WO2005056784A1 - インスリン誘導性ポリペプチド - Google Patents

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WO2005056784A1
WO2005056784A1 PCT/JP2004/019153 JP2004019153W WO2005056784A1 WO 2005056784 A1 WO2005056784 A1 WO 2005056784A1 JP 2004019153 W JP2004019153 W JP 2004019153W WO 2005056784 A1 WO2005056784 A1 WO 2005056784A1
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polypeptide
insulin
amino acid
blood glucose
inducible
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PCT/JP2004/019153
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Shigekazu Nakatsugawa
Original Assignee
Japan Science And Technology Agency
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention of this application relates to insulin-inducible polypeptides and oral compositions. More specifically, the invention of this application relates to a polypeptide having an insulin-inducing / hyperglycemic effect when administered orally, and a composition containing the polypeptide, such as a functional food or a therapeutic agent for diabetes. .
  • Diabetes is a disease associated with an increase in blood sugar levels caused by absolute deficiency of insulin, a hormone secreted by the knee 3 cells (type 1 diabetes), or relative deficiency and insufficient action (type 2 diabetes). It is one of the most common problems in developed countries. Insulin administration is widely used as a treatment, but it is not always safe due to side effects due to a rapid blood glucose lowering effect. For this reason, the development of antidiabetic drugs using ingredients that replace insulin has been promoted. The components of such a therapeutic agent for diabetes are widely selected from various organic and inorganic compounds, and therapeutic agents for diabetes containing proteins and peptides as active ingredients have been proposed.
  • Patent Document 1 For example, application of GLP-1 analog or its peptide to the treatment of diabetes (Patent Document 1), therapeutic agent for diabetes containing activin or its partial peptide (Patent Document 2), -C-terminal peptide of endorphin as an active ingredient And other therapeutic agents for diabetes (Patent Document 3).
  • Nattokinase is an enzyme (protease) produced by Bacillus subtilis (Bacillus sbtilis), and an invention utilizing its thrombolytic effect (Patent Document 4) is known.
  • Patent literature there is no known link between the nut-kinase and insulin induction and blood sugar lowering or hyperglycemic ameliorating effects.
  • Drugs containing a protein or a peptide as an active ingredient are superior in safety compared to drugs containing a compound as an active ingredient, but proteins and peptides are administered orally. Is generally degraded in the digestive tract, so it is generally used by other routes of administration (eg, blood injection).
  • diabetes is a disease in which daily medication can be used to administer medication when needed, and a drug for treating diabetes with a simpler dosage form (ie, oral administration) without resorting to excessive burdensome injections.
  • the invention of this application has been made in view of the circumstances described above, and has as its object to provide a polypeptide having excellent insulin-inducing ability, and a composition containing this polypeptide.
  • This application is directed to a first invention for solving the above-mentioned problem, which is a partial peptide of Bacillus subtilis nut kinase, which is located at the C-terminal side from the twentieth amino acid to the N-terminal amino acid sequence of the amino acid sequence constituting the nut kinase Amino acid sequence of 50 or more amino acids consecutive Or an insulin-inducible polypeptide having a sequence in which a plurality of amino acid residues in the sequence have been deleted, added, or substituted with another amino acid residue.
  • One specific embodiment of the insulin-inducible polypeptide of the first invention is that the amino acid sequence constituting the nattokinase is SEQ ID NO: 2.
  • This application also provides, as a second invention, an oral composition containing the insulin-inducing polypeptide.
  • the present invention further provides, as a third invention, a method for treating diabetes, which comprises orally administering the insulin-inducing polypeptide of the first invention, and, as a fourth invention, an oral composition of the second invention Provide a method for treating diabetes, which is characterized by ingesting a diet. That is, the inventor of the present application has reported that a partial peptide of Bacillus subtilis nattokinase exhibits excellent insulin-inducing properties and accompanying blood glucose-lowering action when administered orally to a diabetic model animal. And completed this invention.
  • insulin induction is broadly defined, and for example, functionally means that insulin lowers blood glucose levels. Alternatively, it means promotion of insulin secretion, including activation of the insulin gene in the arm / 3 cells, promotion of conversion of insulin precursor protein (proinsulin) expressed from the insulin gene to insulin, and the like.
  • protein or “polypeptide” refers to a molecule composed of a plurality of amino acid residues linked to each other by a natural amide bond (peptide bond) or a residue linkage other than the natural amide bond. .
  • polynucleotide refers to a phosphate ester of a nucleoside in which a purine or pyrimidine is / 3-N-glycosidically linked to a sugar (ATP, GTP, CTP, UTP; or dATP, dGTP, dCTP, dTTP) is a molecule linked by 100 or more.
  • ATP ATP, GTP, CTP, UTP; or dATP, dGTP, dCTP, dTTP
  • genomic DNA encoding the protein
  • mRNA transcribed from the genomic DNA and cDNA synthesized from the mRNA. It may be double-stranded or single-stranded.
  • the sense strand and antisense strand of these genomic DNAs, mRNAs and cDNAs are also included.
  • FIG. 1 shows the insulin-inducible polypeptides of the present invention (NK1-381, NK20-381, NK20-326) administered orally and tail intravenously to type I diabetes model mice (STZ mice) at 0 minutes and A graph comparing the blood glucose level after 60 minutes, and a graph (upper right) comparing the blood glucose level after 60 minutes when the blood glucose level after 0 minute is set to 100.
  • Figure 2 shows the graph of blood glucose changes over time up to 80 minutes after oral administration of polypeptide (left), and the degree of change when the blood glucose level at 0 minutes in each group was 100.
  • FIG. 1 shows the insulin-inducible polypeptides of the present invention (NK1-381, NK20-381, NK20-326) administered orally and tail intravenously to type I diabetes model mice (STZ mice) at 0 minutes and A graph comparing the blood glucose level after 60 minutes, and a graph (upper right) comparing the blood glucose level after 60 minutes when the blood glucose level after 0
  • FIG. 3 shows a graph (right) showing the time-course blood glucose changes up to 80 minutes after intravenous injection of the polypeptide tail into STZ mice, and a comparison of the left figure in FIG.
  • FIG. 4 is a graph comparing the plasma concentration of insulin 2 in STZ mice to which the polypeptide was orally administered or injected into the tail.
  • FIG. 5 is a graph showing the time course of blood glucose levels when the insulin-inducing polypeptide (NK20-326) of the present invention and PBS (control) were orally administered to STZ mice.
  • FIG. 6 is a graph showing the time course of blood glucose levels when the polypeptide NK20-69 was orally administered to STZ mice.
  • FIG. 7 is a graph showing the time course of blood glucose level when the polypeptide NK20-119 was orally administered to STZ mice.
  • FIG. 8 is a graph showing the change over time in blood glucose level when the polypeptide NK20-219 was orally administered to STZ mice.
  • FIG. 9 is a graph showing the time course of blood glucose levels when the polypeptide NK40-219 was orally administered to STZ mice.
  • FIG. 10 is a graph showing a time-dependent change in blood glucose level when 1/10 amount of the polypeptide NK20-219 was orally administered to STZ mice.
  • FIG. 11 is a graph showing the time course of blood glucose levels when PBS (control) was orally administered to STZ mice.
  • FIG. 12 is a graph showing the time course of blood glucose level when PBS (control) was orally administered to a type II diabetes model mouse (db / db mouse).
  • FIG. 13 is a graph showing the time course of blood glucose levels when the polypeptide NK20-219 was orally administered to db / db mice.
  • the insulin-inducible polypeptide of the first invention comprises at least 50 consecutive amino acids from the 20th amino acid to the C-terminal side of the amino acid sequence constituting the Bacillus subtilis nattokinase.
  • Various types of nattokinase are known, and any of them can be used without limitation. According to the present invention, a nattokinase whose amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2 is provided as an example.
