CN101505790A - 眼病的治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及至少一种蛋白酶在制备用于治疗和/或预防血管新生相关眼病的药物中的用途，所述血管新生相关眼病选自老年性黄斑变性(AMD)、脉络膜新生血管形成、Hippel－Lindau病、虹膜新生血管形成、缺血性增殖性视网膜病、角膜新生血管形成或增殖性镰状细胞视网膜病，其中至少一种蛋白酶选自植物、非哺乳动物或微生物蛋白酶。

Description

眼病的治疗
本发明涉及治疗血管新生相关疾病的药物。
血管新生定义为从已存在的血管长出内皮细胞形成新血管的过程。在这个过程中，内皮细胞到达下层的基底膜，增殖、迁移至邻近组织内并形成管状结构。最后，管与管之间的连接形成，血流建立。能够适合改变要求的成熟组织既需要可溶性因子例如缺氧诱导因子(HIF)和血管内皮因子(VEGF)，又需要细胞-细胞间以及细胞-基质间的相互作用。
VEGF最初被描述为引起实质性血管渗漏的因子，并被命名为血管通透性因子(VPF)。基于其对内皮细胞的促有丝分裂效应，该蛋白后来被重命名为血管内皮细胞生长因子(VEGF)。
VEGF增加微血管床的通透性，并因此促进液体和蛋白从血管的渗漏。这导致水肿、伤口渗液和血清肿(例如手术后)、渗出(例如慢性炎性疾病中的渗出)、腹水(例如癌症中的腹水)的发生发展。VEGF在诱导血管通透性方面比组胺强10000倍。
此外，VEGF是内皮细胞增殖的最有效的刺激物之一。最终，它刺激内皮细胞形成毛细血管，因此促进对血管生成必要的事件的级联。血管新生(即在新形成的组织甚至是沉积物(如斑块等)中从已存在的血管中长出新的毛细血管)促进众多病理状态的发生和发展。在生理状态下，血管生成是严密调节的过程。在病理状态如癌症、类风湿性关节炎、子宫内膜异位症、银屑病或眼部新生血管形成中，该过程显著增强并失调。
越来越多的证据表明：抗血管生成药物将改进将来对如癌症、类风湿性关节炎、银屑病和眼部新生血管形成和其它疾病的治疗。体内实验证明：缺氧(例如肿瘤坏死区域附近)在不同类型的细胞中既能诱导VEGF的表达又能诱导VEGF受体(VEGFR-1)的表达。缺氧引起缺氧诱导因子-1(HIF-1)的表达。随后，HIF-1复合物积聚在细胞核中，并结合到DNA的HIF-1结合位点上，分别启动、上调VEGF-mRNA的转录(VEGF-mRNA的转录启动邻近血管以出芽方式长入缺氧组织中的血管生成过程)。此外，VEGF表达能被多种促炎性细胞因子诱导/上调，这一点已在多种慢性炎症模型如银屑病或类风湿性关节炎中所证实。
VEGF可经α2巨球蛋白(α2M)途径通过蛋白酶激活的α2M从循环中去除。α2M-蛋白酶复合物能够与VEGF结合在表面隆起上。形成的α2M-酶-VEGF复合物与如巨噬细胞和内皮细胞的细胞表面表达的LRP受体(低密度脂蛋白受体相关蛋白受体)结合而被吞噬和破坏掉。蛋白水解酶的口服治疗增加了激活的α2M分子的数目，因此提高了有机体细胞因子/生长因子的破坏能力(Desser L et al.Cancer ChemotherPharmacol Suppl(2001)47：S10-S15；Lauer D et al.Cancer ChemotherPharmacol Suppl(2001)47：S4-S9)。
最近，已提出将一些使用VEGF受体阻断剂或抗VEGF抗体的治疗性方法用于治疗涉及血管生成增加的疾病，主要是癌症，也可用于治疗涉及眼部血管生成的疾病如黄斑变性。
已证明眼部新生血管形成或血管新生是失明的最普遍原因，并是约20种不同眼病的病理基础。例如在糖尿病中，视网膜中形成的新毛细血管侵入玻璃状液，引起出血和失明。
WO 2005/110453涉及人野生型和突变型MT-SP1蛋白酶用于剪切VEGF和VEGF受体的用途。这样的剪切引起血管生成减少并因此可用于治疗血管生成相关病状。
JP 60112720 A涉及番木瓜蛋白酶和柠檬酸在治疗与血管生成无关的疾病(例如青光眼)中的用途。
WO 2004/046199公开了硫酸软骨素治疗眼病的用途。
WO 2005/056784涉及纳豆激酶(nattokinase)治疗糖尿病的用途。
SU 1342500描述了番木瓜蛋白酶在治疗如青光眼的眼病的用途。
US 6103756涉及可用于治疗眼病的包含抗氧化剂和黄酮类化合物的组合物。
本发明的目标是提供用于治疗或预防与血管新生有关的眼病的药物。
因此，本发明涉及至少一种蛋白酶在制备用于治疗和/或预防与血管新生相关眼病的药物中的用途，所述血管新生相关眼病选自老年性黄斑变性(AMD)、脉络膜新生血管形成、Hippel-Lindau病、虹膜新生血管形成、缺血性增殖性视网膜病、角膜新生血管形成或增殖性镰状细胞视网膜病，其中至少一种蛋白酶选自植物、非哺乳动物或微生物蛋白酶。
令人惊奇地发现，特别是包含至少一种优选选自植物、非哺乳动物或微生物蛋白酶的蛋白酶组合的药物，当对个体使用时，使VEGF水平显著降低(与所述个体使用本发明的药物之前的VEGF水平相比，降低至少40％，优选至少50％，更优选至少60％，再更优选至少70％，最优选至少80％，特别是至少90％)，从而减少血管生成。因此，至少一种蛋白酶，优选至少两种(至少三种、至少四种、至少五种、至少六种)蛋白酶的组合，能用于预防和/或治疗个体血管新生相关眼病。特别适合使用微生物、非哺乳动物和植物蛋白酶，因为所述蛋白酶当与人或动物细胞，特别是与内皮细胞接触时不表现出显著的毒性。即使是这里公开的蛋白酶的组合对动物或人也没有毒性，但却作用于血管生成过程。
有趣的是，可表明源自哺乳动物(即人或动物)的蛋白酶如胰蛋白酶或糜蛋白酶不能抑制或预防血管生成。因此，向个体单独使用这种蛋白酶不可以用于预防或治疗血管新生相关疾病。
如这里所定义的术语“药物”不仅包括药物制品而且包括膳食补充剂。
