CN101434962A - 日本血吸虫中国大陆株酪氨酸激酶tk4保守区基因及其克隆表达方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及日本血吸虫(中国大陆株)酪氨酸激酶TK4保守区(SjcTK4)基因的序列及其克隆表达方法和应用。本发明公开的SjcTK4基因具有序列1所示的核苷酸序列及编码相应的氨基酸序列。本发明还公开了SjcTK4基因在大肠杆菌中的表达方法。经制备纯化重组蛋白和DNA疫苗，免疫C₅₇BL/6小鼠，发现本发明SjcTK4基因可用于制备防治日本血吸虫病的重组蛋白疫苗和DNA疫苗。

Description

日本血吸虫中国大陆株酪氨酸激酶TK4保守区基因及其克隆表达方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及日本血吸虫(中国大陆株)酪氨酸激酶TK4保守区(SjcTK4)基因的序列及其克隆表达方法和应用。

背景技术

日本血吸虫病作为一种人兽共患寄生虫病，曾广泛流行于我国长江流域及其以南的12省、市、自治区，50年代初，全国约有1160万血吸虫病患者，中间宿主钉螺分布面积148亿m²。经过半个多世纪不懈努力，我国的血吸虫病防治工作取得了举世瞩目的成就，至1995年，已有广东、上海、福建、广西、浙江等5省(区、市)达到了血吸虫病传播阻断标准。然而，目前血吸虫病在我国仍是一个重要的公共卫生问题，突出表现在：血吸虫病感染人数增多，局部地区出现急性感染暴发疫情；部分地区疫情死灰复燃，疫区范围明显扩大并向城市蔓延；钉螺大面积扩散，人畜感染的危险增加。近几年报告病人数呈上升趋势，其中，急性感染人数明显增加，2002年比2001年增加59％，2003年又比2002年增加22％，并发生了30余起急性血吸虫病暴发疫情。2003年，全国还有110个县流行血吸虫病，病人84.3万，钉螺面积35亿m²以上；2004年仍有病人84.25万，钉螺面积38.46亿m²。实践证明，灭螺和吡喹酮大规模化疗并未根本解决血吸虫病防治问题。疫区人群再感染率高、惟一有效化疗药物吡喹酮长期使用可能产生血吸虫抗药株，并且家畜作为重要的动物传染源依然广泛分布于流行区，这些都是我国血吸虫病防治工作面临的主要问题。化疗手段(短效)与长效的措施(疫苗)相结合将是血吸虫病综合防治的重要措施，疫苗因其经济、长效的特点而倍受关注。目前，除了研究多价疫苗和新型疫苗外，寻找新的疫苗候选抗原分子也是日本血吸虫病疫苗研究的重点之一。

酪氨酸激酶(tyrosine kinase，TK)是催化ATP上γ-磷酸基团转移到蛋白酪氨酸残基上的一类激酶，作为细胞内关键的信号转导分子，其接受其它一些蛋白活化或转位后的调控，从而使底物酪氨酸残基磷酸化，启动一系列后续级联反应。在整个细胞信号传递过程中，酪氨酸激酶扮演着受体与最终效应分子之间桥梁的角色，并且通过这种方式参与诸如黏附、迁移、分裂、生长、分化和增殖等多种重要细胞活动的调控。到目前为止，尚未见涉及本说明书中日本血吸虫中国大陆株酪氨酸激酶TK4保守区(SjcTK4)基因及其应用研究的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于公开日本血吸虫中国大陆株酪氨酸激酶TK4保守区(SjcTK4)基因序列，以及SjcTK4基因的克隆和在大肠杆菌中表达及纯化的方法，并公开SjcTK4基因在制备防治日本血吸虫病疫苗中的应用。

本发明依据公布的曼氏血吸虫酪氨酸激酶TK4保守区基因序列设计引物，以日本血吸虫大陆株成虫总RNA为模板，反转录PCR(RT-PCR)扩增SjcTK4基因的完整编码框，并分别克隆到原核表达载体pET28a和真核表达载体pcDNA3.0中，分别构建了重组质粒pET28a-SjcTK4和pcDNA3.0-SjcTK4，并对克隆基因的核苷酸序列进行了测定。

