CN101519439B - 一种抗冻多肽、其合成及含有这种多肽的组合物和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗冻肽、其合成及含有这种肽的组合物和应用，本发明通过改进的对苏氨酸进行糖基化修饰后，经过固定相多肽合成，得到所述的抗冻肽。本发明提供的抗冻肽组合物，同多种组份配制成水剂、水凝胶剂、霜剂、乳剂、面膜、贴剂等。本制剂可用于细胞、细菌、组织、器官的低温保存，也可用在创伤、溃疡、烧伤的治疗中，具有抗炎症作用，可以促进伤口愈合、提高伤口的愈合质量，有效减少瘢痕的形成；本发明的抗冻肽复合组方制剂用在护肤品中，可以减少因紫外线照射皮肤而引起的红斑及皮肤灼伤、可以预防低温环境中暴露皮肤的冻疮、皸裂以及红血丝形成。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，具体的说涉及一种多肽。特别涉及一种抗冻多肽、其合成及含有这种多肽的组合物和应用。
背景技术
抗冻蛋白(antifreeze proteins AFPs)是一类能够抑制冰晶生长、改变冰晶形态、抑制冰的重结晶的蛋白质。亦称为热滞蛋白或温度迟滞蛋白(thermal hysteresisproteins THPs)。自1969年Devries在南极Mcmurdo海峡的一种Nototheneniid鱼的血液中首先发现，至今，已先后从鱼类、昆虫、植物及真菌和细菌中发现了抗冻蛋白，并对其作用机制、分子结构作了深入的研究。目前，抗冻蛋白在农业领域的研究非常广泛，在食品和医药应用方面也越来越引起人们的重视。
迄今为止在鱼类中共发现了5种抗冻蛋白，分别是抗冻糖蛋白(AFGPs)、I型抗冻蛋白(AFPI)、II型抗冻蛋白(AFPII)、III型抗冻蛋白(AFP III)和IV型抗冻蛋白(AFPIV)。
抗冻糖蛋白(AFGPs)于1969年首先由Devries在北极鱼Trematomusborohgrevinki的血液中发现。其结构为的重复的含有糖基化的三肽单位组成，分子量从2.5kD到33.7kD不等。它们的活性随其分子量的增加及重复数的增多而提高。通过化学修饰(乙酰化和过氧化)糖基后会导致其抗冻活性的丧失，因此糖基是决定其抗冻性的主要基团。AFGPs在溶液中以左手-折叠螺旋存在，这种构象能使双糖疏水基团面向碳骨架，而亲水基团面向溶液，有利于亲水基团和小分子之间形成氢键，阻止冰核的形成。最近由ProtoKinetix公司人工合成的抗冷冻糖蛋白AAGPTM已被证明可以保持与天然的抗冻蛋白有相同的生物学活性，并已申请了专利保护。
由于抗冻蛋白的特殊作用，在食品科学、农业科学方面的应用性研究长足发展，并且申请了诸多应用性专利。目前，抗冻蛋白在医学、美容产品方面的研究也引起了人们的广泛兴趣，其主要的应用范围主要包括以下方面：
1、应用于保护皮肤，在化妆品中作为抗衰老和抗氧化添加剂，可以减缓细胞的衰老，具有抗皱、修复、保湿、增加皮肤弹性等作用。
2、抗日光照射剂-保护和修复，可以有效减少日光照时所引起的红斑。
3、细胞和组织的低温贮藏，可以有效抑制低温环境下冰晶的形成，能够显著提高细胞和组织等活体的存活率，如菌株保存、胚胎保存、器官保存等，如可以用在器官移植中。
目前多肽合成通常采用生物方法，但生物方法费时费力，不利于工业化大规模生产。此外，文献“0-乙酰氨基半乳糖基化氨基酸的化学合成”，《第三军医大学学报》22卷第10期958-960页报道了一种多肽合成方法，该路线简短，但按照该文献方法无法重复试验。
针对于此，本发明根据几种天然抗冻蛋白的结构，采用改进的化学合成方式制备抗冻肽，所合成的小分子抗冻肽具有与天然抗冻蛋白相同的抗冻功能，与大肠杆菌及酵母表达的抗冻蛋白相比，具有显著的优势，既避免了费时的细菌培养及产品纯化过程，又杜绝了产品中含有的宿主菌的有害成分，产品安全性进一步提高，同时，有效解决了成本问题及稳定性，可以大规模工业化生产，与配方组分相容性好，可以作为主成分之一制成冻干剂、水剂、凝胶剂等，可广泛用于活体组织的低温贮藏、可以有效保护皮肤因低温及紫外线而造成的伤害、也可用于创伤修复领域。
发明内容