  • the insulin-inducible polypeptide of the present invention is required to include, for example, at least 50 consecutive amino acids from the 20th amino acid (Met) to the C-terminal side from the N-terminal in SEQ ID NO: 2 (381 amino acids). As such, it can be of any length.
  • the polypeptide may have a sequence in which a plurality of amino acid residues are deleted, added, or substituted with other amino acid residues as long as the ability to induce insulin is not impaired. In this case, the plurality is, for example, about 1 to 30 pieces.
  • the amino acid sequence from the 20th to the 26th to 40th positions on the N-terminal side is essential for insulin inducibility.
  • Such a polypeptide can be prepared by a known peptide synthesis method (Merrifield, RBJ Solid phase) based on the known amino acid sequence of Bacillus subtilis nuttokinase (for example, SEQ ID NO: 2 or the amino enzyme sequence disclosed in GenBank / AF368283).
  • peptide synthesis I. The synthesis of tetrapeptide. J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963; Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. A Practical Approach. Chan, WC and White, PD, Oxford University Press, 2000). Further, for example, it can be performed automatically by using ABI431A peptide synthesizer (Perkin Elmer) or the like.
  • Such synthetic polypeptides may consist of residue linkages other than natural amide bonds, or may consist of non-natural residues in place of natural amino acid residues.
  • Residue linkages other than the natural amide bond include, for example, glutaraldehyde, N-hydroxysuccinimide ester, bifunctional maleimide, N, N, -dicyclohexylcarboximide (DCC), or ⁇ , ⁇ , -diisopropylcarpoimide. Examples include chemical bonding or coupling means such as diimide (DIC).
  • unnatural amino acid residues include, for aromatic amino acids, for example, D- or L-naphylalanine; D- or L-phenylglycine; D- or L-2 thieneylalanine.
  • Aromatic rings of unnatural amino acids include, for example, thiazolyl, thiophenyl, pyrazolyl, benzimidazolyl, naphthyl, furanyl, pyrrolyl, and pyridyl aromatic rings.
  • an acidic amino acid it can be produced, for example, by substitution with a non-ruvonate amino acid maintaining a negative charge; (phosphono) alanine; sulfated threonine.
  • the carboxyl side group (for example, aspartyl or glutamyl) may also be used, for example, for 1-cyclohexyl-3 (2-morpholinyl- (4-ethyl) carbodiimide or 1-ethyl-3 (4-azonia-4,4-dimethyl). It can be selectively modified by reaction with carpoimide (R, -NCNR>) such as (tolpentyl) carpoimide, etc.
  • Aspartyl or Dalya mill can also be modified by reaction with ammonium ion, asparaginyl and ⁇ Can be converted to a glutaminyl residue
  • Basic amino acids include, for example, amino acids (in addition to lysine and arginine), ordinine, citrulline, or (guadino) -acetic acid, or alkyl as defined above. It can be formed by substitution with a (guanidino) alkyl acetic acid. , Containing a CN- moiety in place of COOH) can be substituted for asparagine or glutamine.Asparaginyl and glutamine residues are deaminated to the corresponding aspartyl or daltamyl residues.
  • the unnatural arginine residue can be substituted with arginyl, for example, one or more, such as phenyldalioxal, 2,3-butanedione, 1,2-cyclohexanedione, or ninhydrin.
  • arginyl for example, one or more, such as phenyldalioxal, 2,3-butanedione, 1,2-cyclohexanedione, or ninhydrin.
  • tyrosyl is formed, for example, by reacting with an aromatic diazonium compound or tetranitromethane. N-Acetylimidizole and tetranitromethane are each 0-acetylti.
  • Non-natural cysteine residues can be formed using rosinyl and 3-nitro derivatives, cysteinyl residues, ⁇ -haloacetates such as 2-chloroacetic acid, or chloroacetamides and equivalents. Carboxymethyl or carboxamidomethyl derivatives.
  • Non-natural cysteine residues also include cysteinyl residues such as, for example, pro-trifluoroacetic acid, a-bromo- / 3- (5-dimidazolyl) propionic acid; chloroacetylphosphato, N-alkylmaleimide, 3-nitro- 2-pyridyl disulfide; methyl 2-pyridyl sulfide; P-co mouth mercury benzoic acid; 2-chloromercury-4 nitrophenol; or chloro mouth-7-nitrobenzoxoxa-1, It can be produced by reacting with 3-diazole.
  • cysteinyl residues such as, for example, pro-trifluoroacetic acid, a-bromo- / 3- (5-dimidazolyl) propionic acid; chloroacetylphosphato, N-alkylmaleimide, 3-nitro- 2-pyridyl disulfide; methyl 2-pyridyl sulfide; P-co mouth mercury benzo
  • Unnatural lysine can be generated (and the amino terminal residue is altered) by reacting ricinyl with, for example, succinic or other carboxylic anhydrides.
  • Lysine and other mimetic amino-containing residues also include methyl picoline imidate, pyridoxal phosphate, pyridoxal, chloroborohydride, trinitrobenzene sulfonic acid, 0-methyl isourea, 2,4 It can be produced by a reaction using imidoesters such as thiophene and a reaction using daloxylate catalyzed by transamidase.
  • Non-natural methionine can be produced, for example, by a reaction using methionine sulfoxide.
  • Unnatural prolines include, for example, pipecolic acid, thiazolidinecarboxylic acid, 3- or 4-hydroxyproline, dehydroxyproline, 3- or 4-methylproline, or 3,3, -dimethylproline.
  • Unnatural histidine can be produced by reacting histidine with, for example, getyl procarbonate or para-bromophenacyl bromide.
  • Other unnatural amino acid residues include, for example, hydroxylation of proline and lysine; phosphorylation of the hydroxyl group of seroyl or threonyl residues; methylation of the 0!
  • the insulin-inducible polypeptide of the present invention can also be obtained by a genetic engineering method using a polynucleotide encoding the same.
  • RNA is prepared by in vitro transcription from a recombinant expression vector carrying a polynucleotide, and this is used as a type III protein for in vitro translation to obtain the desired RNA.
  • Surin-inducible polypeptides can be obtained.
  • insulin-inducible cells when a recombinant expression vector is introduced into prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, and eukaryotic cells such as yeast, insect cells, and mammalian cells to produce transformed cells, insulin-inducible cells can be produced from the transformed cells.
  • the polypeptide can be expressed.
  • the polynucleotide for genetically expressing the insulin-inducible polypeptide is a known sequence encoding Bacillus subtilis nattokinase (for example, SEQ ID NO: 1).
  • nattokinase cDNA using, for example, probe hybridization for the cDNA library or the PCR method, and transcribe the insulin-inducible polypeptide coding region from the nattokinase cDNA. It can be cut out with restriction enzymes and used. Alternatively, a polynucleotide encoding an insulin-inducible polypeptide can be obtained by known methods (for example, Carruthers
  • RNA polymerase promoter examples include T7, T3, and SP6.
  • RNA polymerase promoters examples include pKAl, pCDM8, pT3 / T718, ⁇ 7 / 319, pBluescript II and the like.
  • a polynucleotide To express insulin-inducible polypeptides in microorganisms such as Escherichia coli, a polynucleotide must be used in a vector having an origin, a promoter, a ribosome binding site, a DNA cloning site, a terminator, etc., which can be replicated in microorganisms.
  • the polypeptide encoded by the polynucleotide is expressed in a large amount in a microorganism. be able to.
  • the desired polypeptide can be obtained by separation.
  • the expression vector for Escherichia coli include a pUC system, pBluescript II, a pET expression system, and a pGEX expression system.
  • the polynucleotide When the insulin-inducible polypeptide is expressed in eukaryotic cells, the polynucleotide is inserted into a eukaryotic expression vector having a promoter, a splicing region, and a poly (A) addition site. If a recombinant vector is prepared and introduced into eukaryotic cells, the desired polypeptide can be expressed in transformed eukaryotic cells.