如这里所用的“植物蛋白酶”和“动物蛋白酶”和“非哺乳动物蛋白酶”是指植物或非哺乳动物中天然存在并由此提取或获得的蛋白酶。“植物蛋白酶”和“动物蛋白酶”和“非哺乳动物蛋白酶”也可是重组蛋白酶，该重组蛋白酶的蛋白酶编码DNA(如cDNA)分别源自或获自植物和动物(在其基因组中天然包含所述DNA)，并被克隆进入合适载体并在培养的原核(如细菌)或真核(如昆虫细胞、哺乳动物细胞)细胞中表达。
如这里所用的“微生物蛋白酶”是微生物例如细菌和真菌(如酵母、霉菌)中天然存在的蛋白酶。但是所述蛋白酶也可从其他细胞或有机体中分离，只要所述细胞和有机体具有微生物蛋白酶的DNA并能产生重组所述蛋白酶。
当治疗和/或预防的血管生成相关眼病选自以上所列眼病时，特别合适使用根据本发明的药物。所有这些疾病表现出血管生成增加，主要是由于体内血管内皮生长因子(VEGF)水平增加。但是，特别优选使用本发明的药物治疗老年性黄斑变性。
也可使用本发明的药物治疗一些血管新生相关疾病。
例如，眼部新生血管形成是失明最常见的原因(老年性黄斑变性、Hippel-Lindau病、Behcet’s综合征、原发性眼部新生血管形成)。
特别优选使用本发明的药物预防和/或治疗罹患高水平VEGF引起和血管生成相关的疾病的个体，凭此这些疾病不是主要或完全与增殖活性增加相关。
至少一种植物蛋白酶优选选自菠萝蛋白酶、番木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶或黄瓜素。
根据本发明优选使用的植物蛋白酶如上所列。
这些蛋白酶可通过在宿主中重组表达或者通过从天然产生所述蛋白酶的植物中提取而获得，凭此提取物本身可直接用于制备根据本发明的药物。蛋白酶的提取方法在本领域中是熟知的。
例如，菠萝蛋白酶可从收获果实之后的菠萝树桩或根部制备。从田地里搜集这些树桩或根部，剥落并碾碎以提取含有可溶性菠萝蛋白酶的汁液。进一步的处理包括将酶沉淀并进一步将其纯化。
通过收集番木瓜树果实的乳浆可将番木瓜蛋白酶制成粗制干燥材料。在果实颈部刻痕之后，使乳浆在果实上干燥或者滴入容器以收集乳浆。然后将乳浆进一步干燥。干燥的乳浆这时称为粗制干燥材料。有必要进行纯化步骤以去除污染物。该纯化步骤由溶解和提取活性番木瓜蛋白酶所构成。
根据本发明的优选具体实施方式，微生物蛋白酶选自纳豆激酶、米曲霉菌酶(brinase)、灰色链丝菌蛋白酶(pronase)、蜂蜜曲霉蛋白酶(seaprose)、舍雷肽酶(serrapeptase)或枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)。
微生物蛋白酶也可通过重组技术获得或直接从包含产生所述蛋白酶的微生物的微生物培养物中分离获得。
例如，纳豆激酶是从纳豆(一种由大豆发酵制成的日本传统食品)中获得，或从包含能够产生所述蛋白酶的枯草杆菌(Bacillus subtilis)的特定亚种(纳豆菌)有机体的培养物获得。纳豆菌可从天然肥料和日本商品纳豆中分离。该菌株能够产生降解纤维蛋白的高活性纳豆激酶产物。必须优化碳源、有机氮源或无机氮源、矿物盐、最初pH和温度以从纳豆菌中生产纳豆激酶。发现，例如，纳豆菌的优化的接种物体积是大约5％(v/v)。优化的培养基可含有2.8％大豆蛋白、1％酵母提取物和0.8％麦芽糖。此外，优化的pH和温度可分别是约6.5±0.5和约30℃至40℃。优化的孵育时间为18至48小时。发酵培养液中的纳豆激酶活性可增高至超过40FU/ml。
例如，舍雷肽酶是从位于蚕肠道的沙雷氏菌E15中分离的蛋白水解酶。该酶能用作治疗疼痛和炎症的天然补充剂，并在亚洲和欧洲的部分地区用于临床应用。舍雷肽酶用作通常用于治疗关节炎和炎症的非甾体抗炎药物(NSAIDS)的替代药物。
非哺乳动物蛋白酶优选选自立止血(reptilase)、磷虾酶、巴曲酶(batroxobin)或蚓激酶(lumbrokinase)。
这些蛋白酶可通过本领域已知方法重组制备或直接从各自动物中分离制备。
特别优选的药物包含菠萝蛋白酶和/或番木瓜蛋白酶(作为植物蛋白酶)和任选的纳豆激酶(作为微生物蛋白酶)。根据本发明的药物中这些蛋白酶的优选比率能在下表中找到，凭此番木瓜蛋白酶、纳豆激酶和/或菠萝蛋白酶的量可彼此独立地在药物中存在的蛋白酶总量的0至80％之间，优选10至75％之间，更优选为15(或16、67)至75％之间变化。
 
菠萝蛋白酶 纳豆激酶 番木瓜蛋白酶
75.00％ 25.00％ 0.00％
16.67％ 16.67％ 66.67％
25.00％ 25.00％ 50.00％
0.00％ 75.00％ 25.00％
75.00％ 0.00％ 25.00％
 
菠萝蛋白酶 纳豆激酶 番木瓜蛋白酶
25.00％ 0.00％ 75.00％
16.67％ 66.67％ 16.67％
50.00％ 0.00％ 50.00％
0.00％ 50.00％ 50.00％
0.00％ 25.00％ 75.00％
33.33％ 33.33％ 33.33％
25.00％ 75.00％ 0.00％
50.00％ 25.00％ 25.00％
根据本发明的另一优选具体实施方式，药物中包含的至少一种植物、非哺乳动物和/或微生物蛋白酶的量是10至90％w/w，优选20至80％w/w，更优选30至70％w/w。
至少一种植物、非哺乳动物和/或微生物蛋白酶优选以1至100mg/kg体重，优选2至50mg/kg体重，更优选5至20mg/kg体重的量对个体使用。
药物可优选进一步包含至少一种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂，优选粘合剂、填充物、崩解剂、润滑剂、防腐剂和/或包衣剂。
可根据本发明的药物的剂型使用各种其他物质如赋形剂、包衣剂等。
此外，本发明的药物可优选地适用于口服、外用、肠道或胃肠外给药。
