CN102232959A - 一种降低柔红霉素心脏毒性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药及基因工程领域,涉及表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)降低蒽环类药物化疗药物引起的心脏毒性,及其与柔红霉素(DNR)组合在抑制肝癌中的应用。本发明提供了一种降低柔红霉素心脏毒性的方法:将柔红霉素与表没食子儿茶素没食子酸酯联用。将柔红霉素与表没食子儿茶素没食子酸酯联用于抑制肿瘤细胞生长,可以大大降低DNR的心脏毒性,并增强DNR的抗肿瘤效果,同时相对减少了DNR的用量及药物成本。由于EGCG是天然的茶叶提取物,而茶叶又是全世界三分之二的人口经常饮用的饮料,资源丰富,价格低廉,几乎没有毒副作用。EGCG作为DNR的辅助药物使用,提高了肿瘤的抑制率,降低了肿瘤患者的治疗成本。
Description
技术领域
本发明属于医药及基因工程领域,涉及表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)降低蒽环类药物化疗药物引起的心脏毒性,及其与柔红霉素(DNR)组合在抑制肝癌中的应用。
背景技术
随着治疗手段的不断进步,恶性血液病和实体瘤患者的长期无病生存率逐渐提高,减轻和防治肿瘤治疗带来的副作用,进一步提高患者的生活质量越来越受到临床医生的重视。在诸多方案中,化疗仍是治疗的主要手段,其中蒽环类药物是化疗的支柱药物,然而这类药物的心脏毒性限制了其应用。
蒽环类药物包括阿霉素、阿克拉霉素、柔红霉素、米托蒽醌、去甲柔红霉素等,是近40余年来被广泛应用的抗肿瘤药物,对造血系统肿瘤和实体肿瘤具有高效作用,在临床化疗方案中呈现出明显的剂量-效应性关系,对于在年轻人群中发病率高而且有望治愈的肿瘤,如急性白血病、霍奇金淋巴瘤以及乳腺癌等疾病具有不可替代的作用。化疗方案中蒽环类药物的剂量常常较大,心脏毒性发生率也会增加,限制了它的临床应用,国内外对此进行了大量基础与临床研究。蒽环类药物的心脏毒性威胁患者生命,且不可逆,预防蒽环类相关性心脏毒性的发生,尤其对具有高危因素的患者,可有效减少与之相关的致病率和病死率。
目前对于蒽环类药物引起心脏毒性的机制还不十分清楚,可能存在的机理有以下几种。①自由基及过氧化反应目前,研究最多的是氧自由基机制,其主要与蒽环类药物分子氧化还原过程中氧自由基的产生和(或)蒽环-铁螯合物的形成有关。在细胞水平上,蒽环类药物可引起氧自由基活性增高、细胞内钙负荷过重、心肌β受体下调及血管活性胺类释放,这些均可导致心肌损伤。另外也有研究表明阿霉素可结合氧化亚氮合成酶,从而导致超氧化物的增加和NO的减少,随之形成的过氧化亚硝酸盐可能导致了心脏毒性。②蒽环类药物在体内可以引起心肌α肌动蛋白、肌钙蛋白、肌浆球蛋白轻链、肌酸激酶M和对碘氧基笨甲醚等基因表达的选择性抑制,导致心肌纤维丧失。Kim等研究发现,阿霉素可诱导心肌细胞内Ca2+释放。蒽环类药物还可激活肌浆网上的Ca2+通道,使肌浆网释放到胞浆的Ca2+增加,快速增加的细胞内游离Ca2+浓度可使心电活动发生改变,导致各种心律失常发生。研究还发现,蒽环类药物能抑制心肌细胞肌浆网膜上的Ca2+2ATP酶基因表达,影响Ca2+2ATP酶的生物合成,使其活性降低,肌浆网摄取Ca2+的能力下降,线粒体产生ATP障碍,加重了细胞损伤,甚至导致心肌细胞死亡。③铁离子代谢紊乱引起的毒性。研究发现,铁调节蛋白-铁效应原件结合的改变,也可能是蒽环类药物心脏毒性的重要机制。正常生理条件下,心肌细胞内只有极少量的具有生物活性的游离铁,而铁蛋白作为心肌细胞内铁的主要储存形式,可以防止铁离子逸出,避免对组织和细胞的损伤。在病理条件下,某些还原剂可动员铁蛋白,使之释放有活性的Fe2+,通过参与催化Haber2Weiss反应,产生氧自由基,从而对心肌产生毒性作用。Paglia等报道,对死于心脏毒性的急性白血病患者进行尸解时,发现弥漫性含铁血黄素增多,且血清铁、转铁蛋白饱和度及铁蛋白浓度均有升高,推断铁负荷过重可能提高心肌细胞对蒽环类药物心脏毒性的敏感性,从而引发活性自由基大量产生,导致心脏毒性。
