L，更优选为0.1～0.3mmol/L。
作为前述溶剂，例如可举出Tris-HCl，三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、MES、MOPS、HEPES、CAPS等缓冲液，可使用市售的PCR用缓冲液或市售的PCR试剂盒的缓冲液等。
另外，前述PCR反应液还可进一步含有甘油、肝素、甜菜碱、KCl、MgCl2、MgSO4等，其添加比例，例如只要设定在不抑制PCR反应的范围内即可。
反应液的总体积无特别限制，例如可根据使用的仪器(热循环器)等适当决定，通常为1～500μL，优选为10～100μL。
然后，进行PCR。PCR的循环条件无特别限制，例如(1)全血来源的双链DNA向单链DNA的解离，(2)引物的退火，(3)引物的延伸(聚合酶反应)，分别如下。另外，循环数也无特别限制，以下述(1)～(3)的3步作为1个循环，例如优选为30个循环以上。上限虽无特别限制，例如为总计100个循环以下，优选为70个循环以下，更优选为50个循环以下。各步的温度变化，例如可使用热循环器等自动进行控制。在使用本发明的引物对的情况下，由于如前所述扩增效率好，与以往方法50个循环需3小时左右相比，根据本发明可在约1小时左右(优选为1小时以内)完成50循环。
表3
Figure A20088000129000241
如上操作，能够在同一反应液中同时制备CYP2C9基因和VKORC1基因的各目标区域的扩增产物。
本发明的扩增产物的制备方法，还可进一步包括检测通过前述扩增反应获得的扩增产物的步骤。这样，可检测扩增产物的有无、各基因的各目标区域的基因型。扩增产物的有无可根据以往公知的方法确认。具体而言，例如，在所述(I)步骤中，预先向前述反应液中进一步添加可与CYP2C9基因或VKORC1基因的检测对象位点杂交的探针(例如，荧光标记探针)，进而作为(II)步骤，对前述反应液，通过测定前述探针的荧光标记的荧光强度可进行确认。另外，在确认CYP2C9基因和VKORC1基因两者的扩增产物的有无的情况下，预先分别添加针对各基因的探针，在前述(II)步骤中，对前述反应液通过测定各探针的各荧光标记的荧光强度可进行确认。另一方面，对于CYP2C9基因和VKORC1基因的多态性的检测，作为本发明的一实施方式，以下进行说明。
<CYP2C9基因多态性和VKORC1基因多态性的分析方法>
本发明的基因多态性的检测方法，其特征在于，所述基因为CYP2C9基因和VKORC1基因，其为使用同一反应液分析各基因的检测对象位点的多态性的方法，其特征在于包含下述(i)～(iv)步骤。
(i)按照本发明的扩增产物的制备方法，在同一反应液中同时扩增CYP2C9基因的含检测对象位点的区域和VKORC1基因的含检测对象位点的区域的步骤；
(ii)准备反应液的步骤，所述反应液含有所述(i)步骤中的CYP2C9基因的扩增产物和VKORC1基因的扩增产物、以及能够分别与所述各基因的各检测对象位点杂交的探针；
(iii)改变所述反应液的温度，测定所述各扩增产物和所述各探针的各杂交产物显示解链状态的信号值的步骤；
(iv)由随温度变化的所述信号值的变动，决定所述各检测对象位点的多态性的步骤。
这样，通过使用本发明的引物对来制备扩增产物，如前所述，能够扩增2种基因即CYP2C9基因和VKORC1基因中的含有多态性的目标位点的区域。
前述(ii)步骤中的探针无特别限制，例如可举出与CYP2C9基因的检测对象序列互补的探针(以下，也称为“CYP2C9基因用探针”)及与VKORC1基因的检测对象序列互补的探针(以下，也称为“VKORC1基因用探针”)。探针可为任意1种，但由于能使用同一反应液决定各基因的多态性，因此优选为同时使用CYP2C9基因用探针和VKORC1基因用探针两者。
前述分别针对CYP2C9基因和VKORC1基因的探针无特别限制，可根据以往公知的方法设定，例如，既可基于各基因的有义链的序列来设计含多态性检测目标位点的检测对象序列，也可基于反义链的序列来设计。另外，多态性的检测目标位点的碱基可根据各多态性的种类适当决定。
也就是说，在CYP2C9基因的情况下，由于已知序列号1的第521位的碱基存在A(CYP2C9*1)和C(CYP2C9*3)的多态性，例如可举出与第521位为A的检测对象序列及第521位为C的检测对象序列的任一个互补的探针(有义链的检测用探针)或与其反义链的序列互补的探针(反义链的检测用探针)。另外，由于已知序列号1的第522位的碱基存在T(CYP2C9*1)和C(CYP2C9*4)的多态性，例如可举出与第522位为T的检测对象序列及第522位为C的检测对象序列的任一个互补的探针(有义链的检测用探针)或与其反义链的序列互补的探针(反义链的检测用探针)。
另外，在VKORC1基因的情况下，由于已知序列号2的第484位的碱基存在“C”和“T”的多态性，例如可举出与第484位为C的检测对象序列及第484位为T的检测对象序列的任一个互补的探针(有义链的检测用探针)或与其反义链的序列互补的探针(反义链的检测用探针)。这样，设计探针时无论将产生多态性的检测目标位点的碱基设定为如前所述的任一碱基，都能通过后述方法判断出各基因的检测目标位点显示何种多态性。另外，探针例如可优选考虑人种间的多态性的倾向进行设计。例如，在日本人的情况下，由于序列号2中的第484位的碱基上C的多态性较少，例如可使用与第484位的C形成完全匹配的探针，另一方面，在欧美人的情况下，由于第484位的碱基上C的多态性较多，例如可使用与第484位的T形成完全匹配的探针的方法。
另外，各探针可在对各基因的目标区域进行扩增反应后再向反应液中添加，但由于可容易且迅速地进行分析，例如优选在前述(i)步骤的扩增反应之前，预先添加入反应液中。
