CN101525289B - 采用阴离子交换剂分离纯化银杏酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种采用阴离子交换剂分离纯化银杏酸的方法。该方法的特征为：含有银杏酸的料液，在非酸性条件下，用阴离子交换剂离子交换银杏酸至饱和，先用水洗去未与交换剂发生离子交换的残留料液，再用亲水性有机溶剂水溶液洗去与交换剂亲和力较银杏酸弱的杂质，最后用含有一定浓度阴离子的的亲水性有机溶剂水溶液洗脱银杏酸，洗脱液调pH值后，经减压回收溶剂、真空浓缩、干燥成银杏酸成品。本发明构思新颖，工艺简单，提取效率高，生产成本低，具有较大推广性。

Description

采用阴离子交换剂分离纯化银杏酸的方法

技术领域

本发明涉及一种天然产物的分离纯化方法，更具体涉及一种采用阴离子交换剂制备天然产物银杏酸的方法。

背景技术

银杏(Ginkgo biloba L.)，又称公孙树、白果，系裸子植物门银杏科植物，现存1属1科1种，素有“活化石”、“植物界的熊猫”之称，入选中国卫生部首批药食同源中药材名录。银杏树是中国特有的珍稀名贵树种，中国的银杏资源占世界总量的70％，1984年被列为国家二级保护植物[李中新等，银杏酚酸及其防治农业害虫研究进展，山东农业大学学报(自然科学版)，2007，38(4)，654-656]。

银杏果和银杏叶均有很高的药用价值和食用价值，现代药理研究表明，其活性成份主要有黄酮、内酯、银杏酸及聚戊烯醇等4种，黄酮和内酯对心脑血管疾病、老年性外周循环障碍、老年痴呆症有很好的疗效，银杏酸和聚戊烯醇具有明显的抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗病毒和抗炎活性。

由于银杏酸具有免疫毒性、胚胎毒性和细胞毒性等毒副作用，会引起漆毒样皮炎等致敏反应，因此，银杏酸含量被作为国内外银杏叶提取物制剂的监控指标，其含量被严格限定在5ppm以下。但是，目前国内生产的银杏叶提取物制剂的银杏酸含量常常超标，甚至高达2000ppm以上(专利申请200710049086.7)，严重制约了银杏叶提取物制剂的安全使用和正常出口，因此，研究脱除银杏叶提取物中的银杏酸十分迫切。

专利申请(02113529.0和200710049086.7)涉及了树脂吸附法脱除银杏叶提取物中银杏酸的工艺，专利申请(02113531.2、01133794.X、03131915.7和200610093940.5)涉及了有机溶剂萃取法脱除银杏叶提取物中银杏酸的工艺。但是，迄今为止尚未见到采用离子交换法脱除银杏叶提取物中银杏酸或者采用离子交换法分离制备银杏酸的资讯报道。

目前，国际上对银杏叶的黄酮和内酯成分的研究比较成熟，仅中国就可年产银杏叶提取物浸膏200吨，但对银杏酸和聚戊烯醇的研究较少，尤其是从银杏叶、银杏果和银杏外种皮中制备银杏酸的工作才刚刚起步。

银杏酸广泛存在于银杏叶(占干重的1～2％)、银杏果和银杏外种皮(占干重的3～5％)中，尤其以银杏外种皮中含量最高。银杏外种皮是银杏种子硬壳外面的部分，约占整个种子的70％，在产地采收白果时，往往将其作为废料丢弃，这不仅浪费资源、污染环境，甚至会引起人畜中毒。

由于银杏酸具有强烈的杀虫、抑菌、抗肿瘤、抗病毒、抗炎和抗氧化等活性，可望进一步开发成植物源农药和创新药物(专利申请200610085571.5、200610027601.7和ZL200610024040.5)。假如与生产过程中去除银杏酸结合起来，将生产银杏叶提取物制剂过程中含银杏酸的废料作为提制银杏酸产品的原料，不仅可以解决工业化生产的污染问题，也将为这些废料提供良好的应用前景[臧丽等，银杏酚酸的研究概况，中国医药工业杂志，2000，31(7)：45-48]。