本发明目的之一在于提供一种抗冻多肽；
本发明目的之二在于提供一种所述抗冻多肽的合成方法；
本发明目的之三在于提供所述抗冻多肽的用途；
本发明目的之四在于提供含有所述抗冻多肽的组合物。
为了实现上述目的，本发明采取了如下技术方案：
一种抗冻多肽，所述多肽序列为(NATA)n，所述多肽在每个Thr的羟基上修饰有乙酰氨基半乳糖，其中n＝2～16。所述的修饰有为本领域通常习惯用语。
根据前面所述的抗冻多肽，所述多肽序列优选n＝2或3，更优选为2。
根据前面所述的抗冻多肽，当n＝2时所述多肽分子量理论值为：1138。
为了更清楚的说明这种抗冻多肽的结构，当n优选为2时，其NATANATA分子式结构为如下：
一种前面所述多肽的合成方法，合成包括如下步骤：
乙酰化：将乙酰氨基半乳糖在二氯甲烷中在氯化锡催化下同乙酸酐回流反应，反应结束后用正相硅胶柱分离，经过处理得到产物；
糖基化：将上步反应产物和物质量为上步反应产物0.3～0.5倍的分别溶于无水二氯甲烷和无水乙腈中，其中优选0.4倍物质量的Fmoc-Thr-OH，然后加入到BF3-Et2O中搅拌反应，反应完毕经过后处理后，进行反相HPLC纯化；
固定相多肽合成；将氨基酸单体，以HBTU/HOBt为缩合剂进行多肽合成，然后用三氟乙酸为切肽试剂，得到产物，其中氨基酸投料量优选为树脂取代值的2～4倍，最优选3倍。
按照文献“O-乙酰氨基半乳糖基化氨基酸的化学合成”进行乙酰化合成，却发现有较大杂质产生。关于该反应，现有技术中均采用了较低的温度，且通常认为较缓和的反应条件可以降低副反应，遂降低反应温度并尝试多种催化剂，反复试验仍然不能满意。后将反应进行回流，却意外发现杂质非常少，且缩短了反应时间，收率较文献报道高了近十个百分点。
而在第二步糖基化修饰反应中，通过优化实验，我们发现，采用Fmoc-Thr-OH为乙酰化半乳糖投料量0.3～0.5倍时，有利于最终糖基化修饰产物的提高。
根据前面所述的抗冻多肽的用途，所述抗冻多肽用于制备治疗冻伤或帮助伤口愈合的药物；或者用于制备细菌、细胞、组织或器官冷冻保存的药物；或者用于制备护肤品或防晒品。
一种含有前面所述多肽的组合物，所述组合物含有如下质量百分比的成份：前面所述多肽0.02～5％、其他辅料0.5～99.95％、其余为无菌多重蒸馏水。
所述的其他辅料可以是适合药用或护肤品、防晒品制备用的辅料，或者是适合冷冻保存细菌、细胞、组织、器官等的药物的辅料。本领域技术人员通常知晓在制备前面所述的制备治疗冻伤或帮助伤口愈合的药物，或者细菌、细胞、组织或器官冷冻保存的药物，或者护肤品、防晒品时应该，或者适合使用的辅料种类。
根据前面所述的组合物，所述其他辅料包括保水剂，含量为0.5～60％，所述保水剂优选为甘油、透明质酸、油酸或凡士林的一种或两种组合。
可以优选的是，所述的其他辅料还包括如下成份的一种或几种：渗透压调节剂、稳定剂、基质、防腐剂、pH调节剂、促渗剂，所述渗透压调节剂优选为甘露醇，所述稳定剂优选为羟丙基甲基纤维素，所述基质优选为卡波姆-940或蜂蜡的一种或两种组合，所述防腐剂优选为尼泊金乙酯，所述pH调节剂优选为三乙醇胺，所述促渗剂优选为氮酮。
还可进一步优选所述渗透压调节剂在所述组合物中质量百分比含量为5～30％，所述稳定剂含量为2～10％，所述基质含量为0.5～15％，所述防腐剂含量为0.0005～0.1％，所述pH调节剂用量为制备时配制溶液pH值为6～9，所述促渗剂含量为1～5％。
根据前面所述的组合物，所述其他辅料包括防晒剂，含量为0.5～5％，所述防晒剂优选为氧化锌或二氧化钛的一种或两种组合。
可以进一步优选的是，所述辅料还包括如下成份的一种或几种：基质或其他活性成分，所述基质优选为环甲基硅酮，所述其他活性成分优选为Vital ET或α-红没药醇的一种或两种组合。
所述基质含量在组合物中质量百分比含量可以优选为50～65％，所述其它活性成分含量优选为0.5～6％。
根据前面所述的组合物，所述其他辅料包括防冻剂，含量为5～20％，所述防冻剂优选为二甲基亚砜。
其中优选的是，所述辅料还包括培养基质，所述培养基质优选为胎牛血清或PMI-1640培养液的一种或两种组合。