在前述(i)步骤中，前述反应液中的探针的添加比例无特别限制，例如优选以10～400nmol/L的范围添加各探针，更优选为20～200nmol/L。另外，在使用荧光染料作为探针的标记的情况下，例如，为了调整检测到的荧光强度，可同时使用和标记探针序列相同的未标记探针，该未标记探针也可在其3’端附加磷酸。此时，标记探针和非标记探针的摩尔比例，例如优选为1∶10～10∶1。前述探针的长度无特别限制，例如为5～50mer，优选为10～30mer。
对于Tm值进行说明。若持续加热含双链DNA的溶液，则260nm处吸光度上升。这是因为，双链DNA中的双链间的氢键通过加热解开，解离为单链DNA(DNA的解链)。另外，若全部的双链DNA解离形成单链DNA，则其吸光度显示为加热开始时的吸光度(仅双链DNA的吸光度)的约1.5倍左右，这样可判断解链已完成。基于该现象，解链温度Tm一般被定义为吸光度达到吸光度总上升量的50％时的温度。
在前述(iii)步骤中，前述扩增产物和前述探针的杂交产物显示解链状态的信号的测定，如前所述，可为260nm的吸光度测定，也可为标记物的信号测定。具体而言，优选使用以标记物标记的标记探针作为前述探针，进行前述标记物的信号测定。作为前述标记探针，例如可举出单独显示信号且通过杂交而不显示信号的标记探针，或者单独不显示信号且通过杂交而显示信号的标记探针。如果为前者那样的探针，在与检测对象序列形成杂交体(双链DNA)时不显示信号，通过加热探针游离则显示信号。另外，如果为如后者的探针，通过与检测对象序列形成杂交体(双链DNA)显示信号，通过加热探针游离则信号减少(消失)。因此，通过在信号特有的条件(吸收波长等)下检测该标记的信号，与前述260nm的吸光度测定相同地，可进行杂交产物的解链及进行Tm值的决定等。
在本发明中，为了确认2种基因各自的多态性，2种探针优选利用可在各自不同条件下被检测的不同的标记(例如，荧光标记)进行标记。这样，通过使用不同的标记，即使在同一反应液中，通过改变检测条件，也可个别地分析各扩增产物。
作为前述标记探针的标记物的具体例，例如可举出荧光染料(荧光团)。作为前述标记探针的具体例，例如，优选为以荧光染料标记，单独显示荧光且通过杂交而荧光减少(例如猝灭)的探针。利用这种荧光猝灭现象(Quenching phenomenon)的探针一般被称为荧光猝灭探针。其中，作为前述探针，优选为寡核苷酸的3’端或5’端以荧光染料进行标记，进行标记的前述末端的碱基优选为C。此时，优选如下设计所述标记探针的碱基序列，即，在前述标记探针杂交的检测对象序列上，使与前述标记探针的末端碱基C成对的碱基或者与前述成对的碱基距离1～3碱基的碱基为G。这样的探针一般被称为鸟嘌呤猝灭探针，以所谓QProbe(注册商标)被知晓。这种鸟嘌呤猝灭探针与检测对象序列杂交后，由于以荧光染料标记的末端的C与前述检测对象DNA的G接近，表现出前述荧光染料的发光变弱(荧光强度减少)的现象。若使用这样的探针，通过信号的变动，可容易地确认杂交和解离。
作为前述荧光染料无特别限制，例如可举出，荧光素、磷光体、若丹明、聚甲炔染料衍生物等，作为市售的荧光染料，例如可举出BODIPY FL(商品名，Molecular Probes公司制)，Fluore Prime(商品名，Amersham Pharmacia公司制)，Fluoredite(商品名，Millipore公司制)，FAM(商品名，ABI公司制)，Cy3和Cy5(商品名，Amersham Pharmacia公司制)，TAMRA(商品名，Molecular Probes公司制)等。2种探针中使用的荧光染料的组合，例如只要能够在不同的条件下检测即可，无特别限制，例如可举出，太平洋蓝(Pacific Blue)(检测波长450～480nm)、TAMRA(检测波长585～700nm)及BODIPY FL(检测波长515～555nm)的任意2种的组合等。
下面，将示出用于分析(检测)所述CYP2C9基因和VKORC1基因的各多态性的探针序列的具体例。另外，本发明并不受其限制。
作为CYP2C9基因用探针，例如可举出下述探针(1)。下述探针(1)为用于检测有义链的探针，包含与序列号1的第521位为C的区域互补的序列。另外，作为本发明的探针的具体例，例如如前所述，可为以下示出的寡核苷酸的互补链。
探针(1)
至少一种与以序列号1中第516位的鸟嘌呤碱基(G)为第一位碱基，向着3’方向到第17～22位碱基的区域序列互补的寡核苷酸，所述寡核苷酸以与所述鸟嘌呤碱基互补的胞嘧啶碱基作为3’端
探针(1)的具体例在下述表中示出。
表4
  探针   序列   Tm(℃)   序列号
  探针(P1)   5’-gtggggagaaggtcaAGgtatc-3’   55.7   41
  5’-tggggagaaggtcaAGgtatc-3’   54.4   42
  5’-ggggagaaggtcaAGgtatc-3’   52.8   43
  5’-gggagaaggtcaAGgtatc-3’   50.2   44
  5’-ggagaaggtcaAGgtatc-3’   47.3   45
  5’-gagaaggtcaAGgtatc-3’   44.1   46
另外，使用前述的CYP2C9基因用探针，可检测序列号1中第522位的多态性(CYP2C9*4)。例如，CYP2C9基因用探针为与序列号1中第521位为C且第522位为T的区域互补的序列。即，可判断：若与该探针完全匹配，则为CYP2C9*3(A521C)，一个碱基不同的不匹配情况下，为CYP2C9*1(野生型)，二个碱基不同的不匹配情况下，为CYP2C9*4(T522C)。
前述表的各探针中的大写的碱基G可置换为k，所述k可任意为G和T。另外，大写的A，可置换为r，所述r可任意为A和G。
作为VKORC1基因用探针，例如可举出下述探针(2-1)和(2-2)。下述探针(2-1)为用于检测反义链的探针，包含与序列号2中第484位为C的区域相同的序列。另一方面，下述探针(2-2)为用于检测有义链的探针，包含与序列号2中第484位为C的区域互补的序列。另外，作为本发明的探针的具体例，例如如前所述，可为以下示出的寡核苷酸的互补链。
