CN101564558A - 硫酸钡海藻酸钠微球、其制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种硫酸钡海藻酸钠微球、其制备方法及用途。所述微球的组分和重量百分比为：海藻酸钠：2％－10％；氯化钙：10％－40％；W/O型乳化剂：2.5％－7.5％；壳聚糖：0.5％－2.5％；硫酸钡：40％－85％。所述硫酸钡海藻酸钠微球的直径为50－400μm。本发明提供的硫酸钡海藻酸钠微球可以采用加热灭菌的方法制备注射剂，具有X线可视性。

Description

硫酸钡海藻酸钠微球、其制备方法及用途

技术领域

本发明涉及聚合物微球及其制备方法，具体的涉及硫酸钡海藻酸钠微球、其制备方法及用途。

背景技术

介入疗法是20世纪70年代发展起来的一种治疗方法，在肝癌的综合治疗中具有举足轻重的作用(王为，栓塞剂在肝癌介入治疗中的应用[J]，人民军医，2001，44(5)：268-270)。正常肝脏终末小动脉的内径约为20-50μm，肝窦宽7-15μm，毛细血管宽1-8μm，肝癌组织中的微血管直径7-400μm，肿瘤边缘新生动脉血管直径在25-75μm，理论上讲，只有将直径小于20μm的细小动脉全部栓塞，才能达到有效的栓塞效果，并不至于进入肝窦和毛细血管造成异位栓塞(孔晓龙，刘滔滔，黄文静，化疗栓塞性微球治疗肝癌的概况[J]，中国临床药学杂志，1999，8(5)：325-326)。因此，栓塞剂的选择和开发至关重要。固体栓塞剂是人们努力的一个方向，目前临床应用的固体栓塞剂主要有明胶颗粒，聚乙烯醇微球等，但其常需与造影剂混合使用来示踪，而造影剂的快速流失容易导致误栓塞(李维新，高国栋，梁秦川，显影固体栓塞剂含钡明胶微球的研制[J]，第四军医大学学报，2001，22(19)：1812-1814)。

肝癌的介入治疗中，目前最常用的栓塞剂是碘化油。碘化油是目前使用的栓塞剂中唯一真正意义上的阳性栓塞剂(X线透视下可视)，而其余各种栓塞剂，如明胶海绵、颗粒性栓塞剂(如微球等)、中药类栓塞剂等均为阴性栓塞剂。碘化油是粘滞性液体栓塞剂，普通碘化油粘度较高，使用很不方便，超液化碘油常不能充分、全部积聚于肝癌病灶内，且容易被清除，影响栓塞效果；另外，碘化油虽然可以选择性滞留在肝癌病灶内使肿瘤细胞坏死，但它也可能滞留在肝硬化组织及增生结节内，加重肝功能的损害。

颗粒性栓塞剂除明胶海绵外，已见报道的颗粒性栓塞剂还有聚乙烯醇(polyvinylalcohol，PVA)、冻干硬脑膜、多丙交酯微球(polylactide microsphere)、自体毛发、炭素纤维颗粒等。这些颗粒性栓塞剂易注射，但不显影(需借助造影剂显影，容易误栓)。

临床上常用的是明胶海绵，通常需要临用前剪碎，1-3mm³大小只能用来堵塞较粗的2～3级肝动脉血管，侧支循环容易形成，加之易于吸收再通，所以它不能阻断肿瘤边缘生长活跃的浸润性病灶的丰富血供来源，必然为这些病灶的残存提供滋生条件。PVA、冻干硬脑膜等形态不规则，大小不均一，易栓塞血管近端，产生周围间隙，难以闭塞血管全截面，均不能达到理想的栓塞。其余几种栓塞剂目前应用很少。

近年来，随着天然或人工合成的高分子化合物在医学领域应用研究的深入，人们的思路逐渐转向了将颗粒性栓塞剂微粒化，做成微球制剂来栓塞微血管。当微球直径为50～150μm，可栓塞到与之直径相等的管径的微动脉内，栓塞位点在肝内动脉吻合支水平以远，至肝窦前小动脉水平，侧支循环不易形成。已见文献报道的微球有乙基纤维素微球、丝裂霉素清蛋白微球、阿霉素羧甲基化葡聚糖微球(ADM carboxymethyldextran microsphere)等。王杰等运用葡聚糖微球肝栓塞治疗肝癌，微球能栓塞到直径100μm的微动脉水平，被栓血管191天微球仍未被吸收，也未见再通现象，门静脉内未见微球栓子存在。