  • Expression vectors pKAl, pCDM8, pSVK3, pMSG , pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV vector, pRS, pcDNA3, pMSG, such as pYES2 can be exemplified c Also, pIND / V5-His, pFLAG -CMV- 2. If pEGFP-Nl, pEGFP-Cl, etc. are used as expression vectors, polypeptides can be expressed as fusion proteins with various tags such as His tag, FLAG tag, myc tag, HA tag, GFP, etc. it can.
  • mammalian cultured cells such as monkey kidney cells COS7, Chinese hamster ovary cells CHO, etc., budding yeast, fission yeast, silkworm cells, African Xenopus egg cells, etc.
  • Any eukaryotic cell can be used.
  • known methods such as an electroporation method, a calcium phosphate method, a ribosome method, and a DEAE dextran method can be used.
  • the target peptide After expressing the insulin-inducible polypeptide in prokaryotic or eukaryotic cells, the target peptide can be isolated and purified from the culture by a combination of known separation procedures.
  • treatment with denaturing agents such as urea or surfactants, ultrasonic treatment, enzyme digestion, salting-out / solvent precipitation, dialysis, centrifugation, ultrafiltration, gel filtration,
  • denaturing agents such as urea or surfactants
  • ultrasonic treatment enzyme digestion
  • salting-out / solvent precipitation dialysis
  • centrifugation ultrafiltration
  • gel filtration examples include SDS-PAGE, isoelectric focusing, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, reverse phase chromatography, and the like.
  • the insulin-inducing polypeptide as described above can be formulated into an oral drug by itself. In that case, the polypeptide may be in the form of a “salt”.
  • Salts include, for example, pharmaceutically acceptable acid (inorganic or organic acids) addition salts, for example, hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate, acetate, benzonitrate, maleate, fumarate Succinate, tartrate, citrate, oxalate, methanesulfonate, tolenesulfonate, aspartate, glutamate, etc.
  • the second invention of this application is an oral composition containing the insulin-inducible polypeptide described above. This composition is a composition having a form in which it is ingested from the oral cavity and absorbed in the digestive tract, for example, a food and drink department, an oral pharmaceutical and the like.
  • the insulin-inducible polypeptide of the present invention is a part of nattokinase contained in natto, which is widely taken as a food, so that there is no problem in safety as a food or drink or a component of a drug.
  • a therapeutic agent for diabetes for example, it is preferable to formulate tablets, capsules, granules, fine granules, powders, or oral liquid preparations such as suspensions and mouthwashes.
  • Carriers include common pharmaceutical auxiliaries such as binders (syrup, gum arabic, gelatin, sorbitol, tragacanth, polyvinylpyrrolidone, hydroxypropylcellulose, etc.), excipients (lactose, sugar, corn starch, phosphoric acid) Calcium, sorbitol, glycine, etc.), lubricants (magnesium stearate, talc, polyethylene glycol, silica, etc.), disintegrants (potato starch, carboxymethylcell mouth, etc.), wetting agents (sodium lauryl sulfate, etc.) Can be used. Flavors such as Strawberry 'Flapper and Peppermint can also be added.
  • Oral solutions can be aqueous solutions or dry products. Such oral solutions may contain conventional additives, for example preservatives (methyl or hydroxypropyl benzoate or pill, sorbic acid, etc.).
  • the content of the insulin-inducing polypeptide, which is a medicinal component, can be appropriately determined depending on the severity of the symptoms and the dosage form, but is usually 5 to: 000% (w / w), preferably 10 to 60%. (w / w).
  • the dose of the drug varies depending on the age, weight, symptoms, etc. of the patient, but can be about 100 to 200 mg / kg / day as the amount of the insulin-inducing polypeptide.
  • a composition such as a food or drink
  • it can be produced by blending an insulin-inducing polypeptide so as not to impair its activity in the process of producing an existing product.
  • foods and drinks include, for example, beverages such as soft drinks, nutritional drinks, fruit drinks, and lactic acid drinks (including concentrated stock solutions and Z or prepared powders for preparing these drinks); ice cream , Sorbet and other frozen desserts; buckwheat, udon, bread, rice cake, rind skin, and other processed cereals; candy, candy, chocolate, snacks, biscuits, cookies, crackers, jellies, jams, etc .; kamaboko , Ham, ham, sausage, etc., marine and livestock processed foods; processed milk, cheese, pauna etc., dairy products; margarine, lard, mayonnaise, etc., oils and fats and processed foods; soy sauce, sauce, miso , Ponzu, kelp soup, soup ingredients, seasonings; various prepared foods; pickles; other various forms of
  • the therapeutic agent comprising the above-mentioned insulin-inducing polypeptide and the oral composition containing the insulin-inducing polypeptide normalize the blood glucose level of diabetic patients, impaired glucose tolerance, diabetes (type II diabetes, etc.) , Insulin resistance syndrome (insulin receptor abnormalities etc.), polycystic ovary syndrome, hyperlipidemia, atherosclerosis, cardiovascular diseases (angina pectoris, heart failure etc.), hyperglycemia, hypertension, Angina, pulmonary hypertension, congestive heart failure, diabetic complications (e.g. diabetic gangrene, diabetic arthropathy, diabetic glomerulosclerosis, diabetic skin disorder, diabetic neuropathy, diabetic cataract, It is effective in the prevention and treatment of skin disorders, taste disorders, etc.
  • insulin-inducing polypeptide normalize the blood glucose level of diabetic patients, impaired glucose tolerance, diabetes (type II diabetes, etc.) , Insulin resistance syndrome (insulin receptor abnormalities etc.), polycystic ovary syndrome, hyperlipidemia
  • NK nattokinase
  • genomic DNA is prepared from Bacillus subtilis natto using the Dneasy Tissue Kit (QUIAGEN), and the full length KN gene cDNA is amplified by PCR using this as ⁇ type.
  • a PCR primer was designed on the basis of a known NK mRNA sequence (GenBank / AY219901: SEQ ID NO: 1), and genomic DNA was used as type III and PCR was performed using KODplus (TOYOBO). After confirming the molecular weight of the PCR product by electrophoresis, it was cloned into PPCR-Script vector (INVITROGEN) and the sequence was confirmed.
  • the polypeptide was prepared using an in vitro transcription and translation system (cell-free system). Insert the 4 types of NK cDNAs with the stop codon removed and His tag sequence added into the EcoRV / XhoI site of the pEU3-NII vector attached to the PROTEIOS Wheat germ cell-tree protein synthesis core kit manufactured by TOYOBO did.
  • Expression vectors were constructed using cDNAs encoding NK polypeptides (NK20-326) from which amino acids were deleted as inserts.
  • mRNA was transcribed by reacting with TOYOBO Thermo T7 RNA polymerase (150U) at 37 for 4 hours, and after confirmation by electrophoresis, the transcribed mRNA (12 Hg) was used for 26 to 24 hours.
  • TOYOBO Thermo T7 RNA polymerase 150U
  • the transcribed mRNA (12 Hg) was used for 26 to 24 hours.
  • Four kinds of polypeptides were obtained by translation reaction. The obtained polypeptide was confirmed by SDS-PAGE and electrophoresis followed by bearish-able staining.
  • the fusion polypeptide was confirmed by Western blotting using a His tag antibody.
  • a 5-week-old C57BL / 5 male mouse was intraperitoneally administered with 2 mg of STZ (streptozodocin) to produce a type 1 diabetes (insulin deficient) model mouse.
  • the blood glucose level after fasting at 12 weeks of age for 3 hours reached approximately 400 mg / dl.
  • the fasting blood glucose level was measured, and then a 2 g / kg glucose load (oral administration of sugar water using a gastric tube) was performed.