本发明公开的SjcTK4基因具有序列1所示的核苷酸序列及序列2所示相应的编码氨基酸序列。SjcTK4基因开放阅读框编码194个氨基酸，根据测序结果推导的氨基酸序列与曼氏血吸虫酪氨酸激酶保守区序列有98％的同源性(见附图1)。

本发明公开的SjcTK4基因在大肠杆菌中的表达方法是将该基因克隆到原核表达质粒pET28a中，构建重组质粒pET28a-SjcTK4，转化BL21(DE3)表达菌后，用IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析显示，重组质粒获得高效表达，表达蛋白相对分子质量Mr 26 000，命名为reSjcTK4。

Western Blotting实验显示复性的重组蛋白可被reSjcTK4重组抗原免疫小鼠血清识别，而与正常小鼠血清和日本血吸虫感染小鼠血清无反应，说明reSjcTK4具有良好的抗原性。用Co柱亲和层析法纯化重组蛋白reSjcTK4，以纯化并复性的重组蛋白作为抗原，免疫C₅₇BL/6小鼠，免疫剂量为20μg/鼠，共免疫3次，间隔2周。末次免疫后2周用日本血吸虫尾蚴攻击感染，攻击感染后6周剖杀小鼠，计数成虫数和肝内虫卵数。结果表明，与感染对照组相比，reSjcTK4加ISA206佐剂免疫组小鼠攻击感染后的减虫率、肝组织减卵率和每对成虫肝组织减卵率分别为27.3％，33.6％和28.0％。

本发明研究发现，SjcTK4基因可用于制备防治日本血吸虫病疫苗。将SjcTK4基因克隆到真核表达质粒pcDNA3.0中，构建成DNA疫苗pcDNA3.0-SjcTK4。核酸疫苗注射C₅₇BL/6小鼠后，SjcTK4可以在小鼠肌肉注射局部的肌细胞内表达。在C₅₇BL/6小鼠免疫保护试验中，每只小鼠经股四头肌注射100μg核酸疫苗，共注射3次，间隔2周。于末次免疫后2周用日本血吸虫尾蚴攻击感染，攻击感染后6周剖杀小鼠，计数成虫数和肝内虫卵数。结果表明，与感染对照组相比，DNA疫苗免疫组的减虫率、肝组织减卵率和每对成虫肝组织减卵率分别为20.3％、37.4％和34.0％；DNA疫苗和蛋白疫苗联合免疫组的减虫率和肝组织减卵率分别为22.1％和33.5％。下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

附图说明

图1：RT-PCR扩增目的基因

M：100bp DNA marker；1：无反转录产物的阴性对照；2和3：RT-PCR产物

图2：pET28a-SjcTK4重组质粒双酶切鉴定

M1：100bp DNA marker；1-3：pET28a空质粒BamH I和Xho I双酶切；4-7：重组质粒pET28a-SjcTK 4 BamH I和Xho I双酶切；M2：1kb DNAmarker

图3：日本血吸虫大陆株酪氨酸激酶TK4保守区基因与曼氏血吸虫

TK4保守区蛋白氨基酸序列同源比对分析

图4：SDS-PAGE分析重组蛋白的诱导表达及纯化

M：蛋白质分子量标准；1：pET28a/BL21(DE3)诱导前；2：pET28a/BL21(DE3)诱导3h；3：pET28a-SjcTK4/BL21(DE3)诱导前；4-7：pET28a-SjcTK4/BL21(DE3)分别诱导1h，2h，4h，6h；8：纯化的reSjcTK4蛋白

图5：Western Blotting分析重组蛋白reSjcTK4

M：预染蛋白质分子量标准；1：抗His-G HRP抗体；2：正常小鼠血清；3：日本血吸虫感染小鼠血清；4：重组抗原reSjcTK4免疫小鼠血清

图6-1，6-2：重组蛋白reSjcTK4结构与功能的生物信息学分析

图7：ELISA检测重组蛋白(reSjcTK4)疫苗免疫小鼠血清特异性IgG抗体水平

图8：RT-PCR扩增目的基因及pcDNA3.0-SjcTK4重组质粒双酶切鉴定

M1：100bp DNA marker；1：pcDNA3.0空质粒双酶切；2-4：重组质粒pcDNA3.0-SjcTK 4 BamH I和Xho I双酶切；M2：1kb DNAmarker

