CN101505599A - 5(s)-(2′-羟基乙氧基)-20(s)-喜树碱及其制备和治疗癌症的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一种5(S)－(2′－羟基乙氧基)－20(S)－喜树碱非对映异构体，其是比非对映异构体混合物5(RS)－(2′－羟基乙氧基)－20(S)－喜树碱或者5(R)－(2′－羟基乙氧基)－20(S)－喜树碱非对映异构体更好的拓扑异构酶I抑制剂，还描述了5(S)－(2′－羟基乙氧基)－20(S)－喜树碱非对映异构体的药用组合物，以及使用所述化合物抑制拓扑异构酶I和治疗癌症的方法。

Description

5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱及其制备和治疗癌症的应用
相关专利和专利申请的交互参考
[00001]本发明的主题涉及2001年1月23日授权的美国专利号6,177,439和涉及同时待审的且共同所有的美国非临时专利申请，该申请与本申请同一天提交，其题目为：5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的结晶形式，且具有代理人编号DRF 3.01-031 US(其全文通过引用结合于本文)。
[00002]本申请是专利合作条约申请并要求2006年5月24日提交的印度临时申请号897/CHE/2006和2007年1月31日提交的美国临时申请号60/887,416的权益，其各自依赖于本文并且其全文通过引用结合于本文。
发明背景
(1)发明领域：
[00003]本发明涉及喜树碱的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱非对映异构体的制备及其治疗癌症的应用。
(2)相关技术的描述：
[00004]喜树碱(CPT)是由Wall等，J.Am.Chem.Soc，88：3888(1966)首先从中国树喜树(Camptotheca acuminate)分离的五环植物碱。喜树碱的结构以式I表示：
[00005]如果没有修饰，喜树碱是高度亲脂性的且水溶性差。使用由氢氧化钠水溶液溶解的喜树碱钠(sodium camptothecin)的早期的临床试用显示，该化合物具有抗肿瘤活性，并且进一步的研究证明，该活性是由于该化合物作为DNA拓扑异构酶I抑制剂的作用所致。然而，因为毒性问题和有限的水溶性，喜树碱的治疗潜力因此远未能被充分认识。
[00006]提供该化合物的改善的特性的努力已经包括众多喜树碱类似物的合成和测试。例如，美国专利号5,004,758描述水溶性喜树碱类似物，US 5,734,056描述喜树碱类似物。在美国专利号5,004,758和美国专利公布号US 2007/0105885中讨论了托泊替康，一种喜树碱的类似物。
[00007]在美国专利号6,177,439中描述了多种20(S)-喜树碱的碳-5取代的类似物。一种这样的类似物，5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱具有以式II表示的结构：
Figure A200780027172D00061
6,177,439专利公开了制备此类似物(在本文指的是5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱或5-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱)的非对映异构体混合物的方法。
[00008]5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱是具有五环结构的5-烷氧基取代的20(S)-喜树碱类似物。其在碳-5和碳-20位上具有手性中心。碳-20手性中心相应于天然S-构型。然而，碳-5取代表示大约相同比例的R和S非对映异构体两者。5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的分子式是C22H20N2O6。该化合物的分子量为408.41g/摩尔和熔点为190℃。非对映异构体混合物5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱，其也可指5-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱，具有差的水溶性。
[00009]5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱非对映异构体在化学上被描述为5(S)-(2-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱，然而5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱非对映异构体在化学上被描述为5(R)-(2-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱。5(S)-(2-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱在化学上也被描述为4-(S)-乙基-4-羟基-12(S)-(2-羟基乙氧基)-1，12-二氢-4H-2-氧杂-6，12a-二氮杂二苯并[b，h]芴-3，13-二酮，其化学结构以式III表示：
Figure A200780027172D00071
[00010]5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的化学结构以式IV表示：
Figure A200780027172D00072
[00011]一般而言，当存在于对称环境中时，除了它们能够旋转平面-偏振光相同的量但方向相对外，为对映体的异构体具有同样的化学和物理特性。另一方面，为非对映体(或非对映异构体)的异构体为不是对映体的立体异构体。非对映异构体可，并且最常常具有不同的物理特性和不同的反应性。在另一个定义中，非对映异构体是在一个或多个手性中心具有相对构型的一对异构体而不是为相互的镜像体(images)。
[00012]这样，从前述可以清楚得知，应该需要提供喜树碱在癌症治疗中的益处，同时减轻或避免其不需要的一种或多种副作用或缺点，而这些副作用或缺点限制了其应用。
发明简述
[00013]因此，简言之，本发明涉及基本上无5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱非对映异构体的新的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱非对映异构体。
[00014]本发明也涉及抑制细胞中拓扑异构酶I活性的新的方法，该方法包括给予细胞有效抑制拓扑异构酶I的量的、基本上无5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱。
[00015]本发明也涉及包含以上描述的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱和药学上可接受的载体的新的药用组合物。
[00016]本发明也涉及使用5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱制备药用组合物的新的方法，该方法包括使以上描述的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱与药学上可接受的载体混合。
[00017]本发明也涉及制备以上描述的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的新的方法，该方法包括以下步骤：
a)使5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱与选自正-丁醇或四氢呋喃的溶剂混合；
b)使该混合物回流约1至约4小时；
c)使该混合物冷却至约40℃至约50℃的温度；和
d)从该混合物中分离固体5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱。
[00018]本发明也涉及使用5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱在患者中治疗癌症的新的方法，该方法包括给予患者有效量的以上描述的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱。
[00019]因此，在发现的由本发明实现的几个优点中，可以注意到给定的方法和组合物提供喜树碱在癌症治疗中的益处，同时减轻或避免其不需要的一种或多种副作用或缺点，而这些副作用或缺点限制了其应用。
附图简述
[00020]图1显示5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的一个样本的HPLC色谱图；和
[00021]图2显示5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的另一个样本的HPLC色谱图。
优选实施方案的详述
[00022]依据本发明，发现5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱非对映异构体是比或者非对映异构体混合物5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱或者5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱非对映异构体显著更好的拓扑异构酶I的抑制剂。实际上，5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱效力强度是5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的20倍和是非对映异构体混合物5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的几乎12倍。