肿瘤治疗药物相关毒性是提高肿瘤治疗效果的主要障碍之一,充分认识各类抗肿瘤药物的心脏毒性,从而早期发现、预防和采取针对性治疗是肿瘤综合治疗的重要组成部分。随着蒽环类化疗药物的广泛应用,其心脏毒性的早期发现与防治日益受到重视,寻找早期、敏感、特异的评估心脏毒性的监测方法,选择高效的心脏保护剂及其最佳剂量是今后的探讨方向。
茶叶(tea,camellia sinensis)是深受人们喜爱的饮品之一。全世界每年生产大约250万吨,其中20%为绿茶、78%为红茶、2%为乌龙茶。茶叶的种类虽然很多,但以绿茶为人瞩目,大量的体外研究及动物实验证明绿茶提取物有多种生物活性和药理效应,如防癌抗癌、抗血管生成、抗突变、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗炎、降血脂、抗血小板聚集等等,其中与癌症的关系是研究最为广泛、也是最复杂的有意义的重要课题。
绿茶中的主要成分为茶多酚,占茶叶干重的30%左右,茶多酚中大部分为儿茶素,表没食子儿茶素没食子酸酯〔(-)epigallocatechin gallate(EGCG))含量最高,占儿茶素的80%左右。EGCG分子式C22H18O11,FW 458.4。它是一种高效广谱无毒副作用的生物抗氧化剂,俗称没食子儿茶素没食子酸酯。没食子酸酯能有效清除引发多种疾病和衰老的体内自由基和过氧化物,提高人体免疫力,延缓衰老,具有优异的抗病毒、降血脂、保鲜、美容等效能,在医药、保健、食品、日化等行业有广泛的用途。
到目前为止,还没有EGCG能降低化疗药物引起的心脏毒性的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种降低柔红霉素心脏毒性的方法。
本发明提供了一种降低柔红霉素引起的心脏毒性的方法,即将柔红霉素与表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)联用。
所述柔红霉素与表没食子儿茶素没食子酸酯的比例为1∶200~1∶30。
所述柔红霉素与表没食子儿茶素没食子酸酯的比例为1∶150~1∶40。
所述柔红霉素与表没食子儿茶素没食子酸酯的比例为1∶100~1∶60。
所述表没食子儿茶素没食子酸酯的用量为10μM~160μM。
所述表没食子儿茶素没食子酸酯的用量为20μM~80μM。
所述表没食子儿茶素没食子酸酯的用量为40μM~80μM。
将柔红霉素与表没食子儿茶素没食子酸酯可以联用于抑制肿瘤细胞生长。
本发明中,动物模型中EGCG降低DNR毒性的应用,可以是蒽环类药物代谢酶CBR1表达量高的肿瘤细胞,也可以是CBR1表达量低的肿瘤细胞。所述的肿瘤细胞可以是肝癌细胞。
本发明的一个实施例中,所述的肿瘤细胞是HepG2或者SMMC-7721。
本发明的EGCG和DNR组合物可以抑制肿瘤细胞增殖,而且其效果比单独使用效果的叠加更明显。另一方面,EGCG和DNR联用,明显降低DNR的使用量,降低药物的毒副作用。
本发明中,将EGCG与DNR的组合物用于肿瘤细胞(例如,肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721,来源中国科学院细胞库,上海岳阳路328号),结果显示,与仅使用DNR相比,抑制肿瘤细胞增殖的效果明显增强。本发明的EGCG和DNR组合物可以抑制肿瘤细胞增殖,而且其效果比单独使用两种化合物效果的叠加更明显。EGCG和DNR联用,明显降低了DNR的使用量,其降低效果随着EGCG用量的增加而更加明显。DNR有心脏毒性、消化道反应、骨髓抑制等毒副作用,降低DNR的用量就意味着降低药物的毒副作用。
