CN101525606A

CN101525606A - 一种纤维素酶的制备方法

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Publication number: CN101525606A
Application number: CN200910043197A
Authority: CN
Inventors: 田蔚
Original assignee: CHANGSHA WEILONG BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: CHANGSHA WEILONG BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2009-04-23
Filing date: 2009-04-23
Publication date: 2009-09-09
Anticipated expiration: 2029-04-23
Also published as: CN101525606B

Abstract

一种纤维素酶的制备方法，其包括以下步骤：(1)培养皿液体菌种制备；(2)三角瓶种曲培养；(3)固态厚层通风发酵培养；(4)精制提纯。本发明采用制备液体菌种、固态厚层通风发酵培养制取高活力纤维素酶，在不增加生产成本前提下，酶活力可以达到90000IU/g以上。

Description

一种纤维素酶的制备方法

技术领域

本发明涉及一种纤维素酶的制备方法，尤其是涉及一种高活力纤维素酶的制备方法。

背景技术

纤维素类物质是自然界中最廉价、最丰富的一类可再生资源。全世界的物体生成量每年高达1500亿吨干物质，其中一半以上为纤维素和半纤维素。如果将天然纤维素降解为可利用的糖类物质，再进一步转化为乙醇、菌体蛋白、气体燃料(如氢气)等物质，对解决当今世界所面临的环境污染、粮食短缺、饲料资源紧张和能源危机等问题具有重大现实意义。而降解纤维素效果最好的降解剂是纤维素酶。纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，它们协同作用，将纤维素降解为寡糖和纤维二糖，最终水解为葡萄糖。自然界存在许多产纤维素酶的生物。

纤维素酶(酵素)制剂应用领域广泛，主要有以下几个方面：

1)食品工业：用酶处理植物农副产品，可使细胞软化、膨胀和崩渍，从而改变细胞壁的通透性，提高蛋白质、淀粉、油脂、糖类的提取率，改善质量，简化加工工艺。

2)酿造工业：用于啤酒生产，可增加麦汁发酵糖产量，提高过滤速度，消除凝固沉淀；用于白酒和酒精生产，可提高出酒率；用于酱油酿造，可提高产量，改善质量，缩短生产周期。

3)饲料工业：可提高秸杆等农副产品的利用率，促进畜禽消化吸收，增加出肉率，降低畜禽死亡率。

4)纺织工业：用于棉、麻纺织品的后整理工艺，减少绒毛和起球，使织物表面光洁平整，纹理清晰，触感好，光泽及柔韧性明显提高。

5)洗涤工业：替代传统的蛋白质，能将非结晶的水合纤维素分子分解破坏，软化纤维素分子与水组成的胶状结构，从而彻底清除封闭在纤维内部的污渍，并能使棉织物光亮、柔软如新。

6)造纸工业：与其它酶一起可实现酶法脱墨，代替传统的化学脱墨，改善以废纸为原料生产的纸张质量，同时大大减少化学试剂排放造成的环境污染。

7)生物能源：可利用纤维素酶将人类活动产生的纤维素类物质降解成简单糖，再由简单糖发酵生产乙醇，将大大地缓解目前的能源不足。

总之，使用纤维素酶制剂，可以提高产品产量和质量，降低生产成本；酶作为生物催化剂，使复杂的化学合成和复杂的分子分裂的生物过程在更为温和的条件下进行，能减少和替代强酸、强碱和强氧化剂，减轻排污，降低BOD和COD指标。由于酶是蛋白质，能百分之百生物降解，不会对环境造成危害，因此，市场前景相当广阔。

纤维素酶生产的方法目前主要有两类：液体发酵培养，固态发酵培养。固态培养设备比较简单，操作简单，容易推广，但是容易污染杂菌。液态深层培养方法条件容易控制，不易污染杂菌，生产效率相对较高，但是一次性投资大。目前，不管采用哪种方法培养制取纤维素酶，酶活力很难超过50000IU/g。

发明内容

本发明的目的在于克服现有纤维素酶制备方法存在的上述缺陷，提供一种活力高、生产成本低、应用范围广的纤维素酶制备方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：采用液态制种、固态厚层通风发酵培养法，工艺流程包括试管斜面菌种→培养皿平板培养→三角瓶曲种培养→厚层通风培养→出箱→打碎晾干→加水浸泡→压滤→调节pH→离心→调pH→冷却→加乙醇沉淀→离心分离→浓酒精洗涤→低温干燥→粉碎包装。