  • Blood glucose was measured from the orbital venous plexus of the mouse using a capillary by using Redal Test Ace (GT-1640: manufactured by Sanwa Chemical Laboratory).
  • NK polypeptides (NK1-381, NK20-381, NK20-326) were orally administered to STZ mice.
  • the polypeptide was suspended in PBS (Phosphate Buffer Saline) and administered at about 0.5 g / 50 z1 per animal. Thereafter, the blood glucose level was measured every .20 minutes until 120 minutes later, and the mice that had completed the measurement collected whole blood by cardiac blood sampling.
  • each polypeptide was injected intravenously (tail vein) (about 0.5 g / 50 / il) to STZ mice.
  • the test time was the same as for the oral administration except that the fasting time of the mice was 24 hours and the blood glucose measurement after intravenous injection was 30 minutes and 60 minutes later.
  • FIG. 1 is a graph comparing the blood glucose levels of the polypeptides (NK1-381, NK20-381, NK20-326) at 0 minutes and 60 minutes after intravenous injection of the tail. As is evident from FIG. 1, the polypeptide significantly reduced blood glucose 60 minutes after oral administration when compared to intravenous injection. These results show changes in blood glucose over time up to 80 minutes after administration of the polypeptide. (Oral administration) and Figure 3 (intravenous tail injection). As shown in Fig. 2, in the case of oral administration, blood glucose levels decreased in the order of NK20-381, NK1-381, and NK20-326, but no significant difference was found.
  • NK20-326 was used as the polypeptide. This polypeptide NK20-326 was suspended in PBS and orally administered to STZ mice at a dose of 40 g / 0.2 ml. Specifically, after fasting for 19 hours, orally administer the polypeptide NK20-326 30 minutes after a 2 g / kg glucose load, and measure the blood glucose level at 1 hour, 2 hours, 4 hours, and 8 hours did. As a control, 0.2 ml of PBS was administered under the same conditions as the sample, and the blood glucose level was measured at the same time.
  • Table 1 (upper left) shows the weight of five STZ mice, and Table 1 (upper right) shows the blood glucose level (mg / dl) immediately before NK20-326 administration.
  • the other values in Table 1 are the blood glucose levels of each mouse at 1 hour (middle left), 2 hours (middle right), 4 hours (lower left), and 8 hours (lower right) after administration of NK20-326.
  • Table 2 shows the results of the control (oral administration of PBS) in the same manner as in Table 1.
  • Figure 5 is a graph of the results in Tables 1 and 2.
  • the STZ mouse orally administered the insulin-inducible polypeptide NK20-326 of the present invention was significantly (t test: p ⁇ 0.05) compared with the control. Reduced blood sugar. STZ oral administration (NK20-326)
  • Oral or subcutaneous administration of human insulin 400 ng / animal
  • lmg / kg of nattokinase purified product of about 65% purity
  • the blood glucose level of STZ mice was changed under the same conditions as described in (3) above, except that kg orally or subcutaneously, and 0.2 ml of the recombinant protein synthesis kit medium (8/8 sample) were orally or subcutaneously administered. It was measured.
  • NK20-69, NK20-119, NK20-219, NK40-219 was prepared, and insulin-inducible NK polypeptide was prepared in the same manner as in Example 1 (2). .
  • STZ streptozodocin 195 mg / kg was intraperitoneally administered to 6-week-old C57BL / 5 male mice (SLC) to produce type 1 diabetes (insulin deficient) model mice.
  • Blood glucose was collected from the orbital venous plexus of mice using a capillarium and measured by Daltest Ace (GT-1640: manufactured by Sanwa Chemical Laboratory).
  • each of the NK polypeptides was orally administered to STZ mice.
  • the polypeptide was suspended in PBS (Phosphate Buffer Saline) to prepare 100 mg / ml, and 0.2 ml / animal was administered.
  • PBS + BSA was administered in the same amount as the NK polypeptide. Thereafter, blood glucose was measured every 30 minutes for up to 4 hours.
  • NK20-69 shown in Fig. 6 Did not show a significant blood sugar lowering effect as compared to On the other hand, NK20-119 (FIG. 7) and NK20-210 (FIG. 8) each showed a significant (p ⁇ 0.05) blood glucose lowering effect as compared with the control.
  • NK40-219 which lacked the 39 amino acids at the N-terminal of NK, did not show a significant blood glucose lowering effect in either 1/1 (Fig. 9) or 1/10 (Fig. 10).
  • the NK polypeptide consisting of an amino acid sequence of 50 amino acids or more from the 20th amino acid at the N-terminal to the C-terminal has insulin-inducibility (blood glucose lowering effect).
  • NK40-219 did not show a blood glucose lowering effect, it was confirmed that the N-terminal 20-39 amino acid region was an essential active region.
  • Insulin-inducible NK polypeptide NK20-219 was produced in the same manner as in Example 1 (2).
  • mice Six-week-old C57BL db / db male mice (Clear Japan: type I diabetes model mouse) were divided into groups so that the average blood glucose level after a 3-hour fast was about 400 mg / dl. After fasting for 18 hours, the fasting blood glucose level was measured, and a 2 g / kg glucose load (oral administration of sugar water by gastric sonde) was performed. Blood glucose was measured from the orbital venous plexus of mice using a capillarium and measured by Daltest Ace (GT-1640: manufactured by Sanwa Chemical Laboratory). After confirming that the blood glucose level increased 30 minutes after the glucose load, NK polypeptide NK20-219 was orally administered to db / db mice.
  • GT-1640 Daltest Ace
  • the polypeptide was suspended in PBS (Phosphate Buffer Saline) to prepare 100 mg / ml, and 0.2 ml / animal was administered. As a control, PBS was administered in the same amount as the NK polypeptide. Thereafter, blood glucose levels were measured until 1, 2, and 4 hours later.
  • PBS Phosphate Buffer Saline
  • the insulin-inducing polypeptide of the present invention has an effective therapeutic effect also on type II diabetes.
  • insulin can be effectively induced to lower blood glucose level, and can be administered orally, for prevention, improvement and treatment of diabetes and the like. Effective agents and compositions are provided.

