CN101475575B - 河豚毒素的提取、及河豚毒素用于杜冷丁类药物依赖的制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及河豚毒素的提取，另外还涉及河豚毒素的制剂。河豚毒素的提取，第一步原液提取：取菊黄东方豚卵巢，HAC溶液浸泡取得原液；第二步树脂交换：树脂为D152阳性大孔丙烯酸弱酸性树脂，经常法处理转NH4型，双柱两次交换，A柱为玻璃柱内下层装树脂，上层装硅藻土；B柱为玻璃柱内下层装中性氧化铝，上层装树脂；双柱交换后再进行第三步洗脱：双柱洗脱后合并交换和洗脱收集的强毒馏分，结晶得河豚毒素粗品结晶。本发明河豚毒素提取方法提高了产品的收率和纯度。制剂贮藏期限更长，用于脱瘾治疗，具有起效快，控制症状彻底，过度平稳，易接收等特点。

Description

河豚毒素的提取、及河豚毒素用于杜冷丁类药物依赖的制剂

一、技术领域：

本发明涉及河豚毒素的制法，另外还涉及河豚毒素用于杜冷丁等麻醉药物的原料药制剂。

二、背景技术：

河豚毒素(Tetrodotoxin简称TTX)是从河豚鱼卵巢或肝脏中提取分离的一种非蛋白小分子化合物，其分子式：C₁₁H₁₇N₃O₈，分子量为319.27。河豚毒素是专一性很强的细胞膜钠离子通道阻滞剂，可阻断神经传导，从而起到镇痛、戒毒的作用。临床用于内科、外科、皮肤科等领域。

河豚毒素的提取分离，最早为日本田原氏于1909年从河豚鱼卵巢中提取得到河豚毒素粗品结晶，并确立了其化学结构。1972年日本学者岸义人小组化学合成了河豚毒素。我国1982年北京防化院和河北水产研究所，1984年大连海洋渔业公司、青岛、天津等地相继在河豚毒素提取分离方面获得成功，目前各种提取方法大都采用平田后腾法，即原液提取-树脂交换-活性炭吸附-粗品结晶-苦味酸盐精制。活性炭吸附流程所用活性炭为动物性活性炭，分散性吸附法。河豚毒素损耗量很大，而且用化学法，苦味酸盐精制，每100kg河豚卵巢河豚毒素收率最多1.0-1.2g。

河豚毒素的临床应用，早在30年代日本人能三共株式会社已经将河豚毒素纯度为0.2-1.0(g/ml)的粗制品(推算当时商品每支含量为35.7mg/ml)用于镇痛。镇痉、镇静的治疗。日本学者项乃羲将河豚毒素注射液(粗品)用于鸦片类吸毒者的脱瘾治疗。阿片类药依赖是人类在吸食注射毒品后，会产生一种欣欲、亢奋的感觉。当染上μ毒瘾后会不惜一切手段寻找毒品，以满足这种精神和生理上的需要。戒毒是一个非常痛苦的过程，许多吸毒者之所以最后放弃戒毒，是因为无法忍受停止毒品后出现的戒断反应。

目前市场上用于戒毒药品的主要有美沙酮、LAAM、石丙甲羟二羟、吗啡酮和钠洛酮，而目前临床使用的戒毒药美沙酮自身具有成瘾性，使戒毒者在戒除毒瘾后，又不觉的染上了另一种药瘾，河豚毒素注射液作为新研究的戒毒药，却不具有成瘾性，而且脱瘾时间快速，只需要4-7天实为可推广的脱瘾药物。

如国际专利WO95/29903提供“氨基氢化喹唑啉化合物及其衍生物戒除药物依赖的新用途”，将河豚毒素溶于pH4-5醋酸液，制成河豚毒素含量为5-300μg/ml的注射液。

中国专利CN96119454.5提供一种用于戒毒镇痛药剂及其制法，河豚毒素溶于PH4-5醋酸溶液中，制成含量为0.5-10.0μg/ml加入0.0125普鲁卡因复方注射针剂。