以下介绍具体操作步骤：(1)培养皿液体菌种制备：试管斜面菌种为绿色木霉；试管培养基配方，(NH₄)₂SO₄0.2-0.5g，NaNO₃0.1-0.2g，K₂HPO₄0.1-0.15g，MgSO₄·7H₂O0.05-0.08g，琼脂1.0-1.5g，自来水99-101mL，合计总重102g；上述配料混匀后分放于培养皿，0.1MPa灭菌30-35min，备用；接种与培养：将试管斜面菌种用接种环移取一环于无菌水中，制成孢子悬浮液，接种于培养皿，置于30℃±1℃恒温培养70-72h，取出保存；(2)三角瓶种曲培养：培养基制备，培养基配方为：麸皮75-85g，米糠15-25g，(NH₄)₂SO₄0.25-0.35g，NaNO₃0.10-0.15g，MgSO₄0.05-0.10g，K₂HPO₄0.05-0.10g，水1480-1520mL，合计总重1600g；制备：将麸皮和米糠拌匀，计算好水量，将(NH₄)₂SO₄、NaNO₃、MgSO₄、MgSO₄溶于水，拌入麸皮和米糠混合料(简称麸料)，搅匀后，装入已灭菌三角瓶，每500mL三角瓶装湿料40-50g，0.1Mpa灭菌30-35min，冷却，备用；接种与培养：将培养皿菌种接入所述三角瓶培养基中，置于30℃恒温箱培养70-72h，长好后取出，在40℃下干燥，备用；(3)固态厚层通风发酵培养：培养基配方：麸皮70-80g，米糠15-20g，羧甲基纤维素0.15-0.2g，(NH₄)₂SO₄0.05-0.1g，MgSO₄0.05-0.10g，K₂HPO₄0.1-0.15g，水1480-1520mL，合计总重1600g；制备：先将羧甲基纤维素与MgSO₄等无机盐溶解于水中，调pH至4.5，拌入原料，搅拌均匀，于常压下，95-100℃杀菌1h，闷料30-40min；接种与培养：待麸料冷却至30-38℃时，将三角瓶曲种接入拌匀，以麸料重量为计算基数，接种量为0.35wt％～0.45wt％；装箱温度为30～35℃，厚度25～35cm，在整个培养过程中，控制品温一般在30～35℃，最高不超过37℃；根据整个培养过程合理使用室内循环风和新鲜风比例，控制室内相对湿度为85％-95％，培养时间40～50h，出箱后，打碎晾干，成曲纤维素酶活力要求在6000IU/g干粉以上；(4)精制提纯：将麸曲先经粉碎，用2.5-3.5倍重量的水在30～35℃温度下浸泡1.5-2h后，压滤，取得酶液再重复浸麸曲，再经压滤，取得较浓的酶液，用10-15％的HCl调节pH至2.9-3.1，在10-20℃下静置0.4-0.6h，静置后离心，去除大部分子孢子及与酶无关的杂质，取上层清液再将pH调至4.3-4.5，同时将酶液和酒精分别冷却至5～7℃；将酶液倒入乙醇内迅速搅匀，使酶液浓度保持在60-65wt％，沉淀1.8-2.2h，待沉淀完全后，用离心机离心，分离沉淀，取得沉淀再用96％乙醇洗涤2～3次，在25-30℃的低温下干燥，粉碎，即得纤维素酶粉剂。

所述绿色木霉(Trichoderma viride)为公知常见微生物(参见《酶制剂工业》下册，张树政主编，科学出版社1998年第三次印刷，第609页)。

使用本发明制备的纤维素酶，在不增加生产成本的前提下，酶活力可以达到90000IU/g以上(酶活力检测方法采用CMC糖化力法(参见《酶制剂工业》下册，张树政主编，科学出版社1998年第三次印刷，第608页)。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