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Abstract

枯草菌ナットーキナーゼの部分ペプチドであって、ナットーキナーゼを構成するアミノ酸配列のN端より第20番目アミノ酸からC端側の連続50アミノ酸以上のアミノ酸配列、またはその配列内における複数個のアミノ酸残基が欠失、付加、若しくは他のアミノ酸残基に置換した配列を有するインスリン誘導徃ポリペプチド、およびこのポリペプチドを含有する経口組成物。これらのポリペプチドおよび組成物は、経口投与によって糖尿病に対する治療効果を有する。

Description

明細書 インスリン誘導性ポリペプチド 技術分野 この出願の発明は、 ィンスリン誘導性ポリべプチドと経口組成物に関するもの である。 さらに詳しくは、 この出願の発明は、 経口投与した場合にインスリン誘 導 ·血糖値降下作用を有するポリペプチドと、 このポリペプチドを含有する機能 性食品や糖尿病治療薬等の組成物に関するものである。
背景技術 糖尿病は膝臓 3細胞から分泌されるホルモンであるィンスリンの絶対的不足 ( 1型糖尿病） 、 あるいは相対的不足 ·作用不足 （2型糖尿病） に起因する血糖 値上昇を伴う疾患であり、 先進諸国において最も大きな問題となっている生活習 慣病の一種である。 治療法としてはィンスリン投与が広く行われているが、 急激な血糖低下作用に よる副作用等によって必ずしも安全なものではない。 このため、 ィンスリンに替わる成分を用いた糖尿病治療薬の開発が進められて いる。 このような糖尿病治療薬の成分は、 各種の有機 '無機化合物から広く選択 されているが、 タンパク質やペプチドを有効成分とする糖尿病治療薬も提案され ている。 例えば、 GLP- 1 アナログまたはそのペプチドの糖尿病治療への応用 (特許文献 1 ) 、 ァクチビン類やその部分ペプチドを有効成分とする糖尿病治療 薬 （特許文献 2 ) 、 -エンドルフィンの C 末端ペプチドを有効成分とする糖尿 病治療薬 （特許文献 3 ) 等が知られている。 なお、 ナッ ト一キナーゼ （ nattokinase ) は納豆菌 （枯草菌 Bacillus s btilis) が産生する酵素 （プロテアーゼ） であり、 その血栓溶解効果を利用し た発明 （特許文献 4 ) が知られている。 しかしながら、 このナット一キナ一ゼと ィンスリン誘導および血糖値低下、 あるいは高血糖改善作用との関連性は知られ ていない。 特許文献
1 ：特開 2003- 192698号公報
2 ：特開 2003- 1 131 1 1号公報
3 ：特表 2000-510821号公報
4 ：特開 2002-360220号公報
発明の開示 タンパク質やべプチドを有効成分とする薬剤は、 化合物を有効成分とする薬剤 に比較して安全性の点において優れたものであるが、 夕ンパク質やべプチドは経 口投与した場合には消化器官において分解されやすいため、 経口以外の投与経路 (例えば血中注射） によって使用するのが一般的である。 しかしながら、 糖尿病 は通常、 日常生活を営みながら必要時に投薬治療を行うことが可能な疾患であり、 過度な負担を伴う注射に頼らない、 より簡便な投与形態 （すなわち経口投与） を 伴う糖尿病治療薬が望まれていた。 この出願の発明は、 以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、 優れた インスリン誘導能を有するポリペプチドと、 このポリペプチドを含有する組成物 を提供することを課題としている。 この出願は、 前記の課題を解決する第 1の発明として、 枯草菌ナッ ト一キナー ゼの部分ペプチドであって、 ナット一キナーゼを構成するアミノ酸配列の N 端 より第 20番目アミノ酸から C端側の連続 50アミノ酸以上のアミノ酸配列、 ま たはその配列内における複数個のアミノ酸残基が欠失、 付加、 若しくは他のアミ ノ酸残基に置換した配列を有するインスリン誘導性ポリぺプチドを提供する。 この第 1発明のインスリン誘導性ポリペプチドは、 ナツトーキナーゼを構成す るアミノ酸配列が配列番号 2であることを一つの具体的態様としている。 またこの出願は、 第 2の発明として、 前記のインスリン誘導性ポリペプチドを 含有する経口組成物を提供する。 さらにこの出願は、 第 3 の発明として、 前記第 1 発明のインスリン誘導性ポ リペプチドを経口投与することを特徴とする糖尿病の治療方法を、 第 4 の発明 として、 前記第 2 発明の経口組成物を摂取させることを特徵とする糖尿病の治 療方法を、 それぞれ提供する。 すなわちこの出願の発明者は、 枯草菌ナツトーキナ一ゼ （nattokinase) の部 分ペプチドが、 糖尿病モデル動物に経口投与した塲合に、 優れたインスリン誘導 性と、 それに伴う血糖値降下作用を発揮することを見出してこの発明を完成させ た。 なお、 この出願の発明において、 「インスリン誘導」 とは広く定義され、 例え ば機能的にはィンスリンによる血糖値の低下作用が亢進することを意味する。 あ るいはまた、 膊臓 /3細胞におけるインスリン遺伝子の活性化、 インスリン遺伝子 から発現されたインスリン前駆体タンパク質 （プロインスリン） からインスリン への変換促進等を含めたィンスリン分泌の促進を意味する。 また 「タンパク質」 または 「ポリペプチド」 とは、 天然のアミド結合 （ぺプチ ド結合） または天然のアミド結合以外の残基連結によって互いに結合した複数個 のアミノ酸残基から構成された分子を意味する。 さらには、 「ポリヌクレオチ ド」 とは、 プリンまたはピリミジンが糖に /3 -N-グリコシド結合したヌクレオシ ドのリン酸エステル （ATP、 GTP、 CTP、 UTP； または dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP) が結合した 100個以上連結した分子を意味する。 具体的には、 プロティ ンをコードするゲノム DNA、 ゲノム DNAから転写される mRNA、 mRNAから 合成される cDNA等である。 また、 2 本鎖であっても 1 本鎖であってもよい。 さらに、 これらのゲノム DNAや mRNA、 cDNAのセンス鎖およびアンチセンス 鎖も含まれる。 この出願の各発明におけるその他の用語や概念は、 発明の実施形態の説明や実 施例において詳しく規定する。 またこの発明を実施するために使用する様々な技 術は、 特にその出典を明示した技術を除いては、 公知の文献等に基づいて当業者 であれば容易かつ確実に実施可能である。 例えば、 この発明の薬剤の調製は Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co. , Easton, PA, 1990に、 遺伝子工学および分子生物学的 技術は Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989 ; Ausubel, F. M . et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995 等に記載されている。 さらに、 この発明における用語は 基本的には IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるも のであり、 あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくも のである。