图9：IFAT检测核酸疫苗在小鼠肌肉组织中的表达

a IFAT检测核酸疫苗在小鼠肌肉组织中的表达b IFAT检测空质粒在小鼠肌肉组织中的情况

图10：ELISA检测核酸疫苗免疫小鼠血清特异性IgG抗体

具体实施方式

实施例1  日本血吸虫酪氨酸激酶TK4保守区编码基因的克隆、表达和分析及重组蛋白小鼠免疫保护试验

1.材料

1.1 日本血吸虫大陆株尾蚴和成虫：含成熟尾蚴的阳性钉螺由中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所钉螺室提供，常规方法逸得尾蚴。日本血吸虫大陆株成虫(雌雄混合)取自日本血吸虫尾蚴感染6周的C₅₇BL/6雌性小鼠。

1.2 菌株及质粒：大肠杆菌BL21(DE3)购自北京博大泰克公司；载体pET28a购自Novagen公司。

1.3 实验动物：6周龄C₅₇BL/6雌性小鼠由中国科学院上海实验动物中心提供。

1.4 主要试剂：Trizol试剂为Gibco公司产品；PCR产物纯化试剂盒、酶切产物纯化试剂盒、Taq DNA聚合酶、dNTPs、AMV反转录酶、RNasin、T4 DNA连接酶、限制性内切酶(BamH I和Xho I)等为美国Promega公司产品；质粒DNA小量抽提试剂盒为北京博大泰克公司产品；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG购自Invitrogen公司；蛋白纯化试剂盒购于Clontech公司；Montanide ISA206佐剂由法国Seppic公司提供；其它试剂均为国产分析纯。

1.5 目的基因引物的设计

分析GenBank中公布的曼氏血吸虫酪氨酸激酶TK4基因，选择其保守序列区段，利用软件OligoPerfect^TM Designer设计一对引物，上游引物引入BamH I酶切位点和起始密码子，下游引物引入Xho I酶切位点和终止密码子。

上游引物PF：5′-gca ggatcc ATG TTA GGT GGA GGA AAT TTTGGT C-3′，下划线序列为BamH I酶切位点，ATG为起始密码子。

下游引物PR：5′-cag ctcgag CTA ACC ATA GGA GTA AAC TTCCCA TAA AGT-3′，下划线序列为Xho I酶切位点，CTA的反补序列TAG为终止密码子。

引物由上海生工生物工程公司合成。

2.方法

2.1 SjcTK4基因的扩增：

2.1.1 Trizol法提取日本血吸虫成虫总RNA，操作按试剂盒说明书进行。反转录生成cDNA第一链。反应体系为：

取DEPC处理EP管，依次加入下列试剂：

5×AMV反应缓冲液                                  4.0μl

总RNA                                             3.0μl

下游特异引物(PR)                                  1.0μl

RNase inhibitor                                   0.5μl

dNTPs(各10mmol/L)                                 4.0μl

AMV逆转录酶                                       3.0μl

RNase-free water                                  4.5μl

总量                                             20.0μl

混匀，瞬时离心，42℃水浴1h。

2.1.2 以反转录产物为模板，PCR扩增SjcTK4基因。反应体系为：

10×PCR Buffer                                    5.0μl

MgCl₂(25mmol/L)                                3.0μl

反转录产物                                        3.0μl

dNTPs(各10mmol/L)                                 0.5μl

上游引物PF(10μmol/L)                              0.5μl

下游引物PR(10μmol/L)                              0.5μl

Taq DNA聚合酶                                     0.5μl

灭菌去离子水                                     37.0μl

总量                                             50.0μl

PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃ 45s，60℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；72℃延伸8min。