根据本发明的优选具体实施方式，将药物制成选自下列的剂型：滴眼剂、滴耳剂、滴鼻剂、鼻腔喷雾、片剂、优选可溶性片剂、泡腾片、肠溶片、舌下含片、胶囊、优选肠溶胶囊、散剂、颗粒剂、口服液、口服滴剂、软膏、洗剂、乳剂、水凝胶、栓剂、阴道栓剂、浸剂或注射剂。
本发明的特别优选具体实施方式中，药物适合于口服给药。这种给药模式是非侵入性的，因此可以重复给药而对患者无害。
本发明的药物可特别制成固态或液态的给药形式，包括那些适用于下列的给药形式：(1)口服给药，例如灌服剂(drench)(水或非水溶液或悬浮液)、片剂、大丸剂(boluse)、散剂、颗粒剂、舌用糊剂；(2)胃肠外给药，例如通过皮下、肌肉或静脉注射，例如制成无菌溶液或悬浮液；(3)外用，例如，制成用于皮肤的乳膏、软膏或喷雾剂；或者(4)阴道内或直肠内给药，例如制成阴道栓剂、乳膏或泡沫剂。
这里所用的短语“药学上可接受的”是指那些在合理医学判断范围内的适于与人类和动物组织接触而无额外的毒性、兴奋作用、过敏反应或其他问题或并发症的复合物、材料、组合物和/或剂型，并具有相当的合理受益/风险比率。
能作为药学上可接受载体的材料的例子包括：(1)糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和纤维素乙酸盐；(4)粉末状的黄芪胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)云母；(8)赋形剂，可可脂和栓剂蜡；(9)油脂，如花生油、棉花籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)乙二醇，如丙烯二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇；(12)酯类，如油酸乙酯、月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)褐藻酸；(16)无致热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲液；和(21)其他用于药物制剂的无毒的相容性物质。
根据本发明的药物也能使用润湿剂、乳化剂和润滑剂，如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、香味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、重硫酸钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、叔丁对甲氧酚(butylated hydroxyanisole，BHA)、二叔丁对甲酚(butylatedhydroxytoluene，BHT)、卵磷脂、丙基没食子酸酯(propyl gallate)、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
本发明的制剂包括那些适合于口、鼻、外用(包括口腔和舌下)、直肠、阴道和/或胃肠外给药的制剂。制剂可方便地制成单元剂型并可通过药剂学领域熟知的任何方法制备。能与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据被治疗主体，特别是给药模式而变化。能与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常是产生治疗性效应的化合物的量。
制备根据本发明的药物和制剂的方法包括使本发明的化合物与载体和任选一种或多种附加成分形成组合的步骤。通常，制剂可通过使本发明的化合物与液态载体或细分的固态载体或与二者一起均一地紧密地组合起来，然后如果必要话使产物成形而制备。适于口服给药的本发明的制剂可是以下形式：胶囊、扁胶囊(cachet)、丸剂、片剂、锭剂(lozenge)(用于调味的主要成分通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)、散剂、颗粒剂、或作为水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液、或作为水包油或油包水乳状液或作为糖浆或作为软锭剂(pastille)(用惰性基质，如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)，每种均含有预定量的作为活性成分的本发明的蛋白酶组合物。
本发明的蛋白酶也可以大丸剂、药糖剂(electuary)或糊剂给药。在本发明所述用于口服给药的固态剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖衣片、散剂、颗粒剂等)中，活性成分与一种或多种药学上可接受的载体混合，载体如柠檬酸钠或磷酸二钙，和/或以下任意种类：(1)填充物或添加剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)保湿剂，如甘油；(4)崩解剂，如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、褐藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶解阻滞剂，如石蜡；(6)吸收促进剂，如季铵化合物；(7)润湿剂，如十六烷基醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸附剂，例如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，例如云母、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固态聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，及其混合物；(10)着色剂。