探针(2-1)
至少一种与以序列号2中第477位的胞嘧啶碱基(C)为第一位碱基，向着3’方向到第18～24位碱基的区域序列相同的寡核苷酸，所述寡核苷酸以所述胞嘧啶碱基作为5’端
探针(2-2)
至少一种与以序列号2中第472位的鸟嘌呤碱基(G)为第一位碱基，向着3’方向到第15～24位碱基的区域序列互补的寡核苷酸，所述寡核苷酸以与所述鸟嘌呤碱基互补的胞嘧啶碱基作为3’端
探针(2-1)的具体例在下述表的序列号47～53中，探针(2-2)的具体例在下述表的序列号54～63中，分别示出。
表5
  探针   序列   Tm(℃)   序列号
  探针(P2)   5’-catcgacCcttggactaggatggg-P-3’   59.7   47
  5’-catcgacCcttggactaggatgg-P-3’   57.9   48
  5’-catcgacCcttggactaggatg-P-3’   55.8   49
  5’-catcgacCcttggactaggat-P-3’   54.6   50
  5’-catcgacCcttggactagga-P-3’   54.3   51
  5’-catcgacCcttggactagg-P-3’   52.9   52
  5’-catcgacCcttggactag-P-3’   50.2   53
  5’-cctagtccaagGgtcgatgatctc-3’   57.5   54
  5’-ctagtccaagGgtcgatgatctc-3’   55.5   55
  5’-tagtccaagGgtcgatgatctc-3’   54.6   56
  5’-agtccaagGgtcgatgatctc-3’   54.9   57
  5’-gtccaagGgtcgatgatctc-3’   53.6   58
  5’-tccaagGgtcgatgatctc-3’   52.1   59
  5’-ccaagGgtcgatgatctc-3’   50.6   60
  5’-caagGgtcgatgatctc-3’   47.6   61
  5’-aagGgtcgatgatctc-3’   45.4   62
  5’-agGgtcgatgatctc-3’   44.0   63
前述表的序列号47～53的各探针中，大写的碱基C可置换为y，所述y可任意为C和T。另外，前述表的序列号54～63的各探针中的大写的碱基G可置换为r，所述r可任意为G和A。
此外，如前所述，这些探针优选以各自不同的荧光染料(能在不同的波长下检测的荧光染料)标记。例如，当前述表中所示的探针为猝灭探针的情况下，CYP2C9基因用探针(1)的3’端的胞嘧啶优选以如前所述的荧光染料(例如，BODIPY FL等)标记，当VKORC1基因用探针为(2-1)的情况下，5’端的胞嘧啶优选以如前所述的荧光染料(例如，太平洋蓝(Pacific Blue)等)标记，当为(2-2)的情况下，3’端的胞嘧啶优选以如前所述的荧光染料(例如，太平洋蓝(Pacific Blue)等)标记。另外，5’端标记荧光染料的探针，例如为了防止探针本身延伸，可在其3’端上进一步附加磷酸基。
前述的探针仅为一例，本发明不受其任何限制，但作为CYP2C9基因用探针，优选为包含前述序列号44的碱基序列的探针和包含序列号45的碱基序列的探针，作为VKORC1基因用探针，优选为包含前述序列号51的碱基序列的探针、包含序列号62的碱基序列的探针。
下面，对本发明的分析方法，作为一例，说明使用下述探针，检测CYP2C9基因的多态性(CYP2C9*3，序列号1中第521位碱基的多态性)和VKORC1基因的多态性(C6484T，序列号2中第484位碱基的多态性)的方法。并且，本发明不受其限制。
(P1)包含序列号44的碱基序列的寡核苷酸或者包含序列号45的碱基序列的寡核苷酸
5’-gggagaaggtcaaGgtatc-(BODIPY FL)-3’
5’-ggagaaggtcaaGgtatc-(BODIPY FL)-3’
(P2)包含序列号51的碱基序列的寡核苷酸或者包含序列号62的碱基序列的寡核苷酸
5’-(Pacific Blue)-catcgacCcttggactagga-P-3’
5’-aagGgtcgatgatctc-(Pacific Blue)-3’
首先，使用添加了前述2种标记探针的反应液，如前所述进行PCR，在同一反应液中同时扩增CYP2C9基因和VKORC1基因的各目标区域。前述反应液包含例如本发明的引物对、DNA聚合酶、dNTP、含模板核酸的样品及前述探针。除此之外，还可含有可用于核酸扩增的各种添加剂。
然后，进行所得扩增产物的解离及由解离得到的单链DNA与前述标记探针的杂交。这可通过例如前述反应液的温度变化来进行。
前述解离步骤的加热温度只要为可解离前述扩增产物的温度即可，并无特别限制，例如为85～95℃。加热时间也无特别限制，通常为1秒～10分钟，优选为1秒～5分钟。
解离的单链DNA与前述标记探针的杂交，可通过例如在前述解离步骤后，降低前述解离步骤的加热温度来进行。作为温度条件，例如为40～50℃。
然后，改变前述反应液的温度，测定前述扩增产物和前述标记探针的杂交产物显示解链状态的信号值。具体而言，例如，加热前述反应液(前述单链DNA和前述标记探针的杂交产物)，测定伴随温度上升的信号变动。如前所述，例如，当使用末端的C碱基被标记的探针(鸟嘌呤猝灭探针)的情况下，在与单链DNA杂交的状态下，荧光减少(或猝灭)，在解离状态下，发出荧光。因此，例如，可逐渐加热荧光减少(或猝灭)的杂交产物，测定伴随温度上升的荧光强度的增加。
测定荧光强度的变动时的温度范围无特别限制，例如，起始温度为室温～85℃，优选为25～70℃，结束温度为例如40～105℃。另外，温度的上升速度也无特别限制，例如为0.1～20℃/秒，优选为0.3～5℃/秒。
