CN101545000A - 一种提高东方拟无枝酸菌发酵生产eco-0501的产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高东方拟无枝酸菌发酵ECO－0501的产量的方法，该方法是通过阻断东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)合成万古霉素来实现，所述阻断万古霉素合成包括阻断或敲除万古霉素合成酶基因或万古霉素前体合成酶基因。本发明的提高东方拟无枝酸菌发酵生产化合物ECO－0501的方法，在提高ECO－0501产量的同时，阻断了万古霉素的合成，因而对于下游的分离步骤也非常有利。

Description

一种提高东方拟无枝酸菌发酵生产ECO-0501的产量的方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高东方拟无枝酸菌(Amycolatopsisorientalis)发酵生产ECO-0501的产量的方法。

背景技术

东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)(原名为东方链霉菌(Streptomycesorientalis)或东方诺卡氏菌(Nocardia orientalis))是由Micormick等于1956年从印尼土壤中筛选得到，经鉴定其发酵产物为万古霉素(vancomycin)，该抗生素是具有抗革兰氏阳性菌的一种糖肽类抗生素。后由美国礼莱公司开发，于1958年获FDA批准上市。最近的研究表明东方拟无枝酸菌除产生万古霉素外，还产生至少10种次生代谢产物。Banskota等通过DECIPHER技术分析该菌的基因组，发现其中一个生物合成基因簇编码I型聚酮化合物合酶(polyketide synthases)，并预测其能直接合成一种新类型化合物。通过培养基筛选发酵，分离出此化合物ECO-0501，其结构式为：

同时发现该化合物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcusaureus)和耐万古霉素肠球菌(vancomycin-resistant Enterococcus faecium)均有很强的抑菌活性，因而具有良好的应用前景，但是该化合物在东方拟无枝酸菌(Amycolatopsisorientalis)发酵产物中的量很低。(Banskota AH，McAlpine JB，

 D，Ibrahim A，Aouidate M，Piraee M，Alarco AM，Farnet C，Zazopoulos E(2006b)Genomic analyses lead tonovel secondary metabolites.Part 3.ECO-0501，a novel antibacterial of a new class.J.Antibiot.(Tokyo)59：533-542)

据研究，天然的万古霉素生物合成共有35步。七肽核链是由间-氯-β-羟基酪氨酸(CHT)单位、3，5-二羟基苯基甘氨酸(Dpg)单位、精氨酸、N-甲基亮氨酸组成，在酶的催化下生成7种非蛋白氨基酸AA-1～AA-7，这7种氨基酸在非核糖体肽合成酶(NRPS)装配线上合成一线形的七肽，然后芳基边链在交联酶的催化下适时地组合、交联，形成复杂的七肽骨架。万古霉素的七肽装配是在非核糖体多肽合成酶系(nonribosonml peptide synthetases，NRPS)中进行的，该酶系是一类多功能蛋白质复合体，能识别、激活、转运氨基酸底物并按特定顺序合成多肽，它同时具有酶和模板的功能，因此又被称为蛋白质模板。非核糖体合成酶系由氨基酸激活功能域(A domain)、氨酰载体功能域(T domain)和缩合功能域(C domain)组成。首先，氨基酸激活功能域选择结合氨基酸底物，ATP依赖的氨酰基腺苷酸化形成氨酰腺苷酸；随后，氨酰腺苷酸的氨酰部分再与共价结合在多酶复合物上面的磷酸泛酰巯基乙胺的巯基进行硫酯化反应，形成氨酰载体复合物。最后，分别携带有氨酰基和肽酰基的载体，在缩合功能域的作用下形成肽键，合成的终止——肽的释放，是由于水解、环化或者转移到另外一个功能基团后引起。

本申请人在申请号为200710036861.5的中国发明专利申请中，公开了万古霉素生物合成基因簇，其中万古霉素合成酶基因有vcm2、vcm3、vcm4。万古霉素前体合成酶基因有vcm1、vcm17、vcm18、vcm13；vcm14、vcm15、vcm16；vcm23、vcm24、vcm25、vcm26。其中4个负责催化羟基苯甘氨酸的合成的酶的基因vcm1、vcm17、vcm18、vcm13；4个负责催化二羟基苯甘氨酸的合成的酶的基因vcm23、vcm24、vcm25、vc26；3个负责催化β-羟基酪氨酸的合成的酶的基因vcm14、vcm15、vcm16。

发明内容

本申请的发明人通过阻断或敲除万古霉素合成酶基因或万古霉素前体合成酶基因的表达，以阻断东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)万古霉素生物合成途径，结果发现万古霉素的合成被阻断后，东方拟无枝酸菌的代谢产物中化合物ECO-0501的产量得到了明显的提高。

