CN106222155A - 一种多肽及其在制备结肠炎及结肠炎相关结直肠癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体是一种小分子多肽，其具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。本发明还提供所述小分子多肽在制备治疗结肠炎或结肠炎相关结直肠癌药物中的应用。本发明通过所述小分子多肽的治疗，治疗组小鼠的结肠长度、肿瘤数量等都明显低于对照组；结肠炎相关结直肠癌小鼠的肠组织增殖指标显著下降；同时所述的小分子多肽在体外细胞实验，可以促进肠上皮细胞的凋亡和抑制肠上皮细胞增殖。本发明通过干扰或阻断FKBP11这段多肽的生物学功能来达到阻断炎‑癌转换的目标，为缓解肠炎相关肿瘤提供新的药物设计和治疗靶点。

Description

一种多肽及其在制备结肠炎及结肠炎相关结直肠癌药物中的 应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种通过阻断FKBP11介导的增殖来治疗结肠炎及结肠炎相关结直肠癌的小分子多肽及其应用。

背景技术

炎症性肠病是一种原因不明的非特异性炎症性肠道疾病，包括溃疡性结肠炎和克罗恩病两类。炎症性肠病病情反复、迁延不愈，尚缺乏有效的治疗手段，往往需要终身治疗，严重影响患者的身心健康及生活质量。结直肠炎癌变是炎症性肠病最为严重、死亡率最高的并发症，占炎症性肠病患者死因的10％～15％。炎症性肠病患者炎症范围越广、炎症程度越重、发病年龄越小或合并存在原发性硬化性胆管炎就越容易诱发结直肠癌。因此更需要对肠炎相关结直肠的发病机制有更深刻的认识，以提高临床治疗的水平。

FK506结合蛋白11(FK506binding-protein 11，FKBP11)，又名FKBP19，定位于12q6区，属于FK506结合蛋白家族。该家族成员均具有肽酰-脯氨酰-顺反式异构酶(PPIase)活性。

慢性肠炎的不断进展是结肠炎相关结直肠癌发生的关键因素。研究发现，FKBP11作为UPR功能分子与多种炎症性疾病及肿瘤的发生密切相关。FKBP11在系统性红斑狼疮(SLE)患者B细胞内高表达，调控Pax5、Bach2、Aicda等B细胞-浆细胞分化的关键性转录因子表达，破坏B细胞自身免疫耐受，促进浆细胞分化及自身抗体产生。FKBP11的表达水平在肝炎患者的肝组织、肝良性病变组织、癌旁组织、肝癌组织中逐渐增高，并认为FKBP11是肝癌的早期标记物；更为重要的是：继发于病毒性肝炎的肝癌组织中FKBP11的表达水平明显高于未患有病毒性肝炎的肝癌患者，这表明FKBP11在慢性病毒性肝炎癌变过程中发挥了重要作用，它可能参与了肝炎-肝癌的“炎-癌转换”进程。这些结果表明，内质网应激相关分子FKBP11通过UPR途径促进“炎-癌转换”。FKBP11在IBD(Inflammatory bowel disease,IBD)及其癌变组织中表达逐渐增高；体外实验发现炎症因子(TNF-α及IL-6)可刺激肠上皮细胞内质网应激，上调FKBP11表达；过表达FKBP11可促进肠上皮细胞存活，抑制凋亡。上述证据提示：FKBP11通过UPR，促进肠上皮细胞存活及损伤修复，有助于IBD病情的缓解；然而，感染等炎症因素的持续刺激导致慢性内质网应激，高水平的FKBP11则可能参与炎症局部肠上皮细胞的异常增殖，启动“炎-癌转换”，促进CA-CRC的发生。

目前对结肠炎及其癌变的治疗主要是外科手术+内科保守治疗为主，主要采用抗肿瘤药物，改善营养，积极防治并发症等措施，尚无突破性进展，尚无针对肠炎相关结直肠癌的特效药物。然而在实验研究中疗效明显，但在临床上还没有一种药物获得认可。因此急需研究开发结肠炎相关结直肠癌治疗药物。

发明内容

本发明基于FKBP11与原癌基因cmyc相互作用结构域的确立，构建出了小分子多肽，并通过阻断或抑制FKBP11介导的增殖来治疗哺乳动物特别是人的炎症及炎症相关结直肠癌的方法。