本发明中,将EGCG和DNR合用于裸鼠抑制瘤模型,结果显示,与仅使用DNR相比,本发明的EGCG没有降低DNR对裸鼠抑制瘤的生长的抑制效果,但是可以降低DNR引起的心脏毒性。检测以体重变化为指标的给药后药物的毒性效应显示,DNR毒性导致给药裸鼠体重降低,而EGCG无毒,单独使用时不影响裸鼠体重,并且和DNR联合使用的时候还可以显著减弱DNR毒性引起的裸鼠体重降低的效应。在本发明中,由DNR引起的心脏毒性主要表现在心肌细胞脂质过氧化的指标丙二醛MDA的升高和心肌肌钙蛋白cTnT的升高。与单独使用DNR相比,EGCG和DNR两者合用可以显著降低丙二醛MDA和心肌肌钙蛋白cTnT升高的程度。
EGCG和DNR联用,与单独使用EGCG或者DNR相比,在抑制肿瘤细胞生长面具有明显的增效作用,而且增效作用具有EGCG浓度梯度效应。本发明中EGCG和DNR含量比可以为25∶1,50∶1,30∶1,150∶1,100∶1,200∶1等。
在实验结果也显示,EGCG对DNR的增效,在CBR1表达量高的细胞效果更明显。比如在高表达CBR1的HepG2和SMMC7721的增效效果,明显优于CBR1低表达的Hep3B。这也与EGCG是通过作用CBR1而达到增效的内在机制符合。在裸鼠移植瘤实验中,EGCG增效DNR对SMMC7721细胞的裸鼠移植瘤生长的抑制作用更为明显。而在CBR1低表达的Hep3B细胞的移植瘤模型中,EGCG增效DNR的作用不明显,但是EGCG降低DNR引起的心脏毒性的结果是一致的。
本发明的组合物,当在治疗上进行施用(给药)时,可提供不同的效果。通常,可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中,其中pH通常约为7-8,尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药,其中包括(但并不限于):肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。
以本发明的EGCG与DNR的组合物为例,可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的蛋白质和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的EGCG和DNR可以被制成针剂形式,例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物,可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。此外,本发明的EGCG与DNR的组合物还可与其他治疗剂一起使用。
本发明中,EGCG与DNR的组合物可以是针剂或者片剂。
当本发明的EGCG与DNR的组合物被用作药物时,可将治疗有效剂量的该药物施用于哺乳动物,当然,具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素,这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明提供了一种新的组合物,该组合物含EGCG和DNR。该组合物可用于制备抗肿瘤药物。EGCG和DNR联用,用于制备抗肿瘤药物,可以大大降低DNR的心脏毒性,大大增强DNR的抗肿瘤效果,同时相对减少了DNR的用量及药物成本。由于EGCG是天然的茶叶提取物,而茶叶又是全世界三分之二的人口经常饮用的饮料。不仅资源丰富,价格低廉,经过了千年以上的饮用,几乎没有毒副作用。EGCG作为DNR的辅助药物使用,为一种新的高效价廉抗肿瘤药物的配伍方案,提高了肿瘤的抑制率,降低了肿瘤患者的治疗成本。