因此，本发明的目的就在于提供一种提高东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)发酵生产ECO-0501的产量的方法。

本发明的提高东方拟无枝酸菌发酵生产ECO-0501的产量的方法，是通过阻断东方拟无枝酸菌合成万古霉素来实现。

根据本发明，所述阻断万古霉素合成包括阻断或敲除万古霉素合成酶基因或万古霉素前体合成酶基因。

其中，所述万古霉素合成酶基因包括合成万古霉素七肽骨架的基因vcm2，vcm3，vcm4；

所述万古霉素前体合成酶基因包括：

A、4个负责催化羟基苯甘氨酸的合成的酶的基因vcm1，vcm17，vcm18和vcm13；

B、4个负责催化二羟基苯甘氨酸的合成的酶基因vcm23，vcm24，vcm25和vcm26；

C、3个负责催化β—羟基酪氨酸的合成的酶的基因vcm14，vcm15和vcm16。

本发明的提高东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)发酵生产ECO-0501的产量的方法，在提高ECO-0501产量的同时，阻断了万古霉素的合成，因而对于下游的分离步骤也非常有利。

附图说明

图1是阻断载体pKOA的构建流程图。

图2是PCR-Targeting法敲除vcm14的原理图。

图3是阻断载体pKOA的酶切验证电泳结果。其中Lane1为EcoRI、HindIII酶切验证的电泳结果，Lane2为用EcoRI/BamHI酶切验证；Lane3为用BamHI/HindIII酶切验证；Lane4为1kb DNA Ladder。

图4是PCR验证敲除vcm4双交换突变株染色体鉴定结果。其中Lane1为1kb DNALadder，Lane2为单交换突变株染色体的PCR产物；Lane3为双交换突变株染色体的PCR产物；Lane4为出发菌株染色体的PCR产物。

图5是阻断质粒pLY26的PCR产物电泳结果。其中Lane1为以pLY26为模板的PCR产物，Lane2为以东方拟无枝酸菌染色体为模板的PCR产物；Lane3为1kb DNA Ladder。

图6是PCR验证敲除vcm14双交换突变株染色体鉴定结果。其中Lane1为1kb DNALadder，Lane2为以pLY26为模板的PCR产物；Lane3为双交换突变菌染色体为模板的PCR产物；Lane4为出发菌株东方拟无枝酸菌染色体为模板的PCR产物。

图7是PCR验证敲除vcm13双交换突变株染色体鉴定结果。其中Lane1为东方拟无枝酸菌染色体为模板的PCR产物，lane2为单交换突变株染色体为模板的PCR产物，Lane3、4为双交换突变株染色体为模板的PCR产物，lane5为1kbDNA Ladder，Lane6为pLY27为模板的PCR产物，lane7为单交换突变株染色体为模板的PCR产物，Lane8为水为模板的PCR产物。

图8是PCR验证敲除vcm13双交换突变株染色体鉴定结果。其中Lane1为东方拟无枝酸菌染色体为模板的PCR产物，lane2为可1kbDNA Ladder，Lane3为双交换突变株染色体为模板的PCR产物，Lane4为单交换突变株染色体为模板的PCR产物。

图9是HPLC检测图谱，从上到下依次为万古霉素标准品、vcm4基因阻断突变株和出发菌株。

图10是精制的发酵产物ECO-0501的HPLC图谱。

图11是发酵产物ECO-0501的MS图谱。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人的《分子克隆实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或参考Kieser等人《Practical Streptomyces Genetics》(Norwich，United Kingdom：TheJohn Innes Foundation，2000)，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明使用的菌株和质粒分别为：

