CN101507730B - 表没食子儿茶素没食子酸酯与柔红霉素的组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药和基因工程领域，提供了一种抑制肿瘤细胞增殖的组合物。该组合物含有表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和柔红霉素(DNR)，两者的质量比为600∶1～1∶2。EGCG和DNR联用，一方面抑制肿瘤细胞增殖的效果比单独使用效果的叠加更明显；另一方面，明显降低了DNR的使用量，大大降低DNR的心脏毒性，同时增强DNR的抗肿瘤效果。EGCG是天然的茶叶提取物，不仅资源丰富，价格低廉，经过了千年以上的饮用，几乎没有毒副作用，因此EGCG和DNR联用，相对减少了柔红霉素的用量及药物成本。本发明提供了一种高效廉价抗肿瘤药物组合物，提高了肿瘤的抑制率，同时降低了肿瘤患者的治疗成本。

Description

表没食子儿茶素没食子酸酯与柔红霉素的组合物及其应用

技术领域

本发明属于医药及基因工程领域，涉及组合物表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)与柔红霉素(DNR)及其应用。

背景技术

蒽环类药物是最有效的抗肿瘤的药物之一，包括DNR(DNR)和阿霉素(DOX)，可以治疗多种癌症，包括白血病和实体瘤(Minotti，G.，et al.，Anthracyclines：molecular advances and pharmacologic developments in antitumor activityand cardiotoxicity.Pharmacol Rev，2004.56(2)：p.185-229)，具有一个蒽环平面，可通过它嵌合于DNA碱基对之间并紧密地结合到DNA上，因而使核酸中含有相当高浓度的药物，这种嵌合可导致DNA空间结构的障碍，从而抑制DNA及DNA依赖的RNA合成，对RNA的影响尤为明显，并可选择性作用于嘌呤核苷。为细胞周期非特异性药物，对增殖细胞各期均有杀伤作用，但对G₂期作用更为显著。

DNR是一种重要的蒽环类抗癌药物，分子式C₂₇H₂₉NO₁₀，分子结构式如图7所示。中文别名：正定霉素，柔毛霉素，红比霉素，红保霉素，佐柔比星，红比脘。外文名：Daunorubicin，Daunomycin，Daunoblastin，Rubidomycin，Rubomycin，Ondena，Cerubidine.外文缩写：DNR，DRB，DM，F.I.6339，NSC-82151，13057R.P。化学名：(1S，3S)-3-乙酰基-1，2，3，6，11-六氢-3，5，12-三羟基-10-甲氧基-6，11-二氧-1-1萘基-3-氨基-2，3，6-三去氧-a-L来苏六吡喃糖甙。

DNR药物为橙红色针状结晶，易溶于水，其水溶液相当稳定，在0℃能保存3周，其活力不变，不溶于氯仿、丙酮、乙醚、苯。是Str.peucetius或Str.coeruleorubidus菌种所产生的抗生素，是从我国河北正定县土壤中得到的放线菌菌株，故亦名正定霉素。

在临床化疗治疗中，由于肿瘤细胞对蒽环类化合物的天然或获得性的耐受性以及药物对正常组织的毒性，尤其是心脏毒性(突发性心动过速，呼吸困难，心脏扩大，急性心力衰竭，肺水肿等，能迅速导致死亡，病检可见多灶性心肌退行性变，心脏毒性发生率为2％～10％。)使得蒽环类药物在临床应用上受到限制。DNR和阿霉素在体内会被代谢成为DNR醇和阿霉素醇，蒽环霉素使用时引起的急性和慢性的心脏毒性，也被认为主要是由蒽环类药物的羟基代谢物引起的。而且羟基代谢物的抗癌活性和药物原形相比，抗癌活性较弱。

在人体中，羰基还原酶CBR1为主要的DNR的代谢酶，CBR1位于21q22.12-(NM_001757)，是人的CBR基因。CBR1的cDNA序列是Wermuth从胎盘CDNA文库中得到编码277个氨基酸，蛋白的分子量为30375Da。CBR1对DNR的代谢，导致肿瘤细胞对药物的耐受，以及产生心脏毒性。