然后，分析前述信号的变动来决定Tm值。具体而言，由所得荧光强度算出在各温度下每单位时间的荧光强度变化量(-d荧光强度增加量/dt)，显示最低值的温度可决定为Tm值。另外，单位时间的荧光强度增加量(d荧光强度增加量/dt)的最高点也可以决定为Tm值。并且，不是使用猝灭探针，而是使用单独不显示信号且通过杂交而显示信号的探针作为标记探针的情况下，相反地测定荧光强度的减少量即可。
在本发明中，为了检测2种基因的各多态性，在2种探针的各标记的相应条件下，决定各自的Tm值。例如CYP2C9基因用探针的BODIPY FL可在检测波长515～555nm下检测，VKORC1基因用探针的太平洋蓝(Pacific Blue)可在检测波长450～480nm下进行检测。
从而，由这些Tm值，决定各基因的检测对象位点的基因型。在Tm分析中，可获得如下结果：完全互补的杂交体(匹配)显示解链的Tm值比一个碱基不同的杂交体的(不匹配)更高的结果。因此，通过预先决定与前述探针完全互补的杂交体的Tm值及一个碱基不同的杂交体的Tm值，可决定前述检测对象位点的基因型。例如，假设检测对象序列中目标位点的碱基为突变型(例如，序列号1中第521位碱基为C)，当使用与含其的检测对象序列互补的探针的情况下，若形成的杂交体的Tm值与完全互补的杂交体的Tm值相同，则前述扩增产物的多态性可判断为突变型。另外，若形成的杂交体的Tm值与一个碱基不同的杂交体的Tm值相同(比完全互补的杂交体的Tm值低的值)，则前述扩增产物的多态性可判断为野生型(例如，序列号1中第521位碱基为A)。此外，检测出两种Tm值的情况下，可决定为杂合子。这样，从对应于各标记探针的2个Tm值，可判断CYP2C9基因和VKORC1基因的各多态性。
作为具体例，在使用如前所述的探针(P1、P2)的情况下，可如下进行判断。作为CYP2C9基因检测用探针示出的前述P1，将与序列号1中第521位碱基对应的碱基设定为G。因此，若形成的杂交体的Tm值与完全互补的杂交体的Tm值相同，则前述扩增产物的多态性可判断为突变型(CYP2C9*3)。另外，若形成的杂交体的Tm值与一个碱基不同的杂交体的Tm值相同(比完全互补的杂交体的Tm值低的值)，则前述扩增产物的多态性可判断为野生型(CYP2C9*1)。此外，检测出两种Tm值的情况下，可决定为杂合子。另一方面，作为VKORC1基因检测用探针示出的前述P2，将VKORC1的全长序列的第6484位的碱基(序列号2中第484位碱基)设定为C。因此，若形成的杂交体的Tm值与完全互补的杂交体的Tm值相同，则前述扩增产物的多态性可判断为野生型(C6484C)。另外，若形成的杂交体的Tm值与一个碱基不同的杂交体的Tm值相同(比完全互补的杂交体的Tm值低的值)，则前述扩增产物的多态性可判断为突变型(C6484T)。此外，检测出两种Tm值的情况下，可决定为杂合子。
另外，如前所述，在本发明中，代替加热杂交产物来测定伴随温度上升的信号变动的方法，例如也可进行形成杂交体时的信号变动的测定。即，也可在降低含前述探针的反应液的温度以形成杂交产物时，测定前述伴随温度下降的信号变动。
作为具体例，当使用单独显示信号且通过杂交而不显示信号的标记探针(例如，鸟嘌呤猝灭探针)的情况下，单链DNA与探针解离的状态下发出荧光，但通过降低温度而形成杂交体时，前述荧光减少(或猝灭)。因此，例如，可逐渐降低前述反应液的温度，测定伴随温度降低的荧光强度的减少。另一方面，当使用单独不显示信号且通过杂交而显示信号的标记探针的情况下，单链DNA和探针解离的状态下不发出荧光，但通过降低温度而形成杂交体时，则发出荧光。因此，例如，可逐渐降低前述反应液的温度，测定伴随温度降低的荧光强度的增加。
下面，对本发明的实施例进行说明。但是本发明不受下述实施例的任何限制。
实施例1
使用肝素锂(Heparin Lithium)采血管，从2名受试者身上进行采血(样品1、2)。将所得的0.1μL血液添加入50μL的下述组成的PCR反应液中，使用热循环器进行PCR。PCR的条件为：95℃处理60秒后，以95℃1秒及58℃15秒作为一个循环，重复进行50个循环，再以95℃1秒，40℃60秒进行处理。然后，将温度的上升速度设为1℃/3秒将前述PCR反应液从40℃加热至95℃，测定荧光强度随时间的变化。测定的波长为450～480nm(荧光染料太平洋蓝(Pacific Blue)的检测)和515～555nm(荧光染料BODIPY FL的检测)。并且，50个循环的PCR所需的时间约为1小时。
表6
(PCR反应液)
蒸馏水                     23.25
5％NaN3                    0.5
20％BSA                    1
40％甘油                   12.5
10x Gene Taq缓冲液*        5
2.5mM dNTPs                4
5uM CYP2C9用探针           1
100μM CYP2C9F1引物        0.5
100μM CYP2C9R1引物        0.25
5uM VKORC1用探针           1
100μM VKORC1 F2引物       0.25
100μM VKORC1 R2引物       0.5
5U/μI Gene Taq FP*        0.25
                                                             
                      共计 50μL
*商品名Gene Taq FP：NIPPON GENE公司制(以下相同)
(探针)
CYP2C9用探针(序列号44)
5’-gggagaaggtcaaGgtatc-(BODIPY FL)-3’
VKORC1基因用探针(序列号51)
