PT1011704E - Análogos de peptídeo derivado do receptor do factor da necrose do tumor - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"ANÁLOGOS DE PEPTÍDEO DERIVADO DO RECEPTOR DO FACTOR DA NECROSE DO TUMOR"

1. INTRODUÇÃO A presente invenção refere-se a peptídeos e análogos de peptídeos concebidos a partir de uma volta de ligação de um membro da superfamilia do receptor do factor da necrose do tumor (TNF-R), que está envolvido nas interacções de ligação com o seu ligando. Em particular, refere-se a peptideos ciclicos e peptideos análogos concebidos a partir de três voltas de ligação especificas nos domínios 2 e 3 de TNF-R que inibem a ligação do factor de necrose do tumor (TNF) aos seus receptores celulares e métodos de utilização destes compostos para inibir as actividades biológicas de TNF, antagonizando assim os seus efeitos clínicos indesejados. 2. Antecedentes da invenção

2.1. FACTOR DA NECROSE DO TUMOR E SUA PATOFISIOLOGIA 0 TNF foi descoberto originalmente como uma molécula que provocava a necrose hemorrágica de tumores de ratinhos (Carswell et al., 1975, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 72:3666). Uma segunda linha de investigação de uma proteína do soro conhecida como "caquetina", que se pensava ser responsável pelo estado caquéctico, conduziu à descoberta eventual de que a caquetina era idêntica ao TNF (Beutler et al., 1989, Annu. Rev. Immunol. 7:625). 0 TNF foi agora estabelecido como um mediador inflamatório largamente activo, envolvido em diversas estados clínicos. 2 TNF/caquetina foi renomeado como TNF-α e uma proteína estruturalmente e funcionalmente relacionada, anteriormente conhecida como linfotoxina (LT) foi designada por TNF-β (Vassalli, 1992, Annu. Rev. Immunol. 10:411). Ambas as moléculas são activas como homotrímeros e mediam efeitos biológicos semelhantes ao ligar-se aos mesmos dois receptores de 55kD (p55 ou complexo I) e 75 kD (p75) de peso molecular (Smith et al., 1990, Science 248:1019; Schall et al., 1990, Cell 61:361). Descobriu-se depois um heterotrímero de LT que ocupava um terceiro receptor conhecido como proteína relacionada (rp) com TNF-R mas não é capaz de se ligar a TNF-R p55 e p75 (Browning et al., 1993, Cell 72:847). Este LT tem sido designado como LT-β e o homotrímero (ou TNF-β) é também designado como LT-α. A comparação estrutural dos três TNF-R com vários outros receptores da superfície da célula teve como resultado a classificação destes receptores na superfamília TNF-R (Gruss and Dower, 1995, Cytokines and Mol. Ther. 1:75). O TNF-α é uma proteína com 17 kD de peso molecular, produzida por vários tipos de células, particularmente macrófagos activados. Uma vez que TNF-R é expresso por numerosas populações de células, o TNF induz uma larga variedade de respostas celulares, muitas das quais têm como resultado consequências prejudiciais. Por exemplo, o TNF induz caquexia, que é um estado resultante da perda de gordura e carência da proteína corporal total, acompanhada de ingestão insuficiente de alimento devido a anorexia. A caquexia é vulgarmente observada em pacientes com cancro, foi também observada em pacientes com o síndrome da imunodificiência adquirida (SIDA). Para além disso, a injecção de elevadas doses de TNF em animais produz a maioria dos sintomas do choque séptico. O TNF tem também 3 revelado que desempenha um papel em doenças autoimunes, tais como esclerose múltipla e artrite reumatóide, hipersensibilidade, doenças complexas imunológicas e doença enxerto contra hospedeiro bem como rejeição do transplante. 0 envolvimento de TNF tem sido implicado na malária e fibrose cistica.

2.2. TRATAMENTO DE PERTURBAÇÕES ASSOCIADAS A TNF

Os métodos de neutralização de efeitos negativos do TNF têm-se concentrado na utilização de anticorpos anti TNF e TNF-R solúvel. Em modelos animais, o tratamento de perturbações inflamatórias associadas a TNF com anticorpos específicos do TNF tem revelado eficácia terapêutica (Williams et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 89:9784; Baker et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:2040; Suitters et al., 1994, J. Exp. Med. 179:849). As formas quiméricas de anticorpos anti TNF têm sido construídas para utilização em ensaios clínicos em seres humanos (Lorenz et al., 1996, J. Immunol. 156:1646; Walker et al., 1996, J. Infect. Dis. 174:63; Tak et al., 1996, Arthritis Rheumat. 39:1077). Adicionalmente, as proteínas de fusão TNF-R têm sido introduzidas como antagonistas de TNF em pacientes humanos (Peppel et al., 1991, J. Exp. Med. 174:1483; Williams et al., 1995, Immunol. 84:4.33; Baumgartner et al., 1996, Arthritis Rheumat. 39(Suppl.) S74).

Enquanto que as abordagens mencionadas têm revelado alguma eficácia em certos estados patológicos, os anticorpos anti-TNF e TNF-R solúvel sofrem ambos de limitações comuns das macromoléculas, tal como uma fraca biodisponibilidade e estabilidade, indução de reacções imunitárias e penetração tecidular ineficaz. Assim, resta 4 ainda uma necessidade de melhores compostos terapêuticos para antagonizar os efeitos indesejáveis do TNF. A WO 95/21193 apresenta compostos ciclicos derivados das sequências de aminoácidos primárias contidas em regiões especificas da viragem β do factor de crescimento do nervo (NGF) .

Zhang et al. (1997) Nature Biotechnol. 15, 150-154 apresenta o conceito apresenta a concepção e síntese de peptídeos exocíclicoa modificados que simulam uma região particular de CD4 e que interrompem a interacção entre CD4 e a glicoproteína do envelope do HIV gpl20.

Banner et al. (1993) Cell 73, 431-445 e Naismith et al. (1988) Trends Biochem. Sei. 23, 74-79 apresenta a estrutura cristalina do TNF-R e a sua análise. Revelou-se que os domínios de ligação de ligandos consistem em pequenos subdomínios rios em cisteína.

Hwang et al. (1991) Proc. R. Soc. Lond. B. 245, 115-119 e Lie et al. (1992) Biochem. Biophys. Res. Comm. 188, 503-509 apresentam peptídeos derivados de TNF-R que modificam a interacção do TNF com o seu receptor.

3. RESUMO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a peptídeos e análogos de peptídeos concebidos a partir de uma alça de ligação de um membro da superfamília TNF-R. Em particular, refere-se a peptídeos e análogos de peptídeos concebidos a partir de três alças de ligação de RNF-R. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a peptídeos e análogos de peptídeos que interferem com as interaeções de ligação 5 entre TNF e TNF-R e métodos de utilização destes compostos e suas composições farmacêuticas, para antagonizar as actividades biológicas indesejáveis do TNF in vivo, bem como aos métodos de utilização dos compostos para detectar a presença de TNF numa amostra e para inibir as actividades do TNF in vitro. A presente invenção baseia-se, em parte, na descoberta do requerente de que os peptideos concebidos a partir de três alças de ligação de TNF-R p55 inibiram a ligação de TNF-α a TNR-R. Estes peptideo foram gerados com base nas sequências de aminoácidos que formam as alças de ligação especificas. Os resíduos CYs foram adicionados aos peptideos para permitir a sua ciclização por formação de pontes dissulfureto e os resíduos aromáticos hidrofóbicos foram adicionados aos seus terminais para aumentar a estabilidade estrutural. Entre os peptideos que inibiram de forma competitiva a ligação de TNF-α ao seu receptor cognato, os peptideos concebidos a partir da alça 1 do domínio 3 de TNF-R foram os mais eficazes.

Numa forma de concretização, a presente invenção proporciona um composto com a fórmula: \ F ,¾ / em que:

Bi e Bio são cada um independentemente do outro, um peptideo de 1 a 3 aminoácidos, pelo menos um dos quais é um aminoácido aromático; Z2 e Zg são cada um independentemente do outro, um aminoácido tipo Cys; X3 está ausente ou é um aminoácido ácido; 6 Χ4 é um aminoácido aromático ou apoiar; X5 é um aminoácido polar; Xê é um aminoácido polar; X7 é um aminoácido aromático ou polar;

Xs é um aminoácido aromático, apoiar ou polar seleccionado; " é uma ligação amida; "= " é uma ligação dissulfureto e "=" é uma ligação amida.

Numa outra concretização, a presente invenção proporciona um composto com a fórmula: \ f

|tT

Xis / em que: B11 e B22 são cada um independentemente do outro, um peptideo de 1 a 3 aminoácidos, pelo menos um dos quais é um aminoácido aromático; Z12 e Z2i são cada um independentemente do outro, um aminoácido tipo Cys; X13 está ausente ou é um aminoácido aromático; X14 está ausente ou é um aminoácido polar; X15 é um aminoácido básico, polar ou apoiar;

Xi6 é um aminoácido polar; X17 está ausente ou é um aminoácido apoiar;

Xis é um aminoácido ácido; X19 é um aminoácido polar; X20 é um aminoácido básico; " é uma ligação amida; "= " é uma ligação dissulfureto e 7 "=" é uma ligação amida. invenção

Numa outra concretização, a presente proporciona um composto com a fórmula:

Ba11™ Ç-i \

I /* em que: B23 e B33 são cada um independentemente do outro, um peptideo de 1 a 3 aminoácidos, pelo menos um dos quais é um aminoácido aromático; Z24 e Z32 são cada um independentemente do outro, um aminoácido tipo Cys; X25 está ausente ou é um aminoácido básico; X26 é um aminoácido básico; X27 é um aminoácido ácido; X28 é um aminoácido apoiar; X29 é um aminoácido apoiar; X30 está ausente ou é um aminoácido polar; X31 está ausente ou é um aminoácido apoiar; "—" é uma ligação amida; "= " é uma ligação dissulfureto e "=" é uma ligação amida.

Numa concretização particularmente preferida, os peptideos e os análogos de peptideo inibem especificamente a ligação do TNF aos seus receptores celulares. Por conseguinte, estes compostos são úteis para antagonizar as actividades biológicas indesejadas do TNF. Neste contexto, é aqui apresentada uma grande variedade de utilizações especificas, incluindo, sem se limitar a, tratamento de estados patológicos associados ao TNF, tais como respostas inflamatórias agudas e crónicas, choque séptico, caquexia, autoimunidade, doença enxerto contra hospedeiro, reacções alérgicas da pele, doença imunitária complexa, rejeição de transplantes e malária.

4. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 Alinhamento de sequências de aminoácidos em certos dominios ricos em Cys, extracelulares dos membros da superfamilia TNF-R: TNF-R p55 (SEQ ID N0:1), TNF-R p75 (SEQ ID NO:2) , TNF-R-rp (SEQ ID NO: 3), NGF-R p75 (SEQ ID NO:4), CD27 (SEQ ID N0:5), CD30 (proximal) (SEQ ID NO: 6), CD30 (distai) (SEQ ID NO:7), CD40 (SEQ ID NO:8), antigénio Fas (SEQ ID NO:9) , 0X40 (SEQ ID NO:10) e 4-IBB (SEQ ID NO: 11).

Figura 2 Inibição da interacção TNF-α radiomarcada com TNF-R. Numa análise radioreceptor competitivo, pré-incubou-se TNF rotulado 1251 com um peptideo seguido de ligação a TNF-R imobilizado. Os peptideos foram comparados a 25 μΜ quanto à sua capacidade de inibir a ligação de TNF-α (10 nM) a 1 nM de proteína quimérica TNF-R-IgG.

Figura 3 Inibição da interacção TNF-α radiomarcada com TNF-R numa análise de resposta à dose. Numa análise do radioreceptor competitivo, a ligação de RNF-α à proteína quimérica TNF-R imobilizada foi inibida na presença de vários peptideos da série WP9 numa gama de doses definida. Os resultados representam os desvios médios e padrão destas três experiências independentes.