对于胶囊、片剂和丸剂，药物组合物也可包含缓冲剂。相似类型的固态组合物也可用作以如乳糖或奶糖，以及高分子量的聚乙二醇等为赋形剂填充的软和硬明胶胶囊中的填充物。
片剂可通过压制或塑形来制备，任选具有一种或多种附加成分。压制片剂制备可使用粘合剂(例如，明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如淀粉羟乙酸钠或交联的羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂。塑形片剂可通过将润湿的粉末状化合物与惰性液态稀释剂的混合物在合适的机器中塑型而制成。本发明的药物组合物的片剂和其他固态剂型，如糖衣片、胶囊、丸剂和颗粒剂，可任选用包被剂和外壳(如肠包被剂以及药物制剂领域熟知的其他包被剂)配制(score)或制备。也可使用如各种比例的羟丙基甲基纤维素以产生所需释放谱、其他多聚体基质、脂质体和/或微球体将其制成活性成分可缓释或控释的剂型。可通过例如阻滞细菌的过滤器过滤，或通过在能溶于无菌水的无菌固态组合物形式中加入灭菌试剂，或在使用前立即加入一些其他无菌的可注射介质的方法将其灭菌。这些组合物还可任选地含有乳浊剂(opacifying agent)并可以是或优选在胃肠道的某个部位或任选以缓释方式仅释放活性成分的的组合物。能使用的包埋组合物的例子包括多聚体物质和蜡。蛋白酶也能是微胶囊化形式，如果适合的话，能含有一种或多种上述赋形剂。本发明化合物用于口服给药的液态剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了活性成分以外，液态剂型还可含有本领域通常使用的惰性稀释剂(如水或其他溶剂)、增溶剂和乳化剂(如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油脂(特别是棉花籽油、落花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、聚乙二醇和去水山梨糖醇(sorbitan)脂肪酸酯、及其混合物。除了惰性稀释剂，口服组合物还能包括辅料，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、香味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。悬浮液中除了活性化合物外，可含有悬浮剂，如乙氧基异硬脂酸醇、聚氧乙烯山梨醇和去水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂-琼脂和黄芪胶，及其混合物。
本发明的药物组合物的直肠或阴道给药的剂型可是栓剂，该栓剂可通过将本发明的蛋白酶与一种或多种合适的无刺激赋形剂或载体混合来制备，这些赋形剂或载体包括例如可可油、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸酯，这些物质在室温下为固态，但在体温时为液态，因此将在直肠或阴道腔内融化并释放活性化合物。本发明的适合于阴道给药的剂型还包括含有本领域已知的合适载体的阴道栓剂、阴道塞、乳膏、凝胶剂、糊剂、泡沫或喷雾剂。本发明的化合物的外用或透皮给药的剂型包括散剂、喷雾剂、软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、溶液、贴剂和吸入剂。蛋白酶可在无菌条件下与药学上可接受载体以及任何防腐剂、缓冲剂和所需抛射剂混合。软膏、糊剂、乳膏和凝胶除了含有本发明的活性化合物以外，还可含有赋形剂，如动物和植物脂肪、油脂、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、云母和氧化锌，或其混合物。
散剂和喷雾剂中除了含有本发明的蛋白酶以外还能含有赋形剂，如乳糖、云母、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末，或这些物质的混合物。喷雾剂能另外含有通常的抛射剂，如氯氟烃和挥发性非取代烃，如丁烷和丙烷。
透皮贴剂还具有以可控方式向体内释放本发明的蛋白酶这一增加的优点。这种剂型可通过将蛋白酶溶解或分散在合适的介质中制备。也能使用吸收增强剂来促进蛋白酶透过皮肤的扩散。该扩散的速率能通过提供速率控制膜或将化合物用多聚体基质或凝胶分散来实现。
眼用剂型、眼用软膏、散剂、溶液等也视为包含在本发明的范围之内。
本发明的适合于胃肠外给药的药物组合物包含本发明的蛋白酶与下列物质的组合：一种或多种药学上可接受的无菌等渗水溶液或非水溶液、分散液、悬浮液或乳状液，或无菌粉末(可将其于使用前立即重新溶解配制成无菌注射液或分散液)，这些液体或粉末中可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、溶质(以使制剂与服药患者的血液等渗)或助悬剂或增稠剂。可用于本发明的药物组合物的合适的水性和非水性载体的例子包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙烯甘油等)及其合适的混合物、植物油(如橄榄油)和注射用有机酯类(如油酸乙酯)。例如使用包衣材料如卵磷脂，如果是分散剂的情况，通过保持所需颗粒大小，和使用表面活性剂能使剂型保持适当的流动性。这些组合物也可含有辅料如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过加入各种抗细菌和抗真菌剂例如羟基苯甲酸酯(paraben)、三氯叔丁醇、苯酚山梨酸酯等来保证防止微生物对本组合物的作用。也可按需向组合物中加入等渗剂如糖类、氯化钠等。此外，通过加入延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶可使注射用药物剂型的吸收延迟。在一些情况下，为了使药物效应延长，需要使皮下或肌肉注射的药物吸收减慢。这一点可以通过使用水溶性差的晶体或非晶材料的液态悬浮液来实现。或者，延迟胃肠外给药剂型的吸收可通过将药物溶解或分散在油脂载体中来实现。可通过将本化合物在可生物降解多聚体(例如聚交酯-聚乙醇酸交酯)中形成微胶囊化基质来制备注射用贮存形式。根据药物与多聚体的比率和所用的特定多聚体的特性，能控制药物释放的速率。其他可生物降解多聚体的例子包括多正酯类(poly(orthoesters))和聚(酸酐)(poly(anhydrides))。