5’-(Pacific Blue)-catcgacCcttggactagga-P-3’
(引物对)
CYP2C9F1引物(序列号5)
5’-gagcccctgcatgcaa-3’
CYP2C9R1引物(序列号18)
5’-gatactatgaatttggggacttcgaa-3’
VKORC1基因F2引物(序列号29)
5’-gaggatagggtcagtgacatggaa-3’
VKORC1基因R2引物(序列号38)
5’-ccctgcccgagaaaggtgat-3’
与CYP2C9用探针匹配的杂交体的Tm值为59℃(后面的各图中的*3)，不匹配的杂交体的Tm值为54℃(以下的各图中的*1)。与VKORC1基因用探针匹配的杂交体的Tm值为61.0℃(以下的各图中的C)，不匹配的杂交体的Tm值为53.0℃(以下的各图中的T)。
样品1和样品2的结果分别在图1中示出。这些图为表示伴随温度上升的荧光强度的变化的Tm分析图，纵轴的微分值表示“-d荧光强度增加量/dt”，横轴表示温度(以下相同)。如该图所示，由信号的峰，可决定各样品中CYP2C9基因和VKORC1基因的各多态性。为了支持这些实施例的结果，通过RFLP法，对前述2名受试者确认CYP2C9和VKORC1基因的各多态性，其结果获得了与实施例相同的结果。这样，通过使用本发明的引物对，使用不实施前处理的全血样品，能够在同一反应液中同时扩增CYP2C9基因和VKORC1基因，并且可使用前述同一反应液分析前述基因的各自的多态性。
实施例2
以棉棒从2名受试者采集口腔细胞，并悬浮于500μL灭菌蒸馏水中(样品3和4)。将2.5μL该悬浮液添加入47.5μL的下述组成的PCR反应液中，与前述实施例1相同地进行PCR及测定随时间的荧光强度的变化。测定的波长为450～480nm(荧光染料太平洋蓝(Pacific Blue)的检测)和515～555nm(荧光染料BODIPYFL的检测)。并且，50个循环的PCR所需的时间约为1小时。
表7
(PCR反应液)
蒸馏水                  20.75
5％NaN3                 0.5
20％BSA                 1
40％甘油                12.5
10x Gene Taq缓冲液*     5
2.5mM dNTPs                 4
5uM CYP2C9用探针            1
100μM CYP2C9 F1引物        0.5
100μM CYP2C9 R1引物        0.25
5uM VKORC1用探针            1
100μM VKORC1 F2引物        0.25
100μM VKORC1 R2引物        0.5
5U/μl Gene Taq FP*         0.25
                                              
                     共计   47.5μL
样品3和样品4的结果分别在图2中示出。如该图所示，由信号的峰，可决定各样品中CYP2C9基因和VKORC1基因的各多态性。为了支持这些实施例的结果，通过RFLP法，对前述2名受试者确认CYP2C9和VKORC1基因的各多态性，结果获得了与实施例相同的结果。这样，通过使用本发明的引物对，使用不实施前处理的口腔细胞样品，能够在同一反应液中同时扩增CYP2C9基因和VKORC1基因，并且可使用前述同一反应液分析前述基因的各自的多态性。
实施例3
准备序列号1中第521位的碱基表现为CYP2C9*1/*3(521A/521C)的杂合子，VKORC1基因的第6484位(序列号2中第484位)的碱基表现为6484T/T的纯合子的人精制基因组。将1μL该精制基因组与49μL下述组成的PCR反应液混合，与前述实施例1同样地进行PCR及测定随时间的荧光强度的变化。测定的波长为450～480nm(荧光染料太平洋蓝(Pacific Blue)的检测)和515～555nm(荧光染料BODIPY FL的检测)。并且，50个循环的PCR所需的时间约为1小时。
表8
(PCR反应液)
蒸馏水                    22.25
5％NaN3                   0.5
20％BSA                   1
40％甘油                  12.5
10x Gene Taq缓冲液        5
2.5mM dNTPs                 4
5uM CYP2C9用探针            1
100μM CYP2C9 F1引物        0.5
100μM CYP2C9 R1引物        0.25
5uM VKORC1用探针            1
100μM VKORC1 F2引物        0.25
100μM VKORC1 R2引物        0.5
5U/μl Gene Taq FP*         0.25
                                                          
                      共计  49μL
结果如图3所示。如该图所示，由于CYP2C9有2个峰，因此可知能区别检测出序列号1的第521位的碱基。如该图所示，由信号的峰，可决定各样品中CYP2C9基因和VKORC1基因的各多态性。这些实施例的结果与基因组的信息一致。这样，通过使用本发明的引物对，能够在同一反应液中同时扩增CYP2C9基因和VKORC1基因，并且可使用前述同一反应液分析前述基因的各多态性。
实施例4