目前，常用的银杏酸提制方法主要有：非极性有机溶剂萃取、超临界二氧化碳萃取、硅胶柱层析纯化、制备色谱多次分离等[沈刚等，超临界流体萃取和高效液相色谱法测定银杏酸，分析化学，2000，28(8)：985-988；吴向阳等，银杏酸单体制备及其抗菌活性，林产化学与工业，2003，23(4)：17-21；张小利等，银杏酸的分离制备及HPLC分析，中药材，2003，28(3)：557-559；倪学文等，大孔吸附树脂提取纯化银杏酚酸的研究，中草药，2003，34(3)：231-233；倪学文等，银杏外种皮银杏酚酸的提取方法及其体外抗肿瘤活性，江苏农业科学，2006(5)：151-153]。但是，采用这种亲脂性有机溶剂萃取、硅胶柱层析纯化或HPLC制备色谱多次分离等方法制备银杏酸的工艺，明显存在着溶剂的渗透性不强、溶剂和硅胶耗量大、溶剂毒性大、制备成本和设备投资大、不易实施的缺点。即使是所述的大孔吸附树脂提取纯化工艺，也存在着银杏酸的得率和纯度较低的缺点，亟待改进。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述背景技术的不足。本发明提供一种采用阴离子交换剂分离纯化银杏酸的方法，该方法不仅设备简单、分离效果好、产品收率高，而且离子交换剂使用寿命长、生产成本低。

本发明的采用阴离子交换剂分离纯化银杏酸的方法是这样实现的：含有银杏酸的料液，在非酸性条件下，用阴离子交换剂离子交换银杏酸至饱和，先用水洗去未与交换剂发生离子交换的残留料液，再用亲水性有机溶剂水溶液洗去与交换剂亲和力较银杏酸弱的杂质，最后用含有一定浓度阴离子的的亲水性有机溶剂水溶液洗脱银杏酸，洗脱液调pH值后，经减压回收溶剂、真空浓缩、分离上层油状物、干燥成银杏酸成品。

所述的含有银杏酸的料液可以是采用碱性亲水性有机溶剂水溶液从含有银杏酸的物料中充分热溶后获得的料液。

本发明可以解决上述现有技术的不足。从银杏酸的结构可见，银杏酸为水杨酸类衍生物，属于脂溶性物质，极性较弱，易溶于石油醚、正己烷、苯等非极性溶剂，难溶于水、甲醇、乙醇等极性溶剂中。但是，由于银杏酸结构中含有极性的酚羟基和羧基，呈现出弱酸性特点，虽然在非极性有机溶剂中易溶、在极性有机溶剂中溶解度难溶、在水中基本不溶，但银杏酸在碱性亲水性有机溶剂中溶解度明显增大，如果选择到合适的条件，则有望采用离子交换法分离制备银杏酸。

银杏酸(Ginkgolic acids，简称GA)的结构式

采用离子交换技术分离纯化银杏酸的主要依据是离子交换剂对银杏酸和杂质的亲和力不同。离子交换剂对银杏酸的亲和力主要取决于银杏酸的理化性质、交换剂的功能团特点以及溶液中其它杂质的影响。

由于银杏酸为弱酸性有机酸，在中性或碱性条件下，是以阴离子状态存在，根据离子交换理论，可选用阴离子交换树脂进行分离提取。各种一价离子对阴离子交换树脂的亲和力大小排序如下：采用强碱性树脂时，GA^-＜OH^-＜F^-＜HCO₃ ^-＜Cl^-＜HSO₃ ^-＜Br^-＜NO₃ ^-＜I^-＜ClO₄ ^-；采用弱碱性树脂时，GA^-＜F^-＜HCO₃ ^-＜Cl^-＜HSO₃ ^-＜Br^-＜NO₃ ^-＜I^-＜ClO₄ ^-＜OH^-。

本发明制备方法的主要优点之一在于：充分利用了非酸性条件下阴离子交换剂对目标活性物质银杏酸的亲和力与对蛋白质、多糖、氨基酸、色素、无机盐等杂质的亲和力的差异，以及一定浓度的洗脱剂溶液对吸附在离子交换树脂上的银杏酸与蛋白质、氨基酸、无机盐等杂质的洗脱能力的不同，真正达到了银杏酸与杂质的高效分离。

本发明制备方法的主要优点之二在于：巧妙利用了银杏酸在极性有机溶剂中溶解度较低，而在碱性亲水性有机溶剂中溶解度明显增大的特点，先用体积比不少于1倍树脂量的水洗去未发生离子交换的残留料液，再用体积比不少于1倍树脂量的30～50％亲水性有机溶剂水溶液洗去与树脂吸附力较银杏酸弱的杂质，最后用体积比不少于2倍树脂量的含有一定浓度阴离子的30～60％亲水性有机溶剂水溶液洗脱银杏酸的处理步骤，有利于在不降低银杏酸收率情况下提高银杏酸的纯度和品质，能大大缩短制备时间和降低制备成本。