通过抑制羰基还原可以增强DNR的抗肿瘤活性以及减弱心脏毒性，如何保护蒽环类药物的羰基不被还原一直是本领域的一个重要课题。

茶叶(tea，camellia sinensis)是深受人们喜爱的饮品之一。全世界每年生产大约250万吨，其中20％为绿茶、78％为红茶、2％为乌龙茶。茶叶的种类虽然很多，但以绿茶为人瞩目，大量的体外研究及动物实验证明绿茶提取物有多种生物活性和药理效应，如防癌抗癌、抗血管生成、抗突变、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗炎、降血脂、抗血小板聚集等等，其中与癌症的关系是研究最为广泛、也是最复杂的有意义的重要课题。

绿茶中的主要成分为茶多酚，占茶叶干重的30％左右，茶多酚中大部分为儿茶素，表没食子儿茶素没食子酸酯((-)epigallocatechin gallate(EGCG))含量最高，占儿茶素的80％左右。EGCG分子式C₂₂H₁₈O₁₁，FW 458.4。它是一种高效广谱无毒副作用的生物抗氧化剂，俗称没食子儿茶素没食子酸酯。没食子酸酯能有效清除引发多种疾病和衰老的体内自由基和过氧化物，提高人体免疫力，延缓衰老，具有优异的抗病毒、降血脂、保鲜、美容等效能，在医药、保健、食品、日化等行业有广泛的用途。有报道称其可用于治疗白血病(专利申请CN1377644A)。但是绿茶提取物毕竟不是细胞毒类药物，在体外对肿瘤细胞的直接杀伤作用不很强。绿茶提取物及其主要成分不会也不能取代现有的抗肿瘤药物，其独特价值在于作为肿瘤化疗中的生化调节剂，可增强现有抗肿瘤药物的抗肿瘤活性，降低抗肿瘤药物的毒性。

到目前为止，还没有EGCG与DNR联合使用的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的组合物：表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)与DNR(DNR)。

本发明的另一个目的是提供上述组合物的应用。

本发明提供了一种新的抑制肿瘤细胞增殖的组合物，该组合物含有EGCG和DNR；其中，EGCG和DNR的质量比为600∶1～1∶2。

本发明中，没食子酸酯和DNR的质量比较好为500∶1～10∶1。

本发明中，没食子酸酯和DNR的质量比更好为200∶1～25∶1。

本发明中，没食子酸酯和DNR的质量比最好为100∶1～50∶1。

本发明还提供了上述组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明中，所述的肿瘤可以是肝癌或者白血病。

本发明的EGCG和DNR组合物可以抑制肿瘤细胞增殖，而且其效果比单独使用效果的叠加更明显。另一方面，EGCG和DNR联用，明显降低DNR的使用量，降低药物的毒副作用。

本发明中，将EGCG与DNR的组合物用于肿瘤细胞(例如，肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721和白血病细胞株Jurkat，来源中国科学院细胞库，上海岳阳路328号)，结果显示，与仅使用DNR相比，抑制肿瘤细胞增殖的效果明显增强。本发明的EGCG和DNR组合物可以抑制肿瘤细胞增殖，而且其效果比单独使用两种化合物效果的叠加更明显。EGCG和DNR联用，明显降低了DNR的使用量，其降低效果随着EGCG用量的增加而更加明显。DNR有心脏毒性、消化道反应、骨髓抑制等毒副作用，降低DNR的用量就意味着降低药物的毒副作用。

本发明中，将EGCG和DNR的组合物用于裸鼠抑制瘤模型，结果显示，与仅使仅使用DNR相比，本发明的EGCG与DNR组合物对裸鼠抑制瘤的生长的抑制效果显著增强。同时，检测以体重变化为指标的给药后药物的毒性效应显示，DNR毒性导致给药裸鼠体重降低，而EGCG无毒，单独使用时不影响裸鼠体重，并且和DNR联合使用的时候还可以显著减弱DNR毒性引起的裸鼠体重降低的效应。

EGCG和DNR联用，与单独使用EGCG或者DNR相比，在抑制肿瘤细胞生长面具有明显的增效作用，而且增效作用具有EGCG浓度梯度效应。本发明的实施例列举了EGCG和DNR含量比为25∶1，50∶1，250∶1，300∶1，500∶1，10∶1，100∶1，200∶1等。实验表明，在两者含量为600∶1-1∶2的范围都是有效果的。