质粒pIJ773，具有pBluescript KS(+)，aac(3)IV，oriT(RK2)，FRT；

质粒pIJ790，具有oriR101，repA101(ts)，araBp-gam-be-exo；

质粒pUZ8002，具有tra，neo，cos；

菌株E.coli BW25113，具有K12 derivative：

araBAD，

rhaBAD，

菌株E.coli ET12567，具有dam，dcm，hsdS，cat，tet，

以上质粒和菌株均来自Prof.Keith Chater from John Innes Center，UK；

质粒pKC1139，具有安普霉素(Apra)抗性基因，为链霉菌穿梭载体；

cos311为东方拟无枝酸菌库质粒，含有万古霉素合成基因簇；

以上两质粒来自中国科学院上海植物生理生态研究所；

本发明中E.coli BW25113/pIJ790/cos311构建如下：

将E.coli BW25113/pIJ790接种于10mlLB培养基(含氯霉素25μg/ml)30℃过夜培养。取100μl过夜培养物至10mlSOB(含20mM MgSO₄，氯霉素25μg/ml)培养基，30℃，220rpm摇床培养3-4h至OD₆₀₀约为0.4。将培养物倒入预冷的30ml离心管中，冰上置10min(从此细胞温度要保持在0～4℃)。4000rpm、4℃离心5min。弃掉上清，加1ml预冷的10％甘油，在冰上打散沉淀，再加9ml 10％甘油，摇匀。4000rpm 4℃离心5min，弃掉上清，重复上面操作；100μl 10％甘油打散沉淀菌体制成感受态细胞。在预冷的0.2cm的电转化杯中混合50μl感受态细胞与cos311，混匀后立即电击，电击条件：200Ω，25μF，2.5kv，电击时间为4.5～4.9ms。立即加1ml预冷的LB，30℃培养40min。将其涂布于LB平板(100μg/ml氨苄青霉素，50μg/ml卡那霉素，25μg/ml氯霉素)，37℃培养16h。从抗性LB平板上挑出单菌落，即为含cos311的E.coli BW25113/pIJ790。

本发明使用到的培养基及配方为：

LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母抽提物10，NaCl5，pH7.4；LB固体培养基另加入琼脂粉20；

MS平板(g/L)：黄豆粉20，甘露糖20，琼脂粉20；

YMB液体培养基(g/L)：酵母抽提物4，葡萄糖4，麦芽抽提物10，微量元素溶液2ml，pH7.2；

其中微量元素溶液(mg/L)：ZnCl₂ 40，FeCl₃·6H₂O 200，CuCl₂·2H₂O 10，MnCl₂·4H₂O10，Na₂B₄O₇·10H₂O 10，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 10；

高氏一号斜面培养基(g/L)：可溶性淀粉20，NaCl 0.5，K₂HPO₄·3H₂O 0.5，KNO₃ 1.0，MgSO₄·7H₂O 0.5，FeSO₄·7H₂O 0.01，琼脂20，pH7.2-7.4；

2×YT培养基(g/L)：胰蛋白胨16，酵母抽提物10，NaCl5。

本发明使用酶购自TaKaRa公司；胰蛋白胨，酵母抽提物购自Oxoid公司；

其他常规试剂均为国产或进口分装。

本发明的基因同源重组原理，是通过PCR方法分别扩增两个同源片段，每个片段的大小应基本相符并大于500bp，在两个同源片段连入含有Apra抗性基因的大肠杆菌及链霉菌穿梭载体pKC1139等，构建基因阻断载体；然后将构建的基因阻断载体，通过接合转移，导入东方拟无枝酸菌中，获得接合转移子，根据载体上的Apra抗性基因进行筛选，获得阻断载体与宿主菌染色体基因整合的单交换的突变菌株。利用PCR的方法，验证阻断载体的整合。单交换突变株进行连续传代培养，筛选发生第二次单交换的基因阻断菌株。

本发明的PCR-Targeting的方法，是指利用λRED(gam，bet，exo)重组酶可以显著提高线形DNA的重组频率的特性，使用带抗性标记和接合转移起始位点oriT(RK2)的PCR产物置换科斯质粒上的目标基因区域，并通过两亲本接合转移转入东方拟无枝酸菌，由于目标基因两端的同源序列一般长于10kb，使得筛选周期明显缩短并且筛选工作量降低。

实施例1、万古霉素合成酶基因的阻断

万古霉素合成酶基因vcm2，vcm3和vcm4分别编码非核糖体肽合成酶，即Vcp1，Vcp2和Vcp3，这3个非核糖体肽合成酶共包含有7个模块，24个结构域，负责催化万古霉素七肽骨架的生物合成；本实施例以阻断万古霉素合成酶基因vcm4为例，通过阻断万古霉素七肽骨架的合成来阻断万古霉素的合成。

本实施例利用基因同源重组原理，构建基因阻断载体pKOA；然后将构建的基因阻断载体，通过接合转移，导入东方拟无枝酸菌中，获得接合转移子，根据载体上的Apra抗性基因进行筛选，获得单交换突变株。对单交换突变株进行连续的传代培养，筛选获得缺失突变菌株，本实施例中，vcm4的阻断是通过基因内部DNA片段(26788-27183)缺失完成，具体实验步骤如下：

1.1、引物设计与合成

根据申请号为200710036861.5的中国发明专利中的东方拟无枝酸菌万古霉素非核糖体多肽合成酶的基因序列为基础设计引物：

vcpus：5’-GGGAAGCTTTGGACGGTTTCAACGCGACC-3’，

vcpuas：5’-GCCGGTGGATCCCGAGGTGTAC-3’；

两端分别引入HindIII，BamHI酶切位点(下划线部分)

vcpds：5’-GGGGGATCCACCGAGACCACCCTGTGC-3’，

vcpdas：5’-GGGGAATTCCGCCGCCGGATCTCCTCC-3’；

两端分别引入BamHI，EcoRI酶切位点(下划线部分)