附图说明
图1是EGCG对HepG2细胞增殖的抑制作用。
图2是EGCG对SMMC7721细胞增殖的抑制作用。
图3是EGCG促HepG2细胞凋亡的作用。
图4是EGCG促SMMC7721细胞凋亡的作用。
图5是Western blotting检测细胞株中内源CBR1的表达量。
图6是EGCG对DNR抑制肿瘤细胞HepG2增殖效果的影响统计图。
图7是EGCG对DNR抑制肿瘤细胞SMMC-7721增殖效果的影响统计图。
图8是EGCG对DNR抑制肿瘤细胞Hep3B增殖效果的影响统计图。
图9是EGCG增强DNR诱导肿瘤细胞HepG2凋亡能力的图。
图10是图9凋亡细胞的数值统计图。
图11是EGCG增强DNR诱导肿瘤细胞SMMC7721凋亡能力的图。
图12是图11凋亡细胞的数值统计图。
图13是SMMC7721和Hep3B细胞裸鼠移植瘤实验的体重变化图,各分为四组:对照组,EGCG作用组,DNR作用组,EGCG联合DNR(DNR+EGCG)。左边为加药期间裸鼠的体重变化趋势,右边为加药前后的体重差。其中,DNR+EGCG组和DNR组比较,(*):P<0.05,n=8,SMMC7721组和Hep3B组显示一致的结果。
图14是药物对SMMC7721细胞裸鼠移植瘤的生长抑制作用图。左边为用药期间各组裸鼠瘤体的生长曲线图,中间为用药结束后各组的瘤体图,右边为各组的瘤体重量差异图。其中,DNR+EGCG组和DNR组比较,(**):P<0.01,n=8。
图15是药物对Hep3B细胞裸鼠移植瘤的生长抑制作用图。左边为用药期间各组裸鼠瘤体的生长曲线图,中间为用药结束后各组的瘤体图,右边为各组的瘤体重量差异图。其中,DNR+EGCG组和DNR组比较,没有显著差异。
具体实施方式
实施例1EGCG在20μM浓度下使用对肿瘤细胞增殖没有抑制作用
用MTT方法来检测EGCG抑制肿瘤细胞增殖的效应。如图1、2所示,在HepG2和SMMC7721细胞中,加入EGCG的浓度分别为(20μM),(40μM),(80μM),(160μM),高浓度的EGCG(>80μM)对肿瘤细胞有一定的毒性。选用的EGCG的浓度(20μM),此浓度下EGCG单独使用时几乎不影响选用肿瘤细胞的生长。
实施例2EGCG在20μM浓度下使用对肿瘤细胞没有促凋亡作用
用流式细胞仪检测EGCG促肿瘤细胞凋亡的效应(图3、图4)。在SMMC7721和HepG2细胞中,加入EGCG的浓度分别为(20μM),(40μM),(80μM),(160μM),然后用凋亡试剂盒检测药物作用后的细胞,低浓度的EGCG没有促凋亡能力。说明低浓度的EGCG(<40μM)对肿瘤细胞杀伤能力很小,EGCG在低浓度下几乎没有细胞毒作用。
实施例3EGCG在20μM的浓度下增加柔红霉素的作用
用MTT方法检测DNR以及EGCG与DNR合用对细胞增殖的影响。在CBR1表达量高(图5)的HepG2(图6)和SMMC7721(图7)细胞中,EGCG在20μM的浓度下可以增加柔红霉素对细胞增殖的抑制作用,在CBR1表达量低的Hep3B(图8)细胞中,EGCG在20μM的浓度下未能显著增加DNR的作用,但也不减低DNR的作用。
用流式细胞仪检测DNR单用以及EGCG与DNR合用对细胞凋亡的影响。如图9-图12所示,在HepG2和SMMC7721细胞中,EGCG在20μM的浓度下可以增加柔红霉素促细胞凋亡的能力。
实施例4EGCG联合DNR对裸鼠体重的影响
EGCG联合DNR的对裸鼠化疗的给药方式:
药物配制:EGCG的配制方法是先将EGCG针剂或粉末溶于含1%DMSO的双蒸水中,配成20mg/ml的溶液,使用时再用生理盐水稀释到所用浓度。