2.2 重组表达载体pET28a-SjcTK4的构建：

上述PCR产物进行1％低熔点琼脂糖凝胶电泳，用PCR产物纯化试剂盒对目的片段进行割胶纯化。纯化PCR产物首先连入pGEM-TEasy载体，然后转化感受态大肠杆菌JM109并抽提质粒进行酶切和测序鉴定。空质粒pET28a用限制性内切酶BamH I和Xho I双酶切后的DNA片段进行1％低熔点琼脂糖凝胶电泳，用酶切产物纯化试剂盒进行割胶纯化。双酶切后的pET28a载体片段和目的基因产物酶切片段经T4DNA连接酶4℃连接过夜。连接产物转化BL21(DE3)感受态细菌，并抽提质粒。

2.3 重组质粒pET28a-SjcTK4的鉴定：

采用限制性内切酶BamH I和Xho I双酶切对重组质粒DNA进行酶切鉴定。对筛选获得的重组质粒进一步测定核苷酸序列进行鉴定，并确定外源目的基因片段是否正确插入pET28a载体中。

2.4 重组蛋白的诱导表达、纯化和复性：

重组质粒pET28a-SjcTK4转化BL21菌液划LB固体培养基板(含Kan 30μg/ml)培养过夜，挑取单个菌落接种于3ml LB液体培养基(含Kan 30μg/ml)培养过夜，以1:100稀释过夜培养菌于LB液体培养基(含Kan 30μg/ml)中，于37℃ 250rpm振荡培养约4h，加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mmol/L，诱导表达8h。离心收集菌体，溶菌酶法破裂菌体后，离心取沉淀并经盐酸胍溶解后，通过Co-NTA的亲和层析柱纯化目的蛋白并复性，纯化的蛋白以紫外吸收法定量。

2.5 免疫印迹试验(Western blotting)：

纯化的重组蛋白(reSjcTK4)经SDS-PAGE后，电转移至硝酸纤维素膜，转膜条件为30V恒压转移1.5h。将吸附蛋白的硝酸纤维素膜浸在含1％脱脂奶粉的0.01mol/L磷酸缓冲液(PBS)中4℃封闭过夜。将硝酸纤维素膜切成小条后分别浸入一抗反应液(重组抗原免疫小鼠血清工作浓度为1:250，日本血吸虫感染小鼠血清工作浓度为1:500，稀释液为PBS)中37℃轻微振摇反应1h；用PBS-T(0.1％Tween-20)室温轻微振摇洗涤3次，每次5min；浸入二抗反应液(HRP标记的羊抗鼠IgG1:1000稀释，稀释液为PBS)，37℃轻微振摇反应1h，PBS-T洗涤3次，每次5min；用PBS洗涤1次，二胺基联苯胺(DAB)和4-氯-1-萘酚联合显色，观察重组蛋白条带是否被识别。

2.6 reSjcTK4结构与功能的生物信息学分析：

利用瑞士生物信息学研究所(http://au.expasy.org/tools/)中的HNN软件在线分析α-螺旋(α-helix)、β-转角(β-turn)、无规卷曲(random coil)以及延伸链(extend strand)等；运用PROSITE软件进行蛋白特定位点的分析。

2.7 reSjcTK4免疫保护作用的观察：

6周龄雌性C₅₇BL/6小鼠随机分为5组：reSjcTK4加弗氏佐剂免疫组、reSjcTK4加Montanide ISA 206佐剂免疫组、两种佐剂对照组和感染对照组。两免疫组每只小鼠经背部皮下多点注射乳化的20μgreSjcTK4加弗氏或Montanide ISA 206佐剂，两种佐剂对照组小鼠注射乳化的生理盐水加弗氏或Montanide ISA 206佐剂，感染对照组不注射任何抗原和佐剂，共免疫3次，间隔2周。其中弗氏佐剂组第一次注射使用弗氏完全佐剂(FCA)，后2次加强免疫用弗氏不完全佐剂(FIA)。末次免疫后2周每只小鼠经腹部皮肤感染40±1条日本血吸虫尾蚴。攻击感染后6周剖杀小鼠，计数检获的成虫和肝内虫卵。在免疫前、攻击感染前和小鼠剖杀前采血并分离血清，用ELISA检测特异性IgG抗体。