1.2、上、下游同源臂的PCR扩增

以东方拟无枝酸菌ATCC 43491 DNA(提取方法参考Kieser等人《PracticalStreptomyces Genetics》)为模板，以vcpus，vcpuas为引物扩增上游同源臂，将扩增片段命名为vcpu；以vcpds，vcpdas为引物扩增下游同源臂，将扩增片段命名为vcpd，两片段长度均为约500bp。

其中，PCR反应体系为：0.5μmol/L每条引物，1×Buffer，50μmol/L dNTPs，5％ DMSO，2.5U Ex Taq聚合酶，Mg²⁺1.5mmol/L。

PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性45s，55℃退火50s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min。

取上述PCR产物，使用杭州维特洁生化技术有限公司的纯化试剂盒，参考使用手册进行纯化，纯化后获得PCR产物均约500bp，浓度为75ng/μg。

1.3、构建pKOA阻断载体

如图1的流程图所示，构建pKOA阻断载体，具体步骤如下：

取上述步骤1.2获得的纯化PCR产物vcpu，用HindIII/BamHI酶切得约500bp片段，vcpd用BamHI/EcoRI酶切得约500bp片段；先将vcpu克隆进链霉菌穿梭载体pKC1139的HindIII、BamHI位点，然后将vcpd克隆进pKC1139的BamHI、EcoRI位点，构建得到pKOA阻断载体。

将pKOA阻断载体用HindIII、BamHI或EcoRI酶切并电泳鉴定，结果如图3所示，

Lane1～3分别切出1kb、500bp、500bp的条带，证明vcpd、vupu成功克隆进pKC1139，构建成pKOA阻断载体。

1.4、vcm4基因阻断突变株的筛选和获得

将pKOA阻断载体电转到含有辅助质粒的大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，以载体上的Apra抗性为筛选标记进行筛选(具体的过程同实施例2.5)，得到ET12567/pUZ8002/pKOA。

将含阻断载体pKOA的大肠杆菌ET12567/pUZ8002接入3ml的LB培养基(含25μμg/ml氯霉素，50μg/ml安普霉素，50μg/ml卡那霉素)37℃摇床培养过夜。取一部分过夜培养物至10ml新鲜的LB培养基(含25μg/ml氯霉素，50μg/ml安普霉素，50μg/ml卡那霉素)中，菌体终浓度为1％，37℃，220rpm摇床培养3-4h至OD₆₀₀约为0.4。将培养物倒入的30ml离心管中，4000rpm 4℃离心5min，弃掉上清，加1ml LB打散沉淀，再加9ml LB，摇匀。4000rpm 4℃离心10min，弃掉上清，重复上面操作，1mlLB打散沉淀。

将10μl东方拟无枝酸菌ATCC 43491单孢子悬液(≥10⁸)加入500μl 2×YT培养基，50℃热激10min。冷却后与500μl E.coli ET12567/pUZ8002/pKOA混合，吸取100μl涂布于MS(10mmol/LMgCl₂)培养基，30℃培养16-20小时左右，用1ml无菌水(含0.5mg萘啶酮酸和1.25mg安普霉素)覆盖平板，30℃培养5天得到接合转移子。挑选接合转移子到MS平板上(含50μg/ml安普霉素和25μg/ml萘啶酮酸)，验证pKOA是否已整合到东方拟无枝酸菌的染色体上，即筛选单交换突变株。将抗性的单菌落挑入YMB液体培养基中连续传代3次；稀释涂布于MS培养基，30℃培养5天。挑取单菌落影印培养：

用无菌牙签挑取单菌落分别接种于MS平板和含50μg/ml安普霉素的MS平板，30℃培养5天；挑出在Apra抗性MS平板上不生长，而在MS平板上生长的菌落，置于YMB培养基中培养3天，提取染色体。

以vcpus、vcpdas为鉴定引物，进行PCR验证，

PCR反应体系为：0.5μmol/L每条引物，1×Buffer(TAKARA公司)，50μmol/LdNTPs，5％DMSO，2.5U Ex Taq聚合酶，Mg²⁺1.5mmol/L。

PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性45s，55℃退火50s，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸5min。

PCR电泳结果如图4所示，

由图4的结果可知：以出发菌株染色体为模板时，可扩增到1kb的片段；以单交换突变株染色体为模板时，可扩增出1.5kb的片段和1kb片段；以双交换阻断突变株染色体为模板时，可扩增出1.5kb的片段。