DNR的配置方法是先将柔红霉素针剂或粉末溶于双蒸水中,配成5mg/ml的溶液,使用时再用生理盐水稀释到所用浓度。
给药方式:(1)对照组,每天注射生理盐水0.2ml/20g体重
(2)EGCG组:剂量为40mg/kg体重/次,每天一次,共给15次。
(3)柔红霉素组:剂量为1mg/kg体重/次,隔天一次,共给7次。
(4)柔红霉素+EGCG组:给药剂量为(2)和(3)组相加。给药方式为每天同一时间注射EGCG,与EGCG组一致;柔红霉素与EGCG组合使用当天,先注射EGCG,5小时后注射柔红霉素。
以上均为腹腔注射,给药体积为0.2ml/20g体重。
以裸鼠体重的变化是化疗药物毒性的一个指标。检测整个加药的过程中裸鼠体重的变化情况以及计算加药前后的体重变化值,对药物的毒性作一个直观的评价。
裸鼠左侧腋下皮下接种,一次性注射200μl细胞悬液(约3x106个细胞).一周后,游标卡尺测量肿瘤生长情况,瘤体大小约为4mm×4mm。按肿瘤大小和体重随机分为4组,每组10只分别为(1)对照组Control(生理盐水)(2)EGCG(40mg/kg)组(3)DNR(1mg/kg)组(4)DNR(1mg/kg)+EGCG(40mg/kg)组。每3天测量瘤体大小和动物体重。给药15天后杀鼠、取血、取瘤并称取重量。
如图13所示,在加药的过程中,EGCG组的体重和对照组比较并没有明显变化,DNR组(DNR)的体重和对照组相比,体重逐渐降低,而在DNR的基础上加入EGCG即EGCG联合DNR组(EGCG+DNR)的体重变化介于对照组和DNR组之间,说明EGCG在一定程度上降低了DNR对裸鼠体重的影响。
在SMMC7721移植瘤模型中,对照组的平均体重和EGCG组的体重药物处理结束时和处理前比较分别重了2.20g和2.33g,DNR组比对照组体重减轻2.19g,EGCG联合DNR组比对照组轻了0.96g。DNR组比EGCG联合DNR组体重减轻1.23g,有显著差异(p<0.05)。
在Hep3B移植瘤模型中,对照组的平均体重和EGCG组的体重药物处理结束时和处理前比较分别重了0.38g和0.10g,DNR组比对照组体重减轻2.43g,EGCG联合DNR组比对照组轻了1.35g。DNR组比EGCG联合DNR组体重减轻1.23g,有显著差异(p<0.05)。
实施例5EGCG对柔红霉素引起的裸鼠血清中MDA和cTnT含量升高的影响
临床观察和实验研究均已证实,柔红霉素能诱导人、狗、大鼠、家兔及小鼠等多种动物的心肌损伤。研究表明柔红霉素作用于心肌细胞后形成氧自由基,引起心肌细胞膜、线粒体膜发生脂质过氧化反应,使细胞膜的结构改变,膜的完整性被破坏,膜的流动性降低,通透性增加,导致心肌细胞损伤。线粒体膜受损,线粒体肿胀甚至崩解,线粒体钙泵受损,导致血液中心肌肌钙蛋白T(cTnT)的升高,同时,膜脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的含量增加,与核酸和蛋白质发生交联后抑制核酸和蛋白质的合成,影响心肌细胞修复氧化损伤的能力。
血液中心肌肌钙蛋白T(cTnT)和膜脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量的升高是心肌细胞损伤的重要指标。在本实验中,裸鼠血液凝血后3000rpm离心10分钟,取上层血清,用ELISA试剂盒对血清中MDA和cTnT含量进行检测。给药方式同实施例4。