[00023]此外，5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱非对映异构体已经显示为比非对映异构体混合物5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱或5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱非对映异构体的肿瘤和癌症细胞生长的更好的抑制剂。
[00024]然而，出乎意料的是，5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱非对映异构体的增强的抗-癌症活性并不伴随着其对正常人细胞毒性的相称的增加。实际上，当5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱-5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱非对映异构体对抗癌细胞系的体外效价与健康人细胞的体外毒性相比，发现安全边际(GI90/GI50)是5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱非对映异构体的两倍。
[00025]再有，5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱非对映异构体的存在对5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱非对映异构体的生物利用度具有负面效应。从而，有利的是给予适于癌症的治疗的患者以基本上无5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱非对映异构体的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱非对映异构体。
[00026]为了描述本发明，将本文某些术语定义如下。
[00027]术语“5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱”意欲不仅涵盖更具活性的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的内酯形式，还包括较少活性的羧酸酯形式，包括由此形成的任何盐。
[00028]术语“抑制”及其多种变化指可经由本文描述的方法检测的细胞活性，诸如拓扑异构酶I活性的任何降低。
[00029]以下进一步定义的术语“药学上可接受的”指那些在正确医学判断范围内、适于用于与人和低级动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应等的活性药物、水合物、溶剂合物、盐、多晶型物、载体等，它们与合理的利益/风险比相称并且在它们计划的用途中是有效的。
[00030]如本文使用的、在以下进一步详细定义的术语“个体”、“受治疗者”和“患者”，指需要诊断、治疗或疗法的任何动物。如本文使用的术语“动物”指人和其它哺乳动物，以及其它动物。
[00031]如本文使用的术语“治疗”和患病体质、紊乱、疾病或病症的“治疗”指(1)预防或延迟在患者中发生的病况(state)、紊乱、疾病或病症的临床症状的出现，所述患者可罹患或易于感染病态、紊乱、疾病或病症，但尚未经历或显示病况、紊乱或病症的临床或亚临床症状，(2)抑制患病体质、紊乱、疾病或病症，即，使疾病或其至少一种临床或亚临床症状的发展暂停或减缓，或(3)缓解疾病，即，使病况、紊乱、疾病或至少一种临床或亚临床症状恢复。对于将要被治疗的患者的益处是或者在统计上有显著意义或至少对于患者和/或对于医师而言是显而易见的。
[00032]如本文使用的和以下进一步详细定义的术语“有效量”和“治疗有效量”，指当给予患者以治疗病况、紊乱、疾病或病症时对于这样的治疗是足够有效的化合物的量。有效量或治疗有效量将依化合物、疾病及其严重程度以及被治疗个体的年龄、体重、身体状况和反应性的不同而异。
[00033]如本文使用的和以下进一步详细定义的术语“传递”和“给予”，指向患者体内的一个或多个特定区域提供治疗有效量的活性药物而在所述区域产生有效治疗浓度的活性成分。如将在以下详细讨论的那样，此可例如通过局部或全身给予活性成分至患者而实现。
[00034]如本文使用的术语“组合物”指包含一种或多种特定药物的产物，以及由特定成分直接或间接组合而产生的任何产物。以下更详细描述的“药用组合物”意欲包含一种或多种活性药物与一种或多种药学上可接受的、惰性的或活性的、使得组合物适于诊断或治疗在体内、体外或离体应用的载体的组合。组合物也可包含稳定剂、防腐剂、辅助剂、填充剂、矫味剂和其它赋形剂。
[00035]如本文使用的，在提及的喜树碱时，术语“碳-5位”指存在于如上式II表示的5(S)-(2-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的化学结构第5位的碳原子，而术语“碳-20位”指存在于如式II表示的5(S)-(2-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的化学结构第20位的碳原子。
[00036]如本文使用的，贯穿本说明书，“5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱”指“5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱”，其在化学上已知为“4(S)-乙基-4-羟基-12(S)-(2-羟基乙氧基)-1，12-二氢-4H-2-氧杂-6，12a-二氮杂-二苯并[b，h]芴-3，13-二酮”。
[00037]如贯穿本说明书全文使用的，“5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱”指“5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱”，其在化学上已知为“4(S)-乙基-4-羟基-12(R)-(2-羟基乙氧基)-1，12-二氢-4H-2-氧杂-6，12a-二氮杂-二苯并[b，h]芴-3，13-二酮”。
如贯穿本说明书全文使用的，“5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱”指“5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱″或″5-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱”，其在化学上已知为4“(S)-乙基-4-羟基-12(RS)-(2-羟基乙氧基)-1，12-二氢-4H-2-氧杂-6，12a-二氮杂-二苯并[b，h]芴-3，13-二酮”。
[00038]如本文使用的，当提及检测的量时，术语“大约”指如应该由实施检测并使关心的水平与检测对象和检测设备的精密度相称的技术人员期望的检测量中的正常偏差。
[00039]术语“基本上无”在下文定义。
[00040]439专利的实施例26描述了为R-和S-非对映异构体，即分别为5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱和5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的混合物的5-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的制备。现在已经发现，与5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱和5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱比较，5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱具有某些出乎意料的改良特性。如上简短讨论的，发明人已经发现，在某些重要的特征上，包括例如，毒性、体内抗-肿瘤活性、生物利用度和拓扑异构酶I抑制作用方面，5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱不同于非对映异构体混合物5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱。此外，现在也已经发现，实质上没有5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱是合意的抗-癌药用化合物。
[00041]本发明的一个方面是基本上无5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱。
[00042]当描述5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱是基本上无5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱时，意味着存在于包含5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱和5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱两者的化合物中的5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的量，小于存在的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱和5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱总重量的2％重量。5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的量可小于约1.5％w/w，或其可小于约1％，和其可小于约0.5％，或甚至小于0.1％w/w。
[00043]在该方面的变量中，本化合物基本上是光学纯的。在该方面的实施方案中，该化合物总的化学纯度超过98％。
[00044]在本发明的另一个实施方案中，在此提供含有小于约1.5％的式V所示的喜树碱杂二聚物的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱，或其可含有小于约1％的式V杂二聚物，或小于约0.8％的杂二聚物，或甚至小于约0.5％的杂二聚物，和甚至小于约0.1％的杂二聚物，所有这些均基于w/w计算。