所述培养基质含量在组合物中质量百分比含量可以优选为80～90％。
此外，本发明还可进一步更具体为：
根据前面所述的多肽组合物，所述多肽组合物由下列组成：0.05～0.1％抗冻肽，5～10％甘油、5～10％甘露醇、2％羟丙基甲基纤维素，剩余成份为无菌多重蒸馏水；所述多肽组合物优选制成水凝胶剂。
根据前面所述的多肽组合物，所述多肽组合物由下列组成：抗冻肽0.02～0.15％、卡波姆0.5～1％、甘油5～10％、尼泊金乙酯0.1％、调节pH至6～9的三乙醇胺，剩余成份为无菌多重蒸馏水；所述多肽组合物优选制成水凝胶剂。
根据前面所述的多肽组合物，所述多肽组合物由下列组成：0.05～2％抗冻肽、10％二甲基亚砜、5～10％胎牛血清、78～84.95％PMI～1640培养基。
根据前面所述的多肽组合物，所述多肽组合物由下列组成：0.05～0.5％抗冻肽、0.5％透明质酸、2％氮酮、1％油酸、0.0001～0.5％肝素、0.0005～0.1％rhKGF～2、5％甘油、0.0005％尼泊金乙酯，剩余成份为无菌多重蒸馏水；所述多肽组合物优选制成水剂。
根据前面所述的多肽组合物，所述多肽组合物由下列组成：0.05～0.1％抗冻肽、0.5％透明质酸、1～2％氮酮、0.5～1％油酸、0.0005～0.1％胸腺素beta～4、0.0005％尼泊金乙酯，剩余成份为无菌多重蒸馏水；所述多肽组合物剂型优选水剂。
根据前面所述的多肽组合物，所述多肽组合物由下列组成：0.1～0.5％抗冻肽、0.5～2％氧化锌、2～3％二氧化钛、2～5％VE磷酸酯络合月桂基亚胺二丙酸二钠、0.5～1％α～红没药醇、50～60％环甲基硅酮，剩余成份为无菌多重蒸馏水。
根据前面所述的多肽组合物，所述多肽组合物由下列组成：0.1～0.5％抗冻肽、40～60％凡士林、20～30％白油、5～15％蜂蜡，剩余成份为无菌多重蒸馏水、香料和防腐剂；所述多肽组合物优选制成膏剂。
本发明所提供的技术方案具有如下优势：
(1)本发明提供的多肽具有优良的抗冻效果，甚至可以达到天然抗冻蛋白的生物活性。
(2)本发明提供的多肽合成方法具有收率高、简单易行的优点。
(3)本发明提供的多肽可以制备成多种组合物，并应用于医学、美容等多种领域，应用范围广，效果优良。
附图说明
图1.NAT(GalNAc-D)ANA T(GalNAc-D)A质谱图；
图2.NAT(GalNAc-D)ANA T(GalNAc-D)A核磁共振氢谱图；
图3、NAT(GalNAc-D)ANA T(GalNAc-D)A核磁共振碳谱图；
图4、NAT(GalNAc-D)ANA T(GalNAc-D)A圆二色谱图，其中数据如下：
根据如上检测数据，可以判定制备的多肽结构为正确。
图5、为当n优选为2时，即多肽为NATANATA时的分子结构。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明作更具体的解释，但本发明并不仅仅局限于这些实施例，同样这些实施例也不以任何方式限制本发明。
实施例1、抗冻肽的制备
1、主要试剂
分析纯乙酰氨基半乳糖(GalNAc)、BF3.Et2O，SnCl4，CH2Cl2，乙酸酐和色谱纯CH3CN购自Sigma公司；Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH单体购自Advanced ChemTech公司；RinkAmide树脂购自天津南开和成科技有限公司。
2、实验方法
2.1乙酰氨基半乳糖过乙酰化：
a SnCl4，Ac2O，CH2Cl2 Yield：52％
三角烧瓶中分别加入1.5g GalNAc、15ml CH2Cl2、15ml乙酸酐及120mg SnCl4，50℃回流反应12小时后，用正相硅胶柱分离，洗脱液为CH2Cl2。收集CH2Cl2洗脱液，旋转蒸发仪抽干，加入乙醚后搅拌至结晶析出，抽干，得0.782g产物，取适量产物进行表征分析，其余样品于-20℃保存备用，此反应得率为52％。产物表征：MS：412.2[M+Na+]，801.3[2M+Na+]