近年来开发的海藻酸钠是从海洋的褐藻中提取的直链阴离子多糖，是一新型无毒、生物相容性好、可生物降解的天然高分子材料，具有较好的成膜及成塑性，近年来已被应用于细胞、药物载体领域。如1980年Lin与Sun首创用海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(A-P-A)制成的微球包裹胰岛进行同种鼠胰岛移植获得成功，但直到最近才被真正运用作为微球化免疫隔离方法，受到国内外研究者关注，微球化人工细胞治疗疾病的研究，为解决组织细胞移植中的免疫排斥反应和移植来源稀少的难题提供了新的途径。

微球制剂具有易注射、易控制、栓塞作用彻底持久、不易形成侧支循环、无选择性的特点。但作为肿瘤血管栓塞剂，与其他阴性栓塞剂一样，最大缺点就是缺乏X线透视的可视性，栓塞过程中因不能直视栓塞剂到达的部位，仍有一定的盲目性，可能导致意外栓塞。

因此，本领域迫切需要开发一种具有X线可视性的微球。

发明内容

本发明的第一方面提供一种硫酸钡海藻酸钠微球，所述微球的组分和重量百分比为：

海藻酸钠        2％-10％；

氯化钙          10％-40％；

W/O型乳化剂     2.5％-7.5％；

壳聚糖          0.5％-2.5％；

硫酸钡          40％-85％。

上述海藻酸钠的重量百分比优选5.1％-6.2％；上述氯化钙的重量百分比优选23％-28％；上述W/O型乳化剂的重量百分比优选4.5％-5.5％；壳聚糖的重量百分比优选1.3％-1.6％；硫酸钡的重量百分比优选61％-74％。