Figure A200780027172D00131
[00045]在另一个方面，在此提供制备基本上无5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的方法。该方法包括以下步骤：
a)提供5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱于有机溶剂(可使用正-丁醇或四氢呋喃)中的溶液和/或悬浮液，其中所述5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱具有比所述5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱更低的溶解性；
b)加热该溶液和/或悬浮液；
c)使该溶液和/或悬浮液冷却，以便形成沉淀；和
d)分离沉淀，得到所述基本上无5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱。
[00046]该方法可包括加热步骤，其包括使溶液和/或悬浮液回流。该方法还可包括用有机溶剂的额外部分使分离的沉淀回流。
[00047]特别地，制备5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的方法可包括以下步骤：
a)使5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱与选自正-丁醇或四氢呋喃的溶剂混合；
b)使该混合物回流约1至约4小时；
c)使该混合物冷却至约40℃至约50℃的温度；
d)从该混合物中分离固体5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱。
[00048]如果需要更纯的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱产物，该方法还可包括以下步骤：
e)用选自正-丁醇或四氢呋喃的溶剂洗涤固体5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱；和
d)使固体5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱干燥，得到基本上无5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱。
[00049]在另一个方面，本发明包括抑制细胞中拓扑异构酶I活性的方法，该方法包括给予细胞一定量的基本上无5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱，其中所述量足以抑制拓扑异构酶I(“抑制拓扑异构酶I的有效量”)。靶细胞可为癌性的并且该给药可在体外或体内实施。
[00050]本发明人已经发现，在某些重要的特征上，包括例如，毒性、体内抗-肿瘤活性、生物利用度和拓扑异构酶I抑制作用，5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱不同于非对映异构体混合物5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱。此外，现在也已经发现，基本上无5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱是合意的抗-癌药用化合物。
[00051]在本发明中，依据本领域普通专业人士熟悉的用于治疗癌症目的的标准递药途径，给予患者5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱。
[00052]5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱可作为纯化合物或以药用活性盐的形式提供。从以下的酸制备作为例证的药学上可接受的盐：甲酸、乙酸、丙酸、丁二酸、乙醇酸、葡萄糖酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、葡萄糖醛酸、顺丁烯二酸、反丁烯二酸、丙酮酸、天门冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸、氨基苯甲酸、甲磺酸、硬脂酸、水杨酸、对-羟基苯甲酸、苯乙酸、扁桃酸、双羟萘酸(扑酸)、甲烷磺酸、乙烷磺酸、苯磺酸、泛酸、甲苯磺酸、2-羟基乙烷磺酸、对氨基苯磺酸、环己氨基磺酸、褐藻酸、b-羟基丁酸、粘酸和半乳糖醛酸。
[00053]本发明化合物的适宜的药学上可接受的碱加成盐，包括金属离子盐和有机离子盐。更优选的金属离子盐包括，但不限于适当的碱金属(Ia族)盐、碱土金属(IIa族)盐和其它生理学上可接受的金属离子盐。这样的盐可由铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌离子制备。优选的有机盐可由叔胺和季铵盐，部分包括三甲基胺、二乙基胺、N，N′-联苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、甲葡胺(N-甲基葡糖胺)和普鲁卡因制备。所有上述盐可由本领域技术人员通过常规方法从相应的本发明化合物制备。
[00054]可提供本发明的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱在药学上可接受的载体和赋形剂(其中所有“载体”和“赋形剂”可用任一术语描述)中，以形成药用组合物。药学上可接受的载体和赋形剂包括，但不限于生理盐水、林格氏(Ringer′s)溶液、磷酸盐溶液或缓冲液、缓冲盐水和本领域已知的其它载体。药用组合物也可包括稳定剂、抗-氧化剂、着色剂和稀释剂。选择药学上可接受的载体和添加剂，以使药用化合物的副作用减至最少，并且使该化合物的特性不被取消或不受抑制，以致达到治疗无效的程度。
[00055]在本发明的一个实施方案中，包含5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的药用组合物任选基本上不含5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱。
[00056]该药用组合物典型地含约0.1至50％w/w，优选的1至20％w/w的活性5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱化合物，组合物的其余物质为药学上可接受的一种或多种载体、稀释剂或溶剂。药用组合物优选为含适当的量，如有效实现所需目的的量的活性化合物的单位剂量形式。
[00057]可经肠道和/或胃肠外给予本药用组合物。口服(胃内)是优选的给药途径。药学上可接受的载体可存在于适于本发明的方法的固体剂型中，其包括片剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂，可用包衣和外壳，诸如肠溶包衣和本领域熟悉的其它材料制备。适于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、溶液剂、悬浮剂、糖浆剂和酏剂。
[00058]胃肠外给药包括皮下、肌肉、皮内、乳房内、静脉和本领域已知的其它给药方法。肠内给药包括溶液剂、片剂、缓释胶囊剂、肠溶包衣胶囊剂和糖浆剂。当给药时，该药用组合物可为或接近体温。
[00059]可依据本领域制备药用组合物的任何已知的方法，制备意欲适于口服使用的组合物，并且这样的组合物可包含选自甜味剂、矫味剂、着色剂和防腐剂的一种或多种物质，以提供药学上美观的和可口的制剂。片剂包含与适宜于制备片剂的非毒性药学上可接受的赋形剂相混合的活性成分。这些赋形剂可为，例如，惰性稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠，粒化剂和崩解剂，例如，玉米淀粉或褐藻酸，粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯树胶，和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。片剂可不包衣，或可采用已知技术对片剂包衣，以延缓其在胃肠道崩解和吸收，从而提供具比较长时期的缓释作用。例如，可使用延时物质，诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
[00060]适于口服使用的制剂也可呈现为硬明胶胶囊剂，其中的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱与惰性固体稀释剂，例如，碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或作为软明胶胶囊剂，其中的活性成分可原样存在，或与水或油性介质，例如，花生油、液体石蜡或橄榄油混合。
[00061]可生产包含与适宜于制备水性悬浮剂的赋形剂相混合的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的水性悬浮剂。这样的赋形剂为助悬剂，例如，羟基甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟基丙基甲基-纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶；分散剂或湿润剂可为天然存在的磷脂，例如卵磷脂，或环氧乙烷和脂肪酸的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)，或环氧乙烷和长链脂族醇的缩合产物例如十七碳亚乙基氧基鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或环氧乙烷和由脂肪酸和己糖醇衍生的偏酯的缩合产物例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯，或环氧乙烷和由脂肪酸和己糖醇衍生的偏酯的缩合产物例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯。