1H-NMR(d6-DMSO，300MHz)：7.905(1H，d)，5.640(1H，d)，5.266(1H，d)，5.080(1H，d)，5.041(1H，d)，4.226(1H，t)，4.145～3.981(3H，m)，2.119(3H，s)，2.037(3H，s)，1.991(3H，s)，1.907(3H，s)，1.779(3H，s)
2.2 Fmoc-Thr-OH氨基酸糖基化：
三角烧瓶中加入过乙酰化GalNAc 148mg和Fmoc-Thr-OH 6lmg分别溶于2ml无水CH2Cl2和1.5ml无水CH3CN中，加入BF3Et2O 0.3ml(48％)，搅拌。反应过程中，硅胶板薄层色谱TLC监测反应(每隔10min监测1次)，扩展剂为乙酸乙酯∶石油醚∶醋酸(40∶20∶0.5)，显色剂为6％的磷钼酸，反应约90min，当游离Fmoc-Thr-OH被消耗完后，用25ml CH2Cl2稀释，移入分液漏斗，用1mol/HCl 100ml洗涤3次，分离CH2Cl2相，无水硫酸钠干燥4h；过滤后抽干至约10ml。
反相HPLC纯化：使用Waters 600 HPLC仪，使用Symmetry C18(150×4.6mm)柱，流动相为0.1％TFA(三氟乙酸)水溶液，0.1％TFA的CH3CN溶液(55∶45)，收集主峰，旋转蒸发仪抽干，收集结晶物，电子天平称量，-20℃保存备用。此反应的最终得率为48％。
上述实验方法，可根据需求进行比例放大后规模化生产，以满足目标多肽的合成。
2.3 NATANATA多肽的合成：
运用全自动固相多肽合成仪(型号：433A，美国应用生物系统公司)合成目标多肽。
包括如下步骤：以RinkAmide树脂为起始原料，以Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、及上述糖基化的Fmoc-Thr(GalNAc(Ac)3-a-D)-OH为单体，氨基酸投料量按照树脂取代值的2-4倍进行，以HBTU/HOBt为缩合剂，依次逐个接上氨基酸，然后加入三氟乙酸切肽试剂进行切肽，加入乙醚沉淀，获得粗品，最后采用SymmetryC18(150×3.9 mm，5μm)柱进行分离纯化，获得目标产物，RP-HPLC纯度为95％。此反应的最终得率为32％。
此外，(NATA)n，其中n为3～16的多肽也可以参考本合成方法进行制备，区别仅仅为使用全自动固相多肽合成仪制备多肽时参数的略微调整。而如何调整为本领域技术人员在本发明说明书公开内容基础上结合其自身知识，或经简单试验即可得出，无需再付出创造性劳动。
实施例2、抗冻肽复合组方，由抗冻肽，甘油、甘露醇、羟丙基甲基纤维素和无菌多重蒸馏水组成时，可用于低温环境下皮肤的防护。
先将上述配方中羟丙基甲基纤维素浸泡于无菌多重蒸馏水中，待完全涨溶后分别加入预先溶解于无菌多重蒸馏水中的抗冻肽及甘露醇，随后加入甘油，搅拌均匀后即可。
实施例3、抗冻肽复合组方，由抗冻肽、卡波姆，甘油，尼泊金乙酯，三乙醇胺适量(调节pH至6～9)，无菌多重蒸馏水制成水凝胶剂，可用于暴露皮肤在低温环境下的防护。
先将卡波姆树脂溶于水中，待完全溶胀后，加入甘油混匀，或过胶体磨，均匀后加入三乙醇胺中和至pH至6～9，得透明的凝胶。加三乙醇胺时，尽量减少气泡生成。然后将抗冻肽水溶液加入上述凝胶中，搅拌均匀分装即可。此凝胶具有水溶性，外观透明美观，搽于皮肤上有特别的细腻滑爽感，与皮肤藕合效果极佳，可防止皮肤由于低温环境而造成的冻伤。
实施例4、抗冻肽复合组方，由抗冻肽、二甲基亚砜、胎牛血清、PMI-1640培养基组成，可用于组织、器官、细菌、细胞等活体材料的低温冷冻保存。
先将抗冻肽溶于无菌多重蒸馏水中，制成10mg/ml的母液，将二甲基亚砜、胎牛血清、PMI-1640培养基按照上述表中百分比混合后加入抗冻肽母液，使其最终浓度为配方中浓度，除菌过滤后即可。
实施例5、当所述的抗冻肽复合组方，由抗冻肽、透明质酸、氮酮、油酸、肝素、rhKGF-2(重组人角质细胞生长因子2)、甘油、尼泊金乙酯及无菌多重蒸馏水制成，可当作护肤品使用，具有细胞修复、保持皮肤弹性、减少皱纹的作用。
将抗冻肽、rhKGF-2、肝素分别用无菌多重蒸馏水配制成10mg/ml的母液，将透明质酸、甘油、油酸、氮酮、尼泊金乙酯按照配方要求用无菌多重蒸馏水混合均匀后，加入抗冻肽、rhKGF-2、肝素母液稀释至所需浓度，除菌过滤即可。