注射用贮存制剂也可通过将药物装入与身体组织相容的脂质体或微乳剂内来制备。当本发明的蛋白酶作为药品对人和动物使用时，可单独给药或作为含有例如0.1至99.5％(更优选地含有0.5至90％)的蛋白酶和药学上可接受载体的药物组合物给药。本发明的制剂可口服、胃肠外、外用或直肠给药。本发明的制剂当然要以适合每种给药途径的形式使用。例如，本发明的制剂可以片剂或胶囊形式通过注射、吸入、眼用洗剂、软膏、栓剂等使用，通过注射、滴注或吸入使用；外用则为洗剂或软膏；直肠给药则为栓剂。优选口服和外用。
如这里所用的短语“胃肠外给药”和“胃肠外使用”意思是肠道以外和外用的给药模式，通常为注射，包括但不限于静脉、肌肉、动脉、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹腔、气管内、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下腔、椎管内和胸骨内注射和滴注。
本发明的药物可通过任何合适的给药途径对人和其他动物治疗使用，合适的给药途径包括口服、经鼻(例如以鼻腔喷雾的形式经鼻)、直肠、阴道内、胃肠外、脑室内和外用(以散剂、软膏或滴剂的形式，包括口腔和舌下)。不论所选的给药途径是什么，本发明的蛋白酶(可以合适的水合形式)和/或本发明的药物组合物均通过本领域技术人员已知的常规方法制成药学上可接受的剂型。
本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可不同，以获得对特定的患者、组合物和给药模式达到期望的治疗反应而不对患者产生毒性的有效的活性成分的量。所选剂量水平取决于众多因素，该因素包括所用的本发明的特定蛋白酶的活性、给药途径、给药时间、所用特定化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所用蛋白酶组合使用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗患者的年龄、性别、体重、状态、一般健康状况和既往病史等医学领域熟知的因素。具有本领域普通技术水平的内科医生或兽医可易于地确定和开出所需要的药物组合物的有效量。例如，内科医生或兽医可将所需药物组合物中含有的本发明的蛋白酶从低于达到期望治疗效果所需的剂量水平开始，逐渐增加剂量直至达到所需效果。
虽然可能单独使用本发明的蛋白酶，但优选以药物制剂(组合物)形式使用该蛋白酶。
根据本发明的另一优选具体实施方式，药物进一步包含至少一种进一步活性成分。
所述活性成分可以是任何一种可支持用本发明的蛋白酶预防和治疗血管生成性疾病的成分。但是，当然也可能加入与所述蛋白酶的效应不同的活性成分。
至少一种进一步活性成分优选选自黄酮类化合物特别是生物黄酮类化合物、抗氧化剂或其他物质例如白柳树皮提取物。
根据本发明的另一优选具体实施方式，药物包含至少一种(两种、三种甚至是四种)选自菠萝蛋白酶、番木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、纳豆激酶、米曲霉菌酶、灰色链丝菌蛋白酶、舍雷肽酶、立止血、磷虾酶、巴曲酶、蚓激酶、黄瓜素、枯草杆菌蛋白酶、蜂蜜曲霉蛋白酶的蛋白酶，和任选的进一步活性成分，其中所述进一步活性成分优选是黄酮类化合物，特别是芸香甙(rutin)。
根据本发明优选具体实施方式，黄酮类化合物选自芸香甙或其衍生物。
例如，菠萝蛋白酶和番木瓜蛋白酶，被称为巯基蛋白酶，其活性位点含有半胱氨酸残基。在氧化条件下，该半胱氨酸的巯基基团失去氢原子并可与另一个巯基基团交联形成二硫键，或者与另一个残基通过相同的氧化过程交联。在这种氧化状态下，菠萝蛋白酶和番木瓜蛋白酶失活。通过加入抗氧化剂维生素C、生物黄酮类化合物如芸香甙和原花青素(proanthocyanidins)能防止巯基蛋白酶的活性巯基基团的氧化。
本发明的药物中包含的所述进一步活性成分的量优选是5至35％w/w，优选10至30％w/w，更优选15至25％w/w。
附图说明
本发明通过以下图示和实施例进一步阐明。
图1显示酶处理HUVEC后，上清液中细胞释放的LDH(毒性试验)。
图2显示酶处理HUVEC后的MTT分析(抗增殖活性)。
图7(A)显示联合应用25％菠萝蛋白酶、50％纳豆激酶和25％番木瓜蛋白酶抑制VEGF诱导的管腔样结构形成。
图7(B)显示仅用VEGF处理的对照组。在VEGF对照组中可见细窄的管腔样结构形成，而酶处理的样品显示大部分区域无管腔样结构形成，表明多种酶联合应用具有抗血管生成活性。
图4显示保心纳豆激酶(Rutozym)治疗患者血液中的VEGF浓度。
图5显示VEGF和芸香甙(rutoside)刺激HUVEC的MTT分析。观察不到对增殖的抑制作用。
图6显示芸香甙对HUVEC的毒性效应。在静息HUVEC中观察不到毒性效应，而在VEGF激活HUVEC中显示出轻微的效应。
图7(左)显示抑制HUVEC自发管腔样结构形成。菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、纳豆激酶、番木瓜蛋白酶和舍雷肽酶抑制管腔样结构形成，而糜蛋白酶或胰蛋白酶不能抑制管腔样结构的形成。