每只小鼠肝组织分别剪碎后用8％ KOH消化，计数肝组织内虫卵数，计算减卵率和每对成虫减卵率：

2.7 ELISA检测免疫小鼠血清特异性IgG抗体：

疫苗免疫组和2个对照组小鼠分别于免疫前、攻击感染前和剖杀前采血，分离血清，-20℃保存备用。用ELISA方法测定小鼠血清中特异IgG抗体水平。reSjcTK4重组抗原5μg/孔包被；加小鼠血清稀释液(待测小鼠血清1:100稀释，稀释液为0.01mol/L PBS)100μl/孔于37℃孵育1h，然后用PBS-T洗涤3次，每次5min；加HRP标记的羊抗鼠IgG稀释液(1:1000稀释，稀释液同上)，于37℃孵育1h，PBS-T洗涤3次，每次5min；OPD显色液中孵育20min，加2mol/LH₂SO₄终止反应，测得各组A₄₉₂值。

2.8 统计方法：

运用SPSS 11.0统计软件包对数据进行方差分析(ANOVA)。

3 结果

3.1 RT-PCR扩增目的基因及pET28a-SjcTK4重组质粒鉴定：

SjcTK4编码基因PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测约600bp(图1)，与预计的大小一致。pET28a-SjcTK4重组质粒DNA经BamH I和Xho I双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，均见RT-PCR产物大小相似条带，而pET28a空质粒DNA经双酶切(BamH I和Xho I)未见此条带(图2)。

3.2 SjcTK4基因核苷酸序列测定和分析：

测序结果表明重组质粒pET28a-SjcTK4构建成功，证实SjcTK4编码194个氨基酸，表达蛋白的相对分子质量为26000(含载体6个组氨酸)，经同源比对分析后发现与曼氏血吸虫酪氨酸激酶TK4保守区氨基酸序列的同源性为98％(图3)。

3.3 重组体诱导表达和重组抗原(reSjcTK4)的纯化：

将pET28a-SjcTK4/BL21(DE3)工程菌用IPTG诱导表达后，在Mr 26 000处有一条特异的表达条带，而pET28a/BL21空质粒对照菌诱导后无此条带。表达蛋白经Co-NTA纯化后也在Mr 26 000处有一条带(图4)。

3.4 Western Blotting：

纯化复性的reSjcTK4与重组抗原免疫小鼠血清有明显反应(图5)。

3.5 重组蛋白结构与功能的生物信息学分析

该蛋白富含α-螺旋和无规卷曲，分别为43.81％和35.05％；含有蛋白激酶ATP结合区域(Protein kinases ATP-binding region)和酪氨酸蛋白激酶特异性活化位点(Tyrosine protein kinases specificactive-site)等多个特定位点(图6-1，6-2)。

3.6 reSjcTK4免疫小鼠保护效果观察(表1)：

免疫小鼠攻击感染后6周剖杀，经门脉灌注收集成虫并计数，reSjcTK4加Montanide ISA 206佐剂组所检获成虫数与感染对照组相比有显著性差异(P<0.05)，减虫率为27.3％。

攻击感染后6周剖杀小鼠，收集分离小鼠肝组织内血吸虫虫卵并计数，与感染对照组相比，reSjcTK4加Montanide ISA 206佐剂免疫组所计得虫卵数有显著性差异(P<0.01)，减卵率为33.6％。

reSjcTK4加Montanide ISA 206佐剂组所计得每对成虫肝卵数与感染对照组相比，差异显著(P<0.05)，每对成虫肝减卵率为28.0％。

3.7 ELISA检测重组蛋白reSjcTK4免疫小鼠血清特异性IgG抗体：

重组蛋白疫苗免疫组小鼠免疫后血清特异性IgG A值比佐剂对照组和感染对照组小鼠显著升高(P<0.001)(图7)。

实施例2  日本血吸虫酪氨酸激酶TK4保守区核酸疫苗的构建与免疫小鼠试验

1 材料

1.1 日本血吸虫大陆株尾蚴和成虫：含成熟尾蚴的阳性钉螺提供同前，常规方法逸得尾蚴。日本血吸虫大陆株成虫(雌雄混合)取自日本血吸虫尾蚴感染6周的C₅₇BL/6雌性小鼠。