进一步的实验表明，EGCG对DNR联用的增效是由于抑制了CBR1对DNR的代谢而实现的，通过检测肿瘤细胞中DNR的代谢物，DNR醇的含量，发现EGCG可降低代谢物的生成。代谢物生成量的减少，一方面说明DNR原型的增多，药物的抗肿瘤效果得以增强，一方面具有心脏毒性的DNR的醇代谢物的减少，也说明药物使用时毒性的降低。

本发明中，所述的肿瘤细胞可以是CBR1表达量高的细胞。

在实验结果也显示，EGCG对DNR的增效，在CBR1表达量高的细胞效果更明显。比如在高表达CBR1的HepG2和SMMC7721的增效效果，明显优于CBR1低表达的Hep3B.而在Hep3B中稳定超量表达CBR1后，EGCG对DNR的增效也显著了。这也与EGCG是通过作用CBR1而达到增效的内在机制符合。

本发明中还提供了一种杀伤肿瘤细胞的方法，即在肿瘤细胞中加入EGCG和DNR组合物，EGCG和DNR的质量比为60∶1～1∶2。

本发明中，所述的肿瘤细胞可以是HepG2、SMMC-7721或者Jurkat细胞。

本发明的组合物，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为7-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。

以本发明的EGCG与DNR的组合物为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的蛋白质和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的EGCG和DNR可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。此外，本发明的EGCG与DNR的组合物还可与其他治疗剂一起使用。

本发明中，EGCG与DNR的组合物可以是针剂或者片剂。

当本发明的EGCG与DNR的组合物被用作药物时，可将治疗有效剂量的该药物施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约1毫克DNR+40毫克EGCG/千克体重.当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明提供了一种新的组合物，该组合物含EGCG和DNR。该组合物可用于制备抗肿瘤药物。EGCG和DNR联用，用于制备抗肿瘤药物，可以大大降低DNR的心脏毒性，大大增强DNR的抗肿瘤效果，同时相对减少了DNR的用量及药物成本。由于EGCG是天然的茶叶提取物，而茶叶又是全世界三分之二的人口经常饮用的饮料。不仅资源丰富，价格低廉，经过了千年以上的饮用，几乎没有毒副作用。EGCG作为DNR的辅助药物使用，为一种新的高效价廉抗肿瘤药物的配伍方案，提高了肿瘤的抑制率，降低了肿瘤患者的治疗成本。

附图说明

图1是EGCG对柔红霉素(DNR)抑制肿瘤细胞HepG2增殖效果的影响统计图。可见，加入了EGCG后可以大大增强DNR的效果，而且加入的EGCG越多，抑制肿瘤细胞的效果更明显。并且，EGCG与DNR联用后，抑制肿瘤细胞增殖的效果不是简单的叠加，而是比分别加入相同剂量的药物的效果叠加后效果更明显。

图2是EGCG对DNR抑制肿瘤细胞SMMC-7721增殖效果的影响统计图。

图3是Western blotting检测稳定细胞株中CBR1的表达量。

图4是DNR或处理Hep3B-pcDNA3.1和Hep3B-CBR1 48h后的细胞存活统计图。

图5是5-氟尿嘧啶(5-FU)处理Hep3B-pcDNA3.1和Hep3B-CBR1 48h后的细胞存活统计图。(相同剂量的时候，DNR的抑瘤效果优与EGCG，此处，5-FU的作用只是作为阴性对照，即CBR1的表达仅仅改变细胞对DNR的耐受，但不影响对其他如5-FU的耐受。)

图6是EGCG与DNR联用抑制肿瘤细胞Hep3B-pcDNA3.1和Hep3B-CBR1增殖的统计图。

图7是DNR分子结构图。其中，圆圈所指示为3种化合物的结构差异。

图8是DNR醇的分子结构图。

图9是阿霉素的分子结构图。

图10是标准样品的色谱图，按洗脱先后，峰形分别指示阿霉素，DNR醇，DNR。

图11是DNR的标准曲线。以DNR浓度(DNR)为横坐标X，DNR(DNR)的峰面积与阿霉素(DOX)的峰面积之比为纵坐标Y。(这是计算DNR醇的含量的标准曲线)