上述W/O型乳化剂的HLB值在3-6之间。

上述W/O型乳化剂为司盘、吐温、或它们的混合物。

上述W/O型乳化剂为司盘-80、吐温-80、或它们的混合物。

上述W/O型乳化剂为司盘-80与吐温-80的混合物。

上述司盘-80与吐温-80的质量比为5∶1-15∶1。

上述硫酸钡海藻酸钠微球的直径为50-400μm。

上述硫酸钡海藻酸钠微球的直径为50-200μm。优选50-150μm。

上述硫酸钡海藻酸钠微球的直径为50-100μm。

本发明的第二方面提供一种硫酸钡海藻酸钠微球的制备方法，所述制备方法中以海藻酸钠、壳聚糖为膜材，以硫酸钡为芯材，以氯化钙为交联剂，采取乳化-离子交联法制备。

上述乳化-离子交联法中使用的乳化剂为W/O型。

上述W/O型乳化剂的HLB值在3-6之间。

上述W/O型乳化剂为司盘、吐温、或它们的混合物。

上述W/O型乳化剂为司盘-80、吐温-80、或它们的混合物。

上述W/O型乳化剂为司盘-80与吐温-80的混合物。

上述司盘-80与吐温-80的质量比为5∶1-15∶1。

上述硫酸钡海藻酸钠微球的制备方法，所述反应物的重量百分比为：

海藻酸钠        2％-10％；

氯化钙          10％-40％；

W/O型乳化剂     2.5％-7.5％；

壳聚糖          0.5％-2.5％；

硫酸钡          40％-85％。

较佳的，上述反应物的重量百分比为：

海藻酸钠        5.1％-6.2％；

氯化钙          23％-28％；

W/O型乳化剂     4.5％-5.5％；

壳聚糖          1.3％-1.6％；

硫酸钡          61％-74％。

上述硫酸钡海藻酸钠微球的制备方法，其制备步骤如下：

(a)粉碎硫酸钡分散于1-5％海藻酸钠溶液，2.5-5％第一乳化剂，搅拌均匀，成为水相；

(b)按照水相与有机相体积比为1∶1-1∶4量取有机相，倒入容器，加入2.5-5％第二乳化剂水浴搅拌，逐滴注入水相，获得乳液；

(c)加入2-5％氯化钙溶液固化乳液；

(d)乳液静置分层，分离出微球并水洗；

(e)将步骤(d)中微球分散在水中，然后加入壳聚糖溶液和2-5％氯化钙溶液，搅拌分离获得硫酸钡海藻酸钠微球。本制备方法中百分比均为重量百分比。

上述第一乳化剂为吐温-80。

上述第二乳化剂为司盘-80。

上述第一乳化剂与第二乳化剂的质量比为5∶1至15∶1。

上述司盘-80与上述吐温-80的质量比为5∶1至15∶1。

上述有机相为玉米油、豆油、花生油或葵花籽油等食用油。

上述水相与上述有机相的体积比为1∶2。

上述氯化钙溶液重量百分比浓度为3％。

壳聚糖溶液重量百分比浓度为0.5-1％，优选0.5％。

上述硫酸钡海藻酸钠微球的制备方法，其具体步骤为：

称取硫酸钡2.0g置乳钵中研磨，用水10ml分3次转移至100ml小烧杯中，超声5min，加入1％海藻酸钠溶液10ml、吐温-80 0.5ml，继续超声5min，将混匀后的硫酸钡海藻酸钠溶液抽入20ml针筒，作为水相；量取玉米油40ml置250ml烧杯内，加入司盘-80 6g，置50-60℃水浴搅拌10min，逐滴注入水相，乳化20min，水浴温度降至40℃，调节RCF至58g，滴加3％氯化钙溶液10ml，固化15min；固化后的乳液移入分液漏斗，静置12h分层，取下层溶液，离心分取下层微球，用水洗涤3次；水洗后的微球分散于20ml水中，加0.5％壳聚糖溶液5ml，3％氯化钙溶液5ml搅拌15min，离心，水洗3次，获得硫酸钡海藻酸钠微球。

上述硫酸钡海藻酸钠微球分散于0.25％海藻酸钠溶液中置冰箱4℃冷藏室保存。

本发明的第三方面提供了上述硫酸钡海藻酸钠微球在制备注射剂中的应用。

衡量乳化性能最常用的指标是亲水亲油平衡值(HLB值)。HLB值低表示乳化剂的亲油性强，易形成油包水(W/O)型体系。本发明中采用的乳化剂为W/O型，其HLB值在3-6之间。

本研究拟以具有生物相容和生物降解特点的天然多糖海藻酸钠(李沙，侯新朴，海藻酸钠-壳聚糖微囊成型机理及其对大分子药物的载药、释药研究[J]，药学学报，2003，38(5)：380-383；；聂淑芳，吴学明，刘宏飞，姜华威，潘卫三，海藻酸钠骨架材料中药物释放的影响因素[J]，药学学报，2004，39(7)：561-565；S.K.Bajpai，Shubhra Sharma，Investigation of swelling/degradation behaviour of alginate beads crosslinked withCa²⁺and Ba²⁺ions[J]，Reactive & Functional Polymers，2004，59：129-140；Haque T，ChenH，Ouyang W，Martoni C，Lawuyi B，Urbanska AM.et al，In vitro study of alginate-chitosanmicrocapsules：an alternative to liver cell transplants for the treatment of liverfailure[J]，Biotechnol Lett，2005，27(5)：317-322)、壳聚糖(S.K.Bajpai，S.Sharma，Investigation of swelling/degradation behavior of alginate beads crosslinked withCa2+and Ba2+ions，Relative & Functional Polymers 2004，59：129-140)为膜材，以硫酸钡为芯材，氯化钙为交联剂，采取乳化-离子交联法制备可以在X线下直接显影的颗粒型固体栓塞剂，使操作者能够准确追踪栓塞剂的栓塞部位。

本研究拟采用高分子材料海藻酸钠来制备微球，严格制备工艺和质量标准，控制微球粒径，并用此微球包覆BaSO₄，解决微球制剂不具有X线可视性的缺陷，最后加以动物模型验证，以期为肝癌介入治疗提供新的阳性颗粒性栓塞剂。目前尚未见任何有关包覆BaSO₄海藻酸钠微球用于肿瘤栓塞治疗的报道，该新型阳性颗粒性微球栓塞剂将对肿瘤的介入治疗产生重大影响，并将产生巨大的经济效益。

本发明微球有以下优点：

1、微球呈球形单体，圆形，表面光滑，分布均匀，分散性好。

2、微球的稳定性好。

3、微球在透视下良好显影。

4、微球具有良好的生物相容性

5、微球对肝癌肿瘤微血管有明显的栓塞作用，经动物实验证明使用本发明微球能抑制肿瘤生长，延长动物生存期。

以下结合附图对本发明进行详细说明。

附图说明

图1是显微镜下微球的形态(×100)。

图2是不同硫酸钡用量的海藻酸钠微球的显影效果。

从左到右硫酸钡用量分别1.5g，0.5g，2.0g，1.0g和阳性对照(复方泛影葡胺注射液)。

图3腹腔灌洗液中微球的形态变化。

A.空白腹液；B.低剂量组1周时散在微球；C.高剂量组1周时散在微球；D.低剂量组2周时吞噬微球；E.高剂量组2周时吞噬微球；F.低剂量组4周时吞噬微球；G.高剂量组4周时吞噬微球

图4试验兔介入治疗HE染色切片(×200)

A.正常对照组；B.肿瘤对照组；C.介入治疗组；D.介入治疗组。

图5.抗CD34免疫组化染色切片(×400)

A.肿瘤对照组；B.肿瘤刘照组；C.介入治疗组；D.介入治疗组。

图6.抗VEGF免疫组化染色切片(×400)