Figura 4 Perfis HPLC de exclusão por tamanho de peptideos exociclicos. Cada peptideo (4 mg) foi eluído de coluna Protein-Pak 60 com tampão de fosfato 0,1 M a pH 7,0, com um caudal de 1 ml/min e o seu UV foi seguido a 214 nm. 9

Figura 5 Análise FAC da ligação TNF-α a receptores celulares na presença do peptideo WP9QY. As células 1=U937 manchadas com anticorpo secundário conjugado com fluoresceina. As células 2=U937 manchadas com um anticorpo receptor anti-TNF (htr-9) e anticorpo secundário. As células 3=U937 manchadas com anticorpo anti-TNF-R na presença de TNF-α e de anticorpo secundário. As células 4=U937 manchadas com um anticorpo receptor anti-TNF (htr-9) e TNF-α pré-incubado com 250 μΜ de peptideo WP9QY.

Figura 6 Análise FAC da ligação TNF-α a receptores celulares na presença de um a três peptideo derivados de TNF-R. A ligação de TNF-α a células U937 foi inibida a cada peptideo de uma forma dependente da dose. -·- = peptideo WP9QY; ---□---= peptideo WP9Q;---A---= peptideo WP5JY.

Os resultados representam a média de duas experiências independentes.

Figura 7 A inibição de citólise induzida por TNF-α de células L929 pelos peptideos derivados de TNF-R. As absorvências com 1 pg/ml só de ACT-D e com ACT-D mais 50 pg/ml de TNF-α são referidas como 100% de sobrevivência e 100% de citotoxicidade, respectivamente. Os resultados indicam os desvios médios e padrão destas três experiências independentes.

Figura 8A & B. Inibição de resistência à insulina induzida por TNF-α pelo peptideo WP9QY. Células 3T3-L1 diferenciadas foram estimuladas com insulina e analisou-se IRS-1 fosforilado por Tyr. Algumas amostras foram também tratadas com o TNF-α que inibiu a fosforilação Tyr de IRS-1. A pré-incubação de TNF-α com o peptideo WP9QY restaurou a fosforilação Tyr de IRS-1 em resposta à insulina. A 10 figura 8A mostra os resultados da mancha de Western com um anticorpo Tyr anti-fosforilado após imunoprecipitação com um anti-soro anti-IRS-1. A figura 8B mostra os resultados da mancha de Western na sequência da imunoprecipitação com o mesmo anti-soro anti-IRS-1.

Figura 9 Perspectiva tridimensional estrutural dos sitios de ligação em TNF-R para TNF-α. TNF-a monomérico é apresentado à direita e TNF-R monomérico é apresentado à esquerda com o sítio de ligação na alça 1 do domínio 3, apresentado com cor escura.

5. DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA PRESENTE INVENÇÃO A presente invenção refere-se a peptídeos cíclicos e análogos de peptídeos que inibem as interacções de ligação entre um membro da superfamília TNF-R e o seu ligando. Apesar de os procedimentos específicos e métodos presentemente descritos serem exemplificados recorrendo a vários peptídeos específicos, derivados de TNF-R p55, estes são meramente ilustrativos da prática da presente invenção. São também contemplados procedimentos e técnicas análogos, bem como peptídeos funcionalmente equivalentes e análogos de peptídeo, tal como será evidente aos especialistas na técnica, com base na divulgação pormenorizada apresentada.

Tal como presentemente utilizado, os termos seguintes terão os seguintes significados: "alquilo": Refere-se a um grupo hidrocarboneto saturado, de cadeia ramificada, linear ou cíclico. Grupos alquilo típicos incluem, sem se limitarem a, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, butilo t, pentilo, isopentilo, hexilo e semelhantes. Em 11 concretizações preferidas os grupos alquilo são alquil(Ci-Cê) , sendo (C1-C3) particularmente preferido. "alquilo substituído": Refere-se a um grupo alquilo em que um ou mais átomos de hidrogénio são cada um substituídos independentemente por outros substituintes. "alcenilo": Refere-se a um grupo hidrocarboneto cíclico ou de cadeia ramificada, linear, insaturado com pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono. 0 grupo pode estar em qualquer uma das conformações cis ou trans, perto da(s) ligação(ões) dupla (s). Os grupos alcenilo típicos incluem, sem se limitarem a etenilo, propenilo, isopropenilo, butenilo, isobutenilo, terc. Butenilo, pentenilo, hexenilo e semelhantes. Em concretizações preferidas o grupo alcenilo é alcenilo (Ci-Cô) , sendo (C1-C3) particularmente preferido. "alcenilo substituído": Refere-se a um grupo alcenilo em que um ou mais átomos de hidrogénio são cada um substituídos independentemente por outros substituintes. "alcinilo": Refere-se a um grupo hidrocarboneto cíclico ou de cadeia ramificada, linear, insaturado com pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono. Os grupos alcinilo típicos incluem, sem se limitar a, etnilo, propinilo, butinilo, isobutinilo, pentinilo, hexinilo e semelhantes. Em concretizações preferidas o grupo alcinilo é alcinilo (Ci-Cô) , sendo (C1-C3) particularmente preferido. 12 "alcinilo substituído": Refere-se a um grupo alcinilo em que um ou mais átomos de hidrogénio são cada um substituídos independentemente por outros substituintes. "alcoxi": Refere-se a um grupo -0R, em que R é alquilo, alcenilo ou alcinilo, tal como anteriormente definido. "fracção aromática": Refere-se a uma fracção com um grupo hidrocarboneto cíclico insaturado que tem um sistema de electrões (4n+2) π conjugado. As fracções aromáticas típicas incluem, sem se limitar a, benzeno, naftaleno, antraceno, azuleno, indaceno e semelhantes. Em concretizações preferidas, a fracção aromática contém 5 a 20 carbonos no sistema de anel, sendo particularmente preferido 5 a 10 átomos de carbono. "fracção aromática substituída": Refere-se a uma fracção aromática, em que um ou mais átomos de hidrogénio são cada um substituídos independentemente por outros substituintes. "fracção heteroaromática": Refere-se a uma fracção aromática, em que um ou mais dos átomos de carbono do anel são substituídos por outro átomo, tal como N, O ou S. As fracções heteroaromáticas típicas incluem, sem se limitarem a pirano, pirazolo, piridina, pirrolo, pirazina, piridazina, pirimidina, pirrolizina, quinazolina, quinolina, quinolizina, quinoxalina, selenofeno, tiofero, telurofeno, xanteno e semelhantes. "fracção heteroaromática substituída": Refere-se a uma fracção heteroaromática, em que um ou mais átomos de 13 hidrogénio são cada um substituídos independentemente por outros substituintes.

5.1. A SUPERFAMÍLIA TNF-R 0 TNF exerce as suas actividades biológicas por meio da ligação a dois TNF-R: P55 e p75. Uma comparação destes receptores com vários outros receptores da superfície celular revelou certas características estruturais comuns que conduziram à sua classificação como uma super-família (Beutler et al., 1994, Science 264:667). Os membros da superfamília TNF-R possuem domínios ricos em Cys extracelulares característicos, mesmo assim partilham apenas cerca de 25% de homologia da sequência. Existem pelo menos dez membros nesta superfamília, incluindo: TNF-R p55 e p75, proteína (rp) relacionada com TNF-R, CD40, antigénio Fas (CD95), receptor do factor de crescimento do nervo com baixa afinidade, (p75), CD27, CD30, 4-1 BB e 0X40 (Beutler et al., 1994, Ann. NY Acad. Sei. pp. 118-133; Gruss and

Dower, 1995, Cytokines and Mol. Ther. 1:75-105).

Tem-se revelado que as alças e viragens em muitas proteínas desempenham papéis com importância funcional em interaeções proteína-proteína. Numa concretização específica, ilustrada a título de exemplo na secção 6, foram concebidos peptídeos cíclicos, infra a partir de três alças de ligação de TNF-R p55 que inibiram a ligação de TNF aos seus receptores celulares. Em particular, os peptídeos concebidos a partir de da alça 1 do domínio 3 apresentavam as actividades inibidoras mais fortes. Quando um peptídeo concebido a partir desta alça de ligação foi utilizado em combinação com peptídeos concebidos a partir de duas outras alças, não se observou mais aumento dos efeitos inibidores, 14 indicando que a alça 1 no domínio 3 é um sítio de ligação do ligando dominante em TNF-R.

Com base nestas descobertas, as regiões correspondentes de outros membros da superfamília TNF-R, a partir dos quais se podem conceber os peptídeos inibidores e análogos de peptídeos, são imediatamente identificados pelo alinhamento da sequência de aminoácidos com os três sítios de ligação específicos de TNF-R p55 (figura 1). Uma vez que o sítio de ligação dominante de TNF-R p55 se encontra entre resíduos de aminoácidos #119 a 136, sequência que começa e termina com Cys, pode-se utilizar a mesma região em cada membro da superfamília TNF-R para conceber peptídeos e análogos de peptídeo abrangidos pelo âmbito da presente invenção. Nos casos em que as regiões não começam ou acabam com Cys, a região pode-se estender até ao próximo Cys. Por exemplo, a região correspondente em Fas é eliminada e assim esta região em Fas começa no resíduo #97 e termina com #143. No caso de NGF-R, a região termina no Cys na posição 135. Adicionalmente, os resíduos 74 as 81 e 97 a 110 podem também ser utilizados para conceber peptídeos adicionais e análogos de peptídeos. Estes compostos são então ciclizados e modificados nos seus terminais com fracções hidrófobas, tal como descrito em maior detalhe nas secções seguintes.

5.2. PEPTÍDEOS E ANÁLOGOS DE PEPTÍDEOS CONCEBIDOS A PARTIR DE ALÇAS DE LIGAÇÃO DE UM MEMBRO DA SUPERFAMÍLIA TNF-R

Em geral, um composto tal como o apresentado aqui, é um peptídeo cíclico ou análogo de peptídeo. O peptídeo ou análogo de peptídeo é modificado nos seus terminais com fracções hidrófobas. Em concretizações em que o composto é um peptídeo, o peptídeo corresponde em sequência primária a uma alça de ligação de um membro da superfamília TNF-R ou 15 uma porção desta. Numa concretização preferida, o peptideo corresponde em sequência primária a uma alça de ligação de TNF-R p55 ou uma porção desta. Nalgumas concretizações, um ou mais residuos de aminoácidos dentro do peptideo são substituídos por outros resíduos de aminoácidos. Tipicamente, estas substituições de aminoácidos são conservadoras, isto é, os resíduos de aminoácidos são substituídos por outros resíduos de aminoácidos com propriedades físicas e/ou químicas semelhantes aos resíduos que estão a substituir. De preferência, as substituições de aminoácidos conservadoras são aquelas em que um aminoácido é substituído por outro aminoácido dentro da mesma classe designada, tal como será descrito mais detalhadamente em seguida. Em concretizações em que o composto é um análogo de peptideo, o análogo é obtido por meio de substituição de pelo menos uma ligação amida no peptideo com uma amida substituída ou um isoster de amida.