中国专利98102072.0将河豚毒素溶于1％醋酸液中制成河豚毒素含量为0.001-0.45μg/ml注射液针剂。

中国专利CN1459286A提供一种“用于戒毒、镇痛的河豚毒素呼吸道给药制剂”，将原料药制成气雾剂、喷雾剂。

中国专利CN1353990A提供“用于镇痛、麻醉或治疗药物依赖性的制剂”河豚毒素含量为5-100μg/ml的注射液针剂。

中国专利200410102449.2提供“河豚毒素衍生物的制备和戒毒、镇痛用途”将河豚毒素溶于酒石酸中，制成含量为1-10μg/ml的注射液。

上述发明对河豚毒素临床应用研究起到积极作用。70年代末期以来，吸扎毒的现行在我国又死灰复燃，阿片类物质依赖已成为严重社会问题，我们北方地区主要以杜冷丁依赖比较多，杜冷丁属于中枢性镇痛麻醉药物，较强的成瘾性，一旦成瘾有较强的心里渴求，获得欢快振奋感，称之心里依赖，逐渐发展躯体依赖。对于杜冷丁依赖患者的治疗往往以其他成瘾性小的A片类物质进行递减替代疗法。这种疗法以小毒替代大毒的现象。有很大的弊端，如美沙酮。他是中枢吗啡多体激动剂，也易产生依赖性，而且疗程时间较长。因而寻找一种起效快、控制症状彻底过度平稳，无毒副作用的药物势在必行。而河豚毒素注射液，有较强的镇痛作用，抑制或减轻戒断症状的出现。目前文献中报导河豚毒素注射液(水针剂)和河豚毒素注射(冻干剂)一般都是由原药和稳定剂组成，稳定剂有枸橼酸盐或右旋糖酐双糖类。但上述配方的制剂稳定性很差，较长时间存放后，易产生差向异构化，使河豚毒素随时间的增长而逐步降低其含量，影响药效的发挥，治疗效果差。

三、发明内容：

本发明的目的是克服上述不足问题，提供一种河豚毒素的提取，提取方法简单易操作，收率大大提高。另外提供一种河豚毒素用于杜冷丁类药物依赖的制剂，稳定性最佳，储存期限长，疗效好。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：河豚毒素的提取，包括原液提取、树脂交换和洗脱步骤，

第一步原液提取：取菊黄东方豚卵巢，切成1-2cm片状小块，用0.1％-0.5％HAC溶液浸泡、搅拌，48小时后用甩干机甩干得原液，加热至沸腾，立即停止加热，除去凝固蛋白，原液冷却后用50-80目筛初滤，再经白陶土——纸浆过滤，得浅黄色透明原液，卵渣继续分次浸泡24小时，重复上述步骤收集滤液，共取得原液20L，用氨水调制PH5-7，加1-5％正丁醇或1-2％甲醛防腐，常温放置备用；

第二步树脂交换：树脂为D152阳性大孔丙烯酸弱酸性树脂，经常法处理转NH4型，双柱两次交换，A柱为玻璃柱内下层装树脂，上层装硅藻土；B柱为玻璃柱内下层装中性氧化铝，上层装树脂；

A柱：原液上树脂柱进行交换，流速100-120ml/min，树脂交换后期用小鼠毒性跟踪，当小鼠显中毒反应时，表明树脂交换已达饱和程度，停止原液上柱，用去离子水冲洗至流出液无色，茚三酮试验阴性止，收集有毒馏分流出液；

B柱：将A柱所收集的有毒馏分，用氨水调PH值为7，开始上柱，流速30-50ml/min，当流出液PH7时，小鼠毒性跟踪显毒性反应时，停止上柱，用去离子水(200L)冲洗柱，收集强毒馏分；

