CN101524090B

CN101524090B - 一种甘草提取物的应用

Info

Publication number: CN101524090B
Application number: CN 200910038275
Authority: CN
Inventors: 罗建军; 胡美英; 钟国华; 郝卫宁; 何玥; 胡黎明
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2009-03-30
Filing date: 2009-03-30
Publication date: 2013-05-01
Anticipated expiration: 2029-03-30
Also published as: CN101524090A

Abstract

本发明公开了一种甘草提取物的应用，具体应用于防治植物病害。通过室内生物测定和盆栽试验，本发明提供了甘草的甲醇提取物对霜疫霉属(Peronophythora Chen)、疫霉属(Phytophthora capsiciLeonian)、芽枝霉属(Cladosporium LK.ex Fr)、核盘菌属(Sclerotinia)、炭疽菌属(Colletotrichum Corda)等属的常见植物病害良好的防治应用。本发明对甘草及其提取物用于防治植物病害的新用途提出了新的思路，为植物替代化学合成杀菌剂提供了新的开发资源，对解决病原菌对药剂日益突出的抗性问题具有重要的意义。

Description

一种甘草提取物的应用

技术领域

本发明属于植物杀菌剂技术领域，具体涉及一种甘草提取物在防治植物病害中的新用途。

背景技术

近年来，随着植物病理学、生物学等相关学科的不断发展，农药中杀菌剂的研究已进入了一个崭新的时期。高效内吸性杀菌剂如Strobilurn类杀菌剂的出现，一方面使植物病害的防治获得了突破性进展，另一方面也造成病原菌对药剂的抗性问题日益突出。寻求对环境相容性好，对病原菌具有持久效果的无公害农药，在绿色食品日益被重视的今天显得格外重要。

天然产物常表现出许多生物活性，数百年来广为人们所用。其中，植物源杀菌活性成分的研究和开发是解决当前化学杀菌剂诸多负面效应的一个重要研究方向。

植物是生物活性化合物的巨大天然宝库，其产生的次生代谢产物超过400000种，据报道，现在地球上的35万多种植物中，约有2400种植物具有控制有害生物的活性。多年以来，国内外科研工作者对多种植物如楝科Meliacea植物中米仔兰属Aglaia植物、樟科Lauraceae植物印度鳄梨Persea indica、天南星科Araceae、植物菖蒲等进行了杀虫物质的研究，而植物源抑菌、杀菌活性物质的研究相对较少，实际上据报道有1389种植物有可能作为杀菌剂，植物中的抗毒素、类黄酮、罹病相关的蛋白质、有机酸和酚类化合物等均有杀菌和抗菌活性。植物源杀菌物质大多为复合的抑菌有效成分，且具有多种作用位点和作用机制，因而植物被认为是化学合成杀菌剂替代品最好的开发资源。

甘草是豆科甘草属植物，其根和根茎是最常用的中药，主产于内蒙古和新疆维吾尔自治区，除用作药品外，还广泛用在食品、酿造和化妆品工业上，有着越来越广的应用前景。近些年，甘草的活性研究已成为关注的焦点。在临床医学上，该属植物广泛用于抗炎、镇痛、镇咳、抗溃疡、抗肝炎、解毒、治疗内分泌系统疾病等方面，即具有抗肿瘤作用、抗炎及抗变态反应作用、抗病原微生物作用、免疫调节作用等功效，作为抗病原微生物药物还可以应用在食品的保鲜防腐方面。

甘草的杀菌活性可见于医学上的报道，而关于甘草及其提取物对植物病原菌的抑菌活性却尚未见报道。因此，研究甘草及其提取物对植物病原菌的抑菌活性，将甘草及其提取物质应用到植物病害的防治上，对解决病原菌对药剂日益突出的抗性问题具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是克服甘草开发应用技术的不足，提供一种甘草提取物的新应用。

本发明的目的通过以下技术方案来予以实现：

提供甘草提取物在防治植物病害方面的应用。

所述甘草提取物为甘草的甲醇提取物。

所述甘草提取物的制备方法是采集甘草全株，优选甘草干燥根，置于50℃电热恒温鼓风干燥箱中烘干；粉碎机粉碎，过40目筛。所得植物粉用密封袋密封避光处保存备用。采用超声波提取法制备甘草提取物。

所述植物病害包括霜疫霉属(Peronophythora Chen)、疫霉属(Phytophthora capsici Leonian)、芽枝霉属(Cladosporium LK.ex Fr)、核盘菌属(Sclerotinia)、炭疽菌属(Colletotrichum Corda)等属的常见植物病害。