Numa concretização ilustrativa um composto, tal como o que é apresentado, possui a seguinte fórmula:

AC em que: AC é um peptideo de resíduos de 3 a 18 aminoácidos, de preferência resíduos de 5 a 8 aminoácidos, o que corresponde em sequência primária a uma alça de ligação de um TNF-R que pode conter opcionalmente substituições de aminoácidos conservadoras, ou um seu análogo em que pelo menos uma ligação amida é substituída por uma amida substituída ou um isoster de amida; 16 ABi é uma fracção com um primeiro grupo funcional capaz de formar uma ligação covalente com um terminal de AC, um segundo grupo funcional capaz de formar uma ligação covalente com AB2 e um terceiro grupo funcional capaz de formar uma ligação covalente com AAi; AB2 é uma fracção com um primeiro grupo funcional capaz de formar uma ligação covalente com um segundo terminal de AC, um segundo grupo funcional capaz de formar uma ligação covalente com ABi e um terceiro grupo funcional capaz de formar uma ligação covalente com AA2; AAi é uma fracção com propriedades hidrófobas e um grupo funcional capaz de formar uma ligação covalente com o terceiro grupo funcional de ABi; AA2 é uma fracção com propriedades hidrófobas e um grupo funcional capaz de formar uma ligação covalente com o terceiro grupo funcional de AB2; "= " é uma ligação covalente e "ξπ é uma ligação covalente. A presente invenção seguintes fórmulas: apresenta compostos com as \ I/ (IX) 17

Bit*Z12«Xu-Xi4 ί” (ΠΙ) χ» χ» / 27

X ÍIV)

X

2B 29

X / Β13^Ζ3 jSsX31 ~ x30 A designação Xn representa, em cada caso, um aminoácido na posição especifica no composto. De forma semelhante, a designação Zn representa um aminoácido ou outra fracção que é capaz de formar ligações covalentes com outros Zn, tais como pontes dissulfureto.

Os resíduos aminoácidos designados por Xn ou Zn podem ser os L-aminoácidos codificados geneticamente, os L-aminoácidos não codificados geneticamente que ocorrem naturalmente, L-aminoácidos sintéticos ou D-enantiómeros de todos os anteriores. As notações de aminoácidos utilizadas neste caso para os vinte L-aminoácidos codificados geneticamente e aminoácidos comuns não codificados são convencionais e são as seguintes: 18

Aminoácidos Símbolo de uma letra Abreviatura comum Alanina A Ala Arginina R Arg Asparagina N Asn Ácido aspártico D Asp Cisteina C Cys Glutamina Q Gin Ácido glutâmico E Glu Glicina G Gly Histidina H His Isoleucina I Ile Leucina L Leu Lisina K Lys Metionina M Met Fenilalanina F Phe Prolina P Pro Serina S Ser Treonina T Thr Triptofano W Trp Tirosina Y Tyr Valina V Vai β-alanina bAla Ácido 2,3-diaminopropiónico Dpr Ácido -a-aminoisobutírico Aib N-metilglicina (sarcosina) MeGly Ornitina Orn Citrulina Cit t-butilalanina t-BuA t-butilglicina t-BuG N-metilisoleucina Me Ile fenilglicina Fg ciclohexilalanina Cha Norleucina Nle naftilalanina Nal Piridilananina 19 (continuação)

Aminoácidos Símbolo de uma letra Abreviatura comum 3-benzotienil alanina 4-clorofenilalanina Fe (4-Cl) 2-fluorofenilalanina Fe (2-F) 3-fluorofenilalanina Fe (3-F) 4-fluorofenilalanina Fe(4-F) Penicilamina Pen Ácido 1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolina-3-carboxílico Tic β-2-tienilalanina Ti Sulfóxido de metionina MSO Homoarginina hArg N-acetil lisina AcLis ácido2,4-diamino butírico Dbu p-aminofenilalanina Fe(pNH2) N-metilvalina MeVal Homocisteina hCis Homoserina hSer Ácido ε-amino hexanóico Aha Ácido δ-amino valérico Ava Ácido 2,3-diaminobutírico Dab

Os compostos que são abrangidos pelo âmbito da presente invenção são parcialmente definidos em termos de residuos de aminoácidos das classes designadas. Os aminoácidos podem ser classificados em geral em três classes principais: Aminoácidos hidrófilos, aminoácidos hidrófobos e aminoácidos de tipo cisteina, dependendo em primeiro lugar das caracteristicas da cadeia lateral do aminoácido. Estas classes principais podem ainda ser divididas em subclasses. Os aminoácidos hidrófilos incluem aminoácidos com cadeias laterais ácidas, básicas ou polares e os aminoácidos hidrófobos incluem aminoácidos com cadeias laterais aromáticas ou apoiares. OS aminoácidos apoiares podem ainda ser subdivididos para incluir, entre outros, aminoácidos 20 alifáticos. As definições das classes de aminoácidos são utilizadas neste caso da seguinte forma: "aminoácido hidrófobo" refere-se a um aminoácido com uma cadeia lateral que não tem carga a pH fisiológico e que é repelido por solução aquosa. Exemplos de aminoácidos hidrófobos codificados geneticamente incluem Ile, Leu e Vai. Exemplos de aminoácidos hidrófobos não codificados geneticamente incluem t-BuA. "aminoácido aromático" refere-se a um aminoácido hidrófobo com uma cadeia lateral contendo pelo menos um anel com um sistema conjugado π-electrão (grupo aromático). O grupo aromático pode ainda ser substituído por grupos substituintes tais como alquilo, alcenilo, alcinilo, hidroxilo, sulfanilo, nitro e amino, bem como outros. Exemplos de aminoácidos aromáticos codificados geneticamente incluem fenilalanina, tirosina e triptofano. Aminoácidos aromáticos não codificados geneticamente comuns incluem fenilglicina, 2-naftilalanina, β-2-tienilalanina, ácido 1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina-3-carboxílico, 4-clorofenilalanina, 2-fluorofenilalanina, 3-fluorofenilalanina e 4-fluorofenilalanina. "aminoácido apoiar" refere-se a um aminoácido hidrófobo com uma cadeia lateral que não tem carga a pH fisiológico e que não é polar. Exemplos de aminoácidos apoiares codificados geneticamente incluem glicina, prolina e metionina. Exemplo de aminoácidos apoiares não codificados geneticamente incluem Cha. 21 "aminoácido alifático" refere-se a um aminoácido apoiar com uma cadeia lateral hidrocarboneto, de cadeia linear, ramificada ou ciclica, saturada ou insaturada. Exemplos de aminoácidos alifáticos codificados geneticamente incluem Ala, Leu, Vai e Ile. Exemplo de aminoácidos alifáticos não codificados incluem Nle. "aminoácido hidrófilo" refere-se a um aminoácido com uma cadeia lateral que é atraída pela solução aquosa. Exemplos de aminoácidos hidrófilos codificados geneticamente incluem Ser e Lys. Exemplos de aminoácidos hidrófilos não codificados geneticamente incluem Cit e hCys. "aminoácido ácido" refere-se a um aminoácido hidrófilo com um valor pK da cadeia lateral inferior a 7. Os aminoácidos ácidos têm tipicamente cadeias laterais com carga negativa a pH fisiológico devido à perda de um ião de hidrogénio. Os exemplos de aminoácidos ácidos codificados geneticamente incluem ácido aspártico (aspartato) e ácido glutâmico (glutamato). "aminoácido básico" refere-se a um aminoácido hidrófilo com um valor pK da cadeia lateral maior que 7. Os aminoácidos básicos têm tipicamente cadeias laterais com carga positiva a pH fisiológico devido à associação com um ião de hidrónio. Exemplos de aminoácidos básicos codificados geneticamente incluem arginina, lisina e histidina. Exemplos de aminoácidos básicos não codificados geneticamente incluem os aminoácidos não cíclicos ornitina, ácido 2,3-diaminopropiónico, ácido 2,4-diaminobutírico e homoarginina. 22 "aminoácido polar" refere-se a um aminoácido hidrófilo com uma cadeia lateral que não tem carga a pH fisiológico

Mas que tem uma ligação em que o par de electrões partilhados, comuns aos dois átomos é mantida mais perto por um dos átomos. Exemplos de aminoácidos polares codificados geneticamente incluem asparagina e glutamina. Exemplos de aminoácidos polares não codificados geneticamente incluem citrulina, N-acetil lisina e sulfóxido de metionina. "aminoácido de tipo cisteína" refere-se a um aminoácido com uma cadeia lateral capaz de formar ligações covalentes com uma cadeia lateral de outro resíduo aminoácido, tal como uma ligação dissulfureto. Tipicamente, os aminoácidos de tipo cisteína têm geralmente uma cadeia lateral contendo pelo menos um grupo tiol (SH) . Os exemplos de aminoácidos de tipo cisteína codificados geneticamente incluem cisteína. Os exemplos de aminoácidos de tipo cisteína não-codifiçados geneticamente incluem penicilamina.

Tal como será avaliado pelos especialistas na técnica, as classificações anteriores não são absolutas, vários aminoácidos exibem mais do que uma propriedade característica e podem assim ser incluídos em mais do que uma categoria. Por exemplo, a tirosina tem um anel aromático e um grupo hidroxilo polar. Assim, a tirosina tem propriedades duplas e pode ser incluída tanto na categoria aromático como polar. De forma semelhante, para além de ser capaz de formar ligações dissulfureto, a cisteína tem também um carácter polar. Assim, embora não fique 23 estritamente classificado como um aminoácido hidrófobo ou apoiar, em muitos casos a cisteina pode ser utilizada para conferir hidrofobicidade a um peptideo.

Alguns aminoácidos vulgarmente encontrados que não são codificados geneticamente, a partir dos quais se pode constituir os peptideos e análogos de peptideos da presente invenção, incluem, sem se limitarem a, β-alanina (b-Ala) e outros ácidos omega-amino tal como ácido 3-aminopropiónico (Dap), ácido 2,3-diaminopropiónico (Dpr), ácido 4-aminobutírico etc.; ácido α-aminoisobutírico (Aib); ε-ácido aminohexanóico (Aha); ácido δ-aminovalérico (Ava); N-metilglicina ou sarcosina (MeGli); ornitina (Orn); citrulina (Cit); t-butilalanina (t-BuA); t-butilglicina (t-BuG); N-metilisoleucina (Melle); fenilglicina (Fg); ciclo-hexilalanina (Cha); norleucina (Nle); 2-naftilalanina (2-Nal) ; 4-clorofenilalanina (Fe(4-Cl)); 2-fluorofenilalanina (Fe(2-F)); 3-fluorofenilalanina (Fe(3-F)); 4-fluorofenilalanina (Fe(4-F)); penicilamina (Pen); ácido 1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina-3-carboxílico (Tic); β-2-tienilalanina (Ti); sulfóxido de metionina (MSO); homoarginina (hArg); N-acetil lisina (AcLis); 2,3-ácido diaminobutirico (Dab); ácido 2,3-diaminobutirico (Dbu); p-aminofenilalanina (Fe(pNH2)); N-metil valina (MeVal); homocisteina (hCis) e homoserina (hSer). Estes aminoácidos são também convenientemente abrangidos pelas categorias definidas anteriormente.

As classificações dos aminoácidos codificados e não codificados geneticamente, anteriormente descritos são resumidos no quadro em seguida. Subentende-se que o quadro 1 se destina apenas a ilustrar e não pretende ser uma lista exaustiva de resíduos de aminoácidos que podem incluis os 24 peptídeos e análogos de peptídeos descritos neste caso. Outros resíduos de aminoácidos que são úteis para a preparação de peptídeos e análogos de peptídeos descritos neste caso podem ser encontrados em Fasman, 1989, CRC Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, CRC Press, Inc. E nas referências aí citadas. Os aminoácidos não mencionados especificamente aqui podem ser convenientemente classificados nas categorias anteriormente descritas com base no comportamento conhecido e/ou características químicas e/ou propriedades físicas em comparação com os aminoácidos especificamente identificados.