本发明制备方法的主要优点之三在于：充分利用了碱性条件下银杏酸在亲水性有机溶剂中溶解度明显增大的特点，不采用常规的石油醚、正己烷等亲脂性有机溶剂助溶的方式，而采用碱性亲水性有机溶剂水溶液热溶的方式获得料液，大大提高了助溶溶剂的渗透性、降低了溶剂的耗用量和毒性、明显减少了制备成本和设备投资、利于实施工业化安全生产。

本发明制备方法的主要优点之四在于：与已有的文献相比，本发明充分利用了银杏酸在极性有机溶剂中溶解度较低，在水中基本不溶，而在碱性亲水性有机溶剂中溶解度明显增大的特点，不采用常规的石油醚等亲脂性有机溶剂萃取、超临界二氧化碳萃取、硅胶柱层析纯化和高效液相色谱制备等技术，而是直接采用碱性亲水性有机溶剂水溶液热溶、阴离子交换剂吸附、水洗除杂、亲水性有机溶剂水溶液除杂、含有一定浓度阴离子的的亲水性有机溶剂水溶液洗脱银杏酸的集成技术获得高纯度银杏酸，克服了背景技术存在的不足，有较大的推广性。

具体实施方式

含有银杏酸的料液，在非酸性条件下，用阴离子交换剂离子交换银杏酸至饱和，先用体积比不少于1倍树脂量的水洗去未发生离子交换的残留料液，再用体积比不少于1倍树脂量的30～50％亲水性有机溶剂水溶液洗去与树脂吸附力较银杏酸弱的杂质，最后用体积比不少于2倍树脂量的含有一定浓度阴离子的30～60％亲水性有机溶剂水溶液洗脱银杏酸，洗脱液经减压回收溶剂、真空浓缩、干燥成银杏酸成品。

所选用的亲水性有机溶剂可以是甲醇、丙酮、乙醇、丙醇或异丙醇中的一种或几种混合溶剂，优先选用甲醇或丙酮。优先选用甲醇或丙酮作为亲水性有机溶剂的优点是：相对于乙醇、丙醇或异丙醇等其它亲水性有机溶剂而言，甲醇和丙酮还具有一定的亲脂性，对具有两性性质的银杏酸的溶解性和洗脱效果更佳，而且甲醇或丙酮的沸点更低、减压回收溶剂时的能耗更小，能显著降低银杏酸产品的制备成本。

含有银杏酸的料液是来源于植物提取的含有银杏酸的提取物、生物合成或化学合成的含有银杏酸的物料、其它手段获得的含有银杏酸的物料中的一种或几种。可采用pH≥8.5的含水量≤60％的甲醇、乙醇或丙酮水溶液从含有银杏酸的物料中充分热溶后获得的料液。

所述亲水性有机溶剂水溶液中的阴离子是OH^-、Cl^-、F^-、Br^-、I^-、SO₄ ^2-或PO₄ ^3-无机离子中的一种或几种；所述亲水性有机溶剂水溶液中的阴离子的浓度为0～1.2mol/L。

本发明理化参数测定方法如下：

(1)银杏酸含量的测定：采用高效液相色谱法。测定条件：Agilent 1100型高效液相色谱仪(DAD二极管阵列检测器)，Waters Nova-Pak C₁₈色谱柱(Φ4.6×250mm，5μm)，流动相为甲醇∶0.2％磷酸水溶液(90∶10)，流速1.0ml/min，柱温34℃，检测波长310nm，进样量20μL。以银杏酸标准品(Sigma公司)为对照。

(2)银杏酸的定性分析：采用薄层层析法。测定条件：将硅胶G预制板(10×10cm，0.2mm)置于110℃烘箱中活化1h后，取出后点样约4μl，以石油醚∶乙酸乙酯∶乙酸(7∶3∶0.1)为展开剂，将板预饱和15min后展开，展开距离8cm，展开后置于254nm下观察，银杏酸显蓝色荧光，荧光显色后以碘蒸气显色可显现其它杂质。

经测定，本专利实施例的银杏酸回收率≥93.8％，银杏酸纯度≥86.5％。本专利制备的银杏酸纯品为无色油状或粉状的酸性物质，在石油醚中可析出针状结晶，熔点41～42℃。