[00062]水性悬浮剂也可包含一种或多种防腐剂，例如，对-羟基苯甲酸乙酯或正-丙酯、一种或多种着色剂、一种或多种矫味剂或一种或多种甜味剂，诸如蔗糖或糖精。
[00063]可通过将5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱悬浮于Ω-3脂肪酸、植物油，例如，落花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油或于矿物油诸如液体石蜡中，配制油性悬浮剂。油性悬浮剂可包含增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或十六醇。
[00064]适宜于通过加水制备水性悬浮剂的可分散的粉末和颗粒，提供与分散剂或湿润剂、助悬剂和一种或多种防腐剂混合的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱。适宜的分散剂或湿润剂和助悬剂以以上已经提及的那些物质作为例证。也可存在其它的赋形剂，例如甜味剂、矫味剂和着色剂。
[00065]也可经胃肠外，或者皮下，或者静脉内，或肌肉，或胸骨内，或经输注技术，以灭菌可注射的水性或油性悬浮剂的形式，给予5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱和包含它们的组合物。可依据已知技艺，使用那些适宜的以上已经提及的分散剂或湿润剂和助悬剂或其它可接受的物质，配制这样的悬浮剂。灭菌可注射制剂也可为在非毒性胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的灭菌可注射的溶液剂或悬浮剂，例如，如在1，3-丁二醇中的溶液剂。可应用的可接受的溶媒和溶剂是水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，灭菌的、不挥发的油被常规用作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可使用任何刺激性少的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，可发现正-3多不饱和脂肪酸用于可注射的制剂中。
[00066]也可以气雾剂或适于喷雾器的溶液剂的形式通过吸入给药，或以由药物与适宜的非刺激性赋形剂混合而制备的栓剂的形式给药，所述赋形剂在常温下是固体，但在直肠温度下是液体的并且将因此在直肠中融化而释放药物。这样的物质为可可脂和聚乙二醇。
[00067]本发明也包括面平或“舌下”给药，其包括含有本文中所列的化合物的菱形锭剂或可咀嚼的树脂。可将化合物沉积在经矫味的基质，通常为蔗糖、阿拉伯树胶或黄蓍胶中，和包含在惰性基质，诸如明胶和丙三醇或蔗糖和阿拉伯树胶中的化合物的锭剂。
[00068]本发明也包括局部给药系统，包括油膏、粉剂、喷雾剂、乳膏剂、凝胶剂、洗眼剂、溶液剂或悬浮剂。
[00069]粉剂具有粘附潮湿的表面的优势，并且从而，可长时间地保持活性。因此，粉剂对于治疗在例如耳道中的癌症特别具有吸引力。为了许多同样的理由，乳膏也是有效的药学上可接受的载体。
[00070]本发明组合物可任选添加额外的物质，诸如，例如，粘度增加剂、防腐剂、表面活性剂和渗透促进剂。
[00071]这样的粘度形成剂，包括，例如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、羟基乙基纤维素、羧基甲基纤维素、羟基丙基纤维素或本领域技术人员已知的其它试剂。典型地，在以重量计0.01％-2％水平上使用这样的物质。
[00072]任选使用防腐剂以防止在应用中的微生物污染。适宜的防腐剂包括：聚季铵盐-1、苯扎氯铵、硫柳汞、三氯叔丁醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯乙醇、依地酸二钠、山梨酸或本领域技术人员已知的其它物质。优选聚季铵盐-1用作抗微生物防腐剂。典型地，在以重量计0.001％-1.0％水平上使用这样的防腐剂。
[00073]可通过组合物中的表面活性剂或其它适当的共-溶剂，增强本组合物的组分的溶解性。这样的共-溶剂包括聚山梨醇酯20、60和80、聚氧乙烯/聚氧丙烯表面活性剂(如，Pluronic(泊洛沙姆)F-68、F-84和P-103)、环糊精或本领域技术人员已知的其它物质。典型地，在以重量计0.01％-2％水平上使用这样的共-溶剂。
[00074]药学上可接受的赋形剂和载体包括所有前述的赋形剂和载体等。以上关于有效的制剂和给药方法的考虑事项为本领域所熟悉并在标准教科书中描述。见，如，Gennaro，A.R.，Remington：药学科学与实践(The Science and Practice of Pharmacy)，第20版，(Lippincott，Williams和Wilkins)，2000；Hoover，John E.，雷明顿制药科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，Mack出版公司，EastonPennsylvania，1975；Liberman，等，编著，药物剂型(Pharmaceutical剂量Forms)，Marcel Decker，New York，N.Y.，1980；和Kibbe，等，编著，药用赋形剂手册(Handbook of Pharmaceutical Excipients)(第3版)，American Pharmaceutical Association，Washington，1999。
[00075]为了本发明的目的，优选5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的量包含有效量的化合物。这样，本发明包括预防或治疗癌症、肿瘤和/或肿瘤相关疾病或紊乱(在此统称为“癌症”)的方法，其中这样的治疗优选给予需要这样的预防或治疗的患者，该方法包括给予患者有效量的如本文描述的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱。
[00076]为了确定5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的有效量或剂量，主治诊断医生要考虑许多因素，包括，但不限于，所使用的化合物的效价和作用持续时间、将要治疗的疾病的性质和严重程度，以及待治疗患者的性别、年龄、体重、一般健康状况和个体反应性，和其它相关情况。应该理解的是，需要用于治疗或预防癌症的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的量将在大范围内变化，并且将在每一具体的病例中对个体需求进行调整。
[00077]对于任何化合物，最初可在细胞培养或在动物模型中估计有效治疗剂量。有效治疗剂量指改善病症或其症状的活性化合物的量。可通过标准药学方法(如，ED50：在50％的群体中治疗有效的剂量；LD50：对于50％的群体致死的剂量)确定细胞培养或在动物模型中的治疗效果和毒性。然后可将从细胞培养和在动物模型中获得的数据用于配制适于在患者中使用的化合物的一系列剂量。
[00078]一般而言，对于成人给药，本文描述了适当的每日剂量，但如果有利时，确定为优选的界限可被超越。可给予每日剂量作为单一剂量或以分开的剂量给予每日剂量。本领域技术人员将认识到，也可根据Goodman & Goldman′s治疗学的药理学基出(Goodman &Goldman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics)，第九版(1996)，附录II第1707-1711页的指导确定剂量。典型的推荐的每日剂量方案一般将从约0.01mg/kg/天至约50mg/kg/天，或从约0.05mg/kg/天至约25mg/kg/天，或从约0.1mg/kg/天至约10mg/kg/天，或从约0.1mg/kg/天至约5mg/kg/天，或甚至从约0.2mg/kg/天至约3mg/kg/天。
[00079]在一个实施方案中，可提供结晶5(S)-CPT作为适于口服给药的硬明胶胶囊剂，每胶囊含约1mg至约1000mg的5(S)-CPT，或每胶囊含约2mg至约500mg，或约5mg至约250mg的5(S)-CPT。当给予5(S)-CPT的患者是成人时，5(S)-CPT的每日剂量可从约0.01mg/kg/天至约50mg/kg/天，或从约0.05mg/kg/天至约25mg/kg/天，或从约0.1mg/kg/天至约10mg/kg/天，或从约0.1mg/kg/天至约5mg/kg/天，或甚至从约0.2mg/kg/天至约3mg/kg/天。
[00080]如本文使用的，用于治疗目的的术语“患者”包括任何患者，优选为需要治疗癌症的患者。如本文使用的，术语“有需要的患者”指患有癌症或易于患癌症的任何患者。术语“有需要的患者”也指需要比较低剂量的常规癌症治疗剂的任何患者。此外，术语“有需要的患者”意指需要减轻常规治疗剂的副作用的任何患者。此外，术语“有需要的患者”意指需要改善对用于癌症疗法的任何常规治疗剂的耐受程度的任何患者。
[00081]所述患者典型地为动物，并且还更典型地为哺乳动物。如本文所用的术语“哺乳动物”，指类分为哺乳动物的任何动物，包括人、家养动物和圈养牲畜、动物园、运动用动物或宠物，诸如狗、马、猫、牛等。患者也可为具发展为癌症的风险或癌症复发的风险的病人。
[00082]本发明的方法和组合物可用于治疗或预防包括，但不限于以下的多种癌症：卵巢癌、骨肉瘤、白血病、淋巴瘤、小细胞肺癌、非-小细胞肺癌、中枢神经系统(CNS)癌症、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、表皮癌、肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、子宫癌、软组织肉瘤、胰腺癌和横纹肌肉瘤。
[00083]本发明化合物和制剂也可用于治疗结肠癌、卵巢癌和骨肉瘤。
[00084]本发明化合物和制剂也可用于治疗骨肉瘤、结肠直肠癌和胰腺癌。
[00085]以下实施例描述本发明优选的实施方案。在考虑了本文公开的本发明说明书或实施下，在本文的权利要求范围之内的其它的实施方案，对于本领域技术人员而言应该是显而易见的。意欲将说明书与实施例一起仅认为是例证性的，而本发明发范畴和精神由实施例后面的权利要求书指明。在实施例中，除非另有指明，所有百分数基于重量给出。
实施例1.