Quadro 1

Classifi cação Codificado geneticamente Não codificado geneticamente hidrofobia aromático F, Y, W Phg, Nal, Thi, Tic, Phe(4-Cl), Phe(2 —F) , Phe(3—F), Phe(4-F), Piridil Ala, Benzotienil Ala Apoiar M, G, P alifático A, V, L, I t-BuA, t-BuG, Melle, Nle, MeVal, Cha, bAla, MeGly, Aib hidrofilia ácido D, E Básico Η, K, R Dpr, Orn, hArg, Phe(p-NH2), DBU, A2BU Polar Q, N, S, T, Y Cit, AcLys, MSO, hser Tipo cisteína C Pen, hCys, β-methyl Cys A designação Zn, em cada caso, representa um aminoácido ou outra fracção capaz de formar ligações covalentes com outros Zn de forma a permitir a ciclização do peptídeo. 25

Exemplos de resíduos aminoácidos que são capazes de formar ligações covalentes entre si incluem aminoácidos de tipo cisteína, tal como Cys, hCys, β-metil Cys e Pen, que são capazes de formar pontes dissulfureto entre si. Os resíduos aminoácidos de tipo cisteína preferidos incluem Cys e Pen. Os aminoácidos utilizados para ciclizar um peptídeo não necessitam de ser aminoácidos de tipo cisteína. Pares de aminoácidos que têm grupos funcionais de cadeia lateral capazes de formar ligações covalente entre si podem também ser utilizados. Estes pares de grupos funcionais são conhecidos dos especialistas na técnica e incluem, entre outros -COOH e -OH, -COOH e -NH2 e -COOH e -SH. Assim, pares de aminoácidos que podem ser utilizados para ciclizar um peptídeo incluem, entre outros, Asp e Lys; Glu e Lys; Asp e Arg; Glu e Arg; Asp e Ser; Glu e Ser; Asp e Thr; Glu e Thr; Asp e Cys e Glu e Cys. Outros pares de aminoácidos que podem ser utilizados para ciclizar o peptídeo serão evidentes para os especialistas na técnica.

Irá também reconhecer-se que os grupos Zn utilizados para cilcizar um peptídeo não necessitam de ser aminoácidos. Assim, Zn pode ser qualquer molécula com três grupos funcionais, um grupo funcional capaz de formar uma ligação covalente com um terminal do peptídeo, um segundo grupo funcional capaz de formar uma ligação covalente com o segundo grupo funcional de outro Zn e um terceiro grupo funcional capaz de formar uma ligação covalente com fracções hidrófobas Bm. As moléculas com grupos funcionais adequados serão evidentes para os especialistas na técnica. Exemplos de grupos funcionais capazes de formar uma ligação covalente com o terminal amina de um peptídeo incluem ácidos carboxílicos e ésteres. Exemplos de grupos funcionais capazes de formar uma ligação covalente com um 26 terminal carboxilo de um peptídeo incluem -OH, -SH, -NH2 e -NHR em que R é alquil (Ci-C6) , alcenil (Ci-Cõ) e alcinil(Ci-C6)

Uma variedade de interligações úteis para ciclizar um peptideo podem ser geradas pela reacção entre dois Zn. Zn com grupos funcionais adequados para formar interligações dessas, bem como condições de reacção adequadas para formar estas interligações serão evidentes para os especialistas na técnica. De preferência, as condições de reacção utilizadas para ciclizar os peptideos são suficientemente suaves para não degradar ou danificar de outra forma o peptideo. Os grupos adequados para proteger as várias funcionalidades, à medida das necessidades são bem conhecidos na técnica (cide, p.ex. Greene & Wuts, 1991, 2a ed., John Wiley & Sons, NY) tal como vários esquemas de reacção para a preparação destas moléculas protegidas. A designação Bn em cada caso representa uma fracção hidrófoba. Sem intenção de ligação a qualquer teoria particular, acredita-se que ao serem colocadas em solução aquosa, estas fracções hidrófoba interagem de forma a conferir ao peptideo estabilidade estrutural. Pensa-se que uma interacção hidrófoba significativa para conferir estabilidade estrutural consista em empilhar anéis aromáticos Assim, numa concretização preferida, cada Bn designa um peptideo de 1 a 6 aminoácidos, pelo menos um dos quais é um aminoácido aromático ou uma fracção aromática ou heteroaromática. Bn pode ser ilustrado por X32-X33-X34-X35-ΧΖ36-Χ37ξ em que Xn é um aminoácido, pelo menos um dos quais é um aminoácido aromático. De preferência, X32_X33_X34 estão ausentes e X37 é um aminoácido aromático. Mais preferivelmente, X32-X33-X34-X35X36 estão ausentes e X37 é um 27 aminoácido aromático. Aminoácidos aromáticos adequados incluem Tyr, Phe e Trp, sendo preferidos Tyr e Phe. Fracções aromáticas e heteroaromáticas adequadas incluem fenilo, naftilo, purina, pirimidina e semelhantes.

Nos peptideos das formulas (II) a (IV), o simbolo entre os residuos aminoácidos Xn designa em geral uma interligação estrutural. Assim, o simbolo designa normalmente uma ligação amida (-C(O)-NH). Subentende-se, no entanto que em todos os peptideos descritos nas presentes divulgações especificas, uma ou mais ligações amida podem ser opcionalmente substituídas por uma ligação diferente de amida, de preferência uma amida substituída ou um isoster de uma ligação amida. Assim, enquanto que vários Xn têm sido geralmente descritos em termos de aminoácidos, um especialista na técnica irá reconhecer que em compostos com ligações não-amida o termo "aminoácido" refere-se a outras fracções bifuncionais com grupos de cadeia lateral semelhantes às cadeias laterais dos aminoácidos. Por exemplo, em compostos com ligações não amida, a frase "aminoácido ácido" refere-se a uma molécula bifuncional capaz de formar as interligações estruturais desejadas e que tem um grupo cadeia lateral semelhante à cadeia lateral de um aminoácido ácido. As amidas substituídas incluem geralmente grupos da fórmula -C(0)-NR, em que R é alquil (Ci-C6), alcenil (Ci-C6), alcinil (Ci-C6), alquil (Ci-Cê) substituído, alcenil (Ci-Cô) substituído ou alcinil(Ci-Cô) substituído. Isosteres de amida incluem geralmente, sem se limitar a, -CH2NH-, -CH2S-, -CH2CH2, -CH=CH- (cis e trans), -C(0)CH2-, -CH(OH)CH2- e -CH2SO-.

Os compostos com estas ligações e métodos para a preparação destes compostos são bem conhecidos na técnica 28 (ver p.ex. Spatola, 1983, Vega Data 1(3) para uma perspectiva geral); Spatola, 1983, "Peptide Backbone

Modifications" In: Chemistry and Biochemistry of Amino Acids Peptides and Proteins (Weinstein, ed.), Mareei

Dekker, New York, p. 267 (general review); Morley, 1980, Trends Pharm. Sei. 1:463-468; Hudson et al., 1979, Int. J. Prot. Res. 14:177-185 (-CH2NH-, -CH2CH2-) ; Spatola et al., 1986, Life Sei. 38:1243-1249 (-CH2-S); Hann, 1982, J. Chem. Soe. Perkin Trans. I. 1:307-314 (-CH=CH-, eis e trans);

Almquist et al., 1980, J. Med. Chem. 23:1392-1398 (-COCH2-) ; Jennings-White et al., Tetrahedron. Lett. 23:2533 (-COCH2-); European Patent Application EP 45665 (1982) CA:97:39405 (-CH(OH)CH2-) ; Holladay et al., 1983,

Tetrahedron Lett. 24:4401-4404 (-C (OH)CH2-) ; and Hruby, 1982, Life Sei. 31:189-199 (-CH2-S-) .

Tal como será discutido mais pormenorizadamente em seguida, a interligação designada por "=" entre resíduos Bn e/ou Zn e/ou Xn nos compostos das fórmulas (II) a (IV) pode também ser uma sequência de ligação. Tipicamente, uma sequência de ligação é uma molécula bifuncional que separa uma fraeção de outra. Estas sequências de ligação, que podem ser flexíveis, semi-rígidas ou rígidas, são bem conhecidas na técnica e incluem polipeptídeos tais como poly-Gly e poly-Pro, hidrocarbonetos bifuncionais tais como ácido aminocapróico, ácido δ-aminovalérico e semelhantes.

Os compostos da fórmula (II) podem ser definidos da seguinte forma: 29 fâjãsZjKXj-X, i \ Í1I) f x* I / em que:

Bi e Bio são cada um independentemente do outro, um peptídeo de 1 a 6 aminoácidos, pelo menos um dos quais é um aminoácido hidrófobo, uma fracção aromática ou uma fracção heteroaromática; Z2 é uma fracção que é capaz de formar uma ligação covalente com Bi, X3 e Z9;

Zg é uma fracção que é capaz de formar uma ligação covalente com Bi0, X8 e Z2; X3 está ausente ou é um aminoácido hidrófilo; X4 é um aminoácido hidrófobo; X5 é um aminoácido hidrófilo; Χε é um aminoácido hidrófilo; X7 está aminoácido hidrófobo ou hidrófilo; X8 está aminoácido hidrófobo ou hidrófilo; é uma amida, amida substituída ou um isoster desta amida; "= " é uma ligação covalente e "=" É uma ligação covalente.

Os compostos da presente invenção são os da fórmula (II) em que:

Bi e Bio são cada um independentemente do outro, um peptídeo de 1 a 3 aminoácidos, pelo menos um dos quais é um aminoácido aromático; Z2 e Z9 são cada um independentemente do outro, um aminoácido tipo Cys; X3 está ausente ou é um aminoácido ácido; 30 Χ4 é um aminoácido aromático ou apoiar; X5 é um aminoácido polar; Χε é um aminoácido polar; X7 é um aminoácido aromático ou polar;

Xe é um aminoácido aromático, apoiar ou polar; " é uma ligação amida; "= " é uma ligação dissulfureto e é uma ligação amida.

Numa concretização particularmente preferida, os compostos da presente invenção são os da fórmula (II) em que:

Bi e B10 são cada um independentemente do outro Tyr ou Phe; Z2 e Z9 são cada um Cys; X3 está ausente o Glu; X4 é Trp ou Leu; X5 é Ser; X 6 θ Gin; X7 é Tyr ou Asn; X8 é Tyr ou Leu; " é uma ligação amida; "= " é uma ligação dissulfureto e é uma ligação amida.

Os peptideos particularmente preferidos da presente invenção incluem os seguintes: YCELSQYLCY (SEQ ID NO:12) YC WSQNLCY (SEQ ID NO:13) YC WSQNYCY (SEQ ID NO: 14) YC WSQYLCY (SEQ ID NO:15) 31

Os compostos da fórmula (III) podem ser definidos da seguinte forma: \ ÍIII)

!f* XlT X / Β„*Ζ»«Χ,»'Χ» n em que:

Bn e B22 são cada um independentemente do outro, um peptideo de 1 a 6 aminoácidos, pelo menos um dos quais é um aminoácido hidrófobo, uma fracção aromática ou uma fracção heteroaromática; Z12 é uma fracção que é capaz de formar uma ligação covalente com Bn, Xi3 e Z21; Z2i é uma fracção que é capaz de formar uma ligação covalente com B22, X20 e Zi2; X13 está ausente ou é um aminoácido hidrófobo; X14 está ausente ou é um aminoácido hidrófilo; X15 é um aminoácido hidrófobo ou hidrófilo;

Xi6 é um aminoácido hidrófilo; X17 está ausente ou é um aminoácido hidrófobo;

Xis é um aminoácido hidrófilo; X19 é um aminoácido hidrófilo; X20 é um aminoácido hidrófilo; é uma amida, amida substituída ou um isoster desta amida; "= " é uma ligação covalente e "=" É uma ligação covalente.

Os compostos da presente invenção são os da fórmula (III) em que: 32

Bii e B22 são cada um independentemente do outro, um peptídeo de 1 a 3 aminoácidos, pelo menos um dos quais é um aminoácido aromático; Z12 e Z2i são cada um independentemente do outro, um aminoácido tipo Cys; X13 está ausente ou é um aminoácido aromático; X14 está ausente ou é um aminoácido polar;

Xis é um aminoácido básico, polar ou apoiar; Χίε é um aminoácido polar; X17 está ausente ou é um aminoácido apoiar;

Xis é um aminoácido ácido; X19 é um aminoácido polar; X20 é um aminoácido básico; " é uma ligação amida; "= " é uma ligação dissulfureto e "=" é uma ligação amida.