肠上皮细胞在炎症因子的刺激下会诱发肠道炎症，随着长期的慢性炎症的刺激，肠道屏障功能发生不可逆破坏，肠上皮发生不典型增生造成肠道肿瘤的发生。本发明研究发现在炎-癌转换的动物模型中，FKBP11呈逐渐增加的趋势，且与原癌基因cmyc发生相互作用(见图1)，从而会加速肿瘤的形成。因此该多肽功能阻断或抑制的设计为缓解肠炎相关肿瘤提供新的药物设计和治疗靶点。通过对所述多肽和核酸进行抑制或干扰，从而阻断其促进肠上皮细胞增殖的作用，从而抑制结肠炎的发展、结肠炎相关结直肠癌的发生。

本发明发现FKBP11的第二段多肽序列具有促进肠上皮细胞细胞增殖的效应(见图2)。因此本发明的目的在于通过干扰或阻断FKBP11这段多肽的生物学功能来达到阻断炎-癌转换的目标。

为了实现上述目的，本发明的第一方面，提供一种小分子多肽，其具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

本发明的第二方面，提供上述小分子多肽在制备治疗结肠炎或结肠炎相关结直肠癌药物中的应用。

所述的小分子多肽促进结肠炎、结肠炎相关结直肠癌的功能恢复。

所述的小分子多肽抑制肠上皮细胞增殖。

所述的小分子多肽抑制结肠炎中炎症因子表达。

本发明的第三方面，提供一种编码上述小分子多肽的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的第四方面，提供上述基因在制备治疗结肠炎或结肠炎相关结直肠癌药物中的应用。

本发明是基于慢性肠炎损伤机制和治疗难点，通过抗炎基因治疗途径发明一段重组多肽，证明其具有抗炎的应用价值，并抑制其向肿瘤发展。本发明利用生物工程技术，基因重组一段32个氨基酸多肽对应的DNA序列到pcDNA3.1真核表达载体。经酶切和序列分析证明重组成功后，将此真核表达重组多肽转染到肠上皮细胞，免疫印迹证明多肽的蛋白表达，实现了多肽的重组。接着对多肽的抗炎功能进行了研究，细胞学和小鼠体内实验表明此多肽具有抑制肠上皮细胞分泌促炎因子和抑制小鼠肠炎的发生的功能。

本发明的多肽重组表达质粒是将此多肽对应DNA序列连接进pcDNA3.1真核表达载体，多肽的氨基酸序列和对应DNA序列见SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2。

第一步，重组肽的克隆载体构建提取人的mRNA，体外逆转录成cDNA，以此为模板，通过PCR方法扩增得到的目的片段与pGEMT-easy载体连接，经转化、提取等步骤得到重组质粒后，酶切鉴定并测序。

第二步：重组肽真核表达载体构建及其表达检测

将克隆质粒和质粒pcDNA3.1双酶切后，利用回收试剂盒获得目的片段和载体连接。经转化、提取等步骤获得重组真核表达载体。酶切鉴定重组体，并且测序进一步确定；将正确连接的多肽真核表达载体转染HT29细胞，48小时后搜集样品，免疫印迹结果证明了此多肽的表达(见图3)。

第三步：多肽抗炎功能的检测

1.细胞学实验

(1)在TNFɑ刺激的内质网应激模型中，检测FKBP11的表达及促进细胞增殖作用。

(2)构建FKBP11、c-myc-shRNA的干扰载体、过表达载体及截短突变体转染人肠上皮细胞，流式细胞仪分析对肠上皮细胞增殖的影响。

(3)将重组肽真核质粒转染HT29细胞后，分别在0h，4h，8h，12h，24h,48h检测细胞促炎分子释放水平。实验表明此多肽具有抑制肠上皮细胞分泌促炎因子的功能(见图4)。

2.小鼠肠炎相关肿瘤模型

(1)AOM/DSS诱导的小鼠慢性结肠炎及相关肿瘤模型建立：成年健康的18-22gC57Bl/6雌鼠，AOM 10mg/kg腹腔注射，自来水喂养一周，第二周2.5g的DSS粉剂溶于100ml的自来水中喂养7天，第三、四周换成自来水喂养，第五周予2.5％DSS水喂养，第六、七周换成自来水喂养，第八周再喂养2.5％DSS水，第九、十周换成自来水喂养，共循环10个周期(70天)后，根据小鼠大便性状、大便潜血、以及体重下降等情况予以判断，小鼠造模成功(见图5)。