図面の簡単な説明 図 1 はこの発明のインスリン誘導性ポリペプチド （NK1-381、 NK20-381、 NK20-326) を I型糖尿病モデルマウス （STZマウス） に経口および尾静注した 0分後および 60分後の血糖値を比較したグラフと、 0分後の血糖値を 100 とし た場合の 60分後の血糖値の割合を比較したグラフ （右上） である。 図 2はポリべプチド経口投与の 80分後までの経時的な血糖血変化を示したグ ラフ （左） と、 各群の 0分後の血糖値を 100 とした場合の変化の程度を示した グラフ （右） である。 図 3 は STZマウスへのポリぺプチド尾静注の 80分後までの経時的な血糖血 変化を示したグラフ (右) と、 図 2の左図を対比して示す。 図 4はポリぺプチドを経口投与または尾静注した STZマウスの Insulin 2血 中濃度を比較したグラフである。 図 5 はこの発明のインスリン誘導性ポリペプチド （NK20-326) および PBS (コントロール） を STZ マウスへ経口投与した場合の血糖値の経時的変化を示 すグラフである。 図 6 はポリペプチド NK20-69 を STZマウスへ経口投与した場合の血糖値の 経時的変化を示すグラフである。 図 7はポリぺプチド NK20- 1 19を STZマウスへ経口投与した場合の血糖値の 経時的変化を示すグラフである。 図 8はポリべプチド NK20-219を STZマウスへ経口投与した場合の血糖値の 経時的変化を示すグラフである。 図 9はポリぺプチド NK40-219を STZマウスへ経口投与した場合の血糖値の 経時的変化を示すグラフである。 図 10はポリべプチド NK20-219の 1/ 10量を STZマウスへ経口投与した場 合の血糖値の経時的変化を示すグラフである。 図 1 1 は PBS (コントロール） を STZマウスへ経口投与した場合の血糖値の 経時的変化を示すグラフである。 図 12 は Π型糖尿病モデルマウス （db/db マウス） に PBS (コントロール） を経口投与した場合の血糖値の経時的変化を示すグラフである。 図 13は db/dbマウスにポリべプチド NK20-219を経口投与した場合の血糖 値の経時的変化を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態 第 1 発明のインスリン誘導性ポリペプチドは、 枯草菌ナット一キナーゼを構 成するアミノ酸配列の N端より第 20番目アミノ酸から C端側の連続 50ァミノ 酸以上のアミノ酸配列からなるポリべプチドであって、 経口投与した場合にィン スリン誘導性を有し、 また人為的あるいは病的に上昇した血糖値を正常レベルま で低下させる作用を有するポリペプチドである。 ナツトーキナーゼには各種のものが知られており、 それらを制限なく使用する ことができるが、 この発明では、 一例として配列番号 2にアミノ酸配列を示した ナツトーキナーゼを提供する。 すなわちこのこの発明のィンスリン誘導性ポリぺ プチドは、 例えば配列番号 2 (381アミノ酸） における N端より第 20番目アミ ノ酸 （Met) から C端側の連続 50アミノ酸以上を必須として含むことを条件と して、 任意の長さとすることができる。 またこのポリペプチドは、 そのインスリ ン誘導能を損なわない範囲で、 複数個のアミノ酸残基が欠失、 付加、 若しくは他 のアミノ酸残基に置換した配列を有するものであってもよい。 この場合の複数個 とは、 例えば 1 ~30個程度である。 ただし、 N端側の第 20番目から第 26〜40 番目までのアミノ酸配列はィンスリン誘導性にとって必須である。 このようなポリペプチドは、 枯草菌ナツトーキナ一ゼの公知のアミノ酸配列 (例えば配列番号 2、 または GenBank/AF368283 に開示されたアミノ酵配 列） に基づき、 公知のペプチド合成法 （Merrifield, R.B. J. Solid phase peptide synthesis I. The synthesis of tetrapeptide. J. Amer. Chem. Soc. 85， 2149-2154, 1963； Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. A Practical Approach. Chan, W.C. and White, P.D., Oxford University Press, 2000) によって作成することもできる。 また例えば ABI431Aぺプチド · シンセサイザ ― (Perkin Elmer) 等を用いることによって自動的に行うこともできる。 このような合成ポリペプチドは、 天然のアミド結合以外の残基連結からなるも の、 あるいは天然アミノ酸残基の代わりの非天然残基からなるものであってもよ い。 天然のアミ ド結合以外の残基連結は、 例えばグルタルアルデヒド、 N-ヒドロ キシスクシンイミドエステル、 2官能マレイミ ド、 N，N，-ジシクロへキシルカル ポジイミ ド （DCC) 、 または Ν,Ν，-ジイソプロピルカルポジイミド （DIC) 等の 化学結合またはカップリング手段を例示することができる。 また、 ペプチド結合 の代替となり得る連結基は、 例えばケトメチレン （例えば、 -C ( =0) -CH2-に 対する- C (=θ) -NH-) 、 アミノメチレン ( CH2-NH) 、 エチレン、 才レフィン ( CH = CH) 、 エーテル ( CH2-0) 、 チォエーテル ( CH2-S) 、 テトラゾール ( CN4- ) 、 チアゾール、 レトロアミ ド、 チオアミ ド、 またはエステルを含む (例 ば、 Spatola (1983) in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, "Peptide Backbone Modifications," Marcell Dekker, NYを参照) 。 一方、 非天然のアミノ酸残基は、 芳香族アミノ酸については、 例えば D-また は L-ナフィルァラニン （naphylalanine) ； D-または L-フエニルグリシン； D- または L-2チェネイルァラニン （thieneylalanine) ； D-または L- 1，-2,3-また は 4-ピレネイルァラニン （pyreneylalanine) ； D-または レ3 チェネイルァラ ニン （thieneylalanine) ； D-または L- (2-ピリジニル) -ァラニン； D-または レ (3-ピリジニル） -ァラニン； D-または L- (2-ピラジニル） -ァラニン； D-また は L- (4-イソプロピル） -フエニルダリシシ ； D- (トリフルォロメチル） -フエ ニルダリシン ； D- (トリフルォロメチル） -フエ二ルァラニン ； D-P-フルオロ- フエ二ルァラニン； D-または L-P-ビフエ二ルフエ二ルァラニン； K-または L-P- メトキシ-ビフエニルフエ二ルァラニン； D-または L-2ィンドール （アルキル） ァラニン；および D-または L-アルキルァラニン （alkylalanine) であって、 ァ ルキルが置換されたかまたは未置換のメチル、 ェチル、 プロピル、 へキシル、 ブ チル、 ペンチル、 イソプロピル、 イソーブチル、 2級-イソチル （isotyl) 、 イソ —ペンチル、 または非酸性アミノ酸による置換によって生成することができる。 非天然アミノ酸の芳香環は、 例えば、 チアゾィル、 チォフエニル、 ピラゾィル、 ベンゾイミダゾリル、 ナフチル、 フラニル、 ピロリル、 およびピリジル芳香環を 含む。 酸性アミノ酸の場合には、 例えば負の電荷を維持している非力ルボン酸塩 アミノ酸； （ホスホノ） ァラニン；硫酸化トレオニンによる置換によって生成す ることができる。 カルボキシル側基 (例えば、 ァスパルチルまたはグルタミル) もまた、 例えば 1-シクロへキシル -3 (2-モルフオリニル- (4-ェチル） カルポジ イミ ドまたは 1-ェチル -3 (4-ァゾニァ- 4，4-ジメ卜一ルペンチル) カルポジイミ ドなどのカルポジイミド （R，-N-C-N-R>) との反応によって選択的に修飾するこ とができる。 ァスパルチルまたはダル夕ミルもまた、 アンモニゥムイオンとの反 応により、 ァスパラギニルおよぴグルタミニル残基に変換可能である。 塩基性ァ ミノ酸としては、 例えば （リシンおよびアルギニンに加えて） アミノ酸、 オル二 チン、 シトルリン、 または （グァ二ジノ） -酢酸、 またはアルキルが前文に定義 されている （グァ二ジノ） アルキル酢酸による置換によって生成することが可能 である。 二トリル誘導体 （例えば、 COOH の代わりに CN-部分を含んでいる） は、 ァスパラギンまたはグルタミン用に置換することが可能である。 ァスパラギ ニルおよびグル夕ミニル残基は、 対応するァスパルチルまたはダルタミル残基に 対して脱アミノ基を行うことが可能である。 非天然のアルギニン残基は、 アルギ ニルを、 例えば 1以上の、 例えばフエニルダリオキサール、 2，3-ブタンジオン、 1 ,2-シクロへキサンヂオン、 またはニンヒドリンを含む試薬と、 好ましくはアル カリ性の条件下に反応させることにより生成することができる。 チロシン残基の 場合は、 チロシルを、 例えば芳香族ジァゾニゥム化合物またはテトラニトロメタ ンと反応させることにより生成することができる。 N-ァセチルイミジゾールぉ よびテトラニトロメタンは、 各々 0-ァセチルチロシル類および 3-ニトロ誘導体 を用いて形成することができる。 非天然システィン残基は、 システィニル残基を, 2-クロ口酢酸などの α -ハロアセテート、 またはクロロアセトアミドおよび相当 するァミンと反応させ；カルポキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体 を生じさせることにより生成することができる。 