在Hep3B移植瘤模型中,对照组和EGCG组裸鼠血液中MDA和cTnT的含量没有明显变化。DNR组与对照组相比,MDA从12.70±1.38升高到15.63±1.99,cTnT从249.69±13.71升高到290.55±7.06,具有显著差异(p<0.001)。EGCG组与对照组没有显著差异。EGCG联合DNR组与DNR组相比,两者分别下降到12.87±1.70和260.64±20.78,接近对照组,与DNR组存在显著差异(p<0.01)。在SMMC7721移植瘤模型中,对照组和EGCG组裸鼠血液中MDA和cTnT的含量没有明显变化。DNR组与对照组相比,MDA从11.11±2.73升高到14.86±2.06,cTnT从122.59±9.10升高到157.34±14.64,具有显著差异(p<0.001)。EGCG组与对照组没有显著差异。EGCG联合DNR组与DNR组相比,两者分别下降到11.21±2.99和121.82±14.91,与对照组相当,与DNR组存在显著差异(p<0.01)。
Hep3B组:
SMMC7721组:
实施例6EGCG对柔红霉素抑制裸鼠移植瘤生长作用的影响
在整个实验过程中,我们每3天对肿瘤体积进行测量,从而连续监测肿瘤的生长情况。为了观察EGCG在降低DNR毒副作用的同时对DNR抑制裸鼠移植瘤生长抑制作用的影响。从图中可以看到,在SMMC7721的移植瘤模型中,加药初期,4组的肿瘤平均大小差别不大,药物作用中后期,EGCG联合DNR组跟DNR单独作用比较,肿瘤生长更加缓慢。在Hep3B的移植瘤模型中,EGCG联合DNR组跟DNR单独作用比较,肿瘤的生长速度没有明显差异。因此在裸鼠移植瘤模型中,EGCG可以降低DNR的毒副作用,却没有降低DNR的抗肿瘤作用。
按常规方法给药(亦可参见实施例4),用肿瘤的重量和体积来衡量EGCG对DNR抑肿瘤生长作用的影响。瘤体的重量是给药15天后杀鼠取瘤进行称量。如图14,在SMMC7721的移植瘤中,对照组瘤体重量平均值是0.66±0.13g,EGCG单独作用组的抑瘤率为11.7%,DNR单独作用组为22.3%,EGCG和DNR联合作用组的抑瘤率达到40.8%。在Hep3B的移植瘤中(图15),对照组瘤体重量平均值是0.73±0.54g,EGCG单独作用组的抑瘤率为18.8%,DNR单独作用组为34.8%,EGCG和DNR联合作用组的抑瘤率达到33.5%。
本发明所用的实验材料及试剂
1.肝癌细胞株Hep3B
物种:人类
来源:ATCC
组织:肝细胞癌
2.肝癌细胞株SMMC7721:
物种:人类
来源:中国科学院细胞库,上海岳阳路328号
组织:肝细胞癌
3肝癌细胞株HepG2:
物种:人类
来源:ATCC
组织:肝细胞癌
3.裸鼠试验用动物:
BALB/cA裸小鼠,日龄35-40天,体重18-22g,雌性,SPF级饲养,自由饮水,随意进食。由中国科学院上海药物研究所提供。
4.抗体:
Anti-CBR自制多克隆抗体
Anti-β-actin monoclonal antibody(Sigma公司)
羊抗兔IgG-HRP(Calbiochem公司)
5.相关试剂
蛋白标准分子量(上海西巴斯生物技术开发公司)
硝酸纤维素膜(AMERSHAM公司)
新生小牛血清和胎牛血清(GIBICO公司)
胰蛋白酶(上海华美生物工程公司)
细胞培养基:RPIM1640(GIBICO),Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)(GIBICO公司)
G418(Sigma公司)
6.试剂盒
小鼠血清ELISA试剂盒(R&D公司),进口分装
MTS试剂盒(PROMEGA公司)
ECL显色试剂盒:(Santa Cruze公司)
7.试剂配方
7.1SDS-PAGE和western blotting
SDS-PAGE胶配方:
5×Tris-Gly电泳缓冲液:15.1g Tris碱,94g Gly,50ml 10%SDS,加水至1L。
2×SDS-PAGE上样缓冲液:2.0ml 0.5M Tris-HCl,2.0ml甘油,2.0ml,20%(W/V)SDS,0.5ml0.1%(W/V)溴酚蓝,1.0ml β-巯基乙醇,2.5mlddH2O。