说明东方拟无枝酸菌分别发生两次单交换，第一次单交换使阻断载体整合东方拟无枝酸菌基因组；在第一次单交换的基础上，发生的第二次单交换使东方拟无枝酸菌基因组发生缺失突变。(第二次单交换获得菌株大多数是回复突变，PCR验证结果同出发菌株)

1.5、vcm4基因阻断突变菌株的发酵验证

东方拟无枝酸菌ATCC 43491及实施例1.4所得突变菌株先经过自然分离纯化，得到单一菌落。挑取单菌落涂布于高氏一号斜面培养基上，28℃培养5天，在无菌条件下，从新鲜的斜面中用无菌接种铲刮取一定量的孢子，接入种子培养基中，置于220rpm旋转摇床上振荡培养40～48h，培养温度28℃。在无菌条件下，将培养好的种子液转入发酵摇瓶中，接种量8％，置于220rpm旋转摇床上振荡培养115～120h，培养温度28℃。取发酵液10mL，置于30mL离心管，12000rpm离心10min。取上清HPLC检测，检测结果见图9。

流动相配制：用0.2％的三乙胺溶液，磷酸调pH至3.2作为缓冲液。缓冲液与乙睛和四氢呋喃按92∶7∶1的比例混合，摇匀，作为A液；缓冲液与乙睛和四氢呋喃按70∶29∶1的比例混合，摇匀，作为B液，超声波脱气20min，备用。A液和B液的比例见表1。

色谱条件：色谱柱：DiamonsilTM C18，ODS，ID 4.6*200mm

柱温：40℃

检测器：DAD(HP1100)检测器

检测波长：240nm

流速：1ml/min

进样量：5μl

洗脱方法：梯度洗脱。

表1

由图9可见，万古霉素标准品样在8min左右开始出峰，出发菌株发酵液上清在8min左右开始出峰，突变菌株在8min左右则未出峰，说明基因阻断株均不再产生万古霉素。

1.6、发酵产物ECO-0501的分离及精制

根据文献报道的方法发酵(Banskota AH，McAlpine JB，

，Ibrahim A，AouidateM，Piraee M，Alarco AM，Farnet C，Zazopoulos E(2006b)Genomic analyses lead to novelsecondary metabolites.Part 3.ECO-0501，a novel antibacterial of a new class.J Antibiot(Tokyo)59：533-542)。发酵液4L，离心，倾去上清，沉淀加300ml乙醇浸提3h，两次，过滤，上清蒸馏至干，乙醇水溶液溶解。100mlJD-1吸附，梯度洗脱乙醇-水溶液分别为1:9，1:4，3:7，2:3，3:2，8:1。收集2:3及3:2洗脱液浓缩，进行HPLC检测，检测结果见图10。

(1)液相分析条件：

色谱柱规格Kromasil C18(4.6mm×250mm)，5μm；流动相0.01M NH₄Ac(醋酸调pH5.0)∶乙腈＝62∶38；检测波长λ＝360nm；流速1ml/min；柱温30℃。

(2)液相制备条件：

Kromasil C18(4.6mm×250mm)；流动相0.01M NH₄Ac(醋酸调pH4.6)∶乙腈＝62∶38；检测波长λ＝360nm；流速4ml/min；柱温30℃。

进一步将该发酵产物进行质谱检测，结果如图11所示，可知该物质分子量为836，和文献报道ECO-0501分子量一致，该发酵产物即为化合物ECO-0501。

根据图谱计算产峰面积，可知出发菌株的发酵产物产峰面积为2773，而突变菌株产峰面积为5613，产量大为提高，约为出发菌株的两倍。

由此可见，将万古霉素合成酶基因阻断，可以阻断万古霉素的合成，却大大提高化合物ECO-0501的产量。

当然，针对其他万古霉素合成酶基因：vcm2，vcm3等设计引物，通过基因同源重组的方法构建阻断载体，获得突变菌株，发酵生产ECO-0501对于本领域的工作人员来说是显而易见的，因此这也属于本发明所要保护的内容。

实施例2、催化β—羟基酪氨酸合成的万古霉素前体合成酶基因的敲除

万古霉素前体合成酶基因共有16个，其中vcm14，vcm15和vcm16分别编码水解酶，肽合成酶VCP4，P450氧化酶，这3个酶负责催化β—羟基酪氨酸的合成；本实施例以将万古霉素前体合成酶基因vcm14敲除为例，阻断万古霉素的合成。