第三步洗脱：

A柱：交换后的A柱用12％的HAC液洗脱，流速30-40ml/min，当流出液PH7，小鼠毒性跟踪显毒性反应时，分步收集有毒馏分，毒素高峰在PH6.5-4.5之间；

B柱：将A柱树脂洗脱所得的有毒馏分，用氨水调PH6-7，上柱，用10％HAC洗脱，流速50ml/min，流出液P H 7，小鼠跟踪显毒性反应时，分步收集强毒馏分，弱毒部分做下次浸泡用，合并交换和洗脱收集的强毒馏分，置于0-5℃冷藏存放备用。

所述河豚毒素的提取还包括结晶步骤，在洗脱后进行第四步结晶：将B柱树脂交换和洗脱的强毒馏分，分次真空减压浓缩，-10℃放置24小时后，取出融化解冻并加8％氨水调PH8-9，震动搅拌，析出白色沉淀物，滤取沉淀物，沉淀物用蒸馏水反复洗涤3-5次，用2％-5％HAC液溶解，滤除不溶物杂质，溶液中加8％NH₄水调PH8-9，0-5度冷藏放置24小时，取出再进行上述重结晶2-3次，得河豚毒素粗品结晶。

所述第四步结晶：粗品结晶经高效液相色谱分离纯化得纯品河豚毒素结晶，经高效相色谱分析，纯度为99％。

所述第二步树脂交换：B柱中性氧化铝经180度活化处理2小时，冷却后湿法上柱，氧化铝先上柱，然后树脂上柱，使氧化铝在柱的下层。

本发明制得的河豚毒素用于杜冷丁类药物依赖的制剂，1ml制剂中含有河豚毒素0.01-0.49μg/ml，含有河豚毒素20-40倍重量份的稳定剂硫酸软骨素。

所述1ml制剂由下述原料配制而成：

河豚毒素        0.48μg

0.5％枸橼酸     0.002ml

硫酸软骨素      9.6μg

注射用水        余量。

所述用于杜冷丁类药物依赖的制剂的制备方法：取河豚毒素溶于0.5％枸橼酸溶液中，硫酸软骨素溶于注射用水，两溶液混合后加入注射用水，调PH值4-6，充分搅拌均匀，经除菌过滤、超滤，在无菌条件下计量灌装入安瓶中，半开塞送冷冻干燥机-40度预冷，打开冷井制冷，温度降至-55度时启动真空泵，真空泵在5帕以下，维持24小时，然后升温在30度维持14小时压塞、扎盖。

本发明河豚毒素提取方法经过反复研究，克服了活性炭仍有部分不可逆的吸附作用的不足问题，不采用活性炭吸附的流程，直接用两次树脂交换，两次树脂交换的A柱内径大于B柱，高度小于B柱，A柱内装树脂，在树脂上层加硅藻土，在原液树脂交换中往往会在柱的上部有菌团的形成，使原液通过树脂柱流速减慢，甚至树脂柱有阻塞现象的发生，本发明A柱树脂上层加硅藻土后，可随时分步清除菌团，提高了流速。B柱内上层装树脂，树脂下层装中性氧化铝，中性氧化铝对生物碱的分离，具有较好的分离作用，提高了河豚毒素的分离效果，从而提高了产品的收率和纯度，减除了活性炭吸附工艺流程，提高了收率5-10％。

本发明河豚毒素用于杜冷丁类药物依赖的制剂，有效剂量选用合理，配料稳定剂硫酸软骨素，起到稳定作用更显著，与同类产品相比贮藏期限更长，保证产品疗效。本发明制剂用于脱瘾治疗，具有起效快，控制症状彻底，过度平稳，易接收等特点，是一种杜冷丁类药物依赖脱瘾治疗较理想的药物。