[00086]该实施例显示，与5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱非对映异构体混合物和5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱非对映异构体比较，5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱改善拓扑异构酶I抑制活性。
5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱、5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)- 喜树碱和5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的制备：
[00087]将如在美国专利号6,177,439实施例-26中描述制备的5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的非对映异构体混合物(75克)悬浮于正-丁醇(约600ml)和回流约2-3小时。用约1小时将反应物质的温度降至约40-50℃，并且过滤所得到的固体物，用正-丁醇(约15-20ml)洗涤和约50-55℃真空下干燥，得到基本上无5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的固体5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱。通过反复在正-丁醇中回流(一般2-4次)进一步富集该产物，得到基本上无5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱(得量25-35克)。
[00088]通过逐滴加入正-庚烷，随后使用10μNutche滤器过滤，从母液中分离5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱。
[00089]如在美国专利号6,177,439实施例26中所述，得到5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱(非对映异构体混合物)。
拓扑异构酶I试验：
[00090]拓扑异构酶I在DNA的特异性位点造成瞬时切口。检测这些DNA瞬时切口需要使用蛋白质变性剂捕获在切口的中间体复合物中DNA上的酶。得到的共价的DNA/topo I复合物包含可用琼脂糖凝胶电泳(用溴化乙锭)检测的切口的开环DNA。捕获切口的中间体的效率相当低，然而，抑制剂，诸如天然产物喜树碱，使该中间体稳定并且导致在切口的DNA产物中增加。此形成机制性药物筛选的基础，该筛选被设计用于检测通过稳定裂解的中间体复合物影响拓扑异构酶I的药物。
[00091]设计
Figure A200780027172D00231
 Topo I药物筛选试剂盒(Drug ScreeningKit)(Topogen，Inc.，Port Orange，FL)，以使研究者快速确定新的拓扑异构酶I的抑制剂。该试剂盒允许检测或者稳定切口的中间体或者不同地抑制拓扑异构酶I的催化活性的新的化合物。
所使用的分析KIT：
Figure A200780027172D00232
药物筛选试剂盒，
制造商：TOPOGEN，目录号：1018。
每一反应混合物包含：
a.10 x反应缓冲液：    2μl
b.TOPO I酶：          2μl
c.pHOTIDNA           1.2μl(0.5ug)
d.水：               14.8μl
e.于DMSO中的药物：   1μl
总：                 20μl
试验方案
[00092]将以上反应混合物于37℃下孵育30分钟。通过加入2μl的10％SDS终止反应，并且将该混合物进行快速旋转处理(于37℃冷却试管时应该加入SDS，重新密封切口DNA)。加入10x染料，每支试管约2.5μl，加入等体积的氯仿和异戊醇的混合物(24:1)，并且于13000rpm下离心10分钟。将样品荷载于1％琼脂糖凝胶上并且于80伏特下电泳1小时。在紫外瞬变显示台下观察凝胶并且计算谱带的密度计的估计值。
计算：
[00093]使用比重计测量超螺旋的和松散形式的DNA两者的DNA谱带的密度。记录经(用试验药物的单一浓度)处理的和未经药物处理的(即，对照组)谱带强度。计算包括治疗组和对照组的所有泳道的与超螺旋的DNA比较的松散形式的DNA的百分率。
拓扑异构酶活性的％抑制计算如下：
＝(100-(100 X(对照组中的1/％抑制)X治疗组中的％抑制))
[00094]表1显示这些试验的结果，并且显示与外消旋混合物5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱比较，各自基本上无对方的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱和5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的体外拓扑异构酶I活性。
表1：5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱、5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱和5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的拓扑异构酶I活性。
 
化合物                                     IC50(μM)
5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱     1.06     
5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱    22        
5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱   12.5     
[00095]结果显示，5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的抑制拓扑异构酶I的活性为5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的活性的大约21倍，为5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的活性的大约12倍。基于非对映异构体之间的结构上的差异，并未期望这样的在活性上的差异。因为这是已知的，特别是考虑到E-环在酶活性中的重要性时更是如此。
实施例2.