本实施例按照图2所示PCR-targeting的原理，体外将Aprar基因盒替换待敲除的vcm14基因，构建基因阻断载体pLY26，具体步骤如下：

2.1、引物设计与合成

根据东方拟无枝酸菌ATCC 43491的基因序列设计引物对Dv14sense和Dv14anti：

Dv14sense：GCGCCGTGGCTGTGCGGTGAGCGGGGAAGGACCATCATGATTCCGGGGATCCGTCGACC；

Dv14anti：CGAACAGGGCCGGTGTCGTGGCCGCCGAAAAAACGGTCATGTAGGCTGGAGCTGCTTC。

2.2、PCR扩增

以EcoRI/HindIII酶切质粒pIJ773，获得1.5kb含Apra抗性基因盒片段，以该片段作为模板，Dv14sense和Dv14anti为引物进行PCR扩增。

PCR反应体系为：0.5μmol/L每条引物，1×Buffer，50μmol/LdNTPs，5％DMSO，2.5UEx Taq聚合酶，Mg²⁺1.5mmol/L。

PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸90s，10个循环；94℃变性45，55℃退火45s，72℃延伸90s，15个循环；72℃延伸5min。

取上述PCR产物，然后参考使用手册，使用杭州维特洁生化技术有限公司的纯化试剂盒，纯化后获得PCR产物为1.5kb，浓度为95ng/μl。

2.3、构建阻断质粒pLY26

将实施例2.2所得含安普霉素抗性基因盒的PCR产物电转入E.coliBW25113/pIJ790/cos311。以载体上的安普霉素抗性为筛选标记，筛选出已替换目标序列的单菌落，从中提取阻断载体命名为pLY26，具体步骤如下：

将含cos311的E.coli BW25113/pIJ790接入3ml SOB-MgSO₄培养基(含25μg/ml氯霉素，100μg/ml氨苄青霉素，50μg/ml卡那霉素)中，30℃摇床培养过夜。取一部分过夜培养物至10ml新鲜的SOB-MgSO₄培养基(含25μg/ml氯霉素，100μg/ml氨苄青霉素，50μg/ml卡那霉素，含20mM MgSO₄)中，菌体终浓度为1％，添加100μl 1M L-阿拉伯糖诱导λ/red重组系统。30℃，220rpm摇床培养3-4h至OD₆₀₀约为0.4。将培养物倒入预冷的30ml离心管中，冰上置10min(从此细胞温度要保持在0～4℃)。4000rpm、4℃离心5min。弃掉上清，加1ml预冷的10％甘油，在冰上打散沉淀，再加9ml 10％甘油，摇匀。4000rpm 4℃离心5min，弃掉上清，重复上面操作；100μl 10％甘油打散沉淀菌体制成感受态细胞。在预冷的0.2cm的电转化杯中混合50μl感受态细胞与1-2μl纯化的PCR产物，混匀后立即电击，电击条件：200Ω，25μF，2.5kv，电击时间为4.5～4.9ms。立即加1ml预冷的LB，37℃培养40min。将其涂布于LB平板(100μg/ml氨苄青霉素，50μg/ml卡那霉素，50μg/ml安普霉素)，37℃培养16h。从抗性LB平板上挑出单菌落，抽提质粒，鉴定正确的质粒命名为pLY26，其中安普霉素抗性基因盒置换序列在cos311中的位置是43438-44262。

2.4、阻断质粒pLY26的鉴定

在安普霉素抗性基因盒插入失活位置上下游约50bp处，设计一对引物Indv14a和Indv14at，以鉴定质粒pLY26：

Indv14a：ATCGCACGTTCCACATCAGA；

Indv14at：TCCAGGTAGCCGAAATGCCC。

PCR反应体系为：0.5μmol/L每条引物，1×Buffer，50μmol/LdNTPs，5％DMSO，2.5UEx Taq聚合酶，Mg²⁺1.5mmol/L。

PCR反应条件为：95℃预变性2min，95℃变性45s，55℃退火50s，72℃延伸90s，30个循环，72℃延伸5min。

PCR扩增的结果如图5所示。

由图5的结果可知，以东方拟无枝酸菌染色体为模板，可扩增到1kb的片段；以阻断载体pLY26为模板时，可扩增出1.5kb的片段，说明安普霉素抗性基因盒已替换目标基因vcm14。

2.5、电转化阻断质粒pLY26

将构建好的阻断载体pLY26电转到含有辅助质粒的大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，以载体上的Apra抗性为筛选标记，从筛选到的Apra^r转化子中提取质粒，验证其分子量大小，具体步骤如下：