图12是未加EGCG样品的HepG2色谱图。其中，A/B的左上角为前面两个峰(阿霉素和DNR醇)放大后的峰图。

图13是加入EGCG样品的HepG2色谱图。其中，A/B的左上角为前面两个峰(阿霉素和DNR醇)放大后的峰图。

图14是EGCG对HepG2细胞株中DNR醇的含量的影响。不加EGCG和加入EGCG比较.**：P＜0.01，n＝5。其中，纵坐标是μg柔红霉素醇(DNROL)/mg蛋白，即反应30分钟时，细胞裂解液蛋白中柔红霉素醇的含量。

图15是SMMC-7721细胞株中DNR醇的含量的影响。不加EGCG和加入EGCG比较.**：P＜0.01，n＝5。其中，纵坐标是μg柔红霉素醇(DNROL)/mg蛋白，即反应30分钟时，细胞裂解液蛋白中柔红霉素醇的含量。

图16是给药15天后，各组裸鼠形成的瘤体。从上到下分别为对照组，EGCG作用组，DNR作用组，EGCG联合DNR(DNR+EGCG)作用组的瘤体，每组瘤体下面附有对应的瘤体体重。其中，DNR+EGCG组和DNR组比较，*(1)：P＜0.05；EGCG+DNR组和对照组比较，**(2)：P＜0.01，n＝9。(*(2)仅为区别两组的显著性差异)

图17是图16所得瘤体图及其重量图。

图18是图16所得瘤体称重后按组取平均值的柱状图。

图19是药物处理后每组裸鼠体重随时间的变化。每一个点表示该组的平均体积。每条折线上点之间的间隔表示时间，即每3天测量一次裸鼠体重。

图20药物处理始末每组裸鼠的体重变化平均值。体重增加以正值表示，体重减轻以负值表示。其中，EGCG+DNR组和DNR组比较，*：p＜0.05。

具体实施方式

实施例1 EGCG对DNR抑制肿瘤细胞增殖的增效

用MTT方法来检测EGCG对DNR抑制肿瘤细胞增殖的效应的影响。选用的EGCG的浓度(20μM)，此浓度下EGCG单独使用时几乎不影响选用肿瘤细胞的生长。0.4μM的DNR作用HepG2 48小时后，细胞存活数为不加药的对照细胞的49.3％，分别和10μM，20μM的EGCG联合使用，细胞存活数降为40％和33.2％。EGCG联合DNR跟DNR单独作用相比，对细胞增殖的抑制增多了16％，增效显著，而且增效作用具有EGCG浓度梯度效应(图1)。在SMMC7721，EGCG显示出类似的增效作用的，DNR联合20μM EGCG后，细胞存活从65.9％降低到45.3％，抑制效果增强了20.6％(P＜0.01)，同样具有EGCG梯度效应(图2)。

实施例2 EGCG对DNR引起肿瘤细胞G2/M阻滞的增效

进一步检测EGCG对DNR引起细胞G2/M期周期阻滞效应的影响。同样选取了HepG2和SMMC7721细胞。0.03和0.04μMDNR处理HepG2后24小时，跟不加药的对照细胞相比，G2/M期的细胞分别从8.37％上升到35.9％和52.6％，发生了显著的G2/M期的周期阻滞，而且有DNR的浓度依赖性，浓度越高，G2/M期细胞数也越多。10μM EGCG对细胞周期没有显著影响，同浓度EGCG和0.03μMDNR联用时，G2/M期细胞数从35.9％上升到41.28％；EGCG和0.04μM DNR联用时，G2/M期细胞数从52.6％上升到61.55％。EGCG可以增强DNR对细胞G2/M期阻滞的效应。

SMMC7721的结果也相似，当EGCG分别和0.02μM，0.03μMDNR联用的时候，G2/M期的细胞跟相应浓度DNR单独作用时比较，分别从53.98％上升到61.04％，从69.9％上升到80.22％。