[00096]本实施例显示，与5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的活性对比的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱对抗裸小鼠中NCI-H460(人小细胞肺癌)异种移植物的抗-肿瘤活性。
[00097]如在实施例1中描述，提供5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱和5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的样品。
5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱和5(S)-(2′-羟基乙氧 基)-20(S)-喜树碱对抗裸小鼠中NCI-H460异种移植物的比较研究试验 方案：
为了实施NCI-H460异种移植物研究，将经测量为～60mm3的NCI-H460肿瘤块植入雌性无胸腺裸小鼠的背腹侧间隙以启动肿瘤生长。当肿瘤生长至～150-1000mm3时，在开始治疗前将动物随机分成5组。配制每克的5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱，以含102.65mg活性化合物、801.62mg羟基丙基β环糊精、80.62mg无水葡萄糖和13.33mg碳酸钠。配制每克的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱含105.57mg活性化合物、800.99mg羟基丙基β环糊精、80.13mg无水葡萄糖和13.34mg碳酸钠。配制每克的安慰剂以含895.2mg羟基丙基β环糊精、89.52mg无水葡萄糖和14.9mg碳酸钠。将每种配制剂溶解于2ml灭菌水中并通过口服途径以(d x 5)2的方案给予。每周两次用游标测径器测量肿瘤直径。
[00098]假设肿瘤为椭圆体，用下式计算肿瘤体积：
V＝(Dxd2)/2
其中V(mm3)是肿瘤体积，D是以mm表示的最长直径和d是以mm表示的最短直径。通过由指定观察那天的平均肿瘤体积减去治疗的第一天(开始那天)的平均肿瘤体积，计算每一治疗组(T)和对照组(C)的肿瘤体积变化(Δ)。这些值用于使用以下式计算百分生长率(％T/C)：
％T/C＝(ΔT/ΔC)x 100，此处ΔT>0，或
％T/C＝(ΔT/ΔTi)x 100，此处ΔT<0和
Ti是平均肿瘤体积。
[00100]然后用下式计算百分肿瘤生长抑制(％TGI)：
％TGI＝100-％TC。
[00101]采用(d x 5)2的试验方案，通过灌胃法，用试验化合物治疗所有经历皮下接种经测量为约150-800mm3的肿瘤的小鼠。每周两次用游标测径器测量肿瘤直径，并且假设肿瘤为椭圆体，用式V＝(D x d2)/2计算肿瘤体积，其中V(mm3)是肿瘤体积，D是以mm表示的最长直径和d是以mm表示的最短直径。通过由指定观察那天的平均肿瘤体积减去治疗的第一天(开始那天)的平均肿瘤体积，计算每一治疗组(T)和对照组(C)的肿瘤体积变化(Δ体积)。这些值用于使用以下式计算百分生长(％T/C)：
％T/C＝(ΔT/ΔC)x 100，其中ΔT>0，或＝(ΔT/ΔTi)x 100，其中ΔT<0，此处Ti是治疗开始时的平均肿瘤体积。
[00102]用下式计算百分肿瘤生长抑制：百分肿瘤生长抑制＝100-％T/C。
[00103]如果肿瘤体积缩减至治疗开始时的肿瘤体积的50％或更小，而不降低至63mm3，定义为肿瘤退缩。如果肿瘤体积降低至低于可测量限度(<63mm3)，定义为肿瘤完全退缩。
[00104]用下式计算与开始那天的每头动物体重比较的百分体重变化：
百分体重变化＝[(指定观察那天的体重-开始那天的体重)/开始那天的体重]X100。
要观察的其它参数是死亡率。
[00105]试验的结果示于表2中，其中肿瘤生长抑制和死亡率表示的是两个试验化合物和对照组各自的数据。
表2：5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱和5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱对具有NCI-H460(人小细胞肺癌)异种移植物的裸小鼠的肿瘤生长抑制和死亡率的影响。
[00106]来自该试验数据显示，5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱证明具有比非对映异构体5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱更好的抗裸小鼠中NCI-H460(人小细胞肺癌)异种移植物的体内活性。如在表2中所示，在相同剂量下，与给予5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱比较，给予5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱导致抑制肿瘤生长的意外的增强(于2mg/kg下为60％对68％，和于4mg/kg下64％对76％)而不增加死亡率。
实施例3.
[00107]本实施例阐明5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱相对于5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱在硫代罗丹明B(SRB)分析法中抑制体外细胞增殖的功效。
[00108]如在实施例1中描述的提供5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱和5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱样品。
体外细胞生长分析的试验方案：
[00109]通过硫代罗丹明B(SRB)分析法评价细胞增殖，其中经过染色后结合至细胞上的染料的量作为细胞生长的检测指标。参考：JNCI，vol 83，No.11，June 5，1991，该文献通过引用结合于本文。
简言之，以每孔10,000个细胞的浓度将细胞(由膀胱癌、乳腺癌、CNS癌、结肠癌、表皮癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、肾癌和子宫癌代表的34个人癌症细胞系)接种于96-孔细胞培养板上并于37℃下CO2孵育器中孵育。24小时后，用溶解于DMSO中在培养基中的终浓度为0.05％的不同浓度的穿心莲内酯处理细胞并且暴露48h。通过加入冰冷的50％三氯乙酸(TCA)固定细胞并于4℃下孵育1h。用蒸馏水洗涤板，将板风干并于室温下用SRB溶液(0.4％wt/vol在1％乙酸中)染色10min。通过用1％乙酸充分洗涤去除未结合的SRB和将板风干。用10mM Tris缓冲液溶解结合的SRB染色斑，并于515nm的单波长下在分光光度读板器上读取光密度。加药时，于0小时(此时加入药物)如以上所述也终止用于细胞生长的单独的参比板。使用下式从光密度计算百分生长率：
如果T大于或等于T0，则百分生长率＝100 x[(T-T0)/(C-T0)]和如果T小于T0，则百分生长率＝100 x[(T-T0)/T0)]，
[00110]此处T是试验的光密度，C是对照的光密度和T0是的0时的光密度。
[00111]从百分生长率产生剂量反应曲线和GI50值内插自生长曲线。
表3显示结果。
表3：5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱相对5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的GI50值。
 
化合物                                   GI50(μM)  
5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱   5.0      
5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱 14.6     
[00112]该试验的结果显示，5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱非对映异构体在本试验中的抗细胞增殖活性几乎是5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱非对映异构体的三倍。
实施例4.
[00113]本实施例阐明5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱在多种骨肉瘤肿瘤模型中的功效。
[00114]如在实施例1中所述，提供5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱和5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱样品。
[00115]采用在Cancer，Res.，0ct.15，64：20：7491-9(2004)和在Calin.Cancer，Res.，Nov.15：9(15)：5442-53(2003)中描述的方法实施本试验。
[00116]采用[(d x 5)2]3的试验方案，通过灌胃法，用试验化合物治疗所有经历皮下(″sc″)接种肿瘤(经测量直径约0.2-1cm)的小鼠。每7天用游标测径器测量肿瘤直径，并且假设肿瘤为椭圆体，用式[π/6)xd3]计算肿瘤体积，此处d是平均直径。肿瘤对试验化合物的反应定义如下：对于各肿瘤，部分退缩(″PR″)被定义为体积缩减>50％，但是在所有时间肿瘤是可测量的。完全退缩(″CR″)定义为在治疗开始后的12周中的某点，可测量肿瘤块的消失。维持的CR被定义为在12-周研究的时间窗中肿瘤不再生长。选择该时间点，因为所有研究持续至少12周。12周研究时间终点前以及产生反应前死亡的小鼠，被认为对肿瘤反应失效。该结果(剂量为28mg/kg)呈现于表4中。
表4：5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱相对5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱在小鼠肿瘤退缩模型中的功效。
 
异种移植物 5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱         5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱        
骨肉瘤-29     6+                       5+                      
骨肉瘤-17   6+                       4+                      
骨肉瘤-2     6+                       5+                      
骨肉瘤-32     6+                       3+                      
6+：维持完全退缩
5+：完全退缩
4+：部分退缩
3+：稳定的疾病
[00117]如由表4中的数据所表示的，如由5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱在所有四个异种移植物系中实现的完全退缩(6+)所指出的那样，与给予5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱比较，给予5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱导致出乎意料的改善的结果。
[00118]在实施例3和4中所提供的数据阐明，在几个试验模型中，5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱具有出乎意料的的改善的活性/效价特性。此外，  5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱比5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱明显更加有效，同时效价的增加不伴随相应的毒性的增加。
实施例5.