将大肠杆菌ET12567/pUZ8002接入3ml LB培养基(含25μg/ml氯霉素50μg/ml卡那霉素)中，37℃摇床培养过夜。取一部分过夜培养物至10ml新鲜的SOB-MgSO₄培养基(含25μg/ml氯霉素，50μg/ml卡那霉素)中，菌液终浓度为1％，37℃，220rpm摇床培养3-4h至OD₆₀₀约为0.4。将培养物倒入预冷的30ml离心管中，冰上置10min(从此细胞温度要保持在0～4℃)。4000rpm 4℃离心5min，弃掉上清，加1ml预冷的10％甘油，在冰上打散沉淀，再加9ml 10％甘油，摇匀。4000rpm 4℃离心5min，弃掉上清，重复上面操作；100μl10％甘油打散沉淀菌体。在预冷的0.2cm的电转化杯中混合50μl感受态细胞与1-2μl阻断载体pLY26，混匀后立即电击，电击条件：200Ω，25μF，2.5kv，电击时间为4.5～4.9ms。立即加1ml预冷的LB，37℃诱导培养40min。将其涂布于LB平板(25μg/ml氯霉素，50μg/ml卡那霉素，50μg/ml安普霉素)，37℃培养16h。从抗性LB平板上挑出单菌落，命名为ET12567/pUZ8002/pLY26。

2.6、含重组载体的大肠杆菌ET12567/pUZ8002/pLY26与东方拟无枝酸菌成熟孢子接合转移。

按实施例1.4所述的方法，将ET12567/pUZ8002/pLY26与东方拟无枝酸菌成熟孢子接合转移。

PCR鉴定挑出菌株是双交换菌株还是单交换菌株，PCR鉴定的引物、体系和条件同实施例2.4。PCR扩增的结果如图6所示，

由图6的结果可知，以pLY26为模板，可扩增到1.5kb的片段；以双交换突变株染色体为模板，可扩增到1.5kb的片段；以出发菌株染色体为模板时，可扩增出1kb的片段。说明阻断载体pLY26及双交换突变株vcm14基因均被安普霉素抗性基因盒所替换。

将突变菌株按照实施例1.5、1.6所述的方法进行发酵验证，发现同样的不再产生万古霉素，其发酵后的产物ECO-0501产峰面积为5328，约为出发菌株的1.9倍。

由此可见，将催化β—羟基酪氨酸的合成的万古霉素前体合成酶基因敲除，同样可以阻断万古霉素的合成，却大大提高化合物ECO-0501的产量。

当然，针对其他万古霉素合成酶基因vcm15，vcm16等设计引物，通过PCR-Targeting的方法构建敲除载体，获得突变菌株，发酵生产ECO-0501对于本领域的工作人员来说是显而易见的，因此这也属于本发明所要保护的内容。

实施例3、催化羟基苯甘氨酸合成的万古霉素前体合成酶基因的敲除

万古霉素前体合成酶基因共有16个，其中vcm1，vcm17，vcm18和vcm13分别编码预苯酸脱氢酶(prephenate dehydrogenase)，羟基扁桃酸合成酶Hmas，羟基扁桃酸氧化酶Hmo和羟基苯甘氨酸氨基转移酶HpgT，这5个酶负责催化羟基苯甘氨酸(HPG，万古霉素七肽骨架中一个非天然来源的氨基酸)的合成；本实施例以将万古霉素前体合成酶基因vcm13敲除为例，阻断万古霉素的合成。

同实施例2所述的PCR-Targeting的方法，构建基因阻断载体pLY27，敲除vcm13基因，其中安普霉素抗性基因盒置换序列在cos311中的位置是42432-42753。

其中，用于扩增的引物为Dvcm13sense和Dvcm13anti：

Dvcm13sense：TGCGGGCGAACGAGCGGGACGTGCTGCTCGCCCCGGCGCATTCCGGGGATCCGTCGACC；

Dvcm13anti：GGTCTACATCGGATCCTTCGCCAAGACCGGCATGCCCGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC。

用于鉴定的引物为Id13sense和Id13anti：

Id13sense：GTACAGGCCACCGCCCGC；

Id13anti：TCGGTGGTCGTCACCGTCG。

PCR扩增的结果如图7所示。

如图7所示，以出发菌株染色体为模板可扩增获得500bp的片断，以单交换突变菌染色体为模板可扩增获得1.5kb和500bp两条片断，而以pLY27为模板时，也可扩增获得1.5kb和500bp两条片断(有时只能扩增获得1.5kb条带，如pLY26电泳图谱)；以双交换突变株染色体为模板可扩增获得1.5kb的片断，而阴性对照未扩增获得片断。

说明在pLY27中，安普霉素抗性基因盒片段已替换相应序列；单交换突变株中，科斯载体与东方拟无枝酸染色体发生整合；双交换突变株中，安普霉素抗性基因盒片段已替换相应序列，vcm13被阻断。