四、具体实施方式：

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但本发明不限于具体实施例。

实施例1

河豚毒素的提取，包括原液提取、树脂交换和洗脱步骤，

第一步原液提取：取菊黄东方豚卵巢100kg，切成1-2cm片状小块，用0.1％-0.5％HAC溶液100L浸泡、搅拌，48小时后用甩干机甩干得原液，直火加热至沸腾，立即停止加热，除去凝固蛋白，原液冷却后用50-80目尼龙网初滤，再经白陶土——纸浆过滤，得浅黄色透明原液，卵渣继续分次浸泡24小时，重复上述步骤收集滤液，共取得原液20L，用氨水调制PH5-7，加1-5％正丁醇或1-2％甲醛防腐，常温放置备用；

第二步树脂交换：树脂为D152阳性大孔丙烯酸弱酸性树脂，经常法处理转NH4型，双柱两次交换，树脂交换柱分为A、B两柱，A柱为玻璃制内径9cm、高100cm，柱内下层装入树脂5kg，，将0.3-0.5kg硅藻土装入树脂上层。B柱为玻璃制内径7cm、高120cm，柱内装树脂3.5kg，中性氧化铝750g，中性氧化铝经180度活化2小时湿法上柱，首先将750g中性氧化铝上柱，然后装入树脂3.5kg使氧化铝在B柱的下层，树脂在B柱的上层；

A柱：原液上树脂柱进行交换，流速100ml/min，树脂交换后期用小鼠毒性跟踪，当小鼠显中毒反应时，表明树脂交换已达饱和程度，停止原液上柱，用去离子水冲洗至流出液无色，茚三酮试验阴性止，收集有毒馏分流出液；

B柱：将A柱所收集的有毒馏分7.5L，用氨水调PH值为7，开始上柱，流速50ml/min，当流出液PH7时，小鼠毒性跟踪显毒性反应时，停止上柱，用去离子水(200L)冲洗柱，收集强毒馏分；

第三步洗脱：

A柱：用12％的HAC液洗脱，流速40ml/min，当流出液PH7，小鼠毒性跟踪显毒性反应时，分步收集有毒馏分100ml/份，毒素高峰在PH6.5-4.5之间，其收集有毒馏分7.5L；

B柱：将A柱树脂洗脱所得的有毒馏分，用氨水调PH6-7，上柱，用10％HAC洗脱，流速50ml/min，流出液P H 7，小鼠跟踪显毒性反应时，分步收集强毒馏分100ml/份，弱毒部分做下次浸泡用，共收集强毒馏分3.2L，置于冰箱0-5℃冷藏存放备用；

第四步结晶：将B柱树脂交换和洗脱的强毒馏分，分次真空减压浓缩至200ml，-10℃放置24小时后，取出融化解冻并加8％NH₄水调PH8-9，震动搅拌，析出白色沉淀物，滤取沉淀物，沉淀物用蒸馏水反复洗涤5次，用2％-5％HAC液溶解，滤除不溶物杂质，溶液中加8％NH₄水调PH8-9，0-5度冷藏放置24小时，取出后再进行上述重结晶3次，得河豚毒素粗品结晶3.82g，粗品结晶经高效液相色谱(HPLC)分离纯化得纯品河豚毒素结晶2.38g，经高效相色谱(HPLC)分析，纯度为99％。

实施例2

采用实施例1制得的河豚毒素用于杜冷丁类药物依赖的制剂，由下述原料按重量份比配制而成1000支注射制剂，每支1ml：

河豚毒素        480μg

0.5％枸橼酸     2ml

硫酸软骨素      960μg

注射用水        余量。

具体制备方法为：取河豚毒素溶于0.5％枸橼酸溶液中，硫酸软骨素溶于注射用水，两溶液混合后加入注射用水，调PH值4-6，充分搅拌均匀，经除菌过滤、超滤，在无菌条件下计量灌装入安瓶中，半开塞送冷冻干燥机-40度预冷，打开冷井制冷，温度将至-55度时启动真空泵，真空泵在真空度5帕以下，维持24小时，然后升温在30度维持14小时压塞、扎盖。

