CN101526531A - 利用氧化锌量子点进行免疫测定的方法 - Google Patents
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Abstract
本方法中利用在量子点上层层组装辣根过氧化物酶，然后在外层组装上抗体。同时在金电极上生长氧化锌纳米棒，在氧化锌纳米棒上也组装抗体。然后通过抗体和抗原的特异结合使待测抗原和量子点上的抗体与氧化锌纳米棒上的抗体结合，用极少量的抗原把组装有大量辣根过氧化物酶的量子点连接到纳米氧化锌金电极上，然后检测辣根过氧化物酶对过氧化氢催化的电化学响应，建立起抗原浓度和辣根过氧化物酶对过氧化氢催化的电化学信号之间的关系。通过这种检测方法，使极低浓度的抗原即能产生明显的电化学催化信号，起到了信号放大的作用。这在医学领域的疾病早期检测方面有着重要的意义。
Description
一、技术领域
本发明属于免疫测定技术领域，尤其涉及一种利用氧化锌量子点进行免疫测定的方法。
二、背景技术
纳米结构氧化锌除了独特的半导体光电特性之外，还具有对生物安全无毒、具有优良的生物兼容性、能与蛋白质等生物分子以氢键或其他方式螯合并能很好的保持其生物活性、具有较高等电点等优异的性能，这使其在生物/化学传感器方面具有重要的应用。
目前，低浓度抗原的检测是临床医学和诊断学面临的重要课题。能成功检测低浓度的抗原，可以为相应的疾病早期诊断和治疗提供科学的依据。抗原浓度检测的传统手段是先进行病毒培养以提高疾病抗原的浓度，然后辅以光化学检测法或其他检测方法确定抗原浓度并推算出原始浓度。这种方法的局限性在于其周期长，精确度差等，可能延误疾病的发现和最佳治疗时机。利用纳米材料构建生物/化学传感器进行电化学检测抗原的方法因其检测限低、检测快速、选择性好等优点正逐渐受到越来越多的重视，但由于早期疾病期相应抗原的浓度极低，因此如何使低浓度的抗原产生明显的检测信号是这种方法亟待解决的重要问题之一。
三、发明内容
技术问题：本发明针对上述技术缺陷，提供一种利用氧化锌量子点进行免疫测定的方法。该方法利用多层组装的生物化学传感器检测低浓度抗原，对相应抗原的检测限低、选择性好、灵敏度高、稳定性好。
技术方案：在本发明中，利用简单的化学反应把氧化锌纳米棒直接生长在经过处理的金电极表面，得到了形貌均匀，尺度均一且与电极材料结合牢固的纳米氧化锌电极，在氧化锌纳米棒上组装抗体。同时在氧化锌量子点上多层组装辣根过氧化物酶，并在最外层组装相应抗体。在特定浓度的待测抗原溶液中，使量子点上的抗体和氧化锌纳米棒上的抗体均与抗原进行特异性结合，把组装有辣根过氧化物酶的量子点连接到电极上的氧化锌纳米棒上，形成生物/化学传感器。然后检测辣根过氧化物酶对过氧化氢催化的电化学信号建立抗原浓度与电化学信号之间的关系，从而确定待测抗原浓度。本发明的技术解决方案为：
一种利用氧化锌量子点进行免疫测定的方法，测定步骤为：
第一步：将直径0.3～0.7毫米的电极金属丝一端烧熔成一个直径0.8～1.2毫米的小球，再在小球表面蒸镀一层100～300纳米厚的锌，放在管式炉里在250～350℃氧化30～60分钟，取出后用1.5～2.5M KOH溶液煮沸1～3小时，取出后用去离子水清洗，再放置于含H2O2体积百分数为10％～30％的H2SO4中30～60分钟后取出，再用去离子水清洗，室温干燥；
