CN108041038A - 柑橘溃疡病菌产生小分子作为铜制剂杀菌剂增效剂在病害防治中的应用 - Google Patents

柑橘溃疡病菌产生小分子作为铜制剂杀菌剂增效剂在病害防治中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种由柑橘溃疡菌Xanthomonas axonopodis pv. citri（Xac）产生的小分子化合物作为铜制剂的增效剂的新用途，具体为：铜制剂杀菌剂（如喹啉铜、络氨铜和氢氧化铜等）中加入一定浓度小分子化合物能显著增加铜制剂的杀菌效果。小分子化合物是从柑橘溃疡菌Xac发酵液中提取（或可通过人工化学合成）。本增效剂的发明能显著提高铜制剂的杀菌效果，大幅减少化学农药的使用量，在弱化病原菌的抗药性同时，最终促进种植业与环境的和谐发展。

Description

柑橘溃疡病菌产生小分子作为铜制剂杀菌剂增效剂在病害防 治中的应用
技术领域
本发明涉及生物防治技术植物保护领域，具体涉及柑橘溃疡菌Xanthomonas axonopodis pv.citri（Xac）产生的小分子化合物作为一种绿色安全的新型增效剂对提高铜制剂杀菌剂如喹啉铜的杀菌效果，降低化学农药施用量在病害防治的应用。
背景技术
在植物病害综合防控中，化学农药防治因其时效快，效果显著等特点广受青睐，中国是世界上滥用化学药剂最严重的国家之一。随着人们对个人健康、食品安全以及生态环境的关注和重视，在农业生产中减少化学药剂，特别是传统高毒和高残留的化学农药的用量势在必行。研发和推广低毒、低残留、环境相容性好、防治效果显著的新型农药；研发新型的农药增效剂以达到增加药效，降低农药的使用量具有迫切要求和光明前景。传统的增效剂是通过改善农药的润湿、展布、分散、滞留和渗透性能等提高化学农药的药效，但存在着合成较难，污染环境等不足。从病原菌的角度入手，通过改变病原微生物的生活习性，抑制及弱化病原菌的抗药性从而提高农药的杀菌效果，降低农药的使用量，降低成本，保护生态环境是未来的新型增效剂的发展方向，其不但可延长农药品种的生命期，更因为其绿色安全特性将受欢迎。
目前，铜制剂属于广谱性杀菌剂，其大量使用一方面在植物方面会产生明显的抗药性，更为严重的是，铜制剂的施后残留问题会引起土壤板结、生物群落结构改变，并且可通过“土壤—植物—人体”或“土壤—水—人体”被人体吸收，可能引起人的肝脏损害，脑部神经组织病变等，严重影响人类的身心健康。因此，减少铜制剂的使用量，增加铜制剂的利用效率，对柑橘溃疡病的防治以及人类的健康发展是起着关键性的作用。
本发明的前期研究发现柑橘溃疡病病原Xac产生结构不同的新型小分子。例如Wang 等（Wang L, He Y, Gao Y, et al.. A bacterial cell-cell communicationsignal with cross-kingdom structural analogues[J]. Molecular Microbiology,2004,51(3):903-912.），Ellen等（Beaulieu E D, Ionescu M, Chatterjee S, et al.Characterization of a Diffusible Signaling Factor from Xylella fastidiosa[J].Mbio, 2013, 4(1):00539-12.）分别披露了DSF、XfDSF的结构如下：
但目前还没有研究所述小分子化合物对于提高药剂杀菌效果方面的报道。
发明内容