A.介入治疗组；B.肿瘤对照组。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1微球制备

1材料与方法

1.1仪器与试药  电动搅拌器(德国IKA RW20 digital)；显微镜(上海上光实业有限公司，XSP-2XC)；超声仪(上海Branson公司，SB3200-T)；旋转黏度计(上海天平仪器厂，NDJ-1型)；LS激光粒度分析仪(美国Beckman Coulter仪器公司)。海藻酸钠(青岛胶南明月海藻有限公司，药用级，010509014)；壳聚糖(冰岛普利美公司，医用级，06042005)；微粉化硫酸钡II型(山东长清制药厂，药用级，200620216)；复方泛影葡胺注射液(先灵(广州)药业有限公司，200607014)；司盘-80、吐温-80(化学纯，上海化学试剂商店)；玉米油(食品级，市售)；氯化钙、冰醋酸、柠檬酸钠等均为分析纯。

1.2工艺优选

考虑到诸多因素对微球成形的影响，参照有关文献报道(Vandenberg GW，Drolet C et al，Factors affecting protein release from alginate-chitosan coacervate microcapsulesduring production and gastric/intestinal simulation[J]，J ControlRelease，2001，77(3)：297-307；王康，何志敏，海藻酸微胶囊的制备及在药物控释中的研究进展[J]，化学工程，2002，30(1)：48-53；刘善奎，高申，钟延强，张洪英，孙树汉，DNA疫苗海藻酸钠微球的制备及体外释药[J]，第二军医大学学报，2004，25(1)：58-60；孔璐，张阳德，5-FU纳米微粒的制备及其释药特性研究[J]，解放军医学杂志，2007，32(1)：32-34；张彦青，张明春，解军波，戚务勤，韩淑珍，阿司匹林壳聚糖-海藻酸钠微囊处方优选与释药机制研究[J]，中国药房，2007，18(4)：278-280；石晓丽，徐军，张雪梅，程晓耕，干扰素壳聚糖/海藻酸钠微囊控释制剂载体的初步研究[J]，中国生物制品学杂志，2007，20(2)：117-118；吕慧侠，周建平，戴影秋，邓瑾，刘馨，海藻酸钙掩味微囊的制备[J]，中国药科大学学报，2007，38(2)：125-128；刘伟，王莹，王士斌，吴文果，蓝琪，王新刚，乳化-凝胶化法制备药用载体海藻酸钙微球的研究[J]，生物医学工程研究，2007，26(2)：155-158。)在预试验的基础上，选取影响微球性状较显著的4个因素作为考察对象，即海藻酸钠浓度、CaCl₂浓度、司盘-80与吐温-80比例、壳聚糖浓度，通过L9(34)正交设计试验优选工艺条件。取粒径分布、微球形态、分散度和均匀度4个指标进行综合评分。评判标准：粒径大小占综合评分的40％，其余三项各占20％；以显微镜下观察所得来进行评分；粒径、形态、分散度及均匀度都分为3个级别，各赋予一定的分值；综合评分以各子项目的分值之和计算。

1.3微球的形态、粒径和分布  将微球配成混悬液，摇匀后取样制片，显微镜下观察微球的外观、形态、分散度，采用血细胞计数板显微计数法初步考察微球的粒径、分布，每次计数不少于500粒。用LS激光粒度分析仪测定粒径大小和分布状态。

1.4微球的稳定性  分别取硫酸钡2.0g投料量制备的微球混悬液5ml，考查100℃水浴加热0.5h、1h、2h，-4℃冰冻24h，37℃振摇1.5h、3h、6h、12h、24h，钴60(10kGy)照射0.5h等条件对微球稳定性的影响。处理结束后，放置至室温，摇匀后取样制片，置显微镜下观察破损情况，用血细胞计数板计数，调整视野重复6次计算结果。破损率＝(破损微球数量/观察微球总数)×100％。

1.5微球混悬液的悬浮性  取硫酸钡2.0g投料量制备的微球，使用水和不同浓度的海藻酸钠溶液配制混悬液，按药典(国家药典委员会，中华人民共和国药典(二部)[M]，北京：化学工业出版社，2005：附录40)方法测定沉降体积比和黏度。

1.6硫酸钡用量与包封率  取各投料量下制备微球，调节最终体积为30ml，摇匀后取微球混悬液10ml，加入柠檬酸钠使终浓度0.055mol/L(李朝霞，朱建良，制备海藻酸钠-壳聚糖生物微胶囊的技术研究[J]，盐城工学院学报(自然科学版)，2005，18(2)：58-62)，液化1h，冰浴超声30min，离心(RCF 90g)5min，水洗3次，将粉术转移至干燥恒重的称量瓶中，105℃干燥至恒重，测得其质量。包封率＝(干燥硫酸钡粉末质量×3/实际硫酸钡投料量)×100％。