表1：不同河豚毒素注射液和河豚毒素冻干剂在常温下稳定性试验

时间	河豚毒素醋酸液(水针)河豚毒素含量％	河豚毒素枸椽酸液(水针)河豚毒素含量％	河豚毒素硫酸软骨素(冻干剂)河豚毒素含量％
				初始	100-110	100-110	100-110
0月	100	100	100
				1月	96.51	97.16	99.86
2月	90.22	92.15	99.83
				3月	86.3	88.2	99.81
4	84.5	84.12	99.82
				月
5月	80.12	82.30	99.80
				6月	77.40	80.14	99.80

河豚毒素注射液(水针剂)和河豚毒素冻干剂，在常温下进行稳定性试验，按时取样，HPLC检测河豚毒素含量。

稳定性试验表明：河豚毒素醋酸液和枸橼酸液注射液随着储藏时间增长，河豚毒素含量逐渐下降，河豚毒素加硫酸软骨素作为稳定剂，其含量随时间增长基本无大变化，因此硫酸软骨素作为稳定剂阻止了河豚毒素差向异构化，在常温条件下保持稳定。

一、河豚毒素(TTX)急性毒性实验：

选取18-22克小白鼠50只，随机分为5组，每组10只。将TTX分别配成浓度为2μg/ml、1μg/ml、0.78μg/ml、0.4μg/ml、0.2μg/ml的溶液。每只小白鼠肌肉注射TTX溶液0.4μg/10克，左右后腿各一半，饲养观察10天，记录动物死亡数。结果1μg/ml浓度下肌肉注射的小鼠全部死亡，而0.4μg/ml以下浓度肌肉注射小鼠全部未死亡，LD50浓度范围在1μg/ml到0.4μg/ml之间。

选取18-22克的小白鼠150只，随机分为5组，每组30只，雌雄各半。TTX溶液给药剂量分为20μg/ml、18μg/kg、16.2μg/kg、14.58μg/kg、12.56μg/kg，小白鼠肌肉注射后，饲养观察10天，记录动物死亡数，随时挑出死亡动物。统计结果如表2：

表2：TTX肌肉注射LD50实验结果：

给药剂量(μg/ml)	动物数(个)	死亡率(％)	概率单位
				20	30	100	15.435
18	30	100	15.435
				16.2	30	70	11.183
14.58	30	33.3	9.751
				12.56	30	6.67	6.962

求得LD50＝15.18+1.085μg/kg

二、河豚毒素注射液30天亚急性毒性试验方法和结果：

选取健康SD大白鼠120只，随机分成四组，每组30只，雌雄各半并分笼饲养，每天定时给水换饲料，搞好动物饲养卫生。连续30天肌肉注射TTX注射液，于四肢肌肉依次注射。TTX注射液高、中、低三个剂量组剂量分别为5.2μg/kg、3μg/kg、2.2μg/kg。对照组注射等量盐水0.2ml/100g，给药期间，每3天称动物体重一次，观察记录动物的活动状况及尿液粪便情况。给药30天后，取血30天后，取血液测试红细胞、白细胞及血红蛋白量并进行白细胞分类计数。测试血液谷丙转氨酶(SGPT)，谷草转氨酶(SGOT)活性及血液尿素氮(BUN)含量，来评价动物肝、肾功能的状况，对动物进行大体解剖，称取心、肝、脾、肺、肾等主要脏器重量，并对心、肝、肺、肾、脑、子宫、睾丸等几种主要脏器进行组织学切片，光学显微镜观察。评价器官有无病理变化。

1、给药过程中动物活动状况及体重变化：

TTX注射液高、中、低剂量组肌注30天，中、低剂量组动物活动正常，尿液和粪便与对照组比较无显著性差异。动物体重与对照组比较也无显著变化；TTX注射液高剂量组在肌注3天，有一只雌性鼠死亡，肌注第7天有一只雄性鼠死亡。观察死亡症状，是属于毒性致死，主要器官无明显变化。