周期上的结果进一步验证CBR1的抑制剂EGCG可以增强DNR的抗肿瘤活性。

实施例3 EGCG在表达外源CBR1的Hep3B对DNR抗肿瘤活性的影响

首先用western blot检测稳定株的CBR1表达量，用抗CBR1抗体和抗Myc抗体检测细胞裂解液，Hep3B-CBR1中既有内源CBR1的表达，又有外转CBR1-Myc的表达，Hep3B-pcDNA3.1中只有内源CBR1的表达。用β-actin调平上样量(图3)。结果证明Hep3B-CBR1有较高量的CBR1的表达。

接着检测细胞中超量表达CBR1对细胞耐药性的影响。用MTT检测细胞存活作为细胞对药物耐受性的指标。药物在相同条件下处理对照组Hep3B-pcDNA3.1，Hep3B-CBR1，即用0.4μM DNR作用48小时，与Hep3B-pcDNA3.1相比，Hep3B-CBR1细胞的存活分别从34.4％上升到52.8％，同样，0.8μM DNR作用48小时，Hep3B-CBR1细胞的存活从25.5％上升到44.0％，差异显著(p＜0.01)。CBR1的表达使细胞对DNR更耐受(图4)。而用100μM的5-氟尿嘧啶处理两种细胞后，两种细胞的存活并没有明显变化(图5)。也就是这说明CBR1的表达使细胞对药物的耐受性是有药物特异性的，CBR1能使DNR失活，所以表达了CBR1的细胞对DNR耐受，而CBR1不能代谢5-氟尿嘧啶，所以不影响细胞对其耐受性。

然后，用EGCG和DNR联合使用，作用稳定细胞株，观察肿瘤细胞的增殖情况。0.4μMDNR，20μM EGCG联合0.4μMDNR分别处理Hep3B-CBR1细胞株后，细胞存活分别为52.8％和41.4％。0.8μMDNR，20μM EGCG联合0.8μMDNR联用，细胞存活分别44.0％降到25.3％，EGCG使细胞对DNR更敏感了。而同样处理Hep3B-pcDNA3.1细胞株后，EGCG并不能增强DNR的效应(图7)。

实施例4 EGCG对肿瘤细胞代谢DNR的抑制的标准方法

DNR代谢后的产物是DNR醇，DNR醇抗癌活性大大弱于原型DNR。那么通过对DNR醇的量的测定，可以反应DNR的代谢情况。也就可以通过测量代谢产物DNR的量来检测EGCG对DNR代谢的抑制，可以获得更直接的证据。

在细胞裂解液中加入DNR，随着被裂解液中CBR1的代谢，DNR生成DNR醇，裂解液中为DNR和DNR醇的混合物，选用HPLC来分离检测DNR和DNR醇，以DNR醇的含量来反映细胞对DNR的代谢能力。为了平衡样品制备过程中对各样品造成的影响，选用阿霉素作为HPLC的内参。具体步骤条件见实验方法部分。

1.色谱行为

DNR，DNR醇，阿霉素，都是蒽环类化合物，结构上的差异在于DNR和DNR醇的差别仅在于C13位，原型为羰基，代谢物为羟基，DNR和阿霉素的差别在于C14位上的，阿霉素多一个羟基(图7-图9)。配制阿霉素，DNR和DNR醇的标准样品，选择色谱条件，使3个化合物梯度洗脱，色谱图表明，3个峰峰形尖锐，完全分离。洗脱时间分别为阿霉素4.7分钟，DNR醇5.6分钟，DNR 8.3分钟(图10)。

2.标准曲线的制备

取DNR标准储备液稀释成1，5，10，50，250μg/ml，取200μL，加入2μg阿霉素，混匀后，照样品预处理操作，液氮吹干后150μl重溶，10μl进样分析，以DNR浓度(C)为横坐标X，DNR的峰面积与阿霉素的峰面积之比(Y)为纵坐标Y作标准曲线，得线性回归方程为：Y＝0.0907X+0.2041，R²＝0.9997，n＝3，在1μg/ml到250μg/ml范围内，有良好的线性关系(图11)。后续实验DNR醇定量按此公式计算，后续的实验中所测定的DNR醇的浓度均在此可信范围内。