1.7微球显影效果  取1.6中微球混悬液10ml，复方泛影葡胺注射液作为阳性对照，在X光机下显影，定性观察显影效果。

2结果

2.1工艺优选结果  设计的4个因素中，CaCl₂浓度对微球形态影响较小，其次是壳聚糖浓度，海藻酸钠浓度、司盘-80和吐温-80的用量和配比对微球粒径和形态的影响较大，详见表1、2、3。微球制备工艺为：称取硫酸钡2.0g置乳钵中研磨，用水10ml分3次转移至100ml小烧杯中，超声5min，加入1％海藻酸钠溶液10ml、吐温-80 0.5ml，继续超声5min，将混匀后的硫酸钡海藻酸钠溶液抽入20ml针筒，作为水相；量取玉米油40ml置250ml烧杯内，加入司盘-80 6g，置50-60℃水浴搅拌(RCF 90g)10min，逐滴注入水相，乳化20min，水浴温度降至40℃，调节RCF至58g，滴加3％氯化钙溶液10ml，固化15min；固化后的乳液移入分液漏斗，静置12h分层，取下层溶液，离心(RCF 90g)分取下层微球，用水洗涤3次；水洗后的微球分散于20ml水中，加0.5％壳聚糖溶液5ml，3％氯化钙溶液5ml搅拌(RCF 22g)15min，离心，水洗3次，分散于0.25％海藻酸钠溶液置冰箱4℃冷藏室保存。

表1正交试验设计的因素及水平

因素水平	A海藻酸钠浓度(w/v，％)	B氯化钙浓度(w/v，％)	C司盘∶吐温	D壳聚糖浓度(w/v，％)
					1	0.5	2.0	5∶1	0.25
2	1.0	3.0	6∶1	0.50
					3	1.5	4.0	7∶1	0.75

表2正交试验设计的结果及评判

项目	A	B	C	D	粒径	形状	分散度	均匀度	总分值
										1	1	1	1	1	36	18	12	6	72
2	1	2	2	2	36	18	18	18	90
										3	1	3	3	3	36	12	12	12	72
4	2	1	2	3	36	18	12	6	72
										5	2	2	3	1	36	12	18	6	72
6	2	3	1	2	24	6	6	12	48

7	3	1	3	2	36	6	12	6	60
										8	3	2	1	3	24	6	6	6	42
9	3	3	2	1	36	12	6	12	66
										I	78	68	54	70
II	64	68	76	66
										III	56	62	68	62
R	22	6	22	8

表3F检验结果

2.2微球的形态、粒径和分布

观察结果，硫酸钡海藻酸钠微球大部分为球形单体，圆形，表面光滑，不粘连，分散性较好，所有微球均呈现均匀分散的黑色不透光状态(见图1)，平均粒径为53.08±32.72μm。

2.3稳定性考查

硫酸钡海藻酸钠微球热稳定性较好，100℃水浴加热2h破损率仅为(2.0±1.1)％；-4℃冰冻24h后微球严重破损，其破损率达(86.0±19.2)％；37℃振摇条件下，前6h破损率升高幅度明显比后18h大；钴60(10kGy)照射0.5h破损率达(10.3±3.2)％。因此加热灭菌是制备微球注射用混悬液的有效方法。

2.4悬浮性考查

结果见表4，0.25％海藻酸钠作为助悬剂时，其沉降体积比可以达到0.92±0.018，符合药典标准，而0.50％海藻酸钠微球混悬液黏度较大，不利于今后的临床给药，故选择0.25％海藻酸钠作为助悬剂的最佳浓度。

表4 4种不同混悬条件下微球的沉降体积比和动力黏度(n＝6，x±s)

海藻酸钠浓度(w/v，％)	微球沉降体积比	动力黏度(10-3pa·s，20℃)
			0.000	0.14±0.019	/
0.10	0.73±0.024	12.3±1.5
			0.25	0.92±0.018	34.7±2.6
0.50	0.97±0.015	69.4±4.6

2.5包封率

硫酸钡用量为1.0、1.5、2.0g时，其包封率的变化不大。结合定性显影结果，选择2.0g为硫酸钡的最佳投料量。

2.5微球显影效果

图2显示，同阳性对照相比，投料量为0.5g、1g的硫酸钡海藻酸钠微球X光吸收效果不明显，而投料量为1.5g、2g的硫酸钡海藻酸钠微球可见明显X线吸收，但由于仪器条件所限，无法测量其具体吸收值，只能做定性比较。