Numa concretização particularmente preferida, os compostos são os da fórmula (III) em que:

Bll e B22 são cada um independentemente do outro Tyr ou Phe; Z12 e Z2i são cada um Cys; X13 está ausente ou é Phe; X14 está ausente ou é Thr; X15 é Ala, Asn ou Arg; Χίε é Ser; X17 está ausente ou é Vai;

Xis e Glu; X19 é Asn; X20 é Arg ou His; " é uma ligação amida; "= " é uma ligação dissulfureto e "=" é uma ligação amida. 33

Os peptídeos particularmente preferidos da presente invenção incluem os seguintes: YC FTASENH CY (SEQ. ID NO: 16) YC FTNSENH CY (SEQ. ID NO:17) YC FTRSENH CY (SEQ. ID NO:18) FC ASENH CY (SEQ. ID NO:19) YC ASENH CY (SEQ. ID NO:20) FC NSENH CY (SEQ. ID NO:21) FC NSENR CY (SEQ. ID NO:22) FC NSVENR CY (SEQ. ID NO:23)

Os compostos da fórmula (IV) podem ser definidos da seguinte forma: X. íiv)

Xj»

Bj jís2 j3i=Xj j. "Xj em que: B23 e B33 são cada um independentemente do outro, um peptídeo de 1 a 6 aminoácidos, pelo menos um dos quais é um aminoácido hidrófobo, uma fracção aromática ou uma fracção heteroaromática; Z24 é uma fracção que é capaz de formar uma ligação covalente com B23, X25 e Z32 é uma fracção que é capaz de formar uma ligação covalente com B33, X3i e Z24; X25 está ausente ou é um aminoácido hidrófilo; X26 é um aminoácido hidrófilo; X27 é um aminoácido hidrófilo; X28 é um aminoácido hidrófobo; X29 é um aminoácido hidrófobo; X30 está ausente ou é um aminoácido hidrófilo; X31 está ausente ou é um aminoácido hidrófobo; 34 é uma amida, amida substituída ou um isoster desta amida; "= " é uma ligação covalente e "=" É uma ligação covalente.

Os compostos da presente invenção são os da fórmula (IV) em que: B23 e B33 são cada um independentemente do outro, um peptídeo de 1 a 3 aminoácidos, pelo menos um dos quais é um aminoácido aromático; Z24 e Z32 são cada um independentemente do outro, um aminoácido tipo Cys; X25 está ausente ou é um aminoácido básico; X26 é um aminoácido básico; X27 é um aminoácido ácido; X28 é um aminoácido apoiar; X29 é um aminoácido apoiar; X30 está ausente ou é um aminoácido polar; X3i está ausente ou é um aminoácido apoiar; " é uma ligação amida; "= " é uma ligação dissulfureto e "=" é uma ligação amida.

Numa concretização particularmente preferida, os compostos da presente invenção ou seus análogos são os da fórmula (IV) em que: B23 e B33 são cada um independentemente do outro Tyr ou Phe; Z24 e Z32 são cada um Cys; X25 está ausente ou é Arg; X26 é Lys; X27 e Glu; 35 Χ28 é Leu, Pró ou Met; X29 é Gly; X30 está ausente ou é Gin; X31 está ausente ou é Vai; " é uma ligação amida; "= " é uma ligação dissulfureto e "=" é uma ligação amida.

Os peptideos particularmente preferidos da presente invenção incluem os seguintes: YC RKELGQV CY (SEQ. ID NO:24) YC KEPGQ CY (SEQ. ID NO:25) YC RKEMG CY (SEQ. ID NO:26) FC RKEMG CY (SEQ. ID NO:27)

Em todas as concretizações anteriormente mencionadas da presente invenção subentende-se que a frase "aminoácido" se refere também às fracções bifuncionais com cadeias laterais tipo aminoácido tal como anteriormente descrito.

Em geral, os peptideos activos ou análogos de peptideos da presente invenção são aqueles que apresentam pelo menos cerca de 15% de inibição das interacções TNF-R:TNF conforme medido em análises in vitro, tais como as descritas na secção 6 infra. De preferência, os peptideos activos da presente invenção ou seus análogos apresentarão pelo menos cerca de 20% a 50% ou mesmo 80% ou mais de inibição de interacções de ligação TNF-R:TNF-a.

5.3. PREPARAÇÃO DE PEPTIDEOS E ANÁLOGOS DE PEPTÍDEO 5.3.1. SÍNTESE QUÍMICA

Os peptideos da presente invenção ou seus análogos podem ser preparados utilizando virtualmente qualquer 36 técnica conhecida para a preparação de peptideos e análogos de peptideos. Por exemplo, os peptideos podem ser preparados sob forma linear ou não ciclizada, recorrendo a síntese de peptideos em solução ou fase sólida e em forma ciclizada com processos químicos padrão. De preferência, os processos químicos utilizados para ciclizar o peptídeo serão suficientemente suaves de forma a evitar uma degradação substancial do peptídeo. Os procedimentos adequados para sintetizar os peptideos descrito aqui, bem como os processos químicos adequados para ciclizar os peptideos são bem conhecidos na técnica. A formação de ligações dissulfureto, se desejadas, são geralmente conduzidas na presença de agente de oxidação suaves. Podem ser utilizados agentes de oxidação químicos, enzimáticos ou fotolíticos. São conhecidos na técnica vários métodos, incluindo os descritos, por exemplo por Tam, J.P. et al., 1979, Synthesis 955-957; Stewart et al., 1984, Solid Phase Peptide Synthesis, 2a Ed., Pierce Chemical Company Rockford, IL; Ahmed et al., 1975, J. Biol. Chem. 250:8477-8482; e Pennington et al., 1991 Peptides 1990 164-166, Giralt and Andreu, Eds., ESCOM Leiden, Holanda. Uma alternative adicional é descrita por Kamber et al., 1980, Helv Chim Acta 63:899-915. Um método conduzido sobre suportes sólidos é descrito por Alberício 1985, Int. J. Peptide Protein Res. 26:92-97. Qualquer um destes métodos pode ser utilizado para formar ligações dissulfureto em peptideos da presente invenção. Os métodos preferidos para realizar a formação de pontes de dissulfureto para os peptideos descritos neste caso são apresentados nos exemplos.

5.3.2. SÍNTESE RECOMBINANTE 37

Se o peptídeo é constituído integralmente por aminoácidos codificados por genes, ou uma porção deste é constituída desta forma, o peptídeo ou a porção relevante pode também ser sintetizado recorrendo a técnicas de engenharia genética recombinante convencionais. Os peptídeos isolados, ou seus segmentos, são então condensados e oxidados tal como anteriormente descrito, para se obter um peptídeo cíclico.

Para produção recombinante insere-se uma sequência de polinucleótidos que codificam uma forma linear do peptídeo num veículo de expressão apropriado, isto é um vector que contém os elementos necessários para a transcrição e translação da sequência codificadora inserida ou, no caso de um vector virai ARN, os elementos necessários para a replicação e translação. 0 veículo de expressão é então transfectado para uma célula alvo adequada que irá exprimir a forma linear do peptídeo cíclico. Conforme o sistema de expressão utilizado, o peptídeo expresso é então isolado por procedimentos bem estabelecidos na técnica. Os métodos para a produção de proteína recombinante e peptídeos são bem conhecidos na técnica (ver p.ex. Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.I.; and Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.I.).

Uma variedade de sistemas hospedeiro-vector de expressão pode ser utilizada para expressar os peptídeos descritos neste caso. Estes incluem, sem se limitar a, microorganismos tais como bactérias transformadas com ADN bacteriófago recombinante ou vectores de expressão de ADN plasmídeo contendo uma sequência codificadora apropriada; 38 fermento ou fungos filamentosos transformados com vectores de expressão de fermento ou fungos recombinantes, contendo uma sequência codificadora apropriada, sistemas celulares de insectos infectados com vectores de expressão virai recombinantes (p.ex. baculovirus) contendo uma sequência codificadora apropriada, sistemas celulares de plantas infectados com vectores de expressão de virus recombinantes (p.ex. virus mosaico da couve-flor ou virus mosaico do tabaco) ou transformados com vectores de expressão de plasmideo recombinantes (p.ex. plasmideo Ti) contendo uma sequência codificadora apropriada ou sistemas celulares animais.

Os elementos de expressão dos sistemas de expressão variam na sua força e especificidades. Conforme o sistema hospedeiro/vector utilizado, qualquer um de vários elementos de transcrição e translação adequados, incluindo promotores constitutivos e induciveis, pode ser utilizado no vector de expressão. Por exemplo, ao clonar em sistemas bacterianos, podem ser utilizados promotores induciveis tais como pL do bacteriófago λ, plac, ptrp, ptac (promotor híbrido ptrp-lac) e semelhantes; ao clonar em sistemas celulares de insectos podem ser utilizados promotores tais como o promotor de baculovirus polyhedron; ao clonar em sistemas celulares de plantas podem ser utilizados promotores derivados do genoma de células de plantas (p.ex. promotores do choque térmico, o promotor da pequena subunidade de RUBISCO; o promotor da proteína de ligação a/b clorofila) ou de vírus de plantas (p.ex. o promotor ARN 35S de CaMV; o promotor da proteína da cápsula de TMV); ao clonar em sistemas celulares de mamífero podem ser utilizados promotores derivados do genoma de células de mamífero (p.ex. o promotor metalotioneina) ou de vírus de 39 mamíferos (p.ex. o promotor tardio de adenovírus; promotor 7,5 K do vírus vaccinia); ao geral linhas de células que contêm cópias múltiplas do produto de expressão podem ser utilizados vectores à base de SV40, BPV e EBV com um marcador seleccionável apropriado. Em casos em que os vectores de expressão de plantas são utilizados, expressão das sequências que codificam os peptídeos da presente invenção pode ser implementada por qualquer conjunto dos promotores. Por exemplo, podem ser utilizados promotores virais tais como os promotores 35S ARN e 19S ARN de CaMV (Brisson et al., 1984, Nature 310:511-514) ou o promotor proteico cápsula de TMV Takamatsu et al., 1987, EMBO J. 6:307-311), em alternativa podem ser utilizados promotores de plantas tais como a pequena subunidade de RUBISCO (Coruzzi et al., 1984, EMBO J. 3:1671-1680; Broglie et al., 1984, Science 224:838-843) ou promotores do choquer térmico p.ex. soja hspl7,5-E ou hspl7,3-B (Gurley et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6:559-565). As construções podem ser introduzidas em células de plantas com plasmídeos Ti, plasmídeos Ri, vectores de vírus de plantas, transformação do ADN directa, microinjecção, electroporação, etc. Para consulta destas técnicas ver p.ex. Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NI, Secção VIII, pp. 421-463; e Grierson & Corey, 1988, Plant Molecular Biology, 2a Ed., Blackie, London, Ch. 7-9.

Num sistema de expressão de insecto que pode ser utilizado para produzir os peptídeos da presente invenção, utiliza-se o vírus da poli-hidrose nuclear Autographa californica (AcNPV) como um vector para expressar os genes estranhos. O vírus cresce em células de Spodoptera frugiperda. Uma sequência codificadora pode ser clonada em regiões não-essenciais (por exemplo o gene poli-hedron) do 40 vírus e colocada sob o controlo de um promotor AcNPV (por exemplo, o promotor poliédrico) . A inserção com êxito de uma sequência codificadora irá ter como resultado a inactivação do gene poliédrico e produção de vírus recombinante não ocludido (isto é o vírus sem a cápsula proteica codificada pelo gene poliédrico) . Estes vírus recombinantes são então utilizados para infectar células de frugiperda em que o gene inserido é expresso, (e.g., see Smith et al., 1983, J. Virol. 46: 584; Smith, patente norte-americana No. 4,215,051). Outros exemplos deste sistema de expressão podem ser encontrados em Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ausubel et al., eds., Greene Publish. Assoe. & Wiley Interscience.