2、对血液血象的影响

TTX注射液高、中、低三个剂量组连续给药30天后动物血液红细胞数、白细胞及血红蛋白含量与对照组比较无显著差异。

3、对白细胞分类的影响

TTX注射液三个剂量组分别连续给药30天，对各种类型白细胞无显著性影响。

4、对血液SGPT\SGOT\BUN等生化指标的影响

TTX注射液高、中、低三个剂量组连续给药30天，血液中SGPT、SGOT、活性和BUN含量与对照组比较，无显著性差异，实验结果表明，在现有剂量下，TTX注射液对肝、肾功能无显著性影响。

5、动物大体解剖及主要脏器的影响

TTX注射液高、中、低三个剂量组连续肌注30天后，经对动物大体解剖观察，动物主要脏器包括心、肝、肺、肾、脑、子宫、睾丸、胃肠，均未见异常症理现象。

实验证明，TTX注射液肌注30天，在一定剂量范围内不会产生慢性毒性反应。

三、TTX注射液成瘾性试验：

1、小鼠竖尾试验

体重14-16克小鼠40只，随机分成四组分别给SC吗啡15-20mg/kg，TTX0.1-2.6μg/kg。观察24小时内小鼠活动情况，吗啡组小鼠出现S形竖尾反应、兴奋、跑动，而TTX组小鼠无竖尾反应，外观和未注射前几乎无区别。8小时后重复以上试验，吗啡组小鼠竖尾现象更为明显。而TTX组仍无竖尾现象。证明TTX不属于吗啡类药物，无成瘾性。

另取小鼠40只，随即分组，分别SC吗啡和TTX，然后进行交叉试验。吗啡组从20mg/kg逐渐增至25天后的45mg/kg，TTX组从0.1μg/kg增至2.6μg/kg，吗啡组均有竖尾现象，而TTX组则无。25天后原吗啡组小鼠改用TTX2.6μg/kg，动物无竖尾，而将TTX组改用吗啡45mg/kg则小鼠出现竖尾现象。

2、小鼠跳跃反应试验

采用纯种小鼠30只，每组10只，A组SC吗啡2.5mg/kg，B组TTX0.5μg/kg和等体积生理盐水NS(C组)，第一天注射5次，(注射时间为9:00、10:00、11:00、13:00、15:00)第二天注射2次(注射时间为9:00、11:00)，剂量递增。在末次给药2小时iP烯丙吗啡50mg/kg，观察小鼠10分钟内小鼠跳跃反应，可见吗啡组在iP烯丙吗啡后出现跳跃反应。

采用纯种小鼠体重10-24克，分别分为A、B、C组，每组30只，A组每天皮下注射盐酸吗啡剂量为80mg/kg，连续注射20天，B组每天皮下注射TTX0.5μg/kg，连续注射20天，C组为生理盐水对照组，于最后一次给药后6小时，给各组小鼠注射烯丙吗啡50mg/kg，然后将小鼠入塑料筒(25*5cm)观察小鼠反应，并记录60分钟内小鼠的跳跃反应。吗啡组小鼠(A)在给药后显得很兴奋，跑动频繁，竖尾现象明显，注射烯丙吗啡后，小鼠出现明显跳跃反应。TTX组(B)小鼠给药后，外观同时对照，无竖尾反应，在注射烯丙吗啡后均不见跳跃反应。试验结果表明，TTX明显区别于盐酸吗啡组，说明TTX无药物依赖性。