实施例6、当所述的抗冻肽复合组方，由抗冻肽、甘油、甘露醇、胸腺素beta-4、尼泊金乙酯及无菌多重蒸馏水制成，可用于烧伤、烫伤、各类手术切口、溃疡的治疗。
将抗冻肽、胸腺素beta-4分别用无菌多重蒸馏水配制成10mg/ml的母液，将甘露醇、甘油、尼泊金乙酯按照配方组分要求用无菌多重蒸馏水混合均匀后，加入抗冻肽、胸腺素beta-4母液稀释至所需浓度，除菌过滤即可。
实施例7、当所述的抗冻肽复合组方，由抗冻肽、透明质酸、氮酮、油酸、胸腺素beta-4、尼泊金乙酯及无菌多重蒸馏水制成，可用于烧伤、烫伤、各类手术切口、溃疡的治疗。
将抗冻肽、胸腺素beta-4分别用无菌多重蒸馏水配制成10mg/ml的母液，将透明质酸、油酸、氮酮、尼泊金乙酯按照配方组分要求用无菌多重蒸馏水混合均匀后，加入抗冻肽、胸腺素beta-4母液稀释至所需浓度，除菌过滤即可。
实施例8、当所述的抗冻肽复合组方，由抗冻肽、氧化锌、二氧化钛、Vital ET(VE磷酸酯络合月桂基亚胺二丙酸二钠)、α-红没药醇、环甲基硅酮及无菌多重蒸馏水制成，可用与防晒护肤品。
配方中，将抗冻肽用无菌多重蒸馏水配制成10mg/ml的母液，将Vital ET、α-红没药醇、环甲基硅酮混合搅拌均匀，然后加入少量无菌多重蒸馏水再次搅拌均匀，放置1小时后，分别加入氧化锌、二氧化钛及抗冻肽母液稀释至所需浓度，除菌过滤即可。
实施例9、当所述的抗冻肽复合组方，由抗冻肽、凡士林、蜂蜡、白油及其他成份组成膏霜剂。可用作皮肤防冻、防皲裂膏。
配方中各原料加入容器中(抗冻肽、香料和防腐剂除外)，加热至80℃使其融化，搅拌均匀，冷至58℃以下，加入香料和防腐剂，冷却至40℃时加入抗冻肽，搅拌均匀。
上述所列举的实例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明的限制，有关技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，所作出的各种变化，等同的技术方案也应属于本发明保护的范畴。
此外，本发明提供参考实例如下：
试验例1、反应温度对于乙酰氨基半乳糖过乙酰化的影响：
| 项 目 | 温度(℃) | 收率(％) | 备注 |
| 1 | 10 | 38％ | 杂峰很多，产物分离困难 |
| 2 | 25 | 41％ | 杂峰很多，产物分离困难 |
| 3 | 35 | 42％ | 杂质峰较多，产物分离较易 |
| 4 | 回流 | 52％ | 产物峰单一，分离纯化容易 |
试验例2、乙酰化半乳糖与Fmoc-Thr-OH投料比对于糖基化修饰反应的影响：
| 项目 | 投料比 | 收率(％) | 备注 |
| 1 | 1∶1 | 34％ | 产物峰明显，杂质较多 |
| 2 | 1.5∶1 | 42％ | 产物峰明显，杂质较多 |
| 3 | 2∶1 | 47％ | 产物峰明显，杂质较少 |
| 4 | 2.5∶1 | 48％ | 产物峰明显，杂质较少 |
| 5 | 3.3∶1 | 47.5％ | 产物峰明显，杂质较少 |
| 6 | 1∶1.5 | 31％ | 产物峰减少，杂质增多 |
| 7 | 1∶2 | 29％ | 产物峰减少，杂质增多 |
| 8 | 1∶2.5 | 22％ | 产物峰减少，杂质增多 |
注：表格中投料比为反应物之间的物料摩尔数之比。
试验例3、本发明抗冻多肽在治疗冻伤中的效果
以下参加试验人员均为志愿者，并能够按照要求正确使用供试产品。使用后无任何不良生理反应。
表一、含抗冻肽组合制剂对冻伤、皲裂皮肤的效果
| 项目 | 皮肤冻伤、皮肤皲裂 |
| 人数 | 60(30成年人，30儿童) |
| 效果 | 在冻疮部位及皲裂部位使用3天后，具有明显的改善局部血液循环及皮肤愈合效果；7天后，冻疮部位颜色恢复正常，发痒情况完全消失。 |
分别采用实施例9三种规格组合制剂，一天3～4次涂于冻疮或皲裂部位，连续7天，观察使用效果。
试验例4、本发明抗冻多肽在应用于护肤品中的效果
表二、含抗冻肽组合制剂对皮肤美容效果