我们的研究发现无论在室内还是田间在柑橘溃疡病防治药剂铜制剂中添加低浓度由病原菌Xac产生的小分子化合物能够显著提高药剂的杀菌效果，从而降低药试剂的使用量。所述小分子化合物是指DSF和/或XfDSF。
研究小分子化合物作为增效剂与铜制剂混用能显著提高杀菌剂的药效，降低化学药剂的使用量，降低成本，解决病原菌对药剂日益突出的抗性问题具有重要的意义。
关于小分子化合物作为增效剂与农药混用在植物病害防治的使用未见报道。
本发明的目的在于提供小分子化合物的一个新用途。
本发明的目的通过以下技术方案来予以实现：
提供小分子化合物作为增效剂与铜制剂在防治柑橘溃疡病方面的应用。
所述的小分子化合物是从柑橘溃疡病原菌Xanthomonas axonopodis pv.citri发酵培养液中提取或人工化学合成。
所述小分子DSF的提取方法是通过离心收集柑橘溃疡病菌Xac过夜培养液上清，通过加入乙酸乙酯萃取，利用高效液相色谱（HPLC）进行分离纯化，收集活性物质，经结构鉴定确认为Xac产生的DSF、XfDSF。
将分离提取并所制备的不同浓度小分子化合物分别与铜制剂（喹啉铜）混合处理病原菌Xac,统计菌落生长情况，比较不同浓度的小分子与铜制剂混合分别对室内及盆栽柑橘上的病原菌Xac的杀菌效果。试验结果表明，一定浓度的小分子化合物能够显著提高铜制剂（喹啉铜）对病原菌Xac的杀菌效果，将其开发成一种新型高效的杀菌增效剂在防治植物病害中具有光明前景。
基于以后生产应用成本控制，本发明提供了所述小分子化合物与铜制剂混合配制以0.01μM~1mM浓度范围应用于防治柑橘溃疡病，更优选的为10~500μM。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1）突破以往杀菌增效剂以改善药剂的理化性质为出发点，本发明从病原菌入手，通过利用细菌本身产生的天然的不饱和脂肪酸XfDSF小分子与铜制剂（喹啉铜）混用能够显著提高药效，减少杀菌剂的用药量为研发绿色环保的新型杀菌增效剂提出了新思路，同时为解决病原菌日益突出的抗药性问题具有重要意义。
2）确定了柑橘溃疡病菌小分子化合物作为增效剂用于防治柑橘属细菌性植物病害的技术方案。
附图说明
图1 XfDSF混配喹啉铜对柑橘溃疡菌杀菌增效作用（处理菌液稀10-5倍）。注：1A：WT+5% CH3OH；1B：Cu（单独用喹啉铜500倍处理）；1C：喹啉铜500倍与20μM XfDSF混配；1D：喹啉铜500倍与40μM XfDSF混配；1E：喹啉铜500倍与60μM XfDSF混配。
图2 XfDSF混配喹啉铜对柑橘溃疡菌杀菌增效作用统计结果。注：Cu表示为单独用喹啉铜500倍液处理菌液（作为阳性对照）；C-20~C-200表示为选择20μM~200μM XfDSF混配喹啉铜处理菌液；不同浓度信号XfDSF作为增效剂混配喹啉铜的增效比值=喹啉铜单用CFU/（喹啉铜+XfDSF增效剂）CFU
图3 DSF混配喹啉铜对柑橘溃疡菌杀菌增效作用（处理菌液稀10-5）。注：3A：WT+5%CH3OH； 3B：Cu（单独用喹啉铜500倍处理）；3C：喹啉铜500倍与300μM DSF混配；3D：喹啉铜500倍与400μM DSF混配；3E：喹啉铜500倍与500μM DSF混配。
图4 DSF混配喹啉铜对柑橘溃疡菌杀菌增效作用统计结果。注：Cu表示为单独用喹啉铜500倍液处理菌液（作为阳性对照）；C-100~C-500表示为选择100μM~500μM DSF混配喹啉铜处理菌液；不同浓度信号DSF作为增效剂混配喹啉铜的增效比值=喹啉铜单用CFU/（喹啉铜+DSF增效剂）CFU