非天然システィン残基はまた、 システィニル残基を、 例えばプロモ一トリフルォロ酢酸、 a -ブロモ - /3 - ( 5-ィ ミダゾィル） プロピオン酸； クロロアセチルホスフアート、 N-アルキルマレイ ミド、 3-ニトロ- 2-ピリジルジスルフィ ド ； メチル 2-ピリジルスルフィ ド ； P-ク 口口メルクリ安息香酸； 2-クロロメルクリ -4 ニトロフエノール； または、 クロ 口- 7-二トロべンゾ-ォキサ - 1 ,3-ジァゾールと反応させることにより生成するこ とができる。 非天然リジンは、 リシニルを、 例えば無水コハク酸または他の無水 カルボン酸と反応させることにより生成する （またアミノ末端残基が変更され る） ことができる。 リジンおよび他のひ-アミノ-含有残基模倣物はまた、 メチル ピコリンイミダート、 ピリ ドキサールホスフアート、 ピリ ドキサール、 クロロボ ロヒドリ ド、 トリニトロベンゼンアスルホン酸、 0-メチルイソ尿素、 2，4ペン夕 ンジオンといったィミドエステルを用いた反応、 およびトランスアミダーゼに触 媒されるダリォキシラートを用いた反応により生成することができる。 非天然メ チォニンは、 例えば、 メチォニンスルホキシドを用いた反応により生成すること ができる。 非天然プロリンは、 例えばピペコリン酸、 チアゾリジンカルボン酸、 3-または 4-ヒドロキシプロリン、 デヒドロキシプロリン、 3-または 4-メチルプ 口リン、 または 3，3,-ジメチルプロリンを含む。 非天然ヒスチジンは、 ヒスチジ ルを、 例えばジェチルプロカルボナートまたはパラーブロモフエナシルブロミ ド と反応させることにより生成することができる。 他の非天然のアミノ酸残基は、 例えば、 プロリンおよびリジンの水酸化；セェリルまたはトレオニル残基の水酸 基のリン酸化 ； リジン、 アルギニンおよびヒスチジンの 0! -ァミノ基のメチル 化； N-末端ァミンのァセチル化；主鎖アミド残基のメチル化または N-メチルァ ミノ酸による置換； または C-末端の力ルポキシル基のアミド化等を例示するこ とができる。 この発明のインスリン誘導性ポリペプチドはまた、 それをコードするポリヌク レオチドを利用した遺伝子工学的方法によっても得ることができる。 例えば、 ポ リヌクレオチドを保有する組換え発現ベクターからィンビトロ転写によって RNA を調製し、 これを铸型としてインビトロ翻訳を行うことにより目的のイン スリン誘導性ポリべプチドを得ることができる。 また組換え発現ベクターを大腸 菌、 枯草菌等の原核細胞や、 酵母、 昆虫細胞、 哺乳動物細胞等の真核細胞に導入 して形質転換細胞を作製すれば、 この形質転換細胞からインスリン誘導性ポリべ プチドを発現させることができる。 ィンスリン誘導性ポリべプチドを遺伝子工学的に発現させるためのポリヌクレ ォチドは、 枯草菌ナツトーキナ一ゼをコードする公知の配列 （例えば配列番号
1 ) を利用してナット一キナーゼ cDNA を取得し （例えば、 cDNA ライブラリ —に対するプローブハイブリダィゼ一シヨンや、 PCR 法） 、 このナット一キナ —ゼ cDNA からインスリン誘導性ポリペプチドのコード領域を制限酵素等によ つて切り出して使用することができる。 あるいは、 インスリン誘導性ポリべプチ ドをコードするポリ ヌクレオチドは、 公知の方法 （例えば、 Carruthers
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実施例 以下、 実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細に説明するが、 この 出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
実施例 1
(1) 組換えナット一キナーゼ （NK) の cDNAクローニング 納豆菌 （Bacillus subtilis natto) から Dneasy Tissue Kit (QUIAGEN社） を用いてゲノム DNAを調製し、 これを铸型として全長 KN遺伝子 cDNAを PCR 増幅した。 具体的には、 公知の NK mRNA配列 （GenBank/ AY219901：配列 番号 1 ) に基づき PCR プライマ一を設計し、 ゲノム DNA を铸型とて、 KOD plus (TOYOBO社） により PCRを行った。 PCR産物の分子量を電気泳動によ り確認後、 P PCR-Script ベクタ一 （INVITROGEN 社） にクローニングし、 配 列を確認した。
(2) NKポリペプチドの作製
イ ンビ トロ転写 · 翻訳系 （無細胞系） にてポリペプチドを作製した。 TOYOBO社製 PROTEIOS Wheat germ cell-tree protein synthesis core kitに 添付されている pEU3-NIIベクタ一の EcoRV/XhoI部位に、 終止コドンを除去 して His タグ配列を付加した 4種類の NK cDNAをそれぞれ挿入した。 すなわ ち、 381 アミノ酸からなる全長 NK ポリペプチド （NK1-381 ) をコードする cDNA、 全長 NKの N端から 19アミノ酸を削除した NKポリペプチド （NK20- 381) をコードする cDNA、 全長 NKの N端から 19 アミノ酸、 C端から 55ァ ミノ酸を削除した NKポリペプチド （NK20-326) をコードする cDNAをそれぞ れィンサ一トとする発現べクタ一を構築した。
次いで、 TOYOBO社製 Thermo T7 RNA polymerase (150U) を 37でで 4 時間反応させて mRNAを転写させ、 電気泳動にて確認の後、 転写された mRNA (12 H g) を用いて 26 24時間の翻訳反応により 4種類のポリペプチドを得た。 得られたポリペプチドは、 SDS- PAGE にて電気泳動の後、 クマ一シ一ブル一染 色により確認した。 また、 His タグ抗体を用いたウエスタンブロッテイングによ り融合ポリぺプチドを確認した。 (3) NKポリペプチドの経口投与 （I)
5週齢の C57BL/5雄性マウスに STZ (streptozodocin) 2mgを腹腔投与し、 1型糖尿病 （インスリン欠乏型） モデルマウスを作成した。 12週齢で 3 時間の 絶食後の血糖値が約 400mg/dlに達したものを用いた。 18時間絶食させ、 空腹 時の血糖値を測定した後に、 2g/kg の糖負荷 （胃ゾンデによる砂糖水の経口投 与） を行った。 血糖値はマウスの眼窩静脈叢からキヤピラリーを用いて採血を行 レ ダルテストエース （GT- 1640：三和化学研究所製） によって測定した。 糖 負荷 30分後に血糖値が上昇したことを確認し、 NKポリペプチド （NK1-381、 NK20-381, NK20-326) を STZ マウスに経口投与した。 なお、 ポリペプチド は PBS (Phosphate Buffer Saline) に懸濁し、 1匹当たり約 0.5 g/50 z 1を 投与した。 その後は .20 分ごとに 120 分後まで血糖値を測定し、 測定の終了し たマウスは心臓採血により全血を採取した。
また、 STZマウスに対して、 各ポリペプチドを静脈 （尾静脈） 注射 （約 0.5 g/50/il) した。 試験時間は、 マウスの絶食時間が 24 時間であったこと、 およ び静脈注射後の血糖値測定が 30分後および 60分後であったことを除き、 前記 経口投与と同一である。
結果は、 図 1-3 に示したとおりである。 図 1 は、 ポリペプチド （NK1-381、 NK20-381、 NK20-326) を経口おょぴ尾静注した 0分後および 60 分後の血糖 値を比較したグラフである。 この図 1 から明らかなように、 ポリペプチドは、 尾静注に比較して、 経口投与の場合に有意に 60分後の血糖血を低下させた。 こ の結果は、 ポリペプチド投与の 80分後までの経時的な血糖血変化を示した図 2 (経口投与） および図 3 (尾静注） の結果からも明らかである。 なお、 図 2に示 したように、 経口投与の場合には、 NK20-381、 NK1-381、 NK20-326 の順番 で血糖値が低下したが、 有意な差は見いだせなかった。
さらに、 マウスから採取した全血を対象として、 ELISA により Insulin 2 の 血中濃度を測定した。 その結果、 図 4 に示したように、 特に NK20-381 の経口 投与によって血中ィンスリン濃度が極めて高くなることが確認された。
(4) NKポリペプチドの経口投与 （II)