制备插入了序列号1中所示的第522位的T突变成C的CYP2C9基因(CYP2C9*4)的质粒。将1μL该质粒与49μL与实施例3相同的PCR反应液混合，与前述实施例1同样地进行PCR及测定随时间的荧光强度的变化。测定的波长为450～480nm(荧光染料太平洋蓝(Pacific Blue)的检测)和515～555nm(荧光染料BODIPY FL的检测)。并且，50个循环的PCR所需的时间约为1小时。
与CYP2C9用探针匹配的杂交体的Tm值为60.0℃(以下各图中的*3)，1个碱基不匹配的杂交体的Tm值为54.0℃(以下各图中的*1)，2个碱基不匹配的杂交体的Tm值为49.0℃(以下各图中的*4)。
结果如图4所示。如该图所示，由于在49℃有峰，可知相对于CYP2C9基因用探针，PCR扩增产物的序列号1中第521位的碱基为不匹配(即第521位为A)，第522位碱基为不匹配(即第522位为C)。因此，供于PCR的样品的多态性为CYP2C9*4，与质粒的信息一致。
实施例5
准备序列号1中第521位碱基表现为CYP2C9*1/*1(521A/521A)的纯合子、VKORC1基因的第6484位(序列号2中第484位)的碱基表现为6484T/T或6484C/C的纯合子、6484T/C的杂合子的人的精制基因组。将1μL这些精制基因组与46μL下述组成的PCR反应液混合，与前述实施例1同样地进行P CR及测定随时间的荧光强度的变化。测定波长为450～480nm(荧光染料太平洋蓝(Pacific Blue)的检测)和515～555nm(荧光染料BODIPY FL的检测)。并且，50个循环的PCR所需的时间约为1小时。
另外，从序列号1中第521位的碱基表现为CYP2C9*1/*1(521A/521A)的纯合子、VKORC1基因的第6484位(序列号2中第484位)的碱基表现为6484T/C的杂合子的患者身上，通过EDTA采血管采集血液。将10μL血液与70μL下述样品稀释液1混合，并进一步将10μL前述混合液与70μL下述样品稀释液2混合。将17μL该混合液在95℃加热处理10分钟后，与46μL下述PCR反应液混合，与前述实施例1同样地进行PCR反应及测定随时间的荧光强度的变化。
(样品稀释液1)
10mM Tris-HCl(pH8)、0.1mM EDTA、0.3％SDS、0.5％叠氮化钠
(样品稀释液2)
10mM Tris-HCl(pH8)、0.1mM EDTA、0.5％叠氮化钠
表9
(PCR反应液)
蒸馏水                      20.52
5％NaN3                     0.23
20％BSA                     0.5
50％甘油                    10
10x Gene Taq缓冲液*         5
2.5mM dNTPs                 4
5uM CYP2C9用探针            2
100μM CYP2C9 F1引物        0.5
100μM CYP2C9 R1引物        0.25
5uM VKORC1用探针            2
100μM VKORC1 F2引物        0.5
100μM VKORC1 R2引物        0.25
5U/μl Gene Taq FP*         0.25
                                                    
                      共计  46μL
(探针)
CYP2C9用探针(序列号45)
5’-ggagaaggtcaaGgtatc-(BODIPY FL)-3’
VKORC1基因用探针(序列号62)
5’-aagGgtcgatgatctc-(Pacific Blue)-3’
(引物对)
CYP2C9F1引物(序列号5)
5’-gagcccctgcatgcaa-3’
CYP2C9 R1引物(序列号18)
5’-gatactatgaatttggggacttcgaa-3’
VKORC1基因F2引物(序列号29)
5’-gaggatagggtcagtgacatggaa-3’
VKORC1基因R2引物(序列号38)
5’-ccctgcccgagaaaggtgat-3’
结果如图5和图6所示。图5为使用精制基因组作为样品的结果，图6为使用血液作为样品的结果。如图5所示，由信号的峰可决定各样品中CYP2C9基因和VKORC1基因的各多态性。这些实施例的结果与基因组的信息一致。另外，如图5所示，可知纯合子的VKORC1基因中的6484T/T和6484C/C在不同的位置上出现峰，可区别检测出6484位的碱基。对于杂合子，可知由于获得与前述的2种纯合子对应的2个峰，可区别两者。此外，如图6所示，可知在使用血液样品的情况下，也与使用精制基因组的情况相同地扩增各基因且获得与各多态性对应的峰。这样，通过使用本发明的引物对，能够在同一反应液中同时扩增CYP2C9基因和VKORC1基因，并且可使用前述同一反应液分析前述基因的各多态性。
工业适用性
如上，根据本发明的引物对，能够在同一反应液中，同时且特异地扩增与华法林的效果相关的CYP2C9基因和VKORC1基因分别包含发生检测目标的多态性的位点的区域。因而，与如前所述的以往方法不同，可减少操作和成本。另外，由于这样能够在同一反应液中特异地扩增2种基因的目标区域，例如通过使用与各目标区域中检测对象序列互补的2种探针，可使用前述反应液直接进行Tm分析，分别对前述2种多态性进行分型。另外，由于能够在一反应液中进行扩增和分型，使操作的自动化成为可能。此外，如果使用本发明的引物对，例如即使是含杂质的样品(例如，全血或口腔粘膜等)，由于可省略前处理，可更加迅速且简便地进行扩增反应。另外，如果使用本发明的引物对，由于可以以比以往更优良的增幅效率进行扩增反应，还可缩短扩增反应。因此，根据本发明的引物对和含其的试剂及使用它们的扩增产物的制备方法，由于可迅速且简便地分析各基因的各多态性，在医疗领域中非常有效。
序列表
<110>爱科来株式会社(ARKRAY，Inc.)