本发明干燥方法如下：

(1)冷冻干燥条件：干燥温度-10～-60℃，升华温度35～70℃，压力0.05～0.18mbar，干燥时间20～40h。

(2)真空干燥条件：干燥温度45～75℃，压力-0.06～-0.095MPa，干燥时间15～50h

本文所提及的所有出版物、专利和其它参考文献均引入本文作为参考。

本发明制备方法的实施例陈述如下：

实施例1

pH 7.0的银杏酸浓度为2.8mg/ml的银杏叶乙醇提取物料液，用711强碱性阴离子交换树脂离子交换银杏酸至饱和，先用1倍树脂体积的水洗去未被树脂吸附的残留料液，再用3倍树脂体积的30％甲醇水溶液洗去与711树脂吸附力较银杏酸弱的杂质，最后用2倍树脂体积的pH 10.3的30％甲醇水溶液洗脱银杏酸组分，洗脱液调pH值至6.5后，经减压回收溶剂、真空浓缩、分离上层油状物、干燥成银杏酸成品。

实施例2

含银杏酸600ppm的银杏叶提取物浸膏，于65℃条件下，用6倍体积的pH 8.5的95％乙醇水溶液充分热溶后获得料液，采用银杏酸溶解度调节剂调整料液的pH 8.3、乙醇浓度48％和银杏酸浓度0.25mg/ml后，用D345弱碱性阴离子交换剂离子交换银杏酸至饱和，先用1倍树脂体积的水洗去未被树脂吸附的残留料液，再用1倍树脂体积的50％乙醇水溶液洗去与D345交换剂亲和力较银杏酸弱的杂质，最后用4.8倍树脂体积的pH 8.5的50％乙醇水溶液洗脱银杏酸组分，洗脱液调pH值至5.8后，经减压回收溶剂、真空浓缩、分离上层油状物、干燥成银杏酸成品

实施例3

含银杏酸2.1g/Kg的银杏叶提取物粉末，于60℃条件下，用3倍体积的pH 10.5的60％甲醇水溶液充分热溶后获得料液，采用银杏酸溶解度调节剂调整料液的pH 9.9、甲醇浓度42％和银杏酸浓度0.52mg/ml后，用701弱碱性阴离子交换树脂离子交换银杏酸至饱和，先用2倍树脂体积的水洗去未被树脂吸附的残留料液，再用1倍树脂体积的50％甲醇水溶液洗去与701树脂吸附力较银杏酸弱的杂质，最后用10倍树脂体积的pH 4.6的含有0.75mol/L Na₂SO₄的60％甲醇水溶液洗脱银杏酸组分，洗脱液经减压回收溶剂、真空浓缩、分离上层油状物、干燥成银杏酸成品。

实施例4

含银杏酸0.28％的银杏外种皮提取物粉末，于48℃条件下，用10倍体积的pH 11.0的43％丙醇水溶液充分热溶后获得料液，采用银杏酸溶解度调节剂调整料液的pH 9.5、丙醇浓度40％和银杏酸浓度0.70mg/ml后，用Dowex 1×2强碱性阴离子交换树脂离子交换银杏酸至饱和，先用1.5倍树脂体积的水洗去未被树脂吸附的残留料液，再用2倍树脂体积的pH 3.2的42％丙醇水溶液洗去与Dowex 1×2树脂吸附力较银杏酸弱的杂质，最后用5.7倍树脂体积的pH 8.8的42％丙醇水溶液洗脱银杏酸组分，洗脱液调pH值至7.3后，经减压回收溶剂、真空浓缩、分离上层油状物、干燥成银杏酸盐粉末。

实施例5

含银杏酸0.012％的银杏果匀浆，于35℃条件下，用5倍体积的pH 12.0的55％丙酮水溶液充分热溶后获得料液，用D315弱碱性阴离子交换树脂离子交换银杏酸至饱和，先用3.2倍树脂体积的水洗去未被树脂吸附的残留料液，再用2.8倍树脂体积的30％丙酮水溶液洗去与D315树脂吸附力较银杏酸弱的杂质，最后用4.8倍树脂体积的pH 9.2的30％丙酮水溶液洗脱银杏酸组分，洗脱液调pH值至5.5～7.0后，经减压回收溶剂、真空浓缩、分离上层油状物、干燥成银杏酸成品。