3、猴成瘾试验

恒河猴8只体重2.58-4.85kg，取4只每日各注射TTX(皮下)两次，剂量由0.5μg/kg开始，在50天内逐渐增至最大耐受量7.5μg/kg，然后按此剂量分别维持到52天、68天、和第94天，4只猴的累计注射剂量分别为1.8、4.2、6.1、7.3μg/kg。第64天和93天，分别停止给猴注射TTX，观察24小时，结果猴的外观行为、食欲与停药前无异常，在给药第28天、54天、58天和69天分别停药，20小时后皮下注射烯丙吗啡5-10mg/kg，均未见猴外观出现戒断症状。另4只猴分别皮下注射吗啡两次，始量为6mg/kg，于第2天递增至28mg/kg，然后按此剂量维持，30天后猴已对吗啡产生依赖，停止注射吗啡48小时后，猴子外观出现明显戒断综合症，表现有：在笼内烦躁不安，翻滚，时而趴卧笼底，乱抓，嚎叫、呕吐，全身发抖等。此时给猴注射(皮下)烯丙吗啡，上述症状更为明显，此时给猴皮下注射TTX0.5-2.5μg/kg，上述症状明显减弱或消失。这表明TTX具有抵抗吗啡戒断综合症的药的作用。

四、河豚毒素治疗杜冷丁类药物依赖临床治疗观察：

1、对象和方法：

所有观察对象是自愿戒毒患者。30例均符合CCMD-2R，DSM-III，精神活性物质所致精神障碍-阿片依赖诊断标准。男性20人，女性10人，年龄20-30岁12人、31-40岁16人，40岁以上2人。使用方法：肌肉静注22人，杜冷丁和海洛因混合使用者8人。吸毒时间1年以下10人，1-2年6人，2年以上14人。瘾量1000mg以下8人，1000-3000mg以上19人，3000mg以上3人。详见表3。

河豚毒素注射液每支含量0.48μg/ml。用药方法：根据扎毒的时间长短及戒断症状反应的轻重，及瘾量的大小，采取不同的给药方法及药用量。一般采取每晚一次性给1ml河豚毒素制剂肌肉注射给药，河豚毒素注射液加50％葡萄糖20ml静脉注射，个别的戒断症状重的采取二次/日的给药方法，或辅助给小剂量的镇静药，如安定和抗焦虑剂多虑平等。

2、观察方法：

进行病史调查，体格检查。

治疗前后各查一次血尿便常规、肝功、心电图，尿液毒物检测，纳洛酮促瘾试验。

戒断症状观察量表，参考北京药物依赖研究中心所制定的阿片依赖戒断反应观察量表。

不良反应观察：除每日测量体温，呼吸、心率、血压外还要观察治疗药物不良反应。

纳洛酮促瘾试验治疗前和治疗后各做一次。

3、观察结果：

治疗时尿液毒物检测30例全部阳性，给河豚毒素注射液后均转为阴性。

治疗时纳洛酮促瘾试验30例均呈阳性，用河豚毒素注射液治疗七天后，经复查均呈阴性。

戒断症状变化情况：

(1)、精神状态及行为活动方面：焦虑不安，好争吵闹事，困倦失眠，消失时间：最短1天，最后6-7天，平均1-9天。

(2)躯体症状：头痛、肌肉痛、骨痛、消失时间：最短1天，最长3天，平均1-2天。

(3)植物神经系统症状：哈欠、出汗、汗毛竖立。

交感神经系统症状，流涕、流泪，食欲不振、恶心呕吐、腹泻、胃肠痛(副交感神经系统)，消失时间最短1-2天，最长7-8天，平均4-8天。

观察表明：河豚毒素对缓解肌肉痛、骨痛、有明显的镇痛作用。辅助镇静药安定片和小剂量的抗焦虑药，能抑制和缩短焦虑、不安，失眠等症状的出现，对其他戒断症状：寒战，乏力、食欲不振、恶心、呕吐、也有改善的作用。(详见表4)

不良反应观察：出有个别病人在肌肉注河豚毒素注射液后感觉面部疼痛和恶心，改静脉注射后症状小时。再未见其他不良反应。

4、讨论：通过30例杜冷丁依赖患者应用河豚毒素制剂注射脱瘾治疗，收到很好效果。它具有脱瘾快、治疗时间短戒断瘾小时快，病人无痛苦、无明显副作用。

表3：观察对象特点与基本数据

性别	男22人	女8人
				用毒方法	肌注22人	肌注和静注10人
用毒种类	杜冷丁23人	杜冷丁和海洛因7人
				年龄	20-30岁12人	31岁-40岁16人	40岁以上2人
脱瘾年限	一年以下11人	1-2年9人	2年以上10
				日瘾量	1000mg以下9人	1000-3000mg19人	3000mg以上2人