SDS-PAGE染色液:90ml甲醇∶水(1∶1,V/V);10ml冰乙酸;0.25g考马斯亮蓝R250。
SDS-PAGE脱色液:90ml甲醇∶水(1∶1,V/V);10ml冰乙酸。
TBS:12.1g Tris,9g Nacl用100ml水溶后调PH到7.4,定容到1L。
TBST(洗涤缓冲液):含0.2%Tween-20的TBS。
封闭缓冲液:含5%的脱脂奶粉的洗涤缓冲液。
丽春红染色液:0.5g丽春红中加入1ml冰醋酸,溶解后再加入100ml水。
7.2细胞用:
1×PBS:Na2HPO4·12H2O 3.63g,KCl 0.2g,NaCl 8.0g,KH2PO40.24g用0.1N NaOH调节pH至7.4,加ddH2O定容至1L,120℃高压蒸汽灭菌20min,备用。
EDTA试剂:0.2g EDTA溶解于1×PBS中。
细胞冻存液:90%的完全培养基加5%的DMSO,10%相应血清。
裂解缓冲液(储备):5×PBS 100ml;0.5M EDTA 5ml;Triton X-1002.5ml用ddH2O定容至500ml。4℃储存。
裂解缓冲液(实际用液):在裂解缓冲液(储备)中加入0.1mM的PMSF,10μM的pepstainA,10μM的leupeptin和25μg/ml aprotinin。
8.主要的仪器设备
SW-CJ-1FD型净化工作台(吴江市金晓空调净化有限公司)
TGL-16台式离心机(上海医用仪器厂)
HZ-C型台式恒温振荡器(江苏太仓科教器材厂)
FACS Calibur型流式细胞仪(BD公司)
微量加样器:1000μl/200μl/20μl(Gilson公司)
超速离心机(Heraeus和Beckman公司)
Microplate Reader(medel 550)(Bio-RAD公司)
Claims (10)
1.一种降低柔红霉素心脏毒性的方法,其特征在于,将柔红霉素与表没食子儿茶素没食子酸酯联用。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述柔红霉素与表没食子儿茶素没食子酸酯的比例为1∶200~1∶30。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述柔红霉素与表没食子儿茶素没食子酸酯的比例为1∶150~1∶40。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述表没食子儿茶素没食子酸酯的用量为10μM~160μM。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述表没食子儿茶素没食子酸酯的用量为20μM~80μM。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述表没食子儿茶素没食子酸酯的用量为40μM~80μM。
7.一种柔红霉素与表没食子儿茶素没食子酸酯的药物组合物,其特征在于,所述柔红霉素与表没食子儿茶素没食子酸酯的比例为1∶200~1∶30。
8.权利要求1所述的方法的应用,其特征在于,将柔红霉素与表没食子儿茶素没食子酸酯联用于抑制肿瘤细胞生长。
9.如权利要求8所述的应用,其特征在于,所述的肿瘤细胞是肝癌细胞。
10.如权利要求8所述的应用,其特征在于,所述的肿瘤细胞是CBR1表达量高的细胞。
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《核化学与放射化学》 20030531 冉铁成等 茶多酚主要成分对肿瘤多药耐药性的逆转作用 第25卷, 第2期 * |
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