<120>基因扩增用引物对、含有其的基因扩增用试剂及其用途
<130>TF08005-01
<150>JP2007-079403
<151>2007-03-26
<160>53
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1000
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
tccatccagg tcagtaacag gtcagtatgt cttttgattg gagattttat tccatttaca     60
ttcagtgtta ttattgataa gtaaggactt acccatgccc ctttgttatt tgttttctgg    120
ttgttttgtg gacttctctt ccttctttca tttcttcctg tcttccttta ttgaagagaa    180
ttttctccac ttatatgtgt acagattttt cttaatatct ggtttatggc agttacacat    240
ttgtgcatct gtaaccatcc tctctttaag tttgcatata cttccagcac tataatttaa    300
atttataatg atgtttggat accttcatga ttcatatacc cctgaattgc tacaacaaat    360
gtgccatttt tctccttttc catcagtttt tacttgtgtc ttatcagcta aagtccagga    420
agagattgaa cgtgtgattg gcagaaaccg gagcccctgc atgcaagaca ggagccacat    480
gccctacaca gatgctgtgg tgcacgaggt ccagagatac attgaccttc tccccaccag    540
cctgccccat gcagtgacct gtgacattaa attcagaaac tatctcattc ccaaggtaag    600
tttgtttctc ctacactgca actccatgtt ttcgaagtcc ccaaattcat agtatcattt    660
ttaaacctct accatcaccg ggtgagagaa gtgcataact catatgtatg gcagtttaac    720
tggactttct cttgtttcca gtttggggct ataaaggttt gtaacaggtc ctagtgtctg    780
gcagtgtgtg ttctccagat ttattatctt tcttcaagat tggtttggct actcttaggt    840
gcttatattt ccaaataatt tttaaaggta ttagtttgtc aatttcccaa aaccttgggc    900
tggaatttct ggcagggtga cactaaattt ataggctagt ttggaaagaa ctgaatcttg    960
acacgttgag gctttccatt cctgaatata attatgcttc                         1000
<210>2
<211>1000
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
cgttatacca gccttgccat tttaagaatt acttaagggc cgggcgcggt ggcccactcc     60
tgtaatccca gcactttggg aggccgaggc ggatggatca cttgaagtca ggagttgacc    120
agcctggcca acatggtgaa agcctgtctc taccaaaaat agaaaaatta atcgggcgct    180
atggcgggtg ccttaatccc agctactcgg gggggctaag gcaggagaat cgcttgaacc    240
cgggaggcgg aggtttcagt gagccgagat cgcgccactg cactccagcc tgggccagag    300
tgagactccg tctcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa agagacttac ttaaggtcta    360
agatgaaaag cagggcctac ggagtagcca cgtccgggcc tggtctgggg agaggggagg    420
atagggtcag tgacatggaa tcctgacgtg gccaaaggtg cccggtgcca ggagatcatc    480
gacccttgga ctaggatggg aggtcgggga acagaggata gcccaggtgg cttcttggaa    540
atcacctttc tcgggcaggg tccaaggcac tgggttgaca gtcctaacct ggttccaccc    600
caccccaccc ctctgccagg tggggcaggg gtttcgggct ggtggagcat gtgctgggac    660
aggacagcat cctcaatcaa tccaacagca tattcggttg catcttctac acactacagc    720
tattgttagg tgagtggctc cgccccctcc ctgcccgccc cgccccgccc ctcatccccc    780
ttggtcagct cagccccact ccatgcaatc ttggtgatcc acacagctga cagccagcta    840
gctgctcatc acggagcgtc ctgcgggtgg ggatgtgggg aggtaactaa caggagtctt    900
ttaattggtt taagtactgt tagaggctga agggccctta aagacatcct aggtccccag    960
gttttttgtt tgttgttgtt ttgagacagg gtctggctct                         1000
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>3
cggagcccct gcatgcaa                       18
<210>4
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>4
ggagcccctg catgcaa                        17
<210>5
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>5
gagcccctgc atgcaa                         16
<210>6
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>6
agcccctgca tgcaa                           15
<210>7
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>7
gcccctgcat gcaa                            14
<210>8
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>8
gtttaaaaat gatactatga atttggggac ttcgaa    36
<210>9
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>9
tttaaaaatg atactatgaa tttggggact tcgaa    35
<210>10
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>10
ttaaaaatga tactatgaat ttggggactt cgaa     34
<210>11
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>11
taaaaatgat actatgaatt tggggacttc gaa      33
<210>12
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>12
aaaaatgata ctatgaattt ggggacttcg aa       32
<210>13
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>13
aaaatgatac tatgaatttg gggacttcga a    31
<210>14
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>14
aaatgatact atgaatttgg ggacttcgaa      30
<210>15
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>15
aatgatacta tgaatttggg gacttcgaa       29
<210>16
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>16
atgatactat gaatttgggg acttcgaa        28
<210>17
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>17
tgatactatg aatttgggga cttcgaa    27
<210>18
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>18
gatactatga atttggggac ttcgaa     26
<210>19
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>19
atactatgaa tttggggact tcgaa      25
<210>20
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>20
tactatgaat ttggggactt cgaa      24
<210>21
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>21
actatgaatt tggggacttc gaa       23
<210>22
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>22
ctatgaattt ggggacttcg aa        22
<210>23
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>23
tatgaatttg gggacttcga a         21
<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>24
atgaatttgg ggacttcgaa            20
<210>25
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>25
tgaatttggg gacttcgaa             19
<210>26
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>26
ggggaggata gggtcagtga catggaa    27
<210>27