实施例5 EGCG对肿瘤细胞代谢DNR的抑制

根据实施例4的方法，开始DNR的代谢实验，共选用了4个细胞，分别是HepG2，SMMC7721，Hep3B-pcDNA和Hep3B-CBR1.因为CBR1是游离在胞质中的代谢酶，所以选用制细胞裂解液上清来进行反应。以HepG2为例，在200μl反应体系中，含裂解液150μl，使蛋白总浓度达到约为2mg/ml，再加入DNR至100μM，辅酶NADPH200μM，磷酸盐缓冲液补齐体积，pH 7.0。同样的四组反应体系中分别加入EGCG浓度梯度：0，40，60，80μM。NADPH最后加入启动反应。每组三个平行。以不加裂解液为对照，实际DNR含量为实验组减去对照组。室温反应半小时后终止反应，加入2μg阿霉素作为内参，样品制备后上机检测DNR醇的生成量。

HepG2的细胞裂解液产生的DNR醇为1.07μg/mg protein/30min，加入EGCG 80μM后，产生的DNR醇为0.23μg/mg protein/30min，下降了4.7倍。色谱图如图10所示，三个峰依次为内标阿霉素，DNR醇和DNR。为了使产生的DNR醇的含量达到仪器可检测的范围，加入反应体系中的DNR的量较高，所以DNR的峰相对高，阿霉素和DNR醇的峰较低，为了方便观察，左上角显示的是独立放大后的阿霉素和DNR醇的峰。图12表示未加入EGCG时的样品峰图，而图13所代表的是加入80μM的EGCG后的峰图，代表DNR醇的第二峰的峰面积明显变小。DNR醇的下降的程度还跟EGCG的浓度相关，加入EGCG的浓度越高，产生的DNR就越少(图12)。

SMMC7721的细胞裂解液产生的DNR醇是1.19μg/mg protein/30min，加入EGCG 100μM后，产生的DNR醇为0.31μg/mg protein/30min，下降了3.8倍。同样DNR醇的含量的减少程度有EGCG的浓度梯度的依赖性(图14)。

然后检测稳定株Hep3B-pcDNA3.1和Hep3B-CBR1裂解液代谢产生DNR醇的含量，Hep3B-pcDNA和Hep3B-CBR1遗传分子背景完全相同，只是由于外转CBR1造成两细胞CBR1表达量的差异，western blot的检测结果见图23。如图34，首先，在未加入EGCG的情况下，Hep3B-CBR1代谢产生的DNR醇高于Hep3B-pcDNA3.1，分别为1.43和0.17μg/mg protein/30min，约8.41倍的差别，显然这个差距是由于CBR1表达量的差别引起的。也验证了外转的CBR1是具有DNR代谢活性的。然后再来看EGCG的作用，Hep3B-pcDNA3.1的结果是EGCG并没有引起显著的DNR醇的产量的变化，原因可能是Hep3B-pcDNA本来自身CBR1的表达量就很少，产生的DNR醇的量也很少，本底很低的情况下，即使有变化也不明显。Hep3B-CBR1的结果非常明显，加入最高剂量80μM EGCG后，代谢物DNR醇的量降低到了0.20μg/mg protein/30min，跟1.43μg/mg protein/30min比较，下降了7.2倍。

实施例6 EGCG联合DNR对裸鼠移植瘤生长的影响实验方法

选择人类肝癌SMMC7721细胞株复制裸鼠移植瘤模型。裸鼠左侧腋下皮下接种，一次性注射200μl细胞悬液(约3×10⁶个细胞).一周后，游标卡尺测量肿瘤生长情况，瘤体大小约为4mm×4mm。按肿瘤大小和体重随机分为4组，每组10只分别为(1)对照组Control(生理盐水)(2)EGCG(40mg/kg)组(3)DNR(1mg/kg)组(4)DNR(1mg/kg)+EGCG(40mg/kg)组。每3天测量瘤体大小和动物体重。给药15天后杀鼠取瘤后称取重量

用两个指标来判断给药的效果，一是用移植的肿瘤的生长情况来判断EGCG对DNR抗肿瘤生长的效果，二是用裸鼠自身的体重的变化来判断药物的毒性效应。

实施例7 EGCG联合DNR对裸鼠移植瘤生长的抑制作用

在整个实验过程中，我们每3天对肿瘤体积进行测量，从而连续监测肿瘤的生长情况。如图16所示，可以看到，在加药初期，4组的肿瘤平均大小差别不大，药物作用中后期，EGCG联合DNR组跟DNR单独作用比较，肿瘤生长更加缓慢。