图7(右)显示抑制HUVEC的VEGF诱导的管腔样结构形成。菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、纳豆激酶、番木瓜蛋白酶和舍雷肽酶的抑制程度几乎与其对未经VEGF诱导的HUVEC管腔样结构形成的抑制程度相同。但是糜蛋白酶或胰蛋白酶不能抑制管腔样结构的形成。
实施例
材料
菠萝蛋白酶，来自菠萝树茎部，活性为3.51U/mg，获自奥地利SigmaAldrich公司。
纳豆激酶，活性为10.000U/ml，购自日本Bio Science Laboratory Co，Ltd.公司。
番木瓜蛋白酶，来自番木瓜，活性为大于3U/mg，获自奥地利SigmaAldrich公司。
实施例1：毒性试验
用乳酸脱氢酶(LDH)试验测定菠萝蛋白酶、纳豆激酶和番木瓜蛋白酶的抗增殖活性。胰蛋白酶处理收取半融合培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，以2500个细胞/孔的密度接种到预先以人纤连蛋白包被的96孔微孔板中。为使其恰当贴壁，将细胞在内皮细胞基础培养基2MV(Cambrex Biochemicals)(含有10％胎牛血清、60μg/ml内皮细胞生长补充物、hrEGF、hrFGF2、hrIGF、hrVEGF、抗坏血酸和肝素)中培养24小时。贴壁之后，在37℃/95％湿度，不含生长因子的M199培养基+10％胎牛血清(FCS)下孵育细胞使其饥饿。24小时后，用含有10％FCS、VEGF和各种浓度酶的M199培养基置换培养上清液。孵育48小时后，收集上清液并根据生产商(Promega，德国)的说明进行LDH分析：从所有孔中取50μl转移至新鲜的96孔平底板(酶学分析用)。将分析缓冲液加入到底物混合物中并轻轻混匀。每孔加入50μl重新溶解复原的底物混合物。将孔板在室温下孵育30分钟。每孔加入50μl终止液。一小时内，测定490nm参照620nm波长的光密度值。结果以占未处理对照组的百分率表示。
结果如图1所示。这些结果清楚地表明：孵育两天后，高达包括25μg/ml水平的菠萝蛋白酶、纳豆激酶和番木瓜蛋白酶未表现出对HUVEC的毒性效应。
实施例2：抗增殖活性
菠萝蛋白酶、纳豆激酶和番木瓜蛋白酶及其混合物的抗增殖活性用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)分析进行测定。胰蛋白酶处理收取半融合培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，以1000个细胞/孔的密度接种到预先以人纤连蛋白包被的96孔微孔板中。为使细胞恰当贴壁，将细胞在内皮细胞基础培养基2MV(CambrexBiochemicals)(含有10％胎牛血清、60μg/ml内皮细胞生长补充物、hrEGF、hrFGF2、hrIGF、hrVEGF、抗坏血酸和肝素)中培养24小时。贴壁之后，在37℃/95％湿度，不含生长因子的M199培养基+10％胎牛血清(FCS)下孵育细胞使其饥饿。24小时后，用含有10％FCS和各种浓度的菠萝蛋白酶、纳豆激酶和番木瓜蛋白酶的M199培养基置换培养上清液。将细胞在37℃/95％湿度下继续培养48小时。使用EZ4UMTT Kit试剂盒(Biomedica，奥地利)根据生产商的说明进行MTT分析。测定450nm参照620nm波长的光密度。结果以％增殖表示，100％为VEGF处理的对照组细胞的增殖。
图2中显示浓度-效应实验的结果。该结果清楚地证明菠萝蛋白酶、纳豆激酶和番木瓜蛋白酶的抗增殖活性，其中菠萝蛋白酶和番木瓜蛋白酶在低至25μg/ml的浓度下达到75％的生长。与LDH释放分析的结果综合来看，这些数据表明上述酶具有明确的抗增殖活性，但无细胞毒活性。
表1显示混合物的结果。能看出明确的抗增殖效应。
表1：在VEGF存在时联合使用菠萝蛋白酶、纳豆激酶和番木瓜蛋白酶抑制HUVEC的生长。
 
菠萝蛋白酶 纳豆激酶 番木瓜蛋白酶 ％增殖
0.00％ 0.00％ 100.00％ 75.45％
75.00％ 0.00％ 25.00％ 89.09％
16.67％ 16.67％ 66.67％ 91.82％
25.00％ 75.00％ 0.00％ 94.55％
66.67％ 16.67％ 16.67％ 96.82％
实施例3：抗血管生成活性
方法：使用管腔样结构试验对抗血管生成活性进行了测定。在4℃温度下使生长因子诱导的基质胶(Becton Dickinson，Vienna)融化。以每孔50μl将该基质胶加入到96孔微量滴定板的孔中。将滴定板置于4℃24小时。实验之前，将滴定板在37℃孵育30-60分钟以使凝胶凝固。以胰蛋白酶处理收取HUVEC，在内皮细胞生长培养基2(MV)(Lonza，Brussels)(根据生产商的说明补充了抗坏血酸和氢化可的松以及5000U/ml肝素和1％胎牛血清)中以20.000个细胞/孔的密度接种到基质胶包被的96孔微孔板中。加入药物和VEGF至所需的浓度。继续培养16至18小时后，对孔照相。使用ImageJ软件以神经元长度测定插件(Neuron Length Determination Plugin)测量管腔样结构的总长度。
结果
图3、图7和表1显示酶和酶混合物的管腔样结构形成试验的结果。
表1显示各种菠萝蛋白酶、纳豆激酶和番木瓜蛋白酶的混合物对管腔样结构形成的抑制作用。结果清楚地表明
1.菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、纳豆激酶、番木瓜蛋白酶和舍雷肽酶抑制管腔样结构的形成。
2.联合应用菠萝蛋白酶、纳豆激酶和番木瓜蛋白酶对于单独使用这些药物来说具有更强的效应。
 