| 项目 | 细胞修复、维持皮肤弹性、减少皱纹 |
| 人数 | 105(35～50岁女性) |
| 效果 | 使用21天后，面部皮肤具有明显光泽，细腻、毛孔缩小；原有色斑淡化甚至消失；面部皱纹减少，具有明显的抗衰老及美容效果。 |
分别采用实施例5三种规格的复合组方，试验者正常洁面后于早、晚时间各用一次本产品，连续使用21～30天，观察受试者皮肤状况，采用使用本产品前后对照及使用者本人感觉评判产品使用效果。
试验例5、本发明抗冻多肽在帮助伤口恢复中的效果
表三、含抗冻肽组合制剂对烧伤，烫伤、溃疡等伤口的作用
| 项目 | 轻度烧伤 | 溃疡 | 轻度烫伤 |
| 人数 | 40 | 80 | 30 |
| 效果 | 使用复合组方3～5天后，创伤面愈合，无色素沉着，疤痕轻微 | 使用复合组方4小时后，溃疡面分泌物显著减少，3天后溃疡创面肉芽组织开始生长，2周左右创面愈合，皮肤恢复原来肤色。 | 使用复合组方，能够有效减少伤口渗出液，3～5天后，创伤面愈合，无色素沉着，疤痕轻微。 |
采用实例6三种复合组方，通过对轻度烧伤、轻度烫伤及溃疡志愿者的试用，具有良好的促进皮肤愈合作用，同时皮肤愈合质量好，无色素沉着现象，瘢痕轻微。试验例6、本发明抗冻多肽在应用于皮肤防晒中的效果
表四、含抗冻肽组合制剂对皮肤的防晒效果
| 项目 | 对皮肤的抗紫外线及防晒效果 |
| 人数 | 110(25～45成年女性) |
| 效果 | 能够减少因紫外照射而产生的红斑及色素沉着可以有效防止紫外线对皮肤造成的伤害。具有良好的防晒效果。 |
分别采用实施例8五种规格复合组方，使用者于户外活动时，均匀涂抹本产品于皮肤暴露部位，按照防晒要求，每隔2～3小时左右，重复涂抹本品一次。
试验例7、本发明抗冻多肽在应用于细胞冷冻保存中的效果
表五、含抗冻肽组合制剂对3T3小鼠成纤维细胞的冷冻保护效果
采用实施例4中抗冻肽含量为0.5％的复合组方，试验对3T3小鼠成纤维细胞的冷冻保护效果。同时用92％FBS(胎牛血清)+8％DMSO(二甲基亚砜)低温保存液为对照。先将传代2～3次的生长状况良好的上述细胞用胰酶消化后离心收集，以50ml细胞培养瓶(生长面积：25cm2)加入2ml冻存液，按照相同程序冻存细胞。冻存细胞于液氮中保存12小时后取出在37℃水浴解冻后用PR1640+10％FBS培养基稀释后按照下列步骤检查细胞活力：
1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中。
2、加入0.5ml 0.4％台盼兰染液，染色2-3分钟。
3、吸取少许悬液涂于血球计数板上，加上盖片，镜下观察计数。，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：
细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×10000
注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10％以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。
4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。
细胞活力(％)＝无染色细胞数/计数细胞总数(染色细胞数+无染色细胞数)×100％
死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。
序列表：
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<110>北京金迪克生物技术研究所
<120>一种抗冻多肽、其合成及含有这种多肽的组合物和应用
<130>5633-105
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<170>PatentIn version 3.1
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Claims (16)