(2)转染重组肽真核干扰载体后，构建小鼠肠炎相关肿瘤模型，与对照组比较肠道受损情况，验证该重组肽具有抗炎，进而抑制炎症向肿瘤转换的作用。

本发明的第五方面，提供一种药物组合物，其包含上述小分子多肽和药学上可接受的载体。

所述的药学上可接受的载体为药学上可接受的赋形剂，悬浮剂，填充剂和/或稀释剂。

本发明制得如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的小分子多肽；同时建立结肠炎相关结直肠癌小鼠模型，将合成的小分子多肽作为小鼠结肠炎相关结直肠癌的治疗药物，以PBS为空白对照，以小分子多肽作为治疗治疗组，通过治疗结肠炎、结肠炎相关结直肠癌，发现小分子多肽治疗后结肠炎、结肠炎相关结直肠癌小鼠的肿瘤数量减少、精神状态恢复，肢体活动能力提高，巨噬细胞的激活数量及炎症因子的表达量得到明显抑制，增殖细胞的数量降低。

本发明通过如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列小分子多肽的治疗，治疗组小鼠的结肠长度、肿瘤数量等都明显低于对照组；结肠炎相关结直肠癌小鼠的肠组织增殖指标显著下降；同时如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列小分子多肽在体外细胞实验，可以促进肠上皮细胞的凋亡和抑制肠上皮细胞增殖。

附图说明

图1为结肠炎相关结直肠癌模型中FKBP11与cmyc存在相互作用；

图2为FKBP11发挥作用的片段；A.将FKBP11截短成3个功能片段；B.将这三个片段转染到293T细胞中，用免疫共沉淀方法检测FKBP11与cmyc发生相互作用的片段；

图3为免疫印迹结果证明了重组肽的表达；

图4为促炎因子释放水平的分析图；

图5为小鼠肠炎相关肿瘤模型的造模情况分析图；

图6为增殖细胞数量分析图；

图7为凋亡细胞数量分析图；

图8为炎症因子表达量的分析图；

图9为IL6表达量的分析图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。

部分氨基酸相应的缩写如下：

谷酰胺gln Q；甘氨酸gly G；丝氨酸ser S；丙氨酸ala A；苏氨酸thr T；缬氨酸valV；异亮氨酸ile I；亮氨酸leu L；酪氨酸tyr Y；苯丙氨酸phe F；组氨酸his H；脯氨酸proP；天冬酰胺asn N；甲硫氨酸met M；谷氨酸glu E；色氨酸trp W；赖氨酸lys K；半胱氨酸cysC；精氨酸arg R。

实施例1：小分子多肽的合成

小分子多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

小分子多肽合成在ABI 431A型固相多肽合成仪(美国PE公司)上进行。方法采用标准芴甲氧羰基(Fmoc)方案，精氨酸采用两次偶联。起始选用0.125mmol对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂(HMP树脂)，按照多肽序列使肽链从羧基端逐个向氨基端延伸，每种氨基酸的用量为0.5mmol，与树脂的摩尔比为4：1.各种氨基酸的α-氨基酸为Fmoc保护，其余侧链保护基团为：Ser(tBu)、Glu(OtBu)、Arg(Pmc)。第一个氨基酸连接到树脂上用4-二甲基吡啶，氨基酸活化用1-羟基苯并三唑和二环乙基碳，偶联后用体积分数为20％的哌啶水溶液去除Fmoc保护基。多肽粗品合成后，将树脂-粗肽在冰冷浴条件下混合于10ml切割液A(由结晶苯酚0.75g、1,2-乙二硫醇0.25ml、苯甲硫醚0.5ml、去离子水0.25ml和三氟乙酸10ml组成)中，待切割液温度上升至室温后，搅拌2小时，使肽链从树脂上裂解下来，同时去除多种保护基团，将反应混合液经G4玻砂漏斗过滤后以除去树脂，先后用1ml三氟乙酸，10ml二氯甲烷反复冲洗反应瓶，树脂和漏斗。将滤液在常温低压下蒸发至1-2ml，加入50ml预冷乙醚蒸发小分子多肽粗品，-20°保存备用。