[00119]本实施例显示5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱相对5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的人骨髓毒性。
[00120]如在实施例1中描述的提供5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱和5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱样品。
人骨髓分析的试验方案：
[00121]将包含在Iscove′s MDM中的甲基纤维素、胎牛血清、牛血清白蛋白、2-巯基乙醇、L-谷氨酰胺、rh干细胞因子、rhGM-CSF和rhIL-3的MethocultTM GF(目录号：H4534，Poietics，Biowhittakar，USA)培养基用于本试验。将人骨髓单核细胞(目录号2M-125C，Poietics，Biowhittakar，USA)与Methocult GF混合，并且调节细胞密度至3 x 105个细胞/ml。从该制备中，制备500μL等份试样和将2.5μL的20 X药物溶液或溶媒加至每个等份中并且充分混合。将100μL的集落生成培养基(clonogenic medium)铺陈于每个孔中，并且于4℃将板凝胶化15分钟。于5％CO2的充分潮湿气氛下，于37℃孵育器中孵育板14天。于倒置显微镜下计数作为50个细胞或更多个细胞聚集的CFU-GM集落。用下式计算百分集落抑制：
100-[(药物处理的孔中的集落数/对照孔中的集落数)X 100]。
[00122]比较两个非对映异构体对抗癌症细胞系的体外效价与其在健康细胞中的体外毒性。表5提出人细胞中骨髓毒性比较研究的结果。
表5：5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱和5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的体外人骨髓细胞的GI90值。
 
化合物                                     GI90(μM)  
5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱     0.69       
5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱    0.89       
[00123]参考示于表3和5中的数据，可见5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的对抗34种人癌细胞系(包膀胱癌、乳腺癌、CNS癌、结肠癌、表皮癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、肾癌和子宫癌细胞)强度出乎意料地为5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的几乎3倍，而同时两种非对映异构体两者的毒性是可比较的。实际上，如果安全边际如用如示于表6的表示人细胞毒性的GI90对表示抗癌活性的GI50的比率估计，明显的是作为用于癌症治疗的药用化合物，5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱出乎意料优于5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱和5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱。这样，与R-非对映异构体和非对映异构体混合物比较，5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱化合物增强治疗癌症的功效。实际上，特别重要的是使给予患者的、存在于5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱中的5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的量最小。
表6：5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱和5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的表示人细胞毒性的GI90对表示抗癌活性的GI50的比率
 
化合物                                   安全边际(GI90/GI50)  
5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱   0.14                 
5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱 0.06                 
实施例6.
[00124]本实施例显示5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的存在对5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱在大鼠和小鼠中的生物利用度的影响。
[00125]如在实施例1中描述的提供5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱(″5(S)-CPT″)和5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的(″5(RS)-CPT″)样品。
在雄性Wistar大鼠中的生物利用度：
[00126]将5(S)-CPT(2.5mg/kg)和5(RS)-CPT(5mg/kg，该混合物包含2.5mg/kg的5(S)-CPT)给予雄性Wistar大鼠以评价口服药物代谢动力学。
[00127]将6-8周龄和体重在205和218g之间的雄性Wistar大鼠分成每组4只大鼠的各组中。口服药物代谢动力学试验在禁食过夜状况下实施，而静脉药物代谢动力学在喂食状况下实施。用灌胃法或侧尾静脉注射给予作为溶液的试验药物。于指定的时间点，从眼眶后静脉丛(retro-orbital plexus)收集约250毫升稀的血液样品至含25毫升EDTA的微离心管中。经于12,800rpm下离心血液2min分离血浆并冷冻直至分析。
[00128]如下进行存在试验药物的样品检验。用400μl冷甲醇使整份的100μl血浆(贮存于8℃)沉淀以评估总(内酯+羧酸酯)。在混合2min和于12,800rpm离心4min后，分离上清液至300μl自动进样器小瓶中，并将20μl的该混合物注射入分析柱中用于HPLC分析。从于空白大鼠血浆中加进已知浓度的试验药物所作的线形图计算试验药物的浓度。采用非间室分析法计算试验药物的药物代谢动力学参数。
[00129]研究结果呈现于表7中。
表7：雄性Wistar大鼠中口服5(S)-CPT的药物代谢动力学参数。
 
化合物 剂量 AUC(o-t)μM＊h     
5(S)-CPT                      5mg/kg                 5.76    
5(RS)-CPT 5mg/kg(2.5mg/kg5(S)-CPT+2.5mg/kg5(R)-CPT)    5.08
5(RS)-CPT中5(S)-CPT的贡献   2.5mg/kg             1.21    
Swiss白化(Albino)小鼠中的生物利用度：
[00130]给予Swiss白化(Albino)小鼠5(S)-CPT(2.5mg/kg)和5(RS)-CPT(5mg/kg，混合物中包含2.5mg/kg的5(S)-CPT)以评价口服药物代谢动力学。
[00131]将3-6周龄和体重在28-34g之间的Swiss白化(Albino)小鼠用于研究。每一研究12只大鼠。口服药物代谢动力学试验在禁食过夜状况下实施，而静脉药物代谢动力学在喂食状况下实施。用灌胃法或侧尾静脉注射给予作为溶液的试验药物。于指定的时间点，从眼眶后静脉丛收集约250毫升稀的血液样品至含25毫升EDTA的微离心管中。经于12,800rpm下离心血液2min分离血浆并冷冻直至分析。
[00132]如下进行存在试验药物的样品检验。用400μl冷甲醇使整份的100μl血浆(贮存于8℃)沉淀以评估总(内酯+羧酸酯)。在混合2min和于12,800rpm离心4min后，分离澄清的上清液至300μl自动进样器小瓶中，并将20μl的该混合物注射入分析柱中用于HPLC分析。从于空白大鼠血浆中加进已知浓度的试验药物所作的线形图计算试验药物的浓度。采用非间室分析法计算试验药物的药物代谢动力学参数。研究结果呈现于表8中。
表8：Swiss白化(Albino)小鼠中口服5(S)-CPT药物代谢动力学参数。
 
化合物 剂量 AUC  (o-t)μM＊h        
5(S)-CPT                      5mg/kg                5-18     
5(RS)-CPT 5mg/kg(2.5mg/kg5(S)-CPT+2.5mg/kg5(R)-CPT)     5.20
5(RS)-CPT中5(S)-CPT的贡献   2.5mg/kg             1.10     
[00133]参考表7和8，“5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的贡献”是可归结于RS非对映异构体混合物中的S-非对映异构体的曲线下面积(″AUC″)。如可见于表7和8中的，5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的存在出乎意料地降低合意的5(S)非对映异构体的生物利用度。此外，相信这样的合意的非对映异构体的生物利用度的出乎意料地降低也应该在病人中观察到。基于以上所述，本发明人已经认识到，使5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱中的R非对映异构体杂质的量最小是需要的。
实施例7.