Em célula hospedeiras de mamífero podem-se utilizar vários sistemas de expressão de base virai. Em casos em que é utilizado um adenovírus como vector de expressão pode-se ligar uma sequência codificadora a um complexo de controlo de transcrição/translação de adenovírus p.ex. o promotor tardio e sequência líder tripartida. Este gene quimérico pode então ser inserido no genoma do adenovírus por meio de recombinação in vitro ou in vivo. A inserção numa região não essencial do genoma virai (p.ex. a região El ou E3) terá como resultado um vírus recombinante que é viável e capaz de expressar peptídeo em hospedeiros infectados, (e.g., See Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 81:3655-3659). Em alternativa, o promotor de vaccinia 7,5 K pode ser utilizado (ver p.ex. 1982, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 79:7415-7419; Mackett et al., 1984, J. Virol. 49:857-864; Panicali et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sei. 79:4927-4931) . 41

Outros sistemas de expressão para produzir formar lineares ou não cliclizadas dos peptideos cíclicos da presente invenção serão evidentes aos especialistas na técnica.

5.3.3. PURIFICAÇÃO DE PEPTÍDEOS E ANÁLOGOS DE PEPTÍDEO

Os peptideos e análogos de peptideos da presente invenção podem ser purificados por meio de técnicas conhecidas tais como cromatografia líquida de elevado rendimento, cromatografia de permuta iónica, electroforese em gel, cromatografia de afinidade e semelhantes. As condições reais utilizadas para purificar um peptídeo ou análogo particular irão depender, em parte, de factores tais como carga líquida, hidrofobicidade, etc. e serão evidentes para os especialistas na técnica.

Para purificação por cromatografia de afinidade, pode ser utilizado qualquer anticorpo que ligue especificamente os peptideos ou análogo de peptídeo. Para a produção de anticorpos, vários animais hospedeiros, incluindo, mas sem se limitar a, coelhos, ratinhos, ratos, etc. podem ser imunizados por meio de injecção com um peptídeo linear ou cíclico. 0 peptídeo pode ser fixado a um suporte adequado, tal como BSA, por meio de um grupo funcional de cadeia lateral ou ligações fixas a um grupo funcional de cadeia lateral. Vários adjuvantes podem ser utilizados para aumentar a resposta imunológica, conforme a espécie do hospedeiro, incluindo, sem se limitar a Freund (completo ou incompleto), géis minerais tais como hidróxido de alumínio, substâncias com actividade superficial tais como lisolecitina, pluronic polióis, polianiões, peptideos, emulsões oleosas, hemocianina de Megathura crenulata, dinitrofenol e adjuvantes humanos potencialmente úteis, 42 tais como BCG (bacilos de Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum.

Anticorpos monoclonais para um peptídeo podem ser preparados recorrendo a qualquer técnica que proporcione a produção de moléculas de anticorpos por linha de células continuas em cultura. Estas incluem, sem se limitar a, a técnica de hibridoma, descrita originalmente por Koehler and Milstein, 1975, Nature 256:495-497, the human B-cell hybridoma technique, Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80:2026-2030 e a técnica de EBV hibridoma (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)). Para além disso, podem ser utilizadas técnicas desenvolvidas para a produção dos "anticorpos quiméricos" Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81:6851-6855; Neuberger et al., 1984,

Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454) por meio de splicing dos genes de uma molécula de anticorpo de ratinho com a especificidade apropriada do antigénio em conjunto com genes de uma molécula de anticorpo humano de actividade biológica apropriada. Em alternative, as técnicas descritas para a produção de anticorpos cadeia simples (patente norte-americana n° 4,946,778) podem ser adaptada para produzir anticorpos de cadeia simples especificas do peptídeo cíclico.

Fragmentos de anticorpos que contêm eliminações de sítios de ligação específicos podem ser gerados por técnicas conhecidas. Por exemplo, estes fragmentos incluem, sem se limitar a, fragmentos F(ab')2 que podem ser produzidos por digestão com pepsina da molécula do anticorpo e fragmentos Fab que podem ser gerados por meio 43 da redução das pontes dissulfureto dos fragmentos F(ab')2-Em alternative, podem ser construídas bibliotecas da expressão Fab (Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281) para permitir uma identificação rápida e fácil dos fragmentos Fab monoclonais com a especificidade desejada para o peptídeo cíclico interessante. 0 anticorpo do fragmento de anticorpo específico para o peptídeo cíclico desejado pode ser fixado, por exemplo, a agarose e o complexo de anticorpo-agarose é utilizado em imunocromatografia para purificar peptídeos cíclicos da presente invenção. Ver, Scopes, 1984, Protein Purification: Principies and Practice, Springer-Verlag New York, Inc., NI, Livingstone, 1974, Methods Enzymology: Immunoaffinity Chromatography of Proteins 34:723-731.

5.4. UTILIZAÇÕES DE PEPTÍDEOS E ANÁLOGOS DE PEPTÍDEOS CONCEBIDOS A PARTIR DE UM MEMBRO DA SUPERFAMÍLIA TNF-R

Os compostos da presente invenção são úteis para inibir as actividades biológicas dos ligandos para membros da superfamilia TNF-R. Os ligandos de todos os membros da superfamília TNF-R têm sido identificados e isolados e estão também classificados numa superfamília baseada nas suas semelhanças estruturais. Todos os membros desta família de ligandos são capazes de regular diversas respostas celulares, incluindo a proliferação, activação, diferenciação e mesmo a morte celular por apoptose ou citotoxicidade. Uma vez que todos os membros da superfamília TNF-R são expressos em linfócitos, particularmente células T, os seus ligandos são capazes de regular respostas imunitárias. Uma segunda característica comum a todos os membros da superfamília de ligandos TNF reside na sua capacidade para induzir a morte celular. 44 A título de ilustração, o CD40 é expresso em células B e a ligação cruzada deste receptor pelo seu ligando induz a activação da célula B, incluindo a secreção de IgE. Por conseguinte, a inibição das interacções CD40 com os seu ligando subregula as respostas da célula B e pode ser utilizada para tratar a autoimunidade e hipersensibilidade. Em contraste, o ligando Fas faz a ligação cruzada do antigénio Fas (CD95) expresso em células T e células B activadas e induz a morte celular. A inibição das interacções do ligandos Fas e antigénio Fas tem sido utilizada para prevenir a rejeição de transplantes. 0 ligandos Fas tem sido proposto como um potencial agente imunossupressor, com base na observação de que a expressão do ligando Fas por células Sertoli era responsável pela natureza imuno/privilegiada da rede testicular ao induzir a apoptose das células T que expressam Fas (Bellgrau e tal., 1995, Nature 377: 360). Por conseguinte, os compostos da presente invenção que inibem a ligação de Fas ao seu ligando podem ser utilizados para aumentar as respostas imunitárias em certas condições.

Numa concretização preferida da presente invenção, um composto da presente invenção inibe a ligação de TNF aos seus receptores. Uma vez que TNF-α e TNF-β liga aos mesmos receptores, espera-se que estes compostos inibam ambas as actividades de TNF-α e TNF-β. Estes compostos podem ser utilizados para o tratamento de estados patológicos em que as actividades biológicas do TNF desempenham um papel activo. Estas condições incluem, sem se limitar a, inflamação aguda e crónica, caquéxia, choque séptico, doença enxerto contra hospedeiro, rejeição de transplantes, hipersensibilidade, doença do complexo imunitário, malária e autoimunidade tal como esclerose múltipla, artrite 45 reumatóide, doença peridontal e diabetes não insulino-dependente.

5.4.1. FORMULAÇÃO E VIA DE ADMINISTRAÇÃO

Os compostos da presente invenção podem ser administrados a um sujeito per se ou na forma de uma composição farmacêutica. As composições farmacêuticas que incluem os compostos da presente invenção podem ser fabricados por meio de processos de mistura, dissolução, granulação, drageificação, levigação, emulsificação, encapsulação, inclusão numa matriz ou liofilização. As composições farmacêuticas podem ser formuladas de forma convencional, utilizando um ou mais veículos fisiologicamente aceitáveis, diluentes, excipientes ou adjuvantes que facilitam o processamento dos peptídeos activos ou análogos de peptídeo em preparações que podem ser utilizadas farmaceuticamente. A formulação conveniente depende da via de administração escolhida.

Para administração tópica, os compostos da presente invenção podem ser formulados como soluções, géis, unguentos, cremes, suspensões, etc. tal como é bem conhecido na técnica.

Formulações sistémicas incluem as concebidas para administração por meio de injecção, p.ex. injecção subcutânea, intravenosa, intramuscular, intratecal ou intraperitoneal, bem como as concebidas para administração transdérmica, transmucosa, oral ou pulmonar.

Para injecção, os compostos da presente invenção podem ser formulados em soluções aquosas, de preferência em tampões fisiologicamente compatíveis, tais como a solução 46 de Hank, solução de Ringer ou tampão de soro fisiológico. A solução pode conter agentes formulantes tais como agentes de suspensão, estabilizantes e/ou dispersantes.

Em alternativa, os compostos podem encontrar-se sob a forma de pó para reconstituição com um veículo adequado, p.ex. água isenta de pirogénio estéril, antes da utilização.

Para administração transmucosa, são utilizados penetrantes apropriados à barreira que se quer permear na formulação. Estes penetrantes são geralmente conhecidos na técnica. tais como

Para administração por via oral, os compostos podem ser imediatamente formulados por meio da combinação de peptídeos activos ou análogos de peptídeos com veículos farmaceuticamente aceitáveis, bem conhecidos na técnica. Estes veículos permitem aos compostos da presente invenção ser formulados como comprimidos, pílulas, drageias, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, suspensões espessas, suspensões e semelhantes, destinados a ingestão por via oral por um paciente em tratamento. Para formulações orais sólidas, tais como, por exemplo, pós, cápsulas e comprimidos, os excipientes adequados incluem cargas tais como açucares, tais como lactose, sucrose, manitol e sorbitol, preparações de celulose tais como amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma de tragacanta, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, carboximetilcelulose de sódio e/ou polivinilpirrolidona (PVP), agentes de granulação e agentes de aglutinantes. Se assim se desejar, podem ser adicionados agentes desintegrante, 47 polivinilpirrolidona com ligação cruzada, agar ou ácido algínico ou seu sal, tal como alginato de sódio.

Se assim se desejar, as formas de dosagem sólidas podem ser revestidas com açúcar ou com revestimento entérico recorrendo a técnicas padrão.

Para preparações liquidas orais, tais como, por exemplo suspensões, elixires e soluções, veículos, excipientes ou diluentes adequados incluem água, glicóis, óleos, álcoois, etc. Adicionalmente, podem ser acrescentados agentes aromatizantes, conservantes, corantes e semelhantes.

Para administração bucal, os compostos podem assumir a forma de comprimidos, losangos, etc. formulados de modo convencional.

Para administração por inalação, os compostos destinados a uma utilização de acordo com a presente invenção são convenientemente fornecidos sob a forma de um pulverizador aerossol a partir de embalagens pressurizadas ou um nebulizador com utilização de um propulsor adequado, p.ex. diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada por uma válvula para libertar uma quantidade exacta. As cápsulas e cartuchos de p.ex. gelatina, destinados a um inalador ou insuflador podem ser formulados contendo uma mistura em pó do composto e uma base em pó adequada, tal como lactose ou amido.

Os compostos podem também ser formulados em composições rectais ou vaginais, tais como supositórios ou enemas de 48 retenção p.ex. contendo bases de supositório convencionais tais como manteiga de cacau ou outros glicéridos.

Para além das formulações descritas anteriormente, os compostos podem também ser formulados como uma preparação depot. Estas formulações de acção prolongada podem ser administradas por meio de implante (por exemplo subcutâneo ou intramuscular) ou por meio de injecção intramuscular. Assim, por exemplo, os compostos podem ser formulados com materiais de polímero ou hidrófobos adequados (por exemplo, como uma emulsão num óleo aceitável) ou resinas permutadoras de iões ou como derivados moderadamente solúveis, por exemplo como um sal moderadamente solúvel.