1.2 菌株及质粒：大肠杆菌JM109株购自北京博大泰克公司；载体pcDNA3.0购自Novagen公司。

1.3 实验动物：6周龄C₅₇BL/6雌性小鼠由中国科学院上海实验动物中心提供。

1.4 主要试剂：酶切产物纯化试剂盒、T4 DNA连接酶、限制性内切酶(BamH I和Xho I)等为美国Promega公司产品；超纯质粒大量快速提取试剂盒为北京博大泰克公司产品；FITC标记的羊抗鼠IgG购自华美生物工程公司；其它试剂均为国产分析纯。

2.方法

2.1 重组表达载体pcDNA3.0-SjcTK4的构建：

pGEM-T Easy-SjcTK4重组质粒BamH I和Xho I双酶切后，进行1％低熔点琼脂糖凝胶电泳，用酶切产物纯化试剂盒对目的片段进行割胶纯化。对pcDNA3.0双酶切DNA片段进行相同的操作。两酶切纯化片段经T4 DNA连接酶4℃连接过夜。连接产物转化JM109感受态细菌，将菌液涂布于含氨苄青霉素(Ampicillin)(100μg/ml)的LB固体培养基上，于37℃培养过夜。次日挑取分隔良好的单个菌落分别于含Amp(100μg/ml)的LB培养液中培养扩增，抽提质粒DNA，用于进一步鉴定。

2.2 真核表达重组质粒pcDNA3.0-SjcTK4的鉴定和大量制备：

采用限制性内切酶BamH I和Xho I对重组质粒DNA进行酶切鉴定。对筛选获得的阳性克隆重组质粒进一步测定核苷酸序列进行鉴定。鉴定正确的pcDNA3.0-SjcTK4/JM109工程菌单个菌落接种于含Amp(100μg/ml)的LB培养液中培养扩增，次日按1:100比例加入LB液体培养基(含Amp 100μg/ml)于37℃ 250rpm振荡培养过夜。离心收集菌体，用碱裂解法大量提取重组质粒pcDNA3.0-SjcTK4，溶于TE缓冲液(pH8.0)，经BamH I和Xho I双酶切和核苷酸序列测定进行鉴定。紫外分光光度计测定质粒的A₂₆₀和A₂₈₀，计算含量并分析纯度。同法制备pcDNA3.0空质粒DNA作为对照。

2.3 间接荧光抗体试验(IFAT)观察DNA疫苗在肌肉注射的局部组织中的表达：

取3只6周龄雌性C₅₇BL/6小鼠经股四头肌注射核酸疫苗，于注射后72h取注射部位局部组织制作冰冻切片，采用间接荧光抗体试验(IFAT)检测注射局部抗原表达情况。以注射pcDNA3.0空质粒者为对照(2只C₅₇BL/6小鼠)。取出冰冻切片，回复至室温后，用5mmol/L PBS洗3次，每次5min，晾干。然后滴加1:50稀释的免疫小鼠血清50μl覆盖切片，放湿盒内37℃培育1h。5mmol/L PBS洗3次，每次5min。随后，FITC标记的羊抗鼠IgG 1:100稀释后，湿盒内37℃培育切片1h。5mmol/L PBS洗2次，双蒸水洗1次，晾干。最后，10％甘油缓冲液封片，荧光显微镜下观察，摄片。

2.4 小鼠免疫保护作用观察：

将6周龄雌性C₅₇BL/6小鼠随机分为4组，第I组为感染对照组，第II组为pcDNA3.0空质粒对照组，第III组为pcDNA3.0-SjcTK4免疫组，第IV组为pcDNA3.0-SjcTK4和reSjcTK4联合免疫组。每组10～12只小鼠。免疫前，按10μl/克体重用0.75％戊巴比妥钠溶液经腹腔注射麻醉小鼠。感染对照组不注射任何抗原或质粒；空质粒对照组每只小鼠经股四头肌注射100μg pcDNA3.0空质粒；核酸疫苗免疫组每只小鼠经股四头肌注射100μg pcDNA3.0-SjcTK4重组质粒，共注射3次，间隔2周；联合免疫组小鼠第一次免疫每只小鼠经股四头肌注射100μg pcDNA3.0-SjcTK4重组质粒，加强免疫时每只小鼠背部皮下多点注射乳化的20μg reSjcTK4分别加FCA和FIA，间隔2周。末次免疫后2周每只小鼠经腹部皮肤感染40±1条日本血吸虫尾蚴。攻击感染后6周剖杀小鼠，计数检获的成虫和肝内虫卵。在免疫前、攻击感染前和小鼠剖杀前采血并分离血清，用ELISA检测特异性IgG抗体。