本发明用75％甲醇作为溶剂将甘草提取物配制成一定浓度的药液，采用菌丝生长速率法、孢子囊芽管萌发法、离体叶片法对甘草甲醇提取物对霜疫霉属(Peronophythora Chen)、疫霉属(Phytophthora capsiciLeonian)、芽枝霉属(Cladosporium LK.ex Fr)、核盘菌属(Sclerotinia)、炭疽菌属(Colletotrichum Corda)等属的常见植物病害进行室内毒力测定并进行了温室盆栽试验。试验结果表明，甘草甲醇提取物对所述病原菌具有良好的抑制效果，可以开发其在防治植物病害中的新用途。

作为一个优选方案，本发明提供了所述甘草提取物以400μg/mL的干粉浓度应用于防治辣椒辣椒疫霉病。

本发明的有益效果是：

本发明突破传统的甘草仅应用于医药学的限制，对甘草的应用提出了新的思路，并确定了甘草提取物用于防治植物病害的技术方案。为植物替代化学合成杀菌剂提供了新的开发资源，对解决病原菌对药剂日益突出的抗性问题具有重要的意义。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步详细说明本发明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1甘草提取物的制备

采集甘草根，置于50℃电热恒温鼓风干燥箱中烘干；粉碎机粉碎，过40目筛。所得植物粉用密封袋密封避光处保存备提取用。

本发明采用现有常规的超声波提取法制备甘草提取物，也可以参用现有的其他常规技术提取制备。

实施例2：甘草甲醇粗提物对霜疫霉属(Peronophythora Chen)病菌的抑制作用

用75％甲醇作溶剂溶解提取物，然后再与PDA培养基配制成带毒培养基，以菌丝生长速率法测定不同溶剂提取物对荔枝霜疫霉菌丝生长的抑制作用。具体操作是：

采用菌丝生长速率法：用75％甲醇作为溶剂将甘草提取物配制成一定浓度的供试药液，准确吸取1mL药液加入到49mL融化的PDA培养基中(约50℃)混合均匀后倒入灭过菌的培养皿中(直径9cm)，每瓶均匀倒入3个培养皿中，配制成所需浓度的带毒培养基。以混入相同体积的无菌水或75％甲醇做对照。供试病菌荔枝霜疫霉病菌在直径9cm的培养皿内用约17mL PDA培养基培养，培养5天后在菌落边缘菌丝生长旺盛处用打孔器打取直径为0.6cm的菌饼，分别接种于每个培养皿中央，有菌丝的一面向下。每个培养皿放一个菌饼，每个处理做三个重复，25℃培养箱中培养数天后，采用十字交叉法测定菌落直径(cm)，按以下公式计算抑菌率，实验结果见表1：

表1甘草甲醇提取物对荔枝霜疫霉病菌菌丝生长的抑制作用(7天)

注：1)表中结果为三次重复的平均值；

2)同一列数据后标有相同字母者表示在5％水平上差异不显著(DMRT法)。

实验表明，甲醇提取物对荔枝霜疫霉病菌菌丝生长的抑制率明显高于处理，在10mg/mL、5mg/mL、1mg/mL干粉浓度时抑制率达89.443％、80.683％、63.830％，显示出很强的抑菌作用。

实施例3：甘草甲醇粗提物对霜疫霉属(Peronophythora Chen)病菌的抑制作用

采用载玻片法(方中达，1998)测定：将在PDA培养基上培养10天的荔枝霜疫霉病菌用无菌水洗下孢子囊，加入药液制备成含各种浓度药液的孢子囊悬浮液，孢子囊浓度调整为每视野(10×10倍)约40～60个孢子囊，取50μL孢子囊悬浮液滴在载玻片上，再将载玻片置于已放一张滤纸的9cm培养皿内，并在滤纸上滴加少量无菌水以保湿，盖上培养皿，置于28℃下光照培养4小时后观察孢子囊萌发情况。按下式计算药剂处理的孢子囊萌发率和药剂对孢子囊萌发的抑制百分率。

采用载玻片法测定了甘草甲醇粗提物在1.3、1.0、0.7、0.5、0.3、0.15mg/mL(干粉有效成分的浓度)下对荔枝霜疫霉孢子囊芽管萌发的抑制活性。实验结果表明：处理后4小时，显微镜下观察，随着处理浓度的升高，孢子囊萌发率相应降低，抑制率依次为97.84％、86.45％、67.27％、52.67％、30.21％、13.26％，具体实验结果见表2。