第二步：将锌粉末和去离子水混合超声10～20分钟，静置30～60分钟，倾去水，把锌粉末和水按质量比0.5～1∶100混合转移至高压釜中，静置至无悬浮颗粒，将第一步处理过的电极金属丝浸入水中，不触及沉在高压釜底部的锌粉，密封，使其能承受最大压力不小于1.5×105Pa，加热至80～95℃，保持6～15小时，自然冷却至室温，取出，用去离子水清洗，得到生长有纳米氧化锌的电极；
第三步：利用氧化锌PI＝9.4的高等电点把第二步制得的电极在中性条件下浸入含有0.2～0.8M NaCl的1～2mg/mL聚苯乙烯磺酸钠溶液中1～4小时，取出用去离子水清洗，再在30～37℃时浸入0.01～0.02mg/mL的抗体溶液中1～3小时，去离子水清洗后即得组装抗体的氧化锌纳米棒电极；
第四步：配制0.01～0.1M醋酸锌的乙醇溶液，搅拌加入聚乙烯吡咯烷酮，加入量为0.1～1克聚乙烯吡咯烷酮/10mL溶液，得到量子点前驱体溶液，40～60℃时搅拌滴加与量子点前驱体溶液等体积的0.05～0.5M氢氧化钠乙醇溶液，添加完毕后恒温搅拌1～2小时，离心分离，用乙醇和去离子水交替清洗得氧化锌量子点；
第五步：按0.2～2mg/mL的比例将第四步制得的氧化锌量子点分散到含0.2～0.8M NaCl的1～2mg/mL聚苯乙烯磺酸钠溶液中，超声分散30～60分钟，离心分离，用水清洗后加1～2mg/mL辣根过氧化物酶溶液200微升，摇振2～6小时，离心分离，用水清洗；
第六步：重复第五步3～5次，得多层修饰量子点，向量子点中加入1～2mg/mL含0.2～0.8M NaCl的的聚苯乙烯磺酸钠溶液1毫升，摇振1～2小时，用水清洗后加0.01～0.02mg/mL的抗体溶液200微升，30～37℃摇振1～3小时，离心分离，用水清洗后得修饰有抗体的多层组装辣根过氧化物酶的氧化锌量子点；
第七步：将第六步制得的量子点分散到1毫升0.1纳克/毫升～1微克/毫升的抗原溶液中，并将第三步制得的电极浸入此抗原溶液中，30～37℃温育20～30分钟，取出用水清洗得；
第八步：将第七步制得的电极作为工作电极，铂丝电极作为对电极，银/氯化银电极作为参比电极，组成三电极体系，用pH＝7的0.01～0.1M磷酸氢钠、磷酸二氢钠缓冲溶液作为电解液构建生物/化学传感器，连接电化学工作站，检测得到辣根过氧化物酶对双氧水的催化电化学信号。
上述利用氧化锌量子点进行免疫测定的方法，还包括检测得到辣根过氧化物酶对双氧水的催化电化学信号后，改变第七步中抗原的浓度，重复第七步和第八步，建立修饰的工作电极对加入双氧水前后的时间电流响应曲线在200秒时的差值与抗原浓度之间的线性关系，此线性关系可以为用此发明的方法进行临床检测提供浓度判定的参考依据，是本发明方法中的最重要的基础数据，对利用本发明方法进行快速、准确的临床检测有着极其重要的意义。
上述抗体为肝癌首选标志物α-胎蛋白，所述抗原为肝癌补充标志物癌胚抗原或胰腺癌首选标志物血清糖链抗原。
上述电极金属丝为金丝或铂丝。
有益效果：本方法中利用在量子点上层层组装辣根过氧化物酶，然后在外层组装上抗体。同时在金电极上生长氧化锌纳米棒，在氧化锌纳米棒上也组装抗体。然后通过抗体和抗原的特异结合使待测抗原和量子点上的抗体与氧化锌纳米棒上的抗体结合，用极少量的抗原把组装有大量辣根过氧化物酶的量子点连接到纳米氧化锌金电极上，然后检测辣根过氧化物酶对过氧化氢催化的电化学响应，建立起抗原浓度和辣根过氧化物酶对过氧化氢催化的电化学信号之间的关系。