3讨论

3.1海藻酸钠浓度对微球的影响

由于芯材硫酸钡是不溶固体，故在相同的条件下，海藻酸钠的浓度增大，整个水相的黏度也相应增大，乳化时就不如海藻酸钠低浓度情况下的分散度好，故成品的分散度、形态的圆整性都不如人意。实验中海藻酸钠浓度如果太低也不利于形成所需粒径大小的微球；海藻酸钠浓度较高条件下制得的微囊粒径较大，但形态较差。

3.2乳化剂用量对微球的影响

制备工艺包括形成W/O乳剂的乳化过程。液液两相乳化形成微球较容易，而固液两相乳化，要想得到的微球圆整，则要求较高。司盘-80和吐温-80的用量对微球圆整性及分散度的影响较大。理论上乳化剂HLB值应。使用一定比例司盘-80和吐温-80混合液作为乳化剂，其HLB值在5.72，落在＜6的HLB值内，保证了微球圆整性及分散度。

3.3壳聚糖溶液的影响

pH较高或浓度较大滴加时微球存在粘连情况。壳聚糖溶液用2％醋酸调节pH值在5.0左右，再滴加到微球悬浮液中进行孵化，这样可改善微球粘连情况，但不影响孵化。微球外层膜的牢固度与壳聚糖浓度有一定关系，海藻酸钠与壳聚糖利用正负静电相互作用成膜，一旦壳聚糖的浓度降低就可能使其与海藻酸钠的交联不够充分，膜的强度会受到影响，但是壳聚糖浓度太高，会导致微球粘连，分散度下降，故可以考虑用低浓度壳聚糖分两次充分交联。

3.4关于微球的粒径  实验发现RCF与微球粒径呈负相关。在保证微球形态的情况下，降低RCF能增大微球粒径。当乳化RCF降为33g时，粒径大都在100μm左右；当RCF降至8g时，粒径大都在120μm左右，且形态非常不好。另外，此次实验所制得微球粒径差异较大(53.08±32.72μm)，在下一步的栓塞应用时，对肝窦等有造成异位栓塞的可能。如何解决这一问题呢，一是对工艺做进一步的优化，二是应用筛网来进行截留，去除粒径在30μm以下的微球，以降低异位栓塞的可能性。总体上，微球粒径在50～150μm的占总数的65％以上。

3.5稳定性考查时发现微球冷冻后会变形，而且是不可逆的变形，这可能与芯材是硫酸钡固体有关系。

总之，我们的实验结果表明，应用海藻酸钠、壳聚糖为膜材，硫酸钡为芯材，能够制备出符合一定质量标准的硫酸钡海藻酸钠微球。

实施例2生物相容性研究

取体重200~250g的Wistar健康雄性大鼠(第二军医大学实验动物中心)10只，分为2个剂量组，每组5只。制备每毫升含100000个微球的悬浮液，各取0.5、0.1毫升即50000、10000个微球稀释到1毫升，大鼠腹腔注射。1周后，2个剂量组各取1只大鼠，处死后，用生理盐水1ml，灌洗腹腔，取腹腔灌洗液1ml置显微镜下观察。2周后，2个剂量组各取2只大鼠，处死后，用生理盐水1ml，灌洗腹腔，取腹腔灌洗液1ml置显微镜下观察。4周后，同2周做同样的处理。灌洗液镜检计数微球并观察微球的形态变化，并观察囊壁厚度、有无纤维化，以了解微球在受体体内的稳定性，即生物相容性。

结果显示：整体动物没有观察到明显毒性反应。剂量组之间有明显的剂量差异，高剂量组散在微球明显比低剂量组多；第2周以后能观察到微球被吞噬的现象；微球能被包裹、吞噬，见图3A-G。

实施例3试验兔介入治疗观察

VX2肿瘤细胞株(来源)按细胞培养技术进行复苏，肿瘤细胞悬液0.5ml接种于兔后腿外侧肌肉内，2周后即制成荷瘤兔。取瘤块，用无菌眼科剪剪成约1.0mm大小的瘤组织块，置于无菌生理盐水中备用。实验兔用4％戊巴比妥钠1ml/kg静脉麻醉后仰卧位固定。常规腹部备毛，消毒铺巾，上腹部正中切口打开腹腔，充分暴露肝脏，将1mm³肿瘤块用镊子夹住直接穿刺入肝实质内，穿刺道用Arista止血淀粉封堵。观察肿瘤生长情况。CT检查时各实验组荷瘤兔所用扫描参数相同。CT扫描参数：80KV，200mA，层厚2.5mm，Pitch3，FOV 25cm，所有实验兔均在深度麻醉下采集图像以保证图像的清晰。