每只小鼠肝组织分别剪碎后用8％KOH消化，计数肝组织内虫卵数，计算减卵率和每对成虫减卵率：

2.5 ELISA检测免疫小鼠血清特异性IgG抗体：

疫苗免疫组和2个对照组小鼠分别于免疫前、攻击感染前和剖杀前采血，分离血清，-20℃保存备用。用ELISA方法测定小鼠血清中特异IgG抗体水平。reSjcTK4重组抗原5μg/孔包被；加小鼠血清稀释液(待测小鼠血清1:100稀释，稀释液为0.01mol/L PBS)100μl/孔于37℃孵育1h，然后用PBS-T洗涤3次，每次5min；加HRP标记的羊抗鼠IgG稀释液(1:1000稀释，稀释液同上)，于37℃孵育1h，PBS-T洗涤3次，每次5min；OPD显色液中孵育20min，加2mol/LH₂SO₄终止反应，测得各组A₄₉₂值。

2.6 统计方法：

运用SPSS 11.0统计软件包对数据进行方差分析(ANOVA)。

3.结果

3.1 pcDNA3.0-SjcTK4重组质粒鉴定：

SjcTK4基因与pcDNA3.0真核表达载体连接而构建的重组质粒(pcDNA3.0-SjcTK4)经BamH I和Xho I双酶切后，1％琼脂糖凝胶电泳，可见近600bp条带；而pcDNA3.0空质粒DNA经双酶切后未见该条带(图8)。

3.2 SjcTK4基因核苷酸序列测定：

经核苷酸序列测定验证，SjcTK4编码基因与上述蛋白疫苗基因完全一致(序列1和2)，表明SjcTK4的cDNA以正确的方向克隆入真核表达载体pcDNA3.0，重组pcDNA3.0-SjcTK4质粒构建成功。

3.3 核酸疫苗在小鼠肌肉组织中表达：

pcDNA3.0-SjcTK4注射后72h，取注射部位肌肉制作冰冻切片，经IFAT检测可见肌肉组织内有绿色荧光分布，提示有相应蛋白抗原表达，而空质粒对照组无明显荧光(图9)。

3.4 核酸疫苗免疫保护性作用观察(表2)：

免疫小鼠攻击感染后6周剖杀，经门脉灌注收集成虫并计数。与感染对照组相比，pcDNA3.0-SjcTK4免疫组和联合免疫组所检获成虫数差异具显著性(P<0.05)，减虫率分别为20.3％和22.1％；

与感染对照组相比，DNA疫苗免疫组和联合免疫组肝减卵率分别为37.4％和33.5％(P<0.01或P<0.05)；另外，DNA疫苗免疫组每对成虫肝减卵率为34.0％(P<0.05)。

3.5 免疫小鼠血清特异性IgG水平：

核酸疫苗免疫组和联合免疫组小鼠免疫后血清特异性IgGA值比空质粒和攻击感染对照组显著升高(P<0.001)。(图10)。

序列表

<110>中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所

<120>日本血吸虫中国大陆株酪氨酸激酶TK4保守区基因及其克隆表达方法和应用

<130>权利要求书、说明书

<160>2

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>582

<212>DNA

<213>日本血吸虫中国大陆株酪氨酸激酶TK4保守区基因

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(582)

<400>1

<210>2

<211>194

<212>PRT

<213>日本血吸虫中国大陆株酪氨酸激酶TK4保守区基因

<400>2

Claims (5)