通过这种检测方法，使极低浓度的抗原即能产生明显的电化学催化信号，起到了信号放大的作用。这在医学领域的疾病早期检测方面有着重要的意义。
与现有技术相比，本发明还具有以下优点：
1.本发明氧化锌纳米材料电极制备工艺及设备简单，只需要普通的100mL聚四氟乙烯高压釜即可。生长温度低，温度低于95℃。没有异种杂质离子，整个反应体系只有锌或氧化锌和水，不会引入异种杂质缺陷。
2.本发明制备的纳米氧化锌棒与氧化锌量子点尺寸均一，形貌均匀，条件可控，可重复性强。
3.本发明以所制备的氧化锌量子点及纳米氧化锌电极为基础，采用了生物分子的多层组装技术，构建的生物化学传感器对抗原浓度检测灵敏度高，检测限低，时间响应快，稳定性好。
4.本发明利用氧化锌具有良好的生物兼容性等特点在氧化锌量子点上多层组装辣根过氧化物酶，利用抗体和抗原的特异结合有效的把组装大量酶的量子点连接到氧化锌金电极上构建生物/化学传感器，成功的起到了增强信号的作用。降低了抗原的检测限，缩短了检测时间。
四、附图说明
图1本发明的技术流程图。
图2运用本发明的测试技术利用四层HRP组装的量子点进行AFP抗原测试得出的抗原浓度与加过氧化氢前后时间电流曲线在第200秒的电流差的线性关系图。横坐标为AFP抗原浓度，单位为ng/mL，纵坐标为加过氧化氢前后时间电流曲线在第200秒的电流差，单位μA。
五、具体实施方式
实施例1：
第一步：在金丝或铂丝一端烧熔成一个小球，再在小球表面蒸镀一层约200纳米厚的锌，放在管式炉里在300℃左右氧化1小时，取出后用2M KOH煮沸2小时，取出后用去离子水清洗，再放置于含30％(体积比)H2O2的H2SO4中30分钟后取出，再用去离子水清洗，室温干燥。
第二步：将锌粉末和去离子水混合超声20分钟，静置30分钟，倾去水，把锌粉末和水按1∶100(质量比)混合转移至高压釜中，静置至无悬浮颗粒，将第一步处理过的金或铂浸入水中，不触及高压釜底部的锌粉。密封，使其能承受最大压力不小于1.5×105Pa，加热至80℃～95℃，保持12小时。自然冷却至室温，取出，用去离子水清洗，得到生长有直径60～200纳米氧化锌的电极。
第三步：利用氧化锌的高等电点(PI＝9.4)把第二步制得的电极在中性条件下浸入含有0.5M NaCl的1毫克/毫升PSS溶液中50分钟，取出用去离子水清洗，再在30℃时浸入0.012毫克/毫升的抗体溶液中2小时，清洗。再在0.01毫克/毫升的牛血清蛋白(BSA)溶液中浸30分钟，清洗。即得组装抗体的氧化锌纳米棒电极，此电极在不用时放置冰箱中4℃保存。
第四步：将醋酸锌溶于乙醇溶液中制成20毫升0.1M溶液，搅拌加入2克聚乙烯吡咯烷酮，得到量子点前驱体溶液。40～60℃时剧烈搅拌滴加20毫升0.5M氢氧化钠乙醇溶液。滴加完毕衡温搅拌1～2小时。离心分离，用乙醇清洗三次，水洗三次，得氧化锌量子点。
第五步：在1毫升含0.5M NaCl的1毫克/毫升的PSS溶液中加入1毫克第四步制得的氧化锌量子点，超声分散30分钟，离心分离，用水洗两次。再加200微升1毫克/毫升的辣根过氧化物酶溶液，摇振2小时，离心分离，用水洗两次。
第六步：重复第五步3～5次，得多层修饰量子点。向量子点中加入1毫升含0.5M NaCl的1毫克/毫升的PSS溶液，摇振2小时，用水洗两次，加200微升0.012毫克/毫升的抗体溶液30℃摇振2小时，离心分离，用水洗两次，加200微升0.01毫克/毫升BSA摇振30分钟，离心分离，用水洗两次。得修饰有抗体的多层组装辣根过氧化物酶的氧化锌量子点。