Em alternativa, podem ser empregues outros sistemas de libertação farmacêuticos. Os lipossomas e emulsões são exemplos bem conhecidos de veículos de libertação que podem ser utilizados para libertar peptídeos e análogos de peptídeos da presente invenção. Alguns solventes orgânicos, tais como dimetilsulfóxido podem também ser empregues, apesar de normalmente aumentarem a toxicidade. Adicionalmente, os compostos podem ser distribuídos com um sistema de libertação sustentada, tal como matrizes semi-permeáveis ou polímeros sólidos contendo o agente terapêutico. Vários materiais de libertação sustentada têm sido estabelecidos e são bem conhecidos dos especialistas na técnica. As cápsulas de libertação sustentada podem, conforme a sua natureza química, libertar os compostos durante desde algumas semanas até 100 dias. Conforme a natureza química e estabilidade biológica do reagente terapêutico, podem-se empregar outras estratégias adicionais de estabilização de proteínas. 49

Como os compostos da presente invenção podem conter cadeias laterais ou terminais com carga, podem ser incluídos em qualquer uma das formulações anteriormente descritas, como os ácidos ou bases livres ou sais farmaceuticamente aceitáveis. Os sais farmaceuticamente aceitáveis são aqueles sais que retêm substancialmente a actividade antimicrobiana das bases livres e que são preparados por meio de reacção com ácidos inorgânicos. Os sais farmacêuticos tendem a ser mais solúveis em solventes aquosos e outros solventes próticos que são as formas básicas livres correspondentes.

5.4.2. DOSES EFICASES

Os compostos da presente invenção serão utilizados em geral numa quantidade eficaz para atingir o objectivo proposto. Para uma utilização destinada a tratar ou prevenir as perturbações associadas a TNF, os compostos da presente invenção ou suas composições farmacêuticas são administrados ou aplicados numa quantidade com eficácia terapêutica. Quantidade com eficácia terapêutica significa uma quantidade que melhora ou previne eficazmente os sintomas ou prolonga a sobrevivência do paciente em tratamento. A determinação de uma quantidade com eficácia terapêutica está bem dentro das capacidades dos especialistas na técnica, em especial à luz da apresentação detalhada que agora se apresenta.

Para uma administração sistémica, uma dose com eficácia terapêutica pode ser calculada inicialmente a partir de análises in vitro. Por exemplo, uma dose pode ser formulada em modelos animais para se atingir uma gama de concentração circulante que incluem o IC50, tal como determinado em cultura celular (isto é, a concentração do composto de 50 ensaio que inibe 50% das interacções de TNF-R:TNF). Esta informação pode ser utilizada para determinar com maior exactidão as doses úteis em seres humano.

As dosagens iniciais podem também ser calculadas a partir de dados in vivo, modelos animais, com técnicas que são bem conhecidas na técnica. Alguém com formação ordinária na técnica poderia imediatamente optimizar a administração em seres humanos com base nos dados animais. A dose e intervalos podem ser ajustados individualmente para proporcionar níveis no plasma dos compostos que sejam suficientes para amantes o efeito terapêutico. As doses habituais dos pacientes para administração por injecção oscilam desde cerca de 0,1 a 5 mg/kg/dia, de preferência desde cerca de 0,5 a 1 mg/kg/dia. Os níveis terapeuticamente eficazes no soro podem ser atingidos por meio da administração de múltiplas doses a cada dia.

Em casos de administração local ou ingestão selectiva, a concentração local efectiva dos compostos pode não estar relacionada com a concentração no plasma. Um perito na especialidade será capaz de optimizar dosagens locais terapeuticamente eficazes sem experimentação indevida. A quantidade de composto administrada irá, evidentemente, depender do sujeito em tratamento, do peso do sujeito, gravidade do problema, forma de administração e avaliação do médico responsável. A terapia pode ser repetida intermitentemente enquanto forem detectáveis sintomas ou mesmo quando estes não forem detectáveis. A terapia pode ser proporcionada isoladamente ou em combinação com outros medicamentos. No caso de perturbações associadas a TNF, os medicamentos que podem ser utilizados 51 em combinação com os compostos da presente invenção incluem, sem se limitar a, agentes anti-inflamatórios, esteróides e não-esteróides.

5.4.3. TOXICIDADE

De preferência, uma dose terapeuticamente eficaz do composto descrito presentemente irá proporcionar uma vantagem terapêutica sem provocar toxicidade substancial. A toxicidade dos compostos descritos pode ser determinada por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de células ou animais experimentais, p.ex. por meio da determinação de LD5o (dose letal para 50% da população) ou o LDioo (dose letal para 100% da população). A proporção da dose entre efeito tóxico e terapêutico é o índice terapêutico. Os compostos que apresentam elevados índices terapêuticos são preferidos. Os dados obtidos a partir destas análises em culturas de células e estudos com animais podem ser utilizados na formulação de uma gama de dosagens que não é tóxica para utilização em seres humanos. A dosagem dos compostos descritos situa-se de preferência dentro de uma gama de concentrações circulantes que inclui a dose eficaz com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta gama conforme a forma de dosagem empregue e a via de administração utilizada. A formulação exacta, via de administração e dosagem podem ser eleitas individualmente pelo médico tendo em conta o estado do paciente. (vide, p.ex. Fingi et al., 1975, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch.l, p.l). Descrita a presente invenção, os exemplos seguintes são apresentados a título de ilustração e não de limitação. 52 6. EXEMPLO: Peptídeos exocíclicos derivados de actividades TNF-R antagoniza TNF-ct

6.1. MATERIAIS E MÉTODOS

6.1.1. REAGENTES O TNF-α humano recombinante e o TNF-α rotulado com 1251 foram obtidos da Amersham Life Science, Inc. (Arlington Heights, IL) . 0 TNF-R (I) ou a proteína quimérica de cadeia pesada domínio IgG extracelular p55 foi preparado por meio de expressão de uma construção e cADN (Peppel et al., 1991, J. Exp. Med. 174:1483; Williams et al., 1995, Immunol. 84:433). 0 anticorpo monoclonal anti-TNF-α foi feito de acordo com Doring et al. (1994, Molecular Immunol. 31:1059) e o anticorpo monoclonal anti-TNF-R(I) (htr-9) foi obtido de BMA Biomedicals AG (Augst, Switzerland).

6.1.2. MODELAÇÃO MOLECULAR

Foi realizada modelação por computador com Quanta 4.0 (Molecular Simulation Inc., MA). Os peptídeos modelo foram construídos a partir das suas sequências e entrelaçados com CHARMM. As cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos foram posicionadas primeiro na conformação permitida com a base de dados de rotâmero Ponders (Ponder et al., 1987, J. Mol. Biol. 193:775-791) fornecida em QUANTA. Então, os peptídeos entrelaçados foram minimizados até à convergência com constante dieléctrica ajustada para 80. A estrutura cristalina do complexo ΤΝΕ-β/TNF-R(I) (Banner et al., 1993, Cell 73:431) foi utilizada para determinar os sítios de ligação de TNF-R a TNF-α. A primeira (56-73) e segunda (76-83) alças do domínio 2 e a primeira alça (107-114) do domínio 3 do TNF-R foram 53 exploradas para utilização na concepção de peptídeos. As sequências essenciais de aminoácidos de TNF-R para interacções de ligação com TNF-α foram identificadas como modelos estruturais por meio de sobreposição de TNF-α sobre TNF-β complexado com o seu receptor cognato. Então, os peptideos com 5 a 8 aminoácidos de comprimento, derivados de TNF-R, tal como apresentado no quadro 2, foram utilizados como modelos para a concepção de peptídeos exociclicos. Peptideos adicionais foram derivados a partir de sequências CDR de uma cadeia leve de um anticorpo neutralizante anti TNF-α, CDR1 L de Di62 (Doring et ai., 1994, Mol. Immunol. 31:1059). As modificações exocíclicas, tal como ciclização de peptídeo e adição de aminoácidos aromáticos, tais como Phe e Tyr às pontas de cada peptídeo foram realizadas tal como descrito (Zhang et al., 1996, Nature Biotech. 14:472; Zhang et al., 1997, Nature Biotech. 15:150) .

6.1.3. SÍNTESE CICLIZAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE PEPTÍDEOS

Os peptídeos lineares foram sintetizados por meio de métodos de fase sólida, desprotegidos e libertados da resina utilizando metodologia padrão. Os peptídeos foram precipitados e purificados por meio de cromatografia líquida de elevado rendimento (HPLC) com uma coluna C18 e depois liofilizados. A pureza destes peptideos era superior a 95%, conforme medição por análise de HPLC.

Os peptideos contendo resíduos Cys internos foram oxidados por meio de dissolução a 100 pg/ml em água destilada, ajustada ou tamponizada a pH entre 8,0 a 8,5, por exemplo por meio de (NH4)2C03 com agitação e exposição ao ar a 4 °C durante <10 dias até ter sido confirmada 95% de formação de ligações dissulfureto intramoleculares por 54 DTNB (Sigma, St. Louis, MO) que determinou sulfidrilos livres em peptideos (Habeeb, 1973, Anal. Bioch. 56:60; Angeletti et al., 1996, In Techniques in Protein Chemistry VII, Ed. Marsak, Academic Press, San Diego, CA, pp. 81-91) . Brevemente, peptideos (100 pg/ml, 50 μΐ) e DTNB (10 nM, 50 μΐ) foram adicionados a 0,1 M de tampão de fosfato de sódio (pH 8,0, 1 ml), incubados no escuro durante 30 minutos e determinou-se a absorvância a 420 nm e comparou-se com os peptideos lineares não oxidados.

Os peptideos ciclizados foram liofilizados, purificados por HPLC com uma coluna preparatória C18 e uma coluna de exclusão de tamanho Protein-Pak 60 (Waters, Milford, MA) . Demonstrou-se que a pureza dos peptideos era maior que 95% por meio de análise de HPLC. A concentração de cada peptideo ciclizado foi calculada com base na intensidade UV em comparação com o peptideo linear correspondente por meio de análise de HPLC.

6.1.4. RADIOENSAIO COMPETITIVO A proteína quimérica TNF-R-IgG (100 ng/ml) diluída em 100 μΐ de soro fisiológico tamponizado com fosfato (phosphate buffered saline - PBS) foi imobilizada em placas de análise flexíveis MicroTest III (Becton Dickinson, San Jose, CA) por meio de incubação a 4°C de um dia para o outro. Depois de bloquear com PBS contendo 1 % de albumina de soro de bovino (bovine serum albumin - BSA) durante 2 hr à temperatura ambiente e subsequente lavagem com PBS contendo 0,1 % de Tween 20 (PBS-Tw), TNF-α rotulado com 1251 (1 ng) foi pré-incubado com uma solução de peptideo (100 μΐ) em PBS durante 1 hr a 37° C e foi adicionado aos alvéolos cobertos com TNF-R. Depois de uma incubação de 2 hr a 37 °C, a placa foi lavada com PBS-Tw e mediu-se a 55 radioactividade ligada num contador Cobra gamma (Packard

Instruments, Meriden, CT).

6.1.5. CITOMETRIA DE FLOXO

Uma linha de células da leucemia humana, U937, foi mantida em meio RPMI-1640 suplementado com FCS a 10%. De forma a quantificar a ligação de TNF-α ao seu receptor cognato expresso em células U937, lxlO5 células foram ressuspensas em PBS contendo 0,5% de BSA e 0,05% de NaN3 (tampão de ligação). O TNF-a (2,5 ng) foi pré-incubado com uma solução de peptídeo (50 Al) em PBS durante 1 hr a 37 °C e foi adicionado às células durante 1 hr a 4 °C a uma concentração final de TNF-α de 50 ng/ml. Então, 50 Al de um anticorpo receptor anti-TNF a 3 Ag/ml em tampão de ligação foram adicionados às células durante 1 hr a 4°C. As células foram lavadas em tampão de ligação e manchadas com 50 Al (10 Ag/ml) em anticorpo secundário IgG cabra anti-rato conjugado com fluoresceína (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) durante 30 min a 4°C no escuro. Depois de lavagem em tampão de ligação, as células foram analisadas com citómetro de fluxo FACScan (Becton Dickinson). Os limites foram estabelecidos na população de células vivas e o grau de inibição da ligação TNF-a/célula por peptideo foi calculado com base nos valores médios de cada histograma.