图5 XfDSF混配喹啉铜对柑橘溃疡菌杀菌增效作用盆栽接种统计结果。注：Cu表示为单独用喹啉铜500倍液处理已接种叶片（作为阳性对照）； C-60表示用60μM XfDSF混配喹啉铜500倍处理已接种叶片；C-80表示用80μM XfDSF混配喹啉铜500倍处理已接种叶片； C-100表示用100μM XfDSF混配喹啉铜500倍处理已接种叶片。
图6 DSF混配喹啉铜对柑橘溃疡菌杀菌增效作用盆栽接种统计结果。注：Cu表示为单独用喹啉铜500倍液处理已接种叶片（作为阳性对照）； C-300表示用300μM DSF混配喹啉铜500倍处理已接种叶片；C-400表示用400μM DSF混配喹啉铜500倍处理已接种叶片； C-500表示用500μM DSF混配喹啉铜500倍处理已接种叶片。
图7 DSF或XfDSF混配喹啉铜对水稻基腐病病原菌EC1杀菌增效作用（处理菌液稀10-5倍）。注：图7 A表示为培养基中加入0.5%甲醇对照；图7B表示为单独用喹啉铜500倍液处理菌液； 7C 表示用20μM XfDSF混配喹啉铜处理菌液；图7D表示为培养基中加入0.5%甲醇对照；图7E表示为单独用喹啉铜500倍液处理菌液；7F表示用300μM DSF混配喹啉铜处理菌液。
具体实施方式
下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。
实施例1至4采用的铜制剂喹啉铜的母液浓度为100mg/mL,工作浓度为500倍稀释液。小分子化合物的供试浓度为100mM。本发明的实施例表明一定浓度范围的小分子DSF与铜制剂混配作为生物源增效剂对柑橘溃疡病的防治有一定的增效杀菌的作用效果，符合本发明技术特征中部分铜制剂杀菌剂与小分子化合物的结合作为增效剂均能达到此增效效果。
实施例1
将过夜培养的Xac种子液接入YEB培养基，28℃、200rpm培养24个小时后，通过离心收集柑橘溃疡病菌Xac培养液上清。所得上清待提取小分子用。
本发明采用的是常规的化合物分离提取的方法对发酵液中活性物质的分离与提取。在离心收集柑橘溃疡病菌Xac培养液上清后，加入与上清液等体积的乙酸乙酯，放入4℃静置2h后于20℃摇床处理1h, 用分液漏斗萃取，收集上层分液。再利用旋转蒸发仪将收集的上层分液悬蒸，将有机溶剂蒸干后，使用2-3mL甲醇洗脱。将含有活性成分的甲醇溶液蒸干浓缩之后，在利用高效液相色谱（HPLC）进一步纯化、分析、收集活性物质。对活性成分进行结构鉴定，确认活性成分分别为DSF及其衍生物XfDSF。
实施例2 小分子化合物分别与喹啉铜对柑橘溃疡病菌Xac的杀菌增效作用
用甲醇作为溶剂溶解提取物，与100mg/mL 喹啉铜试剂混合处理一定OD值的柑橘溃疡病菌液，用单位体积中的细菌群落总数(CFU)以测定不同浓度提取物对喹啉铜杀菌增效作用。具体操作是：
采用统计CFU法：用甲醇作为溶剂将小分子化合物配置成一定浓度的供试药剂，准确加入一定量的小分子化合物溶液混合500倍喹啉铜试剂到过夜培养至OD600=1.0 的Xac菌液中，将不同浓度小分子化合物、500倍喹啉铜和菌液同时处理，单独用500倍喹啉铜处理菌液作为阳性对照，放于28℃、200rpm培养24个小时后，梯度稀释处理菌液并用200μL菌液处理液涂板（培养基为LB ）。每个浓度倒3重复的培养平板。28℃培养箱数天后，结合图1，统计平板菌落数可得：1A不经处理的对照CK的CFU为1010、1B单独用喹啉铜处理的CFU为2×109、1C喹啉铜500倍与20μM XfDSF混配处理的CFU为1.2×108、1D喹啉铜500倍与40μM XfDSF混配处理的CFU为109、1E喹啉铜500倍与60μM XfDSF混配处理的CFU为7.5×108。