第七步：将第六步制得的量子点分散到1毫升特定浓度的抗原溶液中，并将第三步制得的电极浸入此抗原溶液中，35℃温育30分钟，取出用水清洗。
第八步：将第七步制得的电极作为工作电极，铂丝电极作为对电极，银/氯化银电极作为参比电极，利用电化学工作站检测辣根过氧化物酶对双氧水的催化电化学信号。
第九步：改变抗原浓度，重复第七步和第八步，建立辣根过氧化物酶对双氧水催化电化学信号与抗原浓度之间的关系。
实施例2：
第一步：将直径0.5毫米的金丝的一端烧熔成一个直径约1.2毫米的小球，在小球表面蒸镀一层约200纳米厚的锌，放入管式炉里300℃氧化1小时，取出后用2M KOH煮沸2小时，取出后用去离子水清洗，再放置于含30％H2O2的H2SO4(体积比)中30分钟后取出，再用去离子水清洗。
第二步：将锌粉末和去离子水混合超声20分钟，静置30分钟，倾去水，把锌粉末和水按1∶100(质量比)混合转移至高压釜中，静置至无悬浮颗粒，将第一步处理过的金丝浸入水中，不触及高压釜底部的锌粉。密封，使其能承受最大压力不小于1.5×105Pa，加热至90℃，保持12小时。自然冷却至室温，取出，用去离子水清洗，得到生长有直径约100纳米氧化锌棒的电极。
第三步：将上步所得电极浸入含有0.5M NaCl的1毫克/毫升PSS溶液中50分钟，取出用去离子水清洗，再在30℃时浸入0.012毫克/毫升的肝癌首选标志物α-胎蛋白(AFP)抗体溶液中2小时，清洗，再在0.01毫克/毫升BSA溶液中浸泡30分钟，清洗。即得组装有AFP抗体的氧化锌纳米棒电极，此电极在不用时放置冰箱中4℃保存。
第四步：将醋酸锌溶于乙醇溶液中制成20毫升0.1M溶液，搅拌加入2克聚乙烯吡咯烷酮，得到量子点前驱体溶液。40～60℃时剧烈搅拌滴加20毫升0.5M氢氧化钠乙醇溶液。滴加完毕衡温搅拌1～2小时。离心分离，用乙醇清洗三次，水洗三次，得直径约10纳米的氧化锌量子点。
第五步：在1毫升含0.5M NaCl的1毫克/毫升的PSS溶液中加入1毫克第四步制得的氧化锌量子点，超声分散30分钟，离心分离，用水洗两次。再加200微升1毫克/毫升的辣根过氧化物酶溶液，摇振2小时，离心分离，用水洗两次。
第六步：分别重复第五步2～5次，得系列1～4层修饰量子点。向量子点中加入1毫升含0.5M NaCl的1毫克/毫升的PSS溶液，摇振2小时，用水洗两次，加200微升0.012毫克/毫升的AFP抗体溶液30℃摇振2小时，离心分离，用水洗两次，再加200微升0.01毫克/毫升BSA溶液摇振30分钟。离心分离，用水洗两次。得系列修饰有抗体的多层组装辣根过氧化物酶的氧化锌量子点。
第七步：将第六步制得的量子点分别分散到1毫升浓度分别为100纳克/毫升AFP抗原溶液中，并将第三步制得的电极浸入此抗原溶液中，35℃温育30分钟，取出用水清洗。
第八步：将第七步制得的一系列电极作为工作电极，铂丝电极作为对电极，银/氯化银电极作为参比电极，利用电化学工作站(CHI660C)检测辣根过氧化物酶对5mM双氧水的催化电化学信号，记录加入过氧化氢前后的时间电流曲线在200秒时的电流值的差值。
第九步：建立量子点修饰层数与加入5mM双氧水前后时间电流曲线在200秒时的差值的对应关系，发现修饰层数从1～4层时电流差值接近线性增加，大于4层时增加趋势减缓。