[00134]本实施例阐明5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱相对5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱和5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱，对抗BCRP突变体和乳腺癌抵抗蛋白(BCRP)过表达Saos-2细胞的功效。
[00135]如在实施例1中描述的提供5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱、5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱和5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱样品。
乳腺癌抵抗蛋白(BCRP)分析的实验方案：
[00136]相对于外消旋物5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱对过表达功能性BCRP#4和非功能性BCRP mut#10的Saos-2细胞的作用，评价5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱和5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的抗癌症作用。从ATCC(美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，Cat#HTB-85，Manassas，VA)得到人骨肉瘤细胞系，Saos-2，并且将其保持在含10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素和2mM谷氨酰胺的DMEM中。或者用BCRP#4使Saos-2细胞转染至过表达功能性BCRP转运蛋白或者用BCRP#10使Saos-2细胞转染至过表达非功能性BCRP转运蛋白。以每孔0.1ml培养基中1000个细胞的密度将细胞铺陈于96-孔板上，并且使之附着过夜。次日早晨轻轻吸去培养基并且加入待测化合物的系列稀释液。在5％CO2孵育器中37℃下培养细胞。暴露试验药物6天后，无菌下向每孔中加入10μl的Alamar蓝，并且将板放回孵育器中6hr。在2300(Millipore，Bedford，MA)上，用激发波长530nm和发射波长590nm检测所产生的荧光染料的量。将所得到的相对荧光单位用于计算相对于未处理的对照值的每个浓度的百分生长率。从百分生长值推导出IC50(与对照组细胞生长比较，抑制50％的细胞生长所需的抑制浓度)值。得到的IC50值列于表9中。
表9：5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱、5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱和5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱抗BCRP突变体和乳腺癌抵抗蛋白(BCRP)过表达Saos-2细胞的IC50值。
Figure A200780027172D00351
[00137]如表9所示，在对BCRP突变体和BCRP过表达Saos-2细胞的细胞毒性活性方面，5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱优于5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱和5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱。这些结果指明，对BCRP mut#10和BCRP#4两者的细胞毒性的排列顺序是5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱>5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱>5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱。对BCRP突变体10(mut#10)和BCRP#4过表达Saos-2细胞的细胞毒性，5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱分别是5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的～6和>2.5倍。
[00138]本说明书中所引用的所有参考文献，包括，但不限于论文、出版物、专利、专利申请、展示、教科书、报告、手稿、小册子、书籍、互联网邮件、期刊论文、杂志等，在此通过全文引用结合于本说明书中。本文参考文献中的讨论仅意欲概述由其作者所提出的主张，而不允许任何参考文献构成在先技术。申请人保留挑战所引用的参考文献的准确性和相关性的权利。
[00139]鉴于以上所述，将可见实现本发明的多个优势和得到的其它优势结果。
[00140]由于在以上方法和组合物中本领域普通技术人员可在不背离本发明范畴下进行多种改变，意欲将纳入以上的描述和在附图中显示的所有事项解释为说明性的，而不具有限制性含义。此外，应该理解，不同的实施方案的诸方面可全部或部分地进行互换。

Claims (29)

1.5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱，其基本不含5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱。
2.依据权利要求1的5(S)-(2’-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱，其基本上是光学纯的。
3.依据权利要求1的5(S)-(2’-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱，其化学纯度超过98％。
4.依据权利要求1的5(S)-(2’-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱，其中5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱存在的量小于约1.5％w/w。
5.依据权利要求1的5(S)-(2’-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱，其中5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱存在的量小于约1％w/w。
6.依据权利要求1的5(S)-(2’-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱，其中5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱存在的量小于约0.5％w/w。
7.依据权利要求1的5(S)-(2’-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱，其中5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱存在的量小于约0.1％w/w。
8.依据权利要求1的5(S)-(2’-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱，其中具有式V的化学结构的喜树碱二聚物杂质以小于约1.5％w/w的量存在于5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱中。
9.依据权利要求1的5(S)-(2’-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱，其中具有式V的化学结构的喜树碱二聚物杂质以小于约1％w/w的量存在于5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱中。
10.依据权利要求1的5(S)-(2’-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱，其中具有式V的化学结构的喜树碱二聚物杂质以小于约0.1％w/w的量存在于5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱中。
11.一种抑制细胞内拓扑异构酶I活性的方法，该方法包括给予所述细胞有效抑制拓扑异构酶I的量的、基本上不含5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱。
12.依据权利要求11的方法，其中5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱被体外给予细胞。
13.依据权利要求11的方法，其中5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱被体内给予细胞。
14.一种药用组合物，其包含如在权利要求1中描述的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱和药学上可接受的载体。
15.依据权利要求14的药用组合物，其为适于成人的单剂量组合物的形式，其中包含从约5mg至约25mg的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱。
16.一种使用5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱生产药用组合物的方法，该方法包括使在权利要求1中描述的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱与药学上可接受的载体混合。
17.一种制备在权利要求1中描述的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的方法，该方法包括以下步骤：
a)使5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱与选自正-丁醇或四氢呋喃的溶剂混合；
b)使该混合物回流约1至约4小时；
c)使该混合物冷却至从约40℃至约50℃的温度；和
d)从该混合物中分离固体5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱。
18.依据权利要求17的方法，其还包括以下步骤：
e)用选自正-丁醇或四氢呋喃的溶剂洗涤固体5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱；和
d)使固体5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱干燥，得到基本上无5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱。
19.一种使用5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱在患者中治疗癌症的方法，该方法包括给予患者有效量的在权利要求1中描述的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱。
20.依据权利要求19的方法，其中所述患者是哺乳动物。
21.依据权利要求19的方法，其中所述患者是人。
22.依据权利要求19的方法，其中5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱经口服给予患者。
23.依据权利要求19的方法，其中所述癌症选自以下之一：卵巢癌、骨肉瘤、白血病、淋巴瘤、小细胞肺癌、非-小细胞肺癌、中枢神经系统(CNS)癌症、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、表皮癌、肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、子宫癌、软组织肉瘤、胰腺癌和横纹肌肉瘤。
24.依据权利要求23的方法，其中所述癌症选自结肠癌、卵巢癌和骨肉瘤中的一种。
25.依据权利要求23的方法，其中所述癌症选自骨肉瘤、结肠直肠癌和胰腺癌中的一种。
26.依据权利要求23的方法，其中所述癌症选自膀胱癌、乳腺癌、CNS癌、结肠癌、表皮癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、肾癌和子宫癌中的一种。
27.依据权利要求19的方法，其中5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱以从约0.1至约10mg/kg/天的量给予患者。
28.依据权利要求19的方法，其中5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱以从约0.1至约5mg/kg/天的量给予患者。
29.依据权利要求19的方法，其中所述患者是需要治疗癌症的患者。
CNA2007800271726A 2006-05-24 2007-05-24 5(s)-(2′-羟基乙氧基)-20(s)-喜树碱及其制备和治疗癌症的应用 Pending CN101505599A (zh)

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