结合图2得出：C-20表示为用20μM的XfDSF对喹啉铜的杀菌增效比值为1.6倍、C-40表示为用40μM的XfDSF对喹啉铜的杀菌增效比值为2倍、C-60表示为用60μM的XfDSF对喹啉铜的杀菌增效比值为2.7倍、C-80表示为用80μM的XfDSF对喹啉铜的杀菌增效比值为为3倍、C-100表示为用100μM的XfDSF对喹啉铜的杀菌增效比值为为4倍、C-200表示为用200μM的XfDSF对喹啉铜的杀菌增效比值为为4.5倍。结合图3，统计平板菌落数可得：3A不经处理的对照CK的CFU为5×109、3B单独用喹啉铜处理的CFU为2.5×109、3C喹啉铜500倍与300μM DSF混配处理的CFU为7×108、3D喹啉铜500倍与400μM DSF混配处理的CFU为1.4×108、1E喹啉铜500倍与500μM DSF混配处理的CFU为108。
结合图4得出：C-100表示为用100μM的DSF对喹啉铜的杀菌增效比值为2倍、C-200表示为用200μM的DSF对喹啉铜的杀菌增效比值为2.5倍、C-300表示为用300μM的DSF对喹啉铜的杀菌增效比值为4倍、C-400表示为用400μM的DSF对喹啉铜的杀菌增效比值为17倍、C-500表示为用500μM的DSF对喹啉铜的杀菌增效比值为为25倍。
实施例3 小分子化合物与喹啉铜混配作为增效剂对柑橘溃疡病病菌防治温室盆栽试验
柑橘溃疡菌（Xanthomonas axonopodis pv.citri）菌液悬浮液的制备：将在LB培养基上划线培养2天后，挑取单菌落接入LB液体培养基中，在28℃恒温箱中过夜培养OD600=0.5，待用接种。
室外盆栽实验在塑料大棚温室中进行。购买已种植2年以上的四季桔感病品种盆栽作为试验材料，选取大小相当、颜色相似、长势相同的四季桔嫩叶作为实验接种对象，在接种之前先对实验嫩叶用75%酒精消毒嫩叶表面，用注射器针头从叶背面刺穿叶子，在叶片远轴处两边均匀刺穿8个穿孔，再在穿孔上方接种5μL 的OD600=0.5的菌液悬浮液，接种后置于室温、自然光照条件下培养，常规的水肥管理。
接种病原菌3d后的四季桔嫩叶分别喷洒用自来水配制的不同浓度小分子化合物混配500倍喹啉铜的供试试剂以及500倍喹啉铜作为阳性对照的处理药剂，LB培养基作为阴性对照，每片嫩叶喷涂药剂1mL，每个处理3个重复。
喹啉铜药剂混配不同浓度DSF处理已接种病原菌的四季桔叶片三天后，采样，将各个处理的叶子将带有病斑的区域剪碎于灭菌的研钵，加入少量石英砂和2mL LB培养基研磨至匀浆状于5mL 离心管中，并加3mL LB培养基，摇匀，用灭菌纱布过滤。将取得的滤液10000g/2分钟，1mL 培养基悬浮，重复两次后，用200μL LB培养基悬浮，稀释不同浓度梯度200μL涂板，观察病原菌落生长密度，并统计，结合图5结果得出：C-60表示为用60μM的XfDSF对喹啉铜的杀菌增效比值为3.8倍、C-80表示为用80μM的XfDSF对喹啉铜的杀菌增效比值为4倍、C-100表示为用100μM的XfDSF对喹啉铜的杀菌增效比值为4.5倍。结合图6结果得出：C-300表示为用300μM的DSF对喹啉铜的杀菌增效比值为3倍、C-400表示为用400μM的DSF对喹啉铜的杀菌增效比值为2倍、C-500表示为用500μM的DSF对喹啉铜的杀菌增效比值为8倍。
实施例4 小分子化合物与铜制剂喹啉铜混配作为增效剂对水稻基腐病病原菌EC1的杀菌增效作用