1.一种抗冻多肽，其特征在于，所述多肽序列为(NATA)n，所述多肽在每个Thr的羟基上修饰有乙酰氨基半乳糖，其中n＝2～16。
2.根据权利要求1所述的抗冻多肽，其特征在于，所述多肽序列为n＝2或3，且当n＝2时所述多肽分子量理论值为：1138。
3.权利要求1或2所述多肽的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)乙酰化：将乙酰氨基半乳糖在二氯甲烷中在氯化锡催化下同乙酸酐回流反应，反应结束后用正相硅胶柱分离，经过处理得到产物；
(2)糖基化：将上步反应产物和物质量为上步反应产物0.3～0.5倍的Fmoc-Thr-OH分别溶于无水二氯甲烷和无水乙腈中，然后加入到BF3-Et2O中搅拌反应，反应完毕经过后处理后，进行反相HPLC纯化；
(3)固定相多肽合成；将氨基酸单体，以HBTU/HOBt为缩合剂进行多肽合成，然后用三氟乙酸为切肽试剂，得到产物，其中氨基酸投料量为树脂取代值的2～4倍。
3、根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述Fmoc-Thr-OH物质量为上步反应产物0.4倍。
4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述氨基酸投料量为树脂取代值的3倍。
5.根据权利要求1所述的抗冻多肽的用途，所述抗冻多肽用于制备帮助伤口愈合的药物；或者用于制备用于细菌、细胞、组织或器官冷冻保存的药物；或者用于制备护肤品；或者制备防晒品。
6.一种含有权利要求1所述多肽的组合物，其特征在于，所述组合物含有如下质量百分比的成份：权利要求1所述多肽0.02～5％、其他辅料0.5～99.95％、其余为无菌多重蒸馏水。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述其他辅料包括保水剂，含量为0.5～60％。
8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述保水剂为甘油、透明质酸、油酸或凡士林的一种或两种组合。
9.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述其他辅料包括防晒剂，含量为0.5～5％。
10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述防晒剂为氧化锌或二氧化钛的一种或两种组合。
11.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述其他辅料包括防冻剂，含量为5～20％。
12.根据权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述防冻剂为二甲基亚砜。
13.根据权利要求7所述的多肽组合物，其特征在于，所述的其他辅料还包括如下成份的一种或几种：渗透压调节剂、稳定剂、基质、防腐剂、pH调节剂、促渗剂。
14.根据权利要求13所述的多肽组合物，其特征在于，所述渗透压调节剂为甘露醇，所述稳定剂为羟丙基甲基纤维素，所述基质为卡波姆-940或蜂蜡，所述防腐剂为尼泊金乙酯，所述pH调节剂为三乙醇胺，所述促渗剂为氮酮。
15.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述辅料还包括如下成份的一种或几种：基质或其他活性成分。
16.根据权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述基质为环甲基硅酮，所述其他活性成分为Vital ET或α-红没药醇的一种或两种组合。
17、根据权利要求11所述的多肽组合物，其特征在于，所述辅料还包括培养基质。
18、根据权利要求11所述的多肽组合物，其特征在于，所述培养基质为胎牛血清或PMI-1640培养液的一种或两种组合。
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