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>27
gggaggatag ggtcagtgac atggaa     26
<210>28
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>28
ggaggatagg gtcagtgaca tggaa      25
<210>29
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>29
gaggataggg tcagtgacat ggaa       24
<210>30
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>30
aggatagggt cagtgacatg gaa        23
<210>31
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>31
ggatagggtc agtgacatgg aa       22
<210>32
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>32
gatagggtca gtgacatgga a        21
<210>33
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>33
ttggaccctg cccgagaaag gtgat    25
<210>34
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>34
tggaccctgc ccgagaaagg tgat     24
<210>35
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>35
ggaccctgcc cgagaaaggt gat      23
<210>36
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>36
gaccctgccc gagaaaggtg at       22
<210>37
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>37
accctgcccg agaaaggtga t        21
<210>38
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>38
ccctgcccga gaaaggtgat          20
<210>39
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>39
cctgcccgag aaaggtgat        19
<210>40
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>40
ctgcccgaga aaggtgat         18
<210>41
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>41
gtggggagaa ggtcaaggta tc    22
<210>42
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>42
tggggagaag gtcaaggtat c      21
<210>43
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>43
ggggagaagg tcaaggtatc        20
<210>44
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>44
gggagaaggt caaggtatc         19
<210>45
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>45
ggagaaggtc aaggtatc          18
<210>46
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>46
gagaaggtca aggtatc            17
<210>47
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针2-1
<400>47
catcgaccct tggactagga tggg    24
<210>48
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>48
catcgaccct tggactagga tgg     23
<210>49
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>49
catcgaccct tggactagga tg      22
<210>50
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>50
catcgaccct tggactagga t    21
<210>51
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>51
catcgaccct tggactagga      20
<210>52
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>52
catcgaccct tggactagg       19
<210>53
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>53
catcgaccct tggactag                             18

Claims (16)

1.一种基因扩增用引物对，其特征在于，其为用于通过基因扩增法同时扩增2种基因的引物对，
所述2种基因为CYP2C9基因和VKORC1基因，
所述引物对包括下述(1)和(2)2种引物对：
引物对(1)：
包含含有下述(F1)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R1)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对：
(F1)至少一种与序列号1的碱基序列中第466位的腺嘌呤碱基(A)为第一位碱基向着5’方向到第14～18位碱基的区域序列相同的寡核苷酸，该寡核苷酸以所述腺嘌呤碱基(A)为3’端；
(R1)至少一种与序列号1的碱基序列中第631位的胸腺嘧啶碱基(T)为第1位碱基向着3’方向到第19～36位碱基的区域互补的寡核苷酸，该寡核苷酸以与所述第631位的胸腺嘧啶碱基(T)互补的腺嘌呤碱基(A)为3’端；
引物对(2)：
包含含有下述(F2)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R2)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对：
(F2)至少一种与序列号2的碱基序列中第440位的腺嘌呤碱基(A)为第一位碱基向着5’方向到第21～27位碱基的区域序列相同的寡核苷酸，该寡核苷酸以所述胞嘧啶碱基(A)为3’端；
(R2)至少一种与序列号2的碱基序列中第541位的腺嘌呤碱基(A)为第1位碱基向着3’方向到第18～25位碱基的区域互补的寡核苷酸，该寡核苷酸以与所述第541位的腺嘌呤碱基(A)互补的胸腺嘧啶碱基(T)为3’端。
2.根据权利要求1所述的基因扩增用引物对，所述(1)和(2)的引物对分别为下述(1’)和(2’)的引物对：
引物对(1’)：
包含含有下述(F1’)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R1’)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对：
(F1’)含有序列号5的碱基序列的寡核苷酸；
(R1’)含有序列号18的碱基序列的寡核苷酸；
引物对(2’)：
包含含有下述(F2’)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R2’)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对：
(F2’)含有序列号29的碱基序列的寡核苷酸；
(R2’)含有序列号38的碱基序列的寡核苷酸。
3.根据权利要求1所述的基因扩增用引物对，所述基因扩增用引物对为用于扩增生物样品中的CYP2C9基因和VKORC1基因的引物对。
4.根据权利要求3所述的基因扩增用引物对，所述生物样品为全血。
5.一种基因扩增用试剂，其为用于通过基因扩增法扩增2种基因的试剂，
所述2种基因为CYP2C9基因和VKORC1基因，
其特征在于，所述基因扩增用试剂含有权利要求1所述的基因扩增用引物对。
6.根据权利要求5所述的基因扩增用试剂，其还包含含有下述(P1)和(P2)所示的寡核苷酸的荧光标记探针：
(P1)包含序列号44的碱基序列的寡核苷酸及包含序列号45的碱基序列的寡核苷酸；
(P2)包含序列号51的碱基序列的寡核苷酸及包含序列号62的碱基序列的寡核苷酸。
7.一种制备扩增产物的方法，其特征在于，其为通过基因扩增法制备2种基因的扩增产物的方法，
所述2种基因为CYP2C9基因和VKORC1基因，
所述方法包含下述(I)步骤：
(I)以样品中的核酸为模板，使用权利要求1所述的基因扩增用引物对，在同一反应液中同时进行所述CYP2C9基因和VKORC1基因的扩增的步骤。
8.根据权利要求7所述的扩增产物的制备方法，在所述(I)步骤中，向所述反应液中进一步添加与CYP2C9基因的检测对象位点杂交的探针和与VKORC1基因的检测对象位点杂交的引物中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的扩增产物的制备方法，所述探针为选自由下述(P1)和(P2)所示的寡核苷酸所组成的组中的至少一种探针：
(P1)含有序列号44的碱基序列的寡核苷酸及含有序列号45的碱基序列的寡核苷酸；
(P2)含有序列号51的碱基序列的寡核苷酸及含有序列号62的碱基序列的寡核苷酸。
10.根据权利要求8所述的扩增产物的制备方法，所述探针为荧光标记探针。
11.根据权利要求10所述的扩增产物的制备方法，进一步包含下述(II)步骤：
(II)测定所述反应液的所述荧光标记探针中的荧光标记的荧光强度的步骤。
12.根据权利要求7所述的扩增产物的制备方法，所述样品为生物样品。
13.根据权利要求12所述的扩增产物的制备方法，所述生物样品为全血。
14.根据权利要求13所述的扩增产物的制备方法，所述反应液中的全血样品的添加比例为0.1～0.5体积％。
15.一种多态性分析方法，其特征在于，其为分析基因中的检测对象位点的多态性的方法，
所述基因为CYP2C9基因和VKORC1基因，
所述方法包含下述(i)～(iv)步骤：
(i)按照权利要求7所述的扩增产物的制备方法，在同一反应液中同时扩增CYP2C9基因的含检测对象位点的区域和VKORC1基因的含检测对象位点的区域的步骤；
(ii)准备反应液的步骤，所述反应液含有所述(i)步骤中的CYP2C9基因的扩增产物和VKORC1基因的扩增产物、以及能够分别与所述各基因的各检测对象位点杂交的探针；
(iii)改变所述反应液的温度，测定所述各扩增产物和所述各探针的各杂交产物显示解链状态的信号值的步骤；
(iv)由随温度变化的所述信号值的变动，决定所述各检测对象位点的多态性的步骤。
16.根据权利要求15所述的多态性分析方法，在所述(i)步骤中，在扩增反应之前，向所述反应液中添加能够分别与所述各检测对象位点杂交的探针。
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