用甲醇作为溶剂溶解提取物，与100mg/mL 喹啉铜试剂混合处理一定OD值的水稻基腐病病原菌菌液，用单位体积中的细菌群落总数(CFU)以测定不同浓度提取物对喹啉铜杀菌增效作用。具体操作是：
采用统计CFU法：用甲醇作为溶剂将DSF配置成一定浓度的供试药剂，准确加入一定量的DSF溶液混合500倍喹啉铜试剂到过夜培养至OD600=1.0 的EC1菌液中，使菌液中小分子DSF的工作浓度范围在0.01μM~50μM之间，将不同浓度小分子、500倍喹啉铜和菌液同时处理，单独用500倍喹啉铜处理菌液作为阳性对照，放于28oC、200rpm培养24个小时后，梯度稀释处理菌液并用200μL菌液处理液涂板（培养基为LB ）。每个浓度倒3重复的培养平板。28℃培养箱数天后，观察并统计实验结果：结合图7可得，7A不经处理的对照CK的CFU为2×108、7B单独用喹啉铜处理EC1的CFU为108、7C喹啉铜500倍与20μM XfDSF混配处理的CFU为2.5×107、7D不经处理的对照CK的CFU为2×108、7E单独用喹啉铜处理EC1的CFU为108、7F喹啉铜500倍与300μM DSF混配处理的CFU为5×105。

Claims (10)

1.柑橘溃疡病病原菌Xanthomonas axonopodis pv. citri（Xac）产生的小分子化合物作为铜制剂杀菌剂的生物增效剂的应用，以对柑橘属植物细菌性病害、水稻基腐病有增效的防治作用，所述小分子化合物是指DSF和/或XfDSF。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述小分子DSF的制备方法包括以下步骤：
将过夜培养的所述菌的种子液接入YEB培养基，振荡培养；
通过离心收集培养液上清；
加入与上清液等体积的乙酸乙酯，静置后于常温摇床处理；
用分液漏斗萃取，收集上层分液；
利用旋转蒸发仪将收集的上层分液悬蒸，将有机溶剂蒸干后，使用甲醇洗脱；
将含有活性成分的甲醇溶液蒸干浓缩之后，进一步纯化、分析、收集活性物质。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述小分子化合物的制备方法第(1)步的培养为28oC、200rpm培养24个小时。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述小分子化合物的制备方法第(3)步的静置是放入4℃静置。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述小分子化合物的制备方法第(3)步的摇床处理时间为2h。
6.根据权利要求1至5任一项所述的应用，其特征在于，所述铜制剂杀菌剂为喹啉铜。
7.根据权利要求1至5任一项所述的应用，将小分子化合物制备所需的浓度作为生物增效剂与铜制剂杀菌剂混配，其中所述的制备所需的浓度是指0.01μM~1mM的DSF和/或XfDSF。
8.根据权利要求6所述的应用，铜制剂杀菌剂的浓度是指喹啉铜的母液浓度为100mg/mL,工作浓度为500倍稀释液。
9.一种杀菌剂混配制剂，其特征在于，以铜制剂杀菌剂的作为活性成分，进一步添加柑橘溃疡病病原菌Xanthomonas axonopodis pv. citri（Xac）产生的小分子化合物作为增效剂，所述小分子DSF化合物是指DSF和/或XfDSF。
10.根据权利要求8所述的混配制剂，其特征在于，所述铜制剂杀菌剂为喹啉铜的母液浓度为100mg/mL,工作浓度为500倍稀释液，更优选小分子化合物的浓度为10~500μM。
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