介入治疗时间选择在接种后2周进行，插管方法模拟人肝动脉插管介入治疗的方法。麻醉后，切开皮肤，分离右股动脉，穿刺置入3F微导管和微导丝。导管于T12水平造影(总量4ml，速率1ml/s)，发现腹腔干动脉开口，导丝引导微导管至肝总动脉再次造影(总量3ml，速率1ml/s)。

①实验兔分别于介入术前、术后2周行肝脏螺旋CT扫描，观察肿瘤生长，观察微球在肿瘤内积聚情况。

②实验兔分别于介入术前、术后7天行肝功能(ALT、AST、TB等)检查。

③介入术后2周，处死实验兔，取出肝脏。

病理：大体观察肿瘤大小、坏死情况、包膜情况。进行常规病理学检查，抗CD34免疫组化染色，抗VEGF免疫组化染色。抗VEGF免疫组化染色中阳性细胞为细胞浆出现浅黄色、棕黄色或棕褐色颗粒，＞10％为阳性表达。

①植瘤成功率：25只实验兔VX2肿瘤接种后21只可见肝肿瘤生长，移植成功率为84％(21/25)。

②动物分组：

1.正常对照组5只。

2.肿瘤对照组10只：观察肿瘤重量、体积5只；观察生存期5只。

3.介入治疗组11只(9只有效)：观察重量、体积5只(14天)；观察生存期4只。

③介入治疗成功率：11只实验兔行介入治疗，9只成功，成功率81.8％。另外，1只实验兔介入治疗手术失败，1只实验兔介入治疗后3天死亡(均从治疗组中剔除)。

表5对肿瘤重量和体积的影响(±S，n＝5)

组别	肿瘤重量(g)	肿瘤体积(cm3)
			对照组	4.696±1.246	3.962±1.101
介入治疗组	2.434±0.992*	2.126±0.929*

与对照组比*p＜0.01

介入治疗组肿瘤重量2.434±0.992克，肿瘤对照组肿瘤重量4.696±1.246克，p＜0.01。介入治疗组肿瘤体积2.126±0.929cm³，肿瘤对照组肿瘤体积3.962±1.101cm³，p＜0.01。结果表明：介入治疗对肿瘤生长有明显抑制作用。

表6对肝功能指标的影响(±S，n＝5)

组别	TB	ALT	AST
				正常对照组	0.75±0.06	32.4±8.0	20.7±9.0
肿瘤对照组	0.90±0.32	65.8±14.0△△	50.7±12.8△△
				介入治疗组	0.75±0.13	41.8±10.7**	37.5±13.5

与正常对照组比△△p＜0.01，与肿瘤对照组比**p＜0.01

介入治疗后7大，肿瘤对照组与正常对照组相比，p＜0.01，显示了肿瘤生长对肝功能的损害；而介入治疗组明显低于肿瘤对照组，与肿瘤对照组比，p＜0.01，说明介入治疗不仅控制肿瘤生长，而且通过控制肿瘤生长保护了肝功能。

在苏木精-伊红染色(HE)染色切片上，肿瘤对照组：细胞丰富，排列紧密，显著异型，并可见较多病理性核分裂，见图4B。介入治疗组：细胞排列明显松散，癌细胞大片坏死，走形与血管相一致，癌细胞核固缩和核碎裂现象明显增多，见图4C，图4D。

被抗CD34单克隆抗体染成棕黄色的血管内皮细胞代表着微血管，微血管被肿瘤细胞分割，呈点状、线状分布。

肿瘤对照组：癌灶区微血管数目较多，癌组织间可见丰富的新生血管，见图5A，图5B。CD34，EnVision染色(×400)。

介入治疗组：癌组织大片坏死，残存的癌组织内新生血管明显减少，见图5C，图5D。CD34，EnVision染色(×400)。

VEGF定位于肿瘤细胞浆及胞膜，阳性表达为胞浆或胞膜染为棕黄色(图中显示淡灰色)。

介入治疗组：癌细胞大片坏死，坏死较彻底的肿瘤细胞无VEGF的表达，残存癌细胞胞质可见弱阳性的VEGF表达，见图6A。

肿瘤对照组：癌细胞胞质可见丰富的VEGF表达，呈细颗粒状，见图6B。

对照组5只：生存期分别为39d、43d、46d、53d、55d；

介入治疗组4只：生存期分别为60d、68d，2只70大时仍存活。

动物死亡后尸检发现肝肿瘤直径均大于4cm，但大部分肿瘤组织已经坏死、液化。动物死亡前不进饮食，体重减轻，无活力。

以上对本发明的描述并不用于限制本发明的范围。对于本领域的普通技术人员来说，可以根据本发明是供的技术方案做出各种相应的改变，这些改变都应属于本发明的保护范围。

Claims (18)