STZ 投与による 1型糖尿病モデルマウス （C57BL/6： 6、 8 週齢、 体重 17- 19g： 19 時間絶食後の血糖値 500mg/dl以上、 ィンスリン検出下限以下：各群 5 匹） を用いて、 インスリン誘導性ポリペプチドの効果を試験した。 ポリべプチ ドとしては、 NK20-326 を使用した。 このポリペプチド NK20-326を、 PBSに 懸濁し、 40 g/0.2mlの投与量で STZマウスに経口投与した。 具体的には、 19 時間絶食後、 2g/kg の糖負荷の 30分後にポリペプチド NK20-326 を経口投与 し、 1 時間後、 2時間後、 4時間後、 8時間後の血糖値を測定した。 コントロー ルとしては 0. 2mlの PBS をサンプルと同一条件で投与し、 同一時間経過で血 糖値を測定した。
表 1 (左上） は 5匹の STZマウスの体重であり、 表 1 (右上）は NK20-326投 与直前の血糖値 （mg/dl) を示す。 表 1 の他は、 NK20-326 投与 1時間後 （左 中） 、 2時間後 (右中）、 4時間後 （左下） 、 8時間後 (右下）における各マウスの血 糖値である。 表 2は、 コントロール （PBS 経口投与） の結果を表 1 と同様に示 した。 さらに図 5は表 1および表 2の結果をグラフ化したものである。
この表 1、 2および図 5に示したとおり、 この発明のインスリン誘導性ポリべ プチド NK20-326を経口投与された STZマウスは、 コントロールと比較して有 意 （tテスト： p<0.05) に血糖値を低下させた。 STZ経口投与（NK20 - 326 )
0.2ml
19h絶食
Smple
No. B.W. Glucose Po Time Time (h) No. BG
Time
1 15.5 10 : 35 1 11 : 35 433
2 18.0 1 2 1 473
3 17.5 i 0 3 i 477
4 18.5 1 4 1 411
5 17.7 4 5 1 583 475 .4
Time (h) No. Time BG Time (h) No. Time BG
1 12 : 35 194 1 13 : 35 225
2 1 385 2 1 469
1 3 1 444 2 3 1 536
4 i 309 4 i 504
5 i 14 349.2 5 i 497 446.2
Time (h) No. Time BG Time (h) No. Time BG
1 15 : 35 266 1 19 : 35 209
2 I 481 2 i 560
4 3 i 509 8 3 i 600
4 1 500 4 I 528
5 i 556 462.4 5 i 600 499.4 表 2
Figure imgf000019_0001
(5) 比較試験
ヒト ' インスリン （400ng/匹） を経口または皮下投与、 ナツ トウキナーゼ (粗精製品：純度 40 %以下） の 200mg/kgを経口投与、 ナット一キナーゼ （精 製品：純度 65 %程度） の lmg/kgを経口または皮下投与、 リコンビナントプロ ティン合成キットの培地 （8/8 サンプル） の 0.2ml を経口または皮下投与を行 つた以外は、 前記 (3)と同一の条件で STZマウスの血糖値変化を測定した。
その結果、 これらの物質を経口または皮下投与した場合には、 血糖血は全く低 下しなかった。
実施例 2
( 1) NKポリペプチドの作製
N ポリペプチド （NK20-69、 NK20- 1 19, NK20-219, NK40-219) をコー ドする cDNA を調製し、 実施例 1 (2)と同様にしてインスリン誘導性 NKポリべ プチドを作製した。
(2) NKポリペプチドの経口投与
6 週齢の C57BL/5 雄性マウス （SLC ) に STZ ( streptozodocin ) 195 mg/kg を腹腔投与し、 1型糖尿病 （インスリン欠乏型） モデルマウスを作成し た。 3時間の絶食後の血糖値が約 400mg/dl に達したものを用いた。 18時間絶 食させ、 空腹時の血糖値を測定した後に、 2g/kg の糖負荷 （胃ゾンデによる砂 糖水の経口投与） を行った。 血糖値はマウスの眼窩静脈叢からキヤビラリ一を用 いて採血を行い、 ダルテストエース （GT- 1640：三和化学研究所製） によって 測定した。 糖負荷 30 分後に血糖値が上昇したことを確認し、 NK ポリペプチド の各々を STZマウスに経口投与した。 なお、 ポリペプチドは PBS (Phosphate Buffer Saline) に懸濁して 100 mg/mlとなるように調製し、 0.2 ml/匹を投与 した。 また、 コントロールとして PBS + BSA を NKポリペプチドと同量投与し た。 その後は 30分ごとに 4時間後まで血糖値を測定した。
結果は図 6- 1 1 に示したとおりである。 図 6に示した NK20-69はコントロー ル （図 11 ) と比較して有意な血糖値低下作用は示さなかった。 これに対して NK20- 1 19 (図 7) 、 NK20-210 (図 8) はそれぞれコントロールと比較して有 意 （p<0.05) な血糖値低下作用を示した。 ただし、 NKの N端 39アミノ酸を欠 失した NK40-219 には、 1/ 1量 （図 9) でも 1/ 10量 （図 10) でも有意な血 糖値低下作用は観察されなかった。
以上の結果から、 N端の第 20番目アミノ酸から C端側の 50アミノ酸以上の アミノ酸配列からなる NKポリペプチドにインスリン誘導性 （血糖値低下作用） があることが確認された。 また NK40-219 が血糖値低下作用を示さなかったこ とから、 N端 20- 39アミノ酸領域が必須の活性領域であることも確認された。
実施例 3
( 1) NKポリペプチドの作製
実施例 1 (2)と同様にしてインスリン誘導性 NKポリペプチド NK20-219 を作 製した。
(2) NKポリペプチドの経口投与
6週齢の C57BL db/db雄性マウス （日本クレア ： I型糖尿病モデルマウス） を、 3 時間の絶食後の平均血糖値が約 400mg/dl となるように群分けした。 18 時間絶食させ、 空腹時の血糖値を測定した後に、 2g/kg の糖負荷 （胃ゾンデに よる砂糖水の経口投与） を行った。 血糖値はマウスの眼窩静脈叢からキヤビラリ —を用いて採血を行い、 ダルテストエース （GT- 1640：三和化学研究所製） に よって測定した。 糖負荷 30 分後に血糖値が上昇した.ことを確認し、 NK ポリべ プチド NK20-219 を db/db マウスに経口投与した。 なお、 ポリペプチドは PBS (Phosphate Buffer Saline) に懸濁して 100 mg/mlとなるように調製し、 0.2 ml/匹を投与した。 また、 コントロールとして PBS を NKポリペプチドと 同量投与した。 その後は 1、 2、 4時間後まで血糖値を測定した。
結果は図 12、 13 に示したとおりである。 すなわち図 12に示したとおり、 Π 型糖尿病マウスにおいては、 PBS (コントロール） を経口投与しても血糖値の低 下は全く観察されなかった。 これに対して、 NK ポリペプチド （NK20-219) は， 図 13に示したとおりに顕著な血糖値低下作用を示した。
以上の結果から、 この発明のィンスリン誘導性ポリペプチドは Π型糖尿病に対 しても有効な治療効果を有することが確認された。
産業上の利用可能性 以上詳しく説明したとおり、 この発明によって、 インスリンを効果的に誘導し て血糖値を低下させることができ、 しかも経口投与することのできる、 糖尿病等 の予防、 改善および治療に有効な薬剤および組成物が提供される。

Claims

請求の範囲
1. 枯草菌ナツ卜一キナーゼの部分ペプチドであって、 ナット一キナ一ゼを構 成するアミノ酸配列の N端より第 20番目アミノ酸から C端側の連続 50ァミノ 酸以上のアミノ酸配列、 またはその配列内における複数個のアミノ酸残基が欠失、 付加、 若しくは他のアミノ酸残基に置換した配列を有するインスリン誘導性ポリ ぺプチド。
2. ナツトーキナ一ゼを構成するアミノ酸配列が配列番号 2である請求項 1の インスリン誘導性ポリペプチド。
3. 請求項 1または 2のインスリン誘導性ポリペプチドを含有する経口組成物,
4. 請求項 1または 2のィンスリン誘導性ポリペプチドを経口投与することを 特徴とする糖尿病の治療方法。
5. 請求項 3の経口組成物を摂取させることを特徵とする糖尿病の治療方法。
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