菠萝蛋白酶 纳豆激酶 番木瓜蛋白酶 ％管腔样结构形成
75.00％ 25.00％ 0.00％ 1.89％
16.67％ 16.67％ 66.67％ 6.48％
25.00％ 25.00％ 50.00％ 12.25％
0.00％ 75.00％ 25.00％ 12.58％
75.00％ 0.00％ 25.00％ 13.66％
25.00％ 0.00％ 75.00％ 16.23％
16.67％ 66.67％ 16.67％ 16.35％
0.00％ 0.00％ 0.00％ 16.60％
50.00％ 0.00％ 50.00％ 17.27％
0.00％ 50.00％ 50.00％ 19.99％
0.00％ 25.00％ 75.00％ 21.74％
33.33％ 33.33％ 33.33％ 25.86％
25.00％ 75.00％ 0.00％ 38.43％
0.00％ 0.00％ 0.00％ 40.64％
50.00％ 25.00％ 25.00％ 52.22％
0.00％ 0.00％ 100.00％ 60.14％
0.00％ 0.00％ 0.00％ 100％
表1：HUVEC在VEGF存在下管腔样结构的形成(％对照)。结果显示为％管腔样结构的形成，100％相当于仅用VEGF处理的样品管腔样结构的形成。联合应用未显示不能抑制管腔样结构的形成。
结论
菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、纳豆激酶、番木瓜蛋白酶或舍雷肽酶单独处理后和菠萝蛋白酶、纳豆激酶和番木瓜蛋白酶的混合物处理后，检测到VEGF介导的微脉管样结构的形成显著减少。
实施例4
在这个实施例中，研究了酶治疗(酶混合物：纳豆激酶、菠萝蛋白酶、番木瓜蛋白酶+芸香甙生物黄酮类化合物、白柳树皮提取物)对血液中VEGF浓度的量的影响。可显示出(参见以下结果)酶治疗显著降低了人血液中升高的VEGF浓度。
在两平行可比较的组间以随机开放性多中心初步研究的方式对111名男女两性II型糖尿病患者进行试验。54名患者接受4周的酶混合物治疗(酶混合物：纳豆激酶(20000FU/gm)25mg、菠萝蛋白酶(2450GDU/gm)90mg、番木瓜蛋白酶N.F.(2.400USP单位/mg).100mg、芸香甙生物黄酮类化合物制剂(芸香甙&芸香糖苷)120mg、白柳树皮提取物(15％水杨苷/7％多酚)100mg，MarlynNutraceuticals，USA)。补充前和补充4周后立即对患者血浆VEGF浓度进行测定。以患者最初值作为对照(自身对照)。
血液VEGF浓度分成4个不同组(四分；见图4)：治疗前患者血液VEGF浓度<50ng/ml(s50是指起始(start)<50ng/ml；e50是指最终(end))；s100：治疗前患者血液VEGF浓度<100ng/ml；s200：治疗前<200ng/ml；和s300：治疗前>200ng VEGF。可以显示出：包含植物和/或微生物来源的蛋白酶的本发明的药物能用于降低血液VEGF水平，因此能用于治疗与血管新生相关的疾病。
实施例5：芸香甙对HUVEC的抗增殖效应
用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)试验评价Rutosid(芸香甙)可能的抗增殖活性。胰蛋白酶处理来收取半融合培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，以1000个细胞/孔的密度接种到预先用人纤连蛋白包被的96孔微孔板中。为使细胞恰当贴壁，将细胞在内皮细胞基础培养基2MV(Cambrex Biochemicals)(含有10％胎牛血清、60μg/ml内皮细胞生长补充物、hrEGF、hrFGF2、hrIGF、hrVEGF、抗坏血酸和肝素)中培养24小时。贴壁之后，在37℃/95％湿度，不含生长因子的M199培养基+10％胎牛血清(FCS)下孵育细胞使其饥饿。24小时后，用含有10％FCS和各种浓度芸香甙和VEGF的M199培养基置换培养上清液。将细胞在37℃/95％湿度下继续培养48小时。使用EZ4U MTT Kit试剂盒(Biomedica，Austra)根据生产商的说明进行MTT试验。测定450nm参照620nm波长的光密度值。结果以％增殖表示，将VEGF处理的对照组细胞的增殖视为100％。
结果清楚地表明芸香甙没有抑制VEGF刺激的HUVEC增殖(见图5)。
实施例6：芸香甙对HUVEC的毒性效应
用乳酸脱氢酶(LDH)试验评价芸香甙可能的细胞毒性活性。胰蛋白酶处理收取半融合培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，以2500个细胞/孔的密度接种到预先以人纤连蛋白包被的96孔微孔板中。为使细胞恰当贴壁，将细胞在内皮细胞基础培养基2MV(CambrexBiochemicals)(含有10％胎牛血清、60μg/ml内皮细胞生长补充物、hrEGF、hrFGF2、hrIGF、hrVEGF、抗坏血酸和肝素)中培养24小时。贴壁之后，将细胞在37℃/95％湿度，不含生长因子的M199培养基+10％胎牛血清(FCS)下孵育使其饥饿。24小时后，用含有10％FCS、VEGF和不同浓度的酶的M199培养基置换培养上清液。孵育48小时后，收集上清液，根据生产商(Promega，German)的说明进行LDH试验：从所有各孔取50μl加入到新的96孔平底板(酶学分析用)。向底物混合物中加入分析缓冲液并轻轻混匀。向每个孔中加入50μl重新溶解复原的底物混合物。将板在室温下孵育30分钟。向每个孔中加入50μl的终止液。一小时内测定490nm处参照620nm波长的光密度值。结果以占未处理的对照组的百分率表示。
结果清楚地表明芸香甙对于HUVEC的毒性可以忽略不计(见图6)。