1.一种编码日本血吸虫中国大陆株酪氨酸激酶TK4保守区基因的核苷酸序列，其特征在于该核苷酸序列及其编码的相应氨基酸序列如下：

tta ggt gga gga aat ttt ggt cat gtt gtc aaa ggc tta tat cgt aca 48

Leu Gly Gly Gly Asn Phe Gly His Val Val Lys Gly Leu Tyr Arg Thr

1               5                   10                  15

cct tca ggt caa gaa gta cct gtt gca gtt aaa gca ttg aaa cca aat 96

Pro Ser Gly Gln Glu Val Pro Val Ala Val Lys Ala Leu Lys Pro Asn

        20                      25                  30

caa att gtc aat tct ggt gaa cga gaa atc ctt gct gaa gca cgt aca 144

Gln Ile Val Asn Ser Gly Glu Arg Glu Ile Leu Ala Glu Ala Arg Thr

        35                  40                  45

atg gct caa ttg aag cat cgg cat ata gta aga tta atc ggt gta tgt 192

Met Ala Gln Leu Lys His Arg His Ile Val Arg Leu Ile Gly Val Cys

    50                  55                  60

aaa gaa gag caa ttt atg ctt gtc ctt gaa ttg gcg cca tta ggt cca 240

Lys Glu Glu Gln Phe Met Leu Val Leu Glu Leu Ala Pro Leu Gly Pro

65                  70                  75                  80

att aat aaa tat tta aaa aaa cgc cct gat gtc agt gtg cat aca cta 288

Ile Asn Lys Tyr Leu Lys Lys Arg Pro Asp Val Ser Val His Thr Leu

                85                  90                  95

act gaa tta atg cat caa gtt gca tta ggt atg gcc tat tta gaa tca 336

Thr Glu Leu Met His Gln Val Ala Leu Gly Met Ala Tyr Leu Glu Ser

            100                 105                 110

tgt aaa ttt gtt cat cgt gac tta gct gct cgt aat gtt cta cta gtt 384

Cys Lys Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Leu Val

        115                 120                 125

aca cgt cat ttt gct aag att agt gat ttt gga atg agt aaa gcg tta 432

Thr Arg His Phe Ala Lys Ile Ser Asp Phe Gly Met Ser Lys Ala Leu

    130                 135                 140

aat ttc ggt agt gat tat tat cgg gca gcg act gct ggg aaa tgg cct 480

Asn Phe Gly Ser Asp Tyr Tyr Arg Ala Ala Thr Ala Gly Lys Trp Pro

145                 150                 155                 160

tta aaa tgg tat gca cca gaa tgc ata tat tat ttt cga ttt gat tca 528

Leu Lys Trp Tyr Ala Pro Glu Cys Ile Tyr Tyr Phe Arg Phe Asp Ser

                165                 170                 175

aaa tct gac gta tgg agt tat ggt ata act tta tgg gaa gtt tac tcc 576

Lys Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Thr Leu Trp Glu Val Tyr Ser

            180                 185                 190

tat ggt                                                         582。

Tyr Gly

2.一种权利要求1所述的编码日本血吸虫中国大陆株酪氨酸激酶TK4保守区基因的核苷酸序列的克隆方法，其特征在于为获得完整ORF的核酸序列，所设计的引物序列为：

上游引物PF：5′-gca ggatcc ATG TTA GGT GGA GGA AAT TTT GGT C-3′；

下游引物PR：5′-cag ctcgag CTA ACC ATA GGA GTA AAC TTC CCA TAAAGT-3′。

3.一种权利要求1所述的编码日本血吸虫中国大陆株酪氨酸激酶TK4保守区基因的核苷酸序列在大肠杆菌中的表达方法，其特征在于该方法所使用的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)，原核表达质粒为pET28a，构成的重组质粒为pET28a-SjcTK4。

4.一种权利要求1所述的编码日本血吸虫中国大陆株酪氨酸激酶TK4保守区基因在制备防治日本血吸虫病重组蛋白疫苗和核酸疫苗中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于其中所述的核酸疫苗是由SjcTK4和真核表达质粒pcDNA3.0组成，将SjcTK4基因克隆到真核表达质粒pcDNA3.0中，构建成DNA疫苗pcDNA3.0-SjcTK4。

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