实施例3：
第一步：将直径0.5毫米的金丝的一端烧熔成一个直径约1.2毫米的小球，在小球表面蒸镀一层约200纳米厚的锌，放入管式炉里300℃氧化1小时，取出后用2M KOH煮沸2小时，取出后用去离子水清洗，再放置于含30％H2O2的H2SO4(体积比)中30分钟后取出，再用去离子水清洗。
第二步：将锌粉末和去离子水混合超声20分钟，静置30分钟，倾去水，把锌粉末和水按1∶100(质量比)混合转移至高压釜中，静置至无悬浮颗粒，将第一步处理过的金丝浸入水中，不触及底部的锌粉。密封，加热至90℃，保持12小时。自然冷却至室温，取出，用去离子水清洗，得到生长有直径约100纳米氧化锌棒的电极。
第三步：将上步所得电极浸入含有0.5M NaCl的1毫克/毫升PSS溶液中50分钟，取出用去离子水清洗，再在30℃时浸入0.012毫克/毫升的肝癌首选标志物α-胎蛋白(AFP)抗体溶液中2小时，清洗，再在0.01毫克/毫升BSA溶液中浸泡30分钟，清洗。即得组装有AFP抗体的氧化锌纳米棒电极，此电极在不用时放置冰箱中4℃保存。
第四步：将醋酸锌溶于乙醇溶液中制成20毫升0.1M溶液，搅拌加入2克聚乙烯吡咯烷酮，得到量子点前驱体溶液。40～60℃时剧烈搅拌滴加20毫升0.5M氢氧化钠乙醇溶液。滴加完毕衡温搅拌1～2小时。离心分离，用乙醇清洗三次，水洗三次，得直径约10纳米的氧化锌量子点。
第五步：在1毫升含0.5M NaCl的1毫克/毫升的PSS溶液中加入1毫克第四步制得的氧化锌量子点，超声分散30分钟，离心分离，用水洗两次。再加200微升1毫克/毫升的辣根过氧化物酶溶液，摇振2小时，离心分离，用水洗两次。
第六步：重复第五步4次，得4层修饰量子点。向量子点中加入1毫升含0.5M NaCl的1毫克/毫升的PSS溶液，摇振2小时，用水洗两次，加200微升0.012毫克/毫升的AFP抗体溶液30℃摇振2小时，离心分离，用水洗两次，再加200微升0.01毫克/毫升BSA溶液摇振30分钟。离心分离，用水洗两次。得修饰有抗体的多层组装辣根过氧化物酶的氧化锌量子点。
第七步：将第六步制得的量子点分别分散到1毫升浓度分别为0纳克/毫升、1纳克/毫升、5纳克/毫升、50纳克/毫升、100纳克/毫升、200纳克/毫升、400纳克/毫升、600纳克/毫升、800纳克/毫升、1000纳克/毫升AFP抗原溶液中，并将第三步制得的电极浸入此抗原溶液中，35℃温育30分钟，取出用水清洗。
第八步：将第七步制得的一系列电极作为工作电极，铂丝电极作为对电极，银/氯化银电极作为参比电极，利用电化学工作站(CHI660C)检测辣根过氧化物酶对5mM双氧水的催化电化学信号，记录加入过氧化氢前后的时间电流曲线在200秒时的电流值的差值。
第九步：建立抗原浓度与加入5mM双氧水前后时间电流曲线在200秒时的差值的对应关系，计算其线性范围的线性斜率确定对抗原浓度检测的灵敏度。计算结果其灵敏度为0.1微安/纳克/毫升。检测限为0.2纳克/毫升。曲线在AFP抗原浓度在5纳克/毫升到600纳克/毫升之间显示良好的线性关系。
Claims (4)
1.一种利用氧化锌量子点进行免疫测定的方法，其特征在于测定步骤为：