(1)培养皿绿色木霉液体菌种制备：试管培养基配方，(NH₄)₂SO₄0.3g，NaNO₃0.15g，K₂HPO₄0.1g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，琼脂1.0g，自来水100.4mL，合计总重102g；上述配料混匀后分放于培养皿，0.1MPa灭菌30min，备用；接种与培养：将试管斜面菌种用接种环移取一环于无菌水中，制成孢子悬浮液，接种于培养皿，置于30℃±1℃恒温培养70h，取出保存；(2)三角瓶种曲培养：培养基制备，培养基配方为：麸皮75g，米糠20g，(NH₄)₂SO₄0.30g，NaNO₃0.15g，MgSO₄0.05g，K₂HPO₄0.10g，水1504.4mL，合计总重1600g；制备：将麸皮和米糠拌匀，计算好水量，将(NH₄)₂SO₄、NaNO₃、MgSO₄、MgSO₄溶于水，拌入麸皮和米糠混合料(简称麸料)，搅匀后，装入已灭菌三角瓶，每500mL三角瓶装湿料40g，0.1Mpa灭菌30min，冷却，备用；接种与培养：将培养皿菌种接入所述三角瓶培养基中，置于30℃恒温箱培养70h，长好后取出，在40℃下干燥，备用；(3)固态厚层通风发酵培养：培养基配方：麸皮70g，米糠20g，羧甲基纤维素0.2g，(NH₄)₂SO₄0.10g，MgSO₄0.10g，K₂HPO₄0.10g，水1509.5mL，合计总重1600g；制备：先将羧甲基纤维素、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄、K₂HPO₄溶解于水中，调pH至4.5，拌入原料，搅拌均匀，于常压下，95℃杀菌1h，闷料35min；接种与培养：待麸料冷却至36℃时，将三角瓶曲种接入拌匀，以麸料重量为计算基数，接种量为0.45wt％；装箱温度为32℃，厚度30cm，在整个培养过程中，控制品温32℃；根据整个培养过程合理使用室内循环风和新鲜风比例，控制室内相对湿度为90％，培养时间45h，出箱后，打碎晾干，成曲纤维素酶活力6500IU/g干粉；(4)精制提纯：将麸曲先经粉碎，用3倍重量的水在32℃下浸泡1.5h后，压滤，取得酶液再重复浸麸曲，再经压滤，取得较浓的酶液，用10％的HCl调节pH至3，在15℃下静置0.5h，静置后离心，去除大部分子孢子及与酶无关的杂质，取上层清液再将pH调至4.4，同时将酶液和酒精分别冷却至6℃；将酶液倒入乙醇内迅速搅匀，使酶液浓度保持在65wt％，沉淀2h，待沉淀完全后，用离心机离心，分离沉淀，取得沉淀再用96％乙醇洗涤3次，在25℃下干燥，粉碎，即得纤维素酶粉剂。

按照“CMC糖化力”检测方法检测，酶活力达到90900IU/g。

实施例2

(1)培养皿绿色木霉液体菌种制备：试管培养基配方，(NH₄)₂SO₄0.5g，NaN0₃0.2g，K₂HPO₄0.15g，MgSO₄·7H₂O 0.08g，琼脂1.2g，自来水99.87mL，合计总重102g；上述配料混匀后分放于培养皿，0.1MPa灭菌35min，备用；接种与培养：将试管斜面菌种用接种环移取一环于无菌水中，制成孢子悬浮液，接种于培养皿，置于30℃±1℃恒温培养71h，取出保存；(2)三角瓶种曲培养：培养基制备，培养基配方为：麸皮85g，米糠25g，(NH₄)₂SO₄0.35g，NaNO₃0.15g，MgSO₄0.10g，K₂HPO₄0.10g，水1489.3mL，合计总重1600g；制备：将麸皮和米糠拌匀，计算好水量，将(NH₄)₂SO₄、NaNO₃、MgSO₄、MgSO₄溶于水，拌入麸皮和米糠混合料(简称麸料)，搅匀后，装入已灭菌三角瓶，每500mL三角瓶装湿料50g，0.1Mpa灭菌35min，冷却，备用；接种与培养：将培养皿菌种接入所述三角瓶培养基中，置于30℃恒温箱培养72h，长好后取出，在40℃下干燥，备用；(3)固态厚层通风发酵培养：培养基配方：麸皮80g，米糠20g，羧甲基纤维素0.2g，(NH₄)₂SO₄0.1g，MgSO₄0.10g，K₂HPO₄0.1g，水1499.5mL，合计总重1600g；制备：先将羧甲基纤维素与MgSO₄等无机盐溶解于水中，调pH至4.5，拌入原料，搅拌均匀，于常压下，96℃杀菌1h，闷料40min；接种与培养：待麸料冷却至32℃时，将三角瓶曲种接入拌匀，以麸料重量为计算基数，接种量为0.35wt％；装箱温度为30℃，厚度25cm，在整个培养过程中，控制品温在31℃；根据整个培养过程合理使用室内循环风和新鲜风比例，控制室内相对湿度为95％，培养时间40h，出箱后，打碎晾干，成曲纤维素酶活力要求在6300IU/g干粉；(4)精制提纯：将麸曲先经粉碎，用2.5倍重量的水在30℃温度下浸泡2h后，压滤，取得酶液再重复浸麸曲，再经压滤，取得较浓的酶液，用10％的HCl调节pH至2.9，在10℃下静置0.4h，静置后离心，去除大部分子孢子及与酶无关的杂质，取上层清液再将pH调至4.3，同时将酶液和酒精分别冷却至5℃；将酶液倒入乙醇内迅速搅匀，使酶液浓度保持在60wt％，沉淀2h，待沉淀完全后，用离心机离心，分离沉淀，取得沉淀再用96％乙醇洗涤2次，在26℃干燥，粉碎，即得纤维素酶粉剂。