将突变菌株按照实施例1.5、1.6所述的方法进行发酵验证，发现同样的不再产生万古霉素，其发酵后的产物ECO-0501产峰面积为5513，约为出发菌株的两倍。

由此可见，将催化羟基苯甘氨酸合成的万古霉素前体合成酶基因敲除，同样可以阻断万古霉素的合成，却大大提高化合物ECO-0501的产量。

当然，针对其他万古霉素合成酶基因：vcm1，vcm17，vcm18等设计引物，通过PCR-Targeting的方法构建敲除载体，获得突变菌株，对于本领域的工作人员来说是显而易见的，因此这也属于本发明所要保护的内容。

实施例4、催化二羟基苯甘氨酸的万古霉素前体合成酶基因的敲除

万古霉素前体合成酶基因共有16个，其中vcm23，vcm24，vcm25和vcm26分别编码二羟基苯乙酸合成酶，烯酰CoA水解酶，羟酰基脱氢酶和烯酰CoA水解酶，这4个酶负责催化二羟基苯甘氨酸(DHPG，万古霉素七肽骨架中另一个非天然来源的氨基酸)的合成；本实施例以将万古霉素前体合成酶基因vcm23敲除为例，阻断万古霉素的合成。

同实施例2所述的PCR-Targeting的方法，构建基因阻断载体pLY28，敲除vcm23基因，其中安普霉素抗性基因盒置换序列在cos311中的位置是55082-55803。

其中，用于扩增的引物为Dvcm23sense和Dvcm23anti：

dvcm23sense：TCACGCTCGCCGAGGCGGAACGACAGGGACTGCTGCCGGATTCCGGGGATCCGTCGACC；

dcm23anti：GACCACCGCGGTCCGCATCGTGCCGTCCAGCGCGTAGGCTGTAGGCTGGAGCTGCTTC。

用于鉴定的引物为Id23sense和Id23anti：

Idvcm23sense：CCCGGGAACGAACTCGCCC；

Idcm23anti：TGATGATGTAGCTGGCGAAT。

PCR扩增的结果如图8所示。

如图8所示，以出发菌株染色体为模板可扩增获得1kb的片断，以单交换突变菌染色体可扩增获得1.6kb和1kb两条片断，以双交换突变株染色体为模板可扩增获得1.6kb的片断.

说明单交换突变株中，科斯载体与东方拟无枝酸染色体发生整合；双交换突变株中，安普霉素抗性基因盒片段已替换相应序列，vcm23被阻断。

将突变菌株按照实施例1.5、1.6所述的方法进行发酵验证，发现同样的不再产生万古霉素，其发酵后的产物ECO-0501产峰面积为5480，约为出发菌株的2.1倍。

由此可见，将催化羟基苯甘氨酸合成的万古霉素前体合成酶基因敲除，可以阻断万古霉素的合成，却大大提高化合物ECO-0501的产量。

当然，针对其他万古霉素合成酶基因：vcm24，vcm25，vcm26等设计引物，通过PCR-Targeting的方法构建敲除载体，获得突变菌株，发酵生产ECO-0501对于本领域的工作人员来说是显而易见的，因此这也属于本发明所要保护的内容。

综上所述，本发明将万古霉素合成酶基因及其催化β—羟基酪氨酸合成、催化羟基苯甘氨酸合成、催化二羟基苯甘氨酸合成的万古霉素前体合成酶基因阻断和敲除，能使东方拟无枝酸菌丧失产生万古霉素的能力，但能提高对这类多烯聚酮抗菌活性产量，在提高ECO-0501产量的同时，阻断了万古霉素的合成，因而简化下游的分离步骤。

Claims (8)

1、一种提高东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)发酵生产ECO-0501的产量的方法，其特征在于，该方法通过阻断东方拟无枝酸菌合成万古霉素来实现。

2、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阻断万古霉素的合成包括阻断或敲除万古霉素合成酶基因或万古霉素前体合成酶基因。

3、如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述万古霉素合成酶基因包括合成万古霉素七肽骨架的基因vcm2，vcm3，vcm4。

4、如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述万古霉素合成酶基因为vcm4。

5、如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述万古霉素前体合成酶基因包括：

A、4个负责催化羟基苯甘氨酸的合成的酶的基因vcm1，vcm17，vcm18和vcm13；

B、4个负责催化二羟基苯甘氨酸的合成的酶基因vcm23，vcm24，vcm25和vcm26；

C、3个负责催化β—羟基酪氨酸的合成的酶的基因vcm14，vcm15和vcm16。

6、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述催化羟基苯甘氨酸的合成的酶的基因为vcm13。

7、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述催化二羟基苯甘氨酸的合成的酶基因为vcm23。

8、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述催化β—羟基酪氨酸的合成的酶的基因为vcm14。

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