第一步：将直径0.3～0.7毫米的电极金属丝一端烧熔成一个直径0.8～1.2毫米的小球，再在小球表面蒸镀一层100～300纳米厚的锌，放在管式炉里在250～350℃氧化30～60分钟，取出后用1.5～2.5M KOH溶液煮沸1～3小时，取出后用去离子水清洗，再放置于含H2O2体积百分数为10％～30％的H2SO4中30～60分钟后取出，再用去离子水清洗，室温干燥；
第二步：将锌粉末和去离子水混合超声10～20分钟，静置30～60分钟，倾去水，把锌粉末和水按质量比0.5～1∶100混合转移至高压釜中，静置至无悬浮颗粒，将第一步处理过的电极金属丝浸入水中，不触及沉在高压釜底部的锌粉，密封，使其能承受最大压力不小于1.5×105Pa，加热至80～95℃，保持6～15小时，自然冷却至室温，取出，用去离子水清洗，得到生长有纳米氧化锌的电极；
第三步：利用氧化锌PI＝9.4的高等电点把第二步制得的电极在中性条件下浸入含有0.2～0.8M NaCl的1～2mg/mL聚苯乙烯磺酸钠溶液中1～4小时，取出用去离子水清洗，再在30～37℃时浸入0.01～0.02mg/mL的抗体溶液中1～3小时，去离子水清洗后即得组装抗体的氧化锌纳米棒电极；
第四步：配制0.01～0.1M醋酸锌的乙醇溶液，搅拌加入聚乙烯吡咯烷酮，加入量为0.1～1克聚乙烯吡咯烷酮/10mL溶液，得到量子点前驱体溶液，40～60℃时搅拌滴加与量子点前驱体溶液等体积的0.05～0.5M氢氧化钠乙醇溶液，添加完毕后恒温搅拌1～2小时，离心分离，用乙醇和去离子水交替清洗得氧化锌量子点；
第五步：按0.2～2mg/mL的比例将第四步制得的氧化锌量子点分散到含0.2～0.8M NaCl的1～2mg/mL聚苯乙烯磺酸钠溶液中，超声分散30～60分钟，离心分离，用水清洗后加1～2mg/mL辣根过氧化物酶溶液200微升，摇振2～6小时，离心分离，用水清洗；
第六步：重复第五步3～5次，得多层修饰量子点，向量子点中加入1～2mg/mL含0.2～0.8M NaCl的的聚苯乙烯磺酸钠溶液1毫升，摇振1～2小时，用水清洗后加0.01～0.02mg/mL的抗体溶液200微升，30～37℃摇振1～3小时，离心分离，用水清洗后得修饰有抗体的多层组装辣根过氧化物酶的氧化锌量子点；
第七步：将第六步制得的量子点分散到1毫升0.1纳克/毫升～1微克/毫升的抗原溶液中，并将第三步制得的电极浸入此抗原溶液中，30～37℃温育20～30分钟，取出用水清洗得；
第八步：将第七步制得的电极作为工作电极，铂丝电极作为对电极，银/氯化银电极作为参比电极，组成三电极体系，用pH＝7的0.01～0.1M磷酸氢钠、磷酸二氢钠缓冲溶液作为电解液构建生物/化学传感器，连接电化学工作站，检测得到辣根过氧化物酶对双氧水的催化电化学信号。
2.根据权利要求1所述的利用氧化锌量子点进行免疫测定的方法，其特征在于还包括检测得到辣根过氧化物酶对双氧水的催化电化学信号后，改变第七步中抗原的浓度，重复第七步和第八步，建立修饰的工作电极对加入双氧水前后的时间电流响应曲线在200秒时的差值与抗原浓度之间的线性关系。
3.根据权利要求1所述的利用氧化锌量子点进行免疫测定的方法，其特征在于所述抗体为肝癌首选标志物α-胎蛋白，所述抗原为肝癌补充标志物癌胚抗原或胰腺癌首选标志物血清糖链抗原。
4.根据权利要求1所述的利用氧化锌量子点进行免疫测定的方法，其特征在于步骤一中所述电极金属丝为金丝或铂丝。
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