用肿瘤的重量和体积来衡量EGCG对DNR抑肿瘤生长作用的影响。瘤体的重量是给药15天后杀鼠取瘤称取。如图17对照组瘤体重量平均值是0.50±0.12g，EGCG单独作用组的抑瘤率为15.7％，DNR单独作用组为16.8％，EGCG和DNR联合作用组的抑瘤率达到45.6％。

实施例8 EGCG联合DNR对裸鼠体重的影响

以裸鼠体重的变化作为药物毒性的一个指标是比较直观的。检测整个加药的过程中裸鼠体重的变化情况和计算加药始终的体重变化值，以期对药物的毒性作一个直观的评价。

如图16-19所示，在加药的过程中，EGCG组的体重和对照组比较并没有明显变化，DNR组(DNR)的体重和对照组相比，体重逐渐降低，而EGCG联合DNR组(EGCG+DNR)的体重变化介于对照组和DNR组之间。

如图20表示加药始末，每一只裸鼠的体重变化情况，再对每组求变化平均值。对照组的平均体重和EGCG组的体重药物处理结束时和处理前比较分别重了1.79g和1.48g，DNR组比对照组体重减轻2.31g，EGCG联合DNR组比对照组轻了1.34g。DNR组比EGCG联合DNR组体重减轻0.97g，有显著差异(p＜0.05)。

我们把体重的减轻作为药物毒性的一种标志，可以看到EGCG并没有对体重造成影响，认为它几乎无毒，这也与文献报道一致。DNR作为抗肿瘤药物，对机体也有一定的毒性，使体重减轻，值得我们注意的是，EGCG联合DNR组的体重虽然也有减轻，但是减轻的程度低于DNR单独作用组，也就是说，EGCG的加入，可以减轻DNR对机体的毒副作用，这可能与EGCG抑制了毒性代谢物——DNR醇的生成有关。

基于上述动物实验的结果，EGCG联合DNR用药，不仅作用机理明确，而且和DNR单独作用比较，可以增强DNR对肿瘤生长的抑制作用，在以体重为动物体毒性指标的毒性效应显示出，不仅自身安全无毒，还可一定程度减轻DNR的毒性效应。EGCG和DNR的联用，将是一种有益的药物配伍方案。

本发明所用的实验材料及试剂

1.肝癌细胞株Hep3B

物种：    人类

来源：    ATCC

组织：    肝细胞癌

2.肝癌细胞株SMMC7721：

物种：    人类

来源：    中国科学院细胞库，上海岳阳路328号

组织：    肝细胞癌

3肝癌细胞株Hep3B：

物种：    人类

来源：    ATCC

组织：    肝细胞癌

3.裸鼠试验用动物：

BALB/cA裸小鼠，日龄35-40天，体重18-22g，雌性，SPF级饲养，自由饮水，随意进食。由中国科学院上海药物研究所提供。

3.质粒

质粒pcDNA3.1 Myc-His A(-)(Clontech公司)

4.抗体：

Anti-myc monoclonal antibody(Cell Signaling公司)

Anti-β-actin monoclonal antibody(Sigma公司)

羊抗兔IgG-HRP(Calbiochem公司)

5.相关试剂

蛋白标准分子量(上海西巴斯生物技术开发公司)

硝酸纤维素膜(AMERSHAM公司)

新生小牛血清和胎牛血清(GIBICO公司)

胰蛋白酶(上海华美生物工程公司)

细胞培养基：RPIM1640(GIBICO)，Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)(GIBICO公司)

G418(Sigma公司)

6.试剂盒

PCR产物纯化试剂盒(Boehringer公司)

DNA连接试剂盒(Promega公司)

凝胶回收纯化试剂盒(Boehringer公司)

质粒抽提试剂盒(Roche公司)

MTS试剂盒(PROMEGA公司)

ECL显色试剂盒：(Santa Cruze公司)

细胞转染试剂盒：LIPOFECTIN(Invitrogen)

Bradford蛋白定量试剂盒(Pierce公司)

7.试剂配方

7.1 SDS-PAGE和western blotting

SDS-PAGE胶配方：

                12％分离胶(20ml)    5％浓缩胶(10ml)