实施例6

pH 9.3的银杏酸浓度为3.9mg/ml的银杏外种皮提取液，用303×2弱碱性阴离子交换剂离子交换银杏酸至饱和，先用2.7倍树脂体积的水洗去未被树脂吸附的残留料液，再用1.5倍树脂体积的45％甲醇水溶液洗去与303×2交换剂亲和力较银杏酸弱的杂质，最后用6倍树脂体积的pH 8.3的45％甲醇水溶液洗脱银杏酸组分，洗脱液调pH值至7.5后，经减压回收溶剂、真空浓缩、干燥成银杏酸盐粉末。

实施例7

pH 7.4的银杏酸浓度为7.8mg/ml的银杏酸脱色液，用Amberlite IRA-404强碱性阴离子交换树脂离子交换银杏酸至饱和，先用1倍树脂体积的水洗去未被树脂吸附的残留料液，再用2.5倍树脂体积的40％异丙醇水溶液洗去与Amberlite IRA-404树脂吸附力较银杏酸弱的杂质，最后用3倍树脂体积的pH 8.9的40％异丙醇水溶液洗脱银杏酸组分，洗脱液调pH值至5.5～7.0后，经减压回收溶剂、真空浓缩、分离上层油状物、干燥成银杏酸成品。

实施例8

pH 10.8的银杏酸浓度为11.2mg/ml的银杏酸洗脱液，用Amberlite IRA-45弱碱性阴离子交换树脂离子交换银杏酸至饱和，先用3.6倍树脂体积的水洗去未被树脂吸附的残留料液，再用1倍树脂体积的50％的乙醇∶甲醇(2∶1)水溶液洗去与Amberlite IRA-45树脂吸附力较银杏酸弱的杂质，最后用8倍树脂体积的pH 5.0的含有1.2mol/L NH₄Cl的60％乙醇水溶液洗脱银杏酸组分，洗脱液调pH值至5.5～7.0后，经减压回收溶剂、真空浓缩、分离上层油状物、干燥成银杏酸成品。

实施例9

pH 6.8的银杏酸浓度为0.9mg/ml的发酵液，用711∶D301(1∶2，V/V)碱性阴离子交换树脂离子交换银杏酸至饱和，先用1.8倍树脂体积的水洗去未被树脂吸附的残留料液，再用3倍树脂体积的30％乙醇水溶液洗去与树脂吸附力较银杏酸弱的杂质，最后用2倍树脂体积的pH 10.2的30％乙醇水溶液洗脱银杏酸组分，洗脱液调pH值至5.5～7.0后，经减压回收溶剂、真空浓缩、分离上层油状物、干燥成银杏酸成品。

以上实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。

本发明构思新颖，工艺简单，产品品质高，生产成本低，可用于不同来源的银杏酸提取物的进一步分离纯化，具有较大的推广意义。

Claims (1)

1.一种采用阴离子交换剂分离纯化银杏酸的方法，其特征在于：含有银杏酸的料液，在非酸性条件下，用阴离子交换剂离子交换银杏酸至饱和，先用体积比不少于1倍树脂量的水洗去未发生离子交换的残留料液，再用体积比不少于1倍树脂量的30～50％亲水性有机溶剂水溶液洗去与树脂吸附力较银杏酸弱的杂质，最后用体积比不少于2倍树脂量的含有一定浓度阴离子的30～60％亲水性有机溶剂水溶液洗脱银杏酸，洗脱液经减压回收溶剂、真空浓缩、干燥成银杏酸成品；

所述的含有银杏酸的料液是以含有银杏酸的物料为原料，采用pH≥8.5的含水量≤60％的甲醇、乙醇或丙酮水溶液充分热溶后获得的料液；所述的含有银杏酸的料液是来源于植物提取的含有银杏酸的提取物、生物合成或化学合成的含有银杏酸的物料中的一种或几种；

所述亲水性有机溶剂是甲醇、丙酮、乙醇、丙醇或异丙醇中的一种或几种混合溶剂；

所述亲水性有机溶剂水溶液中的阴离子是OH^-、Cl^-、F^-、Br^-、I^-、SO₄ ^2-或PO₄ ^3-无机离子中的一种或几种；所述亲水性有机溶剂水溶液中的阴离子的浓度为0～1.2mol/L；

所述的阴离子交换剂为711强碱性阴离子交换剂、D345弱碱性阴离子交换剂、701弱碱性阴离子交换树脂、Dowex 1×2强碱性阴离子交换树脂、D315弱碱性阴离子交换树脂、303×2弱碱性阴离子交换剂、Amberlite IRA-404强碱性阴离子交换树脂、Amberlite IRA-45弱碱性阴离子交换树脂或D301弱碱性阴离子交换树脂中的一种或几种。