将平均抑制率值进行百分率-概率转换，以概率几率值为横坐标，处理浓度的对数值为纵坐标，求取回归曲线，得到毒力回归方程y＝3.0474x+5.9922，相关系数R＝0.9288，EC₅₀为0.47mg/mL，95％置信限0.45～0.49。

表2甘草甲醇粗提物对荔枝霜疫霉病菌孢子囊芽管萌发的抑制活性(4小时)

注：1)表中萌发率、抑制率结果分别为五次重复的平均值；

实施例4：甘草甲醇粗提物对疫霉属(Phytophthora capsici Leonian)病菌的的温室盆栽试验

辣椒疫霉病菌孢子囊液的制备：采用MSS溶液法(常彩涛等，1995)诱导辣椒疫霉病菌产生大量孢子囊，即将在PSA上培养7天的菌丝块，接种于含PS液体培养基的三角瓶中，在25～27℃下培养48～60小时后，滤去液体培养基，用20mL MSS液将滤纸上的菌丝清洗冲回三角瓶，在25～27℃下光照培养24小时后，取培养菌液用于接种辣椒苗上。

试剂配方如下：

(1)MSS液配方：

MgSO₄·7H₂O 0.004mol/L

，KNO₃ 0.05mol/L

Fe-EDTA 1mL

蒸馏水 1000mL

(2)Fe-EDTA的配方：

EDTA-Na₂ 14.86g

FeSO₄·7H₂O 24.9g

蒸馏水 1000mL

盆栽试验在塑料大棚中进行。每个塑料盆钵装自然风干菜园土0.5kg，移栽4叶期健壮辣椒苗。每处理3个重复，每个重复5盆，每盆4株。在幼苗长到4～5片真叶时，先喷药液，对照喷自来水，并设甲霜灵对照，2h后喷接制备好的辣椒疫霉病菌孢子囊悬浮液，并立即覆盖塑料薄膜保湿24h。2、4、7d分别观察发病情况，记录温度，发病程度一株为单位，按0～4级的分级标准调查：

0级：无病；

1级：1片叶发病；

2级：2片叶发病；

3级：3片叶发病；

4级：4片以上叶发病或茎受害

实验结果见表3所示：

表3甘草甲醇提取物对辣椒疫霉病的盆栽防治效果

注：1)53％雷多米尔处理为稀释500倍液；

2)表中数据为3次重复的平均值；数据后标有相同字母者表示在5％水平上差异不显著(DMRT法)。

室内盆栽测试结果显示，甘草甲醇提取物对辣椒疫霉病有较好的防治效果，防治效果随处理浓度的升高而提高。供试浓度为50、100、200、300、400μg/mL(提取物干粉浓度)时，处理2天后防效依次为65.54％、72.40％、86.22％、85.66％、96.57；处理5天后防效依次为44.44％、74.61％、82.53％、84.13％、88.90％；处理10天后防效依次为34.38％、50.00％、68.75％、75.00％、86.46％。结果还显示处理浓度为400μg/mL的防效优于对照药剂雷多米尔锰锌。

实施例5：甘草甲醇粗提物对3种病原菌的抑菌活性

采用菌丝生长速率法测定甘草甲醇粗提物对3种分属于芽枝霉属(Cladosporium LK.ex Fr)、核盘菌属(Sclerotinia)、炭疽菌属(Colletotrichum Corda)的花生黑霉病、大麦条纹病、香蕉炭疽病原真菌的抑制效果。在无菌条件下，配制不同浓度药剂，再倒入已融化的培养基(温度约为60℃)中，充分摇匀，趁热倒入90cm的培养皿中制成含药培养基平板。平板凝固冷却后用接种针接进大小一致、生长一致的各种植物病原真菌菌饼(Φ＝5.0mm)，每皿接1个菌饼，生长有菌落的一面朝下，每处理3个重复，同时设清水空白对照、1％甲醇对照。置于生化培养箱中，25℃条件下培养5天，再用十字交叉法测量供试真菌菌落直径的大小，按以下公式计算抑菌率，进而计算药剂处理对不同病菌的有效抑制中浓度(EC₅₀)及相关系数(r)值。

抑菌活性测定结果见表4。

表4甘草甲醇粗提物对3种植物病原真菌的抑菌活性

Claims

1.甘草提取物在防治植物病害方面的应用，其特征在于所述甘草提取物为甘草的甲醇提取物；所述甘草提取物的制备方法是采集甘草全株，烘干，粉碎得甘草粉；甘草粉经超声波提取制备得到甘草提取物；所述植物病害为辣椒疫霉病，所述甘草提取物以400μg/mL的干粉浓度应用于防治辣椒疫霉病。