H2O             6.6ml               6.8ml

30％丙烯酰胺    8.0ml               1.7ml

Tris-HCl        5.0ml               1.25ml

                (1.5M，pH8.8)       (1.0M，pH6.8)

10％SDS         0.2ml               0.1ml

10％APS         0.2ml               0.1ml

TEMED           8μl                10μl

5×Tris-Gly电泳缓冲液：15.1g Tris碱，94g Gly，50ml 10％SDS，加水至1L。

2×SDS-PAGE上样缓冲液：2.0ml 0.5 M Tris-HCl，2.0ml甘油，2.0ml，20％(W/V)SDS，0.5ml0.1％(W/V)溴酚蓝，1.0ml β-巯基乙醇，2.5mlddH2O。

SDS-PAGE染色液：90ml甲醇∶水(1∶1，V/V)；10ml冰乙酸；0.25g考马斯亮蓝R250。

SDS-PAGE脱色液：90ml甲醇∶水(1∶1，V/V)；10 ml冰乙酸。

TBS：12.1g Tris，9g Nacl用100ml水溶后调PH到7.4，定容到1L。

TBST(洗涤缓冲液)：含0.2％Tween-20的TBS。

封闭缓冲液：含5％的脱脂奶粉的洗涤缓冲液。

丽春红染色液：0.5g丽春红中加入1ml冰醋酸，溶解后再加入100ml水。

7.2细胞用：

1×PBS：Na2HPO4·12H2O 3.63g，KCl 0.2g，NaCl 8.0g，KH2PO4 0.24g用0.1N NaOH调节pH至7.4，加ddH2O定容至1L，120℃高压蒸汽灭菌20min，备用。

EDTA试剂：0.2g EDTA溶解于1×PBS中。

细胞冻存液：90％的完全培养基加5％的DMSO，10％相应血清。

裂解缓冲液(储备)：5×PBS 100ml；0.5M EDTA 5ml；Triton X-100 2.5ml用ddH2O定容至500ml。4℃储存。

裂解缓冲液(实际用液)：在裂解缓冲液(储备)中加入0.1mM的PMSF，10μM的pepstain A，10μM的leupeptin和25μg/ml aprotinin。

5×胰酶：NaCl 4.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4.12H2O 0.06g，KH2PO4 0.03g，胰酶1.25g。过滤灭菌，-20℃储存。用时用EDTA试剂稀释。

100mg/ml G418溶液：1g的G418溶于10ml的ddH2O中，过滤灭菌，-20储存，使用时按所需浓度稀释。

8.主要的仪器设备

SW-CJ-1FD型净化工作台(吴江市金晓空调净化有限公司)

TGL-16台式离心机(上海医用仪器厂)

HZ-C型台式恒温振荡器(江苏太仓科教器材厂)

FACS Calibur型流式细胞仪(BD公司)

微量加样器：1000μl/200μl/20μl(Gilson公司)

DS-800型凝胶成像系统及相应配制扫描仪(美国Bio-Rad公司)

超速离心机(Heraeus和Beckman公司)

高效液相色谱LG-4A，检测仪UV-VIS Detector(Shimadzu公司)

HMT20型恒温循环水浴锅(Heto公司)

MODEL VC130超声破碎仪(SONICS & MATETIALS公司)

Microplate Reader(medel 550)(Bio-RAD公司)

Claims (6)

1.一种抑制肿瘤细胞增殖组合物，其特征在于，该组合物含有表没食子儿茶素没食子酸酯和柔红霉素；表没食子儿茶素没食子酸酯和柔红霉素的质量比为600∶1-1∶2。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，表没食子儿茶素没食子酸酯和柔红霉素的质量比为500∶1～10∶1。

3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，表没食子儿茶素没食子酸酯和柔红霉素的质量比为200∶1～25∶1。

4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，表没食子儿茶素没食子酸酯和柔红霉素的质量比为100∶1～50∶1。

5.权利要求1所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤是肝癌或者白血病。

6.一种非治疗目的的抑制肿瘤细胞增长的方法，其特征在于，在体外肿瘤细胞中加入权利要求1所述组合物，所述的体外肿瘤细胞是HepG2、SMMC-7721或者Jurkat细胞。

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