将小分子多肽粗品用二甲基亚砜溶解成浓度为20mg/ml的溶液，经孔径为0.45um的绿孔滤膜过滤后，在AKTA explorer 100型中压液相色谱仪(瑞典amerssam bioscience)上用SOURCE凝胶柱上纯化。流动相A有体积百分比为10％的乙醇和体积百分含量为0.1％三氟乙酸组成，流动相B由体积百分含量为90％的乙醇和体积百分含量为0.1％三氟乙酸组成。先用流动相A1.5个柱体积洗脱，再用流动相A和流动相B的混合液。(流动相B占混合液的体积分数在8个柱体积内由0％逐渐增加至80％)洗脱，再用流动相A和流动相B的混合液(流动相B占混合液的体积分数在0.5个柱体积内由0％逐渐增加至80％)洗脱，在主峰处收集多肽溶液，冷却干燥，即得小分子多肽纯品，用二甲基亚砜溶解，-20°保存备用。将小分子多肽纯品用Delta 600型高压液相色谱仪(美国waters公司)鉴定纯度，采用symmetry shieldC18柱，流动相由体积百分含量为10％到60％的乙和体积百分含量为0.1％的三氟乙酸组成，梯度洗脱，流速为1ml/min。结果显示，合成多肽的纯度达到90％以上。同时，将小分子多肽纯品用API2000LC/MS型电喷雾离子化质谱仪测定分子量。结果显示，合成的小分子多肽的分子量与理论值相符。

实施例2:小分子多肽在用于治疗小鼠结肠炎、结肠炎相关结直肠癌中的运用

一、动物：

C57BL6小鼠，5周龄，18-20g，购于南通大学动物实验室，按体重随机分为实验组(15只)、对照组(15只)。实验组予AOM/DSS，对照组腹腔注射生理盐水，自由饮用蒸馏水。实验期间不禁食。

二、药物：

小分子多肽治疗组：给予如SEQ ID NO：1所示的小分子多肽20nmol/kg体重进行腹腔注射，共计6只；

空白组：给予与治疗组等体积的PBS进行腹腔注射，共计6只。

三、实验方法：

①腹腔注入AOM/DSS是结肠炎相关结直肠癌常用动物建模方法，本实验用于验证多肽小分子对结肠炎、结肠炎相关结直肠癌的治疗作用。

②立体定位仪固定老鼠，用75％酒精对腹部进行消毒，暴露腹部；

③用立体定位仪定位老鼠四肢，以12mg/Kg注入AOM或等量生理盐水，一周后予DSS喂养，对照组予生理盐水喂养，后实验、对照生理盐水喂养两周，此过程循环一次。

④注意观察小鼠腹泻、活动情况，加强保暖、预防感染等护理。

经腹腔给大鼠分别给空白组大鼠注射PBS，小分子多肽组大鼠注射小分子多肽，随后每24小时注射一次，共注射7次。

活动指数评分：

表1

大鼠分别在造模前进行一次活动指数评分，然后在造模的第7天评分一次，每组大鼠数量为6只。采用双盲法，评分者经过培训，以保证对标准的正确把握，评分者对实验分组情况未知。评分内容体重变化、大便性状、活动和毛色等，每项满分为2分，若不符合则0分。根据评分情况予以判断，小鼠造模成功(见图5)。

表2

1、免疫组化染色，显示炎症细胞的浸润

为了考察损伤结肠组织的炎症细胞浸润情况，取小鼠结肠组织做免疫组化染色。结肠组织切片在柠檬酸缓冲液中煮沸15分钟以灭活内源性过氧化物酶。体积分数为1％的甲醇15分钟抑制过氧化氢酶，孵育于体积分数为10％的正常猪血清(Biochrom，柏林，德国)，以阻止非特异性免疫球蛋白的结合。使用的单克隆抗体为：ED1(1：100；Serotec，牛津，英国)标记激活的巨噬细胞。使用stereologer软件进行细胞计数。

结果：如图3所示，通过流式细胞技术发现，FKBP11这段多肽本身具有促进肠上皮细胞增殖的作用，能促进肠炎相关结直肠癌的发生发展；而干扰这段多肽以后，细胞的增殖作用明显受到抑制。