实施例7：来自植物的蛋白酶对氧诱导的视网膜病和激光诱导的脉络膜新生血管形成的小鼠模型VEGF的抑制
在工业化国家中血管增生性视网膜病是视力严重丧失的主要原因。潜在的疾病有糖尿病、视网膜静脉阻塞、早产儿视网膜病或晚期老年性黄斑变性(AMD)。缺血性视网膜病的标准治疗基于破坏外周视网膜组织以使如VEGF的血管生成性因子产生最少。由于神经元组织的破坏是不可逆的，所以需要以血管生成性因子抑制剂进行局部治疗以保护出现视网膜或脉络膜新生血管形成的风险的增加的患者。同时，在AMD中，用血管生成抑制性药物进行局部治疗成为治疗标准。
方法
A.氧诱导视网膜病(OIR)
按照Smith及其同事(Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.(1994)35：101-111)的描述建立氧诱导视网膜病(OIR)的小鼠模型。将7日龄(P7)C57/B16J小鼠置于75％氧气中直至第12天(P12)。在恢复正常氧气水平后，动物由于相对缺氧而出现视网膜新生血管形成。这个效应通过在一只眼以玻璃体内注射方式注射试验物质而在另一只眼内注射对照溶液来影响。P17时灌注荧光素葡聚糖之后通过铺片(flatmount)来评估视网膜增殖。这些完整铺片得以编码方式对视网膜脉管系统中血管的变化进行评价。根据评分系统对每个铺片确定分数并用Wilcoxon配对符号秩检验(Wilcoxon matched-pairs signed-rankstest)进行比较，结果是处理组和对照组间存在显著性差异。每组共用30只小鼠。
在第二个试验中，于P12腹腔注射试验物质。在这种情况下，不可能在两只眼睛之间进行同体比较，因此需要另外一个对照组。每组共使用25只小鼠。
B.激光诱导脉络膜新生血管形成(激光-CNV)
按照Campochiaro及其同事(Tobe等人，Am.J.Pathol.(1998)153：1641-1646)的描述建立激光诱导脉络膜新生血管形成的小鼠模型。将不大于12周龄的C57/B16J小鼠麻醉，在第0天(d0)使用3次可视可控激光烧伤视网膜，以此来诱导血管新生。动物在创伤两周内在激光作用位点形成脉络膜新生血管。于第7天或数天后，在一只眼以玻璃体内注射方式注射试验物质而在另一只眼内注射对照溶液，观察是否影响视网膜或脉络膜血管生成。13天后，第14天，以葡聚糖-荧光素灌注动物，制备脉络膜的完整铺片。完整铺片得以评价脉络膜血管的变化以及CNV-膜的大小。通过Wilcoxon配对符号秩检验法比较每组激光斑点的数值，结果是处理组和对照组之间存在显著性差异。每组共使用30只小鼠。
在另一个实验中，于P7或数天腹腔注射试验物质。在这种情况下，不可能进行两只眼睛之间的同体比较，因此需要另外一个对照组。每组共使用25只小鼠。

Claims (14)

1、至少一种蛋白酶在制备治疗和/或预防血管新生相关眼病的药物中的用途，所述血管新生相关眼病选自老年性黄斑变性(AMD)、脉络膜新生血管形成、Hippel-Lindau病、虹膜新生血管形成、缺血性增殖性视网膜病、角膜新生血管形成或增殖性镰状细胞视网膜病，其中至少一种蛋白酶选自植物、非哺乳动物或微生物蛋白酶。
2、根据权利要求1所述的用途，其特征是至少一种植物蛋白酶选自菠萝蛋白酶、番木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶或黄瓜素。
3、根据权利要求1所述的用途，其特征是微生物蛋白酶选自纳豆激酶、灰色链丝菌蛋白酶、米曲霉菌酶、蜂蜜曲霉蛋白酶、舍雷肽酶或枯草杆菌蛋白酶。
4、根据权利要求1所述的用途，其特征是非哺乳动物蛋白酶选自立止血、磷虾酶、巴曲酶或蚓激酶。
5、根据权利要求1至4任一项所述的用途，其特征是药物中包含的至少一种植物、非哺乳动物和/或微生物蛋白酶的量是10至90％w/w，优选20至80％w/w，更优选30至70％w/w。
6、根据权利要求1至5任一项所述的用途，其特征是至少一种植物、非哺乳动物和/或微生物蛋白酶以1至100mg/kg体重，优选2至50mg/kg体重，更优选5至20mg/kg体重的量对个体使用。
7、根据权利要求1至6任一项所述的用途，其特征是药物进一步包含至少一种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂，优选为粘合剂、填充物、崩解剂、润滑剂、防腐剂和/或包衣剂。
8、根据权利要求1至7任一项所述的用途，其特征是药物适用于眼内、口服、外用、肠道或胃肠外给药。
9、根据权利要求1至8任一项所述的用途，其特征是药物选自下列药物形式：滴眼剂、滴耳剂、滴鼻剂、鼻腔喷雾、片剂、优选可溶性片剂、泡腾片、肠溶片、舌下含片、胶囊、优选肠溶胶囊、散剂、颗粒剂、口服液、口服滴剂、软膏、洗剂、乳剂、水凝胶、栓剂、阴道栓剂、浸剂或注射剂。
10、根据权利要求1至9任一项所述的用途，其特征是药物进一步包含至少一种进一步活性成分。
11、根据权利要求10所述的用途，其特征是至少一种进一步活性成分是黄酮类化合物和/或抗氧化剂。
12、根据权利要求11所述的用途，其特征是黄酮类化合物是芸香甙。
13、根据权利要求10至12任一项所述的用途，其特征是药物中包含的进一步活性成分的量为5至35％w/w，优选10至30％w/w，更优选15至25％w/w。
14、根据权利要求1至13任一项所述的用途，其特征是药物包含至少一种选自菠萝蛋白酶、番木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、纳豆激酶、米曲霉菌酶、灰色链丝菌蛋白酶、舍雷肽酶、立止血、磷虾酶、巴曲酶、蚓激酶、黄瓜素、枯草杆菌蛋白酶、蜂蜜曲霉蛋白酶的蛋白酶，和任选的进一步活性成分，其中所述进一步活性成分优选黄酮类化合物，特别是芸香甙。
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