1.一种硫酸钡海藻酸钠微球，其特征在于，所述微球的组分和重量百分比为：

海藻酸钠      2％-10％；

氯化钙        10％-40％；

W/O型乳化剂   2.5％-7.5％；

壳聚糖        0.5％-2.5％；

硫酸钡        40％-85％。

2.权利要求1所述硫酸钡海藻酸钠微球，其特征在于，所述微球的组分和重量百分比为：

海藻酸钠      5.1％-6.2％；

氯化钙        23％-28％；

W/O型乳化剂   4.5％-5.5％；

壳聚糖        1.3％-1.6％；

硫酸钡        61％-74％。

3.权利要求1或2所述硫酸钡海藻酸钠微球，其特征在于，所述W/O型乳化剂的HLB值在3-6之间。

4.权利要求3所述硫酸钡海藻酸钠微球，其特征在于，所述W/O型乳化剂为司盘、吐温、或它们的混合物。

5.权利要求4所述硫酸钡海藻酸钠微球，其特征在于，所述W/O型乳化剂为司盘-80、吐温-80、或它们的混合物。

6.权利要求5所述硫酸钡海藻酸钠微球，其特征在于，所述W/O型乳化剂为司盘-80与吐温-80的混合物，司盘-80与吐温80的质量比为5∶1-15∶1。

7.权利要求1-2、4-6任一权利要求所述硫酸钡海藻酸钠微球，其特征在于，所述硫酸钡海藻酸钠微球的直径为50-400μm。

8.权利要求7所述硫酸钡海藻酸钠微球，其特征在于，所述硫酸钡海藻酸钠微球的直径为50-200μm。

9.权利要求8所述硫酸钡海藻酸钠微球，其特征在于，所述硫酸钡海藻酸钠微球的直径为50-100μm。

10.一种硫酸钡海藻酸钠微球的制备方法，其特征在于，以海藻酸钠、壳聚糖为膜材，以硫酸钡为芯材，以氯化钙为交联剂，采取乳化-离子交联法制备。

11.权利要求10所述硫酸钡海藻酸钠微球的制备方法，其特征在于，所述乳化-离子交联法中使用的乳化剂为W/O型。

12.权利要求11所述硫酸钡海藻酸钠微球的制备方法，其特征在于，所述W/O型乳化剂的HLB值在3-6之间。

13.权利要求10或11所述硫酸钡海藻酸钠微球的制备方法，其特征在于，所述各组分的重量百分比为：

海藻酸钠      2％-10％；

氯化钙        10％-40％；

W/O型乳化剂   2.5％-7.5％；

壳聚糖        0.5％-2.5％；

硫酸钡        40％-85％。

14.权利要求10所述硫酸钡海藻酸钠微球的制备方法，其特征在于，其制备步骤如下：

(a)粉碎硫酸钡分散于1-5％海藻酸钠溶液，2.5-5％第一乳化剂，搅拌均匀，成为水相；

(b)按照水相与有机相体积比为1∶1-1∶4量取有机相，倒入容器，加入2.5-5％第二乳化剂水浴搅拌，逐滴注入水相，获得乳液；

(c)加入2-5％氯化钙溶液固化乳液；

(d)乳液静置分层，分离出微球并水洗；

(e)将步骤(d)中微球分散在水中，然后加入壳聚糖溶液和2-5％氯化钙溶液，搅拌分离获得硫酸钡海藻酸钠微球。

15.权利要求14所述硫酸钡海藻酸钠微球的制备方法，其特征在于，所述第一乳化剂为吐温-80。

16.权利要求15所述硫酸钡海藻酸钠微球的制备方法，其特征在于，所述第二乳化剂为司盘-80。

17.权利要求16所述硫酸钡海藻酸钠微球的制备方法，其特征在于，具体步骤为：

称取硫酸钡2.0g置乳钵中研磨，用水10ml分3次转移至100ml小烧杯中，超声5min，加入1％海藻酸钠溶液10ml、吐温-80 0.5ml，继续超声5min，将混匀后的硫酸钡海藻酸钠溶液抽入20ml针筒，作为水相；量取玉米油40ml置250ml烧杯内，加入司盘-80 6g，置50-60℃水浴搅拌10min，逐滴注入水相，乳化20min，水浴温度降至40℃，调节RCF至58g，滴加3％氯化钙溶液10ml，固化15min；固化后的乳液移入分液漏斗，静置12h分层，取下层溶液，离心分取下层微球，用水洗涤3次；水洗后的微球分散于20ml水中，加0.5％壳聚糖溶液5ml，3％氯化钙溶液5ml搅拌15min，离心，水洗3次，获得硫酸钡海藻酸钠微球。

18.权利要求1-2、4-6、8-9任一权利要求所述硫酸钡海藻酸钠微球在制备注射剂中的应用。

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