表4：戒断症状变化情况

戒断症状	消失时间平均天数	消失时间最长天数	消失时间最短天数
				精神症状	4-9天	8天	2天
植物神经症状	1-8天	7天	1天
				躯体症状	3天	6天	1天

Claims (4)

1.河豚毒素的提取，包括原液提取、树脂交换和洗脱步骤，

第一步原液提取：取菊黄东方豚卵巢，切成1-2cm片状小块，用0.1％-0.5％乙酸溶液浸泡、搅拌，48小时后用甩干机甩干得原液，加热至沸腾，立即停止加热，除去凝固蛋白，原液冷却后用50-80目筛初滤，再经白陶土——纸浆过滤，得浅黄色透明原液，卵渣继续分次浸泡24小时，重复上述步骤收集滤液，共取得原液20L，用氨水调制pH5-7，加1-5％正丁醇或1-2％甲醛防腐，常温放置备用；

第二步树脂交换：树脂为D152阳性大孔丙烯酸弱酸性树脂，经常法处理转NH₄型，双柱两次交换，A柱为玻璃柱内下层装树脂，上层装硅藻土；B柱为玻璃柱内下层装中性氧化铝，上层装树脂；

A柱：原液上树脂柱进行交换，流速100-120ml/min，树脂交换后期用小鼠毒性跟踪，当小鼠显中毒反应时，表明树脂交换已达饱和程度，停止原液上柱，用去离子水冲洗至流出液无色，茚三酮试验阴性止，收集有毒馏分流出液；

B柱：将A柱所收集的有毒馏分，用氨水调pH值为7，开始上柱，流速30-50ml/min，当流出液pH7时，小鼠毒性跟踪显毒性反应时，停止上柱，用去离子水200L冲洗柱，收集强毒馏分；

第三步洗脱：

A柱：用12％的乙酸液洗脱，流速30-40ml/min，当流出液pH7，小鼠毒性跟踪显毒性反应时，分步收集有毒馏分，毒素高峰在pH6.5-4.5之间；

B柱：将A柱树脂洗脱所得的有毒馏分，用氨水调pH6-7，上柱，用10％乙酸洗脱，流速50ml/min，流出液pH 7，小鼠跟踪显毒性反应时，分步收集强毒馏分，弱毒部分做下次浸泡用，合并交换和洗脱收集的强毒馏分，置于0-5℃冷藏存放备用。

2.根据权利要求1所述的河豚毒素的提取，其特征是：还包括结晶步骤，在洗脱后进行第四步结晶：将B柱树脂交换和洗脱的强毒馏分，分次真空减压浓缩，-10℃放置24小时后，取出融化解冻并加8％氨水调pH8-9，震动搅拌，析出白色沉淀物，滤取沉淀物，沉淀物用蒸馏水反复洗涤3-5次，用2％-5％乙酸液溶解，滤除不溶物杂质，溶液中加8％NH₄水调pH8-9，0-5度冷藏放置24小时，取出再进行上述重结晶2-3次，得河豚毒素粗品结晶。

3.根据权利要求2所述的河豚毒素的提取，其特征是：第四步结晶：粗品结晶经高效液相色谱分离纯化得纯品河豚毒素结晶，经高效液相色谱分析，纯度为99％。

4.根据权利要求1-3任一所述的河豚毒素的提取，其特征是：第二步树脂交换：B柱中性氧化铝经180度活化处理2小时，冷却后湿法上柱，氧化铝先上柱，然后树脂上柱，使氧化铝在柱的下层，树脂在柱的上层。