按照“CMC糖化力”检测方法检测，酶活力达到91200IU/g。

Claims

1.一种纤维素酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)培养皿液体菌种制备：试管斜面菌种为绿色木霉；试管培养基配方，(NH₄)₂SO₄ 0.2-0.5g，NaNO₃ 0.1-0.2g，K₂HPO₄ 0.1-0.15g，MgSO₄·7H₂O 0.05-0.08g，琼脂1.0-1.5g，自来水99-101mL，合计总重102g；所述配料混匀后分放于培养皿，0.1MPa灭菌30-35min，备用；接种与培养：将试管斜面菌种用接种环移取一环于无菌水中，制成孢子悬浮液，接种于培养皿，置于30℃±1℃恒温培养70-72h，取出保存；(2)三角瓶种曲培养：培养基制备，培养基配方为：麸皮75-85g，米糠15-25g，(NH₄)₂SO₄ 0.25-0.35g，NaNO₃ 0.10-0.15g，MgSO₄ 0.05-0.10g，K₂HPO₄ 0.05-0.10g，水1480-1520mL，合计总重1600g；制备：将麸皮和米糠拌匀，计算好水量，将(NH₄)₂SO₄、NaNO₃、MgSO₄、MgSO₄溶于水，拌入麸皮和米糠混合料(简称麸料)，搅匀后，装入已灭菌三角瓶，每500mL三角瓶装湿料40-50g，0.1Mpa灭菌30-35min，冷却，备用；接种与培养：将培养皿菌种接入所述三角瓶培养基中，置于30℃恒温箱培养70-72h，长好后取出，在40℃下干燥，备用；(3)固态厚层通风发酵培养：培养基配方：麸皮70-80g，米糠15-20g，羧甲基纤维素0.15-0.2g，(NH₄)₂SO₄ 0.05-0.1g，MgSO₄ 0.05-0.10g，K₂HPO₄ 0.1-0.15g，水1480-1520mL，合计总重1600g；制备：先将羧甲基纤维素、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄、K₂HPO₄、MgSO₄溶解于水中，调pH至4.5，拌入原料，搅拌均匀，于常压下，95-100℃杀菌1h，闷料30-40min；接种与培养：待麸料冷却至30-38℃时，将三角瓶曲种接入拌匀，以麸料重量为计算基数，接种量为0.35wt％～0.45wt％；装箱温度为30～35℃，厚度25～35cm，在整个培养过程中，控制品温30～37℃；根据整个培养过程合理使用室内循环风和新鲜风比例，控制室内相对湿度为85％-95％，培养时间40～50h，出箱后，打碎晾干，成曲纤维素酶活力在6000IU/g干粉以上；(4)精制提纯：将麸曲先经粉碎，用2.5-3.5倍重量的水在30～35℃温度下浸泡1.5-2h后，压滤，取得酶液再重复浸麸曲，再经压滤，取得酶液，用10-15％的HCl调节pH至2.9-3.1，在10-20℃下静置0.4-0.6h，静置后离心，取上层清液再将pH调至4.3-4.5，同时将酶液和酒精分别冷却至5～7℃；将酶液倒入乙醇内搅匀，使酶液浓度保持在60-65wt％，沉淀1.8-2.2h，待沉淀完全后，用离心机离心，分离沉淀，取得沉淀再用96％乙醇洗涤2～3次，在25-30℃的低温下干燥，粉碎，即得纤维素酶粉剂。