2、炎症因子的表达分析

颈椎离断处死小鼠，快速取出损伤结肠组织，放入液氮中保存时。用TrizolLS试剂(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)分离出总RNA，然后使用QuantiTectReverseTranscription试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)逆转录成为cDNA。根据操作指南(BioRad)使用SYBR green qPCR master mix转录所得的cDNA来测量基因表达量的多少。使用iCycler热循环系统和iQ5光学系统软件(BioRad)对基因的表达进行实时检测。RT-PCR的实验采用常规方法进行用来检测基因表达的引物有：

IIL-1βF：5’-tgctgatgtaccagttgggg-3’，SEQ ID NO:3，

IL-1βR：5’-ctccatgagctttgtacaag-3’，SEQ ID NO:4；

TNF-αF：5’-tgatcggtcccaacaagga-3’，SEQ ID NO:5

TNF-αR：5’-tgttggtggtttgctacga-3’，SEQ ID NO:6。

结果：由图5可知，在结肠炎及结肠炎相关结直肠癌模型中，经过小分子肽的治疗，损伤结肠部位的炎症因子表达水平明显降低。

3、NCM460细胞模型实验

为了进一步利用体外实验验证本发明对肠上皮细胞的保护以及对巨噬细胞的验证抑制作用，采用NCM460细胞模型验证。

NCM460细胞系为正常的肠上皮细胞系，购自上海细胞生物学研究所。细胞置于RPMI1640培养液中，内含体积分数为10％胎牛血清、常规细胞培养。实验时NCM460细胞接种于96孔培养板，接种密度2×10⁵/mL，每孔200μL。本试验共分为7组，分别为空白细胞对照组、浓度为40nM的小分子多肽脂质体组(简称40nM)、双氧水组(1微克/毫升)、浓度为10nM的小分子多肽脂质体与双氧水(1微克/毫升)混合液组(简称双氧水+10nM)、浓度为20nM的小分子多肽脂质体与双氧水(1微克/毫升)混合液组(简称双氧水+20nM)、浓度为30nM的小分子多肽脂质体与双氧水(1微克/毫升)混合液组(简称双氧水+30nM)、浓度为40nM的小分子多肽与双氧水(1微克/毫升)混合液组(简称双氧水+40nM)，共计7组，每组3孔，试验重复3次。

预处理时加入不同浓度小分子多肽脂质体，使在培养液中的终浓度分别为10nM，20nM，30nM或40nM和细胞共孵育2h，预处理结束后加入100μmol/LH₂O₂作用24小时。实验采用CCK-8试剂盒(日本同仁)检测存活细胞，由酶标仪检测，结果用每孔OD值表示。观察不同浓度的EPO-肽对IL6刺激后的NCM460细胞生存的影响，结果用Prism5统计分析。

结果：由图6可知，IL6由包括肿瘤细胞在内的多种细胞产生，参与肿瘤细胞的增殖和分化。研究发现实验组细胞中IL6的表达量明显低于对照组，说明FKBP11的这段多肽能抑制IL6刺激导致的细胞增殖。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (9)

1.一种小分子多肽，其具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的小分子多肽在制备治疗结肠炎或结肠炎相关结直肠癌药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的小分子多肽在制备治疗结肠炎或结肠炎相关结直肠癌药物中的应用，其特征在于，所述的小分子多肽促进结肠炎、结肠炎相关结直肠癌的功能恢复。

4.根据权利要求2所述的小分子多肽在制备治疗结肠炎或结肠炎相关结直肠癌药物中的应用，其特征在于，所述的小分子多肽抑制肠上皮细胞增殖。

5.根据权利要求2所述的小分子多肽在制备治疗结肠炎或结肠炎相关结直肠癌药物中的应用，其特征在于，所述的小分子多肽抑制结肠炎中炎症因子表达。

6.一种药物组合物，其特征在于，其包含如权利要求1所述的小分子多肽和药学上可接受的载体。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述的药学上可接受的载体为药学上可接受的赋形剂，悬浮剂，填充剂和/或稀释剂。

8.一种编码权利要求1所述的小分子多肽的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

9.根据权利要求8所述的基因在制备治疗结肠炎或结肠炎相关结直肠癌药物中的应用。