6.1.6. ANÁLISE DE CITOTOXICIDADE

Uma linha de células de fibroblastos de murino, L929, foi mantida em meio Eagle modificado por Dulbecco suplementado com 10% de FCS e o meio foi substituído com meio AIM-V isento de soro (GIBCO BRL) imediatamente antes das células serem utilizadas para a análise de citotoxicidade. As células L929 foram semeadas a uma densidade de 2xl05 células/ml em placas de microtitulação 56 de 96 alvéolos e incubadas durante 20 hr a 37 °C, sob atmosfera de 5% de C02 no ar. O TNF-a (7 ng) foi pré-incubado com uma solução de peptídeo (80 μΐ) em PBS durante 1 hr a 37 °C e foi adicionado às células que tinham sido incubadas com actinomicina D (ACT/D) a 1 pg/ml durante 2 hr. As células foram incubadas com TNF-α ajustado a uma concentração final de 50 pg/ml durante 7 hr a 37 °C sob 5 % de C02 e manchadas com MTT (brometo de 3— [ 4,5— dimetiltiazol-2-il]2,5-difenil-tetrazolio) (Sigma) (Hansen et al., 1989, J. Immunol. Methods 119:203). Em resumo, 10 μΐ de uma solução de 10 mg/ml de MTT foram adicionados a cada alvéolo durante 2 hr a 37 °C e a cor do produto formazan foi desenvolvida com uma incubação de um dia para o outro a 37 °C com 100 μΐ de tampão de extracção (20 % SDS em 50 % DMF, pH 4,7). A densidade óptica do formazan colorido foi medida a 600 nm.

6.1.7. FOSFORILAÇÃO DE IRS-1 EM ADIPÓCITOS Células 3T3-L1 foram desenvolvidas e diferenciadas em adipócitos tal como anteriormente descrito (Garcia de Herreros et al., 1989, J. Biol. Chem. 264:19994). Após a diferenciação máxima (pelo menos 90% das células diferenciadas) as células foram mantidas com falta de nutrientes em 0,2% BSA durante 1 dia e depois foram tratadas com TNF-α a uma concentração de 50 ng/ml em meio L-15 de Leibovitz/PBS (2 ml/2 ml) durante 4 hr a 37 °C sem CO2. Nalgumas amostras, os peptídeos foram pré-incubados com TNF-α em PBS durante 1 hr a 37 °C antes da mistura ser adicionada aos adipócitos famintos. As células foram então estimuladas durante 3 min com insulina (100 nM), lavadas com PBS gelado e depois solubilizadas em tampão de lise (50 mM Hepes, pH 7,4, 150 nM NaCl, 10 nM EDTA, 10 nM Na4P207, 1 mM Na3V04, 100 nM NaF, 1% Triton X-100 (v/v) , 10 pg/ml 57 aprotinina, 1 pg/ml leupeptina e 1 mM fluoreto de fenilmetilsulfonil). IRS-1 foi imunoprecipitado a partir dos extractos de células (1 ml) com um antisoro anti-IRS-1 (5 μΐ, de um dia para o outro a 4 °c) e A-Sepharose de proteína (Sigma) a 20 μΐ volume do leito durante 1 hr a 4 °C. Após três lavagens em 50 mM de tampão Hepes (pH 7,4) incluindo Triton X-100 1 % (v/v), SDS 0,1 % e 150 mM NaCl, as proteínas da imunoprecipitação foram fervidas em tampão amostra de Laemmli durante 3 min e separadas em SDS-PAGE 6%. As proteínas foram então transferidas para uma membrana de nitrocelulose e realizou-se a análise da mancha de Western com um conjunto de mancha de Western ECL (Amersham) de acordo com as instruções do fabricante. A membrana foi primeiro sondada com um anticorpo Tyr anti-fosforilada (1:20,000) acoplada a um anticorpo secundário rotulado, depois eliminada e resondada com um antisoro anti IRS-1 (1:1,000). A intensidade de cada banda foi analisada por um densitómetro Image Quanta (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) e a redução da resistência à insulina induzida por TNF-α por peptídeos foi calculada depois de subtrair a intensidade de fundo de cada banda.

6.2. RESULTADOS

As sequências de aminoácidos correspondentes às três alças de ligação TNF-α foram utilizadas como modelos para a síntese de vários peptídeos. Os resíduos Cys foram incluídos nos peptídeos lineares para permitir a sua ciclização. A sua identidade foi verificada por espectrometria de massa. Vários peptídeos exocíclicos listados no quadro 2 foram testados pela sua capacidade de inibir a ligação de TNF-a radio-rotulado à proteína quimérica TNF-R. A figura 2 58 mostra que, enquanto os peptídeos concebidos a partir de três regiões alça separadas da ligação TNF-α inibida por TNF-R a TNF-R, os peptídeos concebidos a partir da alça 1 do domínio 3 (série WP9) de TNF-R exibiam efeitos inibidores mais fortes do que os peptídeos concebidos a partir da alça 1 do domínio 2 (série WP5) e alça 2 do domínio 2 (série WP8) a uma concentração de 25 AM. As séries WP25 de peptídeos foram desenvolvidas por meio de comparação das estruturas de alças TNF-R e CDR1 de um anticorpo anti-TNF-α. As modificações dos peptídeos WP5 a partir de Aa Para Asn aumentaram as suas actividades inibidoras mas modificações similares dos peptídeos WP8 não tiveram como resultado estes efeitos. A alça 1 do domínio 3 de TNF-R foi utilizada como um modelo para conceber um peptídeo que continha Gin em vez de um resíduo com carga, Glu (WP9Q) . Quando o peptídeo WP9Q foi testado no radioensaio competitivo revelou uma actividade 2 vezes maior do que os melhores peptídeos WP5. Peptídeos WP9 mais modificados foram comparados com um estudo de resposta à dose e o peptídeo WP9QY revelou exibir as actividades inibidoras mais fortes com um IC5o a 5 μΜ (figura 3) . 0 peptídeo WP9QY foi modificado a partir de WP9Q por meio da substituição de Ans em WP9Q com Tyr que intensificou as interacções do receptor com TNF-α via Trp e Gin que são resíduos críticos para a sua ligação ao receptor. Uma forma mais compacta de WP9QY do que os outros peptídeos WP pareceu também aumentar as interacções WP9QY com TNF-α como sugerido peça sua menor eluição a partir de uma coluna de exclusão de tamanho em HPLC (figura 4). 59

Quadro 2

Sequências de aminoácidos de sítios de ligação de TNF-α em TNF-R e peptídeos exocíclicos derivados destes sítios.

Os sítios de ligação de TNF-α no receptor Sítio de ligação - 5 TNF-a 53E 82R 85VSY87 125Q 127E

Receptor (alça 1 do domínio 2) 60 FTASENH 66

Peptídeo exocíclicos*

WP5 YC FTASENH CY WP5N YC FTNSENH CY WP5R YC FTRSENH CY WP5J FC ASENH CY WP5JY YC ASENH CY WP5JN FC NSENH CY WP5JR FC NSENR CY WP5VR FC NSVENR CY WPl** YC SQSVSND CF WP1R** FC VSNDR CY Sítio de ligação - 8 TN F-a

WP8L YC RKELGQV CY WP8JP YC KEPGQ CY WP8J YC RKEMG CY WP8JF FC RKEMG CY 65K 67Q 113P 115Y 143L 145A Receptor (alça 2 do domínio 2) 76 CRKEMGQV 83 Sítio de ligação - 9

TNF-a 72THVL75 77T 971 137 N

WP9Q YC WSQNL CY

Receptor (alça 1 do domínio 3) WP9ELY YCELSQYL CY

107 WSENL 111 WP9Y YC WSQNY CY

WP9QY YC WSQYL CY * peptídeos foram ciclizados com pontes cisteína dissulfureto ** WPl e WPl R foram derivados de um anticorpo anti-TNF-α (Di62, CDR1 L) e a sequência modelo é QSVSNDV.

As células U937 que expressam elevados níveis de TNF-R p55 foram incubadas com TNF-α com um sem peptídeos. A ligação de TNF-α às células foi quantificada por um anticorpo anti-TNF-R seguido de análise FACS. A figura 5 demonstra que enquanto se observou ligação significativa de anticorpo anti-receptor a células U937 houve uma redução de 60 70% desta ligação com o pré-tratamento das células com TNF-α. A adição do peptídeo WP9QY provocou o regresso da mancha anti-receptor para um nível semelhante ao obtido só com o anticorpo anti-receptor. Quando se realizou uma experiência semelhante numa análise de resposta à dose, o peptídeo WP9QY exibiu novamente a actividade inibidora mais forte em comparação com os peptídeos WP9Q e WP5JY (figura 6) . O peptídeo WP9QY inibiu a ligação TNF-α ao seu receptor celular com um IC50 a 7511M.

Adicionalmente, os peptídeos foram testados quanto à sua capacidade de inibir os efeitos biológicos induzidos por TNF-α em células L929 sensíveis ao TNF (Hennet et al., 1993, Biochem. J. 289:587-592). TNF-α induziu apoptose/citotoxicidade das células L929 e o peptídeo WP9QY protegeu quase 90% das células contra estes efeitos do TNF-α a uma concentração de 75 μΜ (figura 7) . O WP9Q revelou também actividade inibidora dependente da dose que correspondeu a cerca de metade dos efeitos de WP9QY.

Estudos anteriores revelaram que a linha de células fibroblástica 3T3-L1 sofre diferenciação em adipócitos em condições de cultura apropriadas e as células diferenciadas desenvolvem uma maior sensibilidade em relação à insulina (Garcia de Herreros et al., 1989, J., Biol. Chem. 264: 19994) . A resposta à estimulação com insulina nestas células pode ser convenientemente medida por fosforilação em tirosina do substrato-1 do receptor da insulina (IRS-1). Tem-se demonstrado que a adição de TNF-α diminui a fosforilação induzida por insulina deste substrato, sugerindo que TNF-α desempenha um papel na resistência à insulina induzida pela obesidade (Kanety et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:23780) . 61 0 peptídeo WP9QY foi ensaiado quanto à sua capacidade de inibir a resistência à insulina induzida por TNF-α. As células 3T3-L1 foram induzidas a diferenciarem-se em adipócitos, estimuladas com insulina e fosforilação Tyr de URS-1 foi analisada por imunoprecipitação dos extractos de célula cin anti-soro anti IRS-1 seguida de análise da mancha de Western com um anticorpo Tyr anti-fosforilado. A figura 8A revela que foi detectado IRS-1 fosforilado em células estimuladas com 100 nM de insulina. Em contraste, quando TNF-a (50 ng/ml) foi adicionado às células antes da insulina, a mesma banda IRS-1 não era detectável, confirmando que TNF-α inibiu a estimulação da insulina de fosforilação Tyr de IRS-1. No entanto, quando o peptídeo WP9QY foi pré-incubado com TNF-α antagonizou os efeitos de TNF-α de uma forma dependente da dose, tal como ficou provado pelo reaparecimento da banda IRS-1 fosforilada à medida que as concentrações do peptídeo aumentaram. A figura 8B demonstra que o IRS-1 estava presente em todas as amostras testadas.

Em conclusão, os peptídeos derivados de certas estruturas de alça de TNF-R inibem a ligação de TNF-α à superfície TNF-R da célula, indicando que estas alças correspondem a sítios de ligação do TNF-R aos seus ligandos. Os peptídeos antagonizam também os efeitos biológicos do TNF-α na prevenção da indução da apoptose/citotoxicidade e resistência à insulina em células alvo. É importante notar que o peptídeo mais eficaz é derivado da alça 1 do domínio 3 de TNF-R, o que pode representar um sítio de ligação crítico entre interacções TNF-R e TNF-α. A figura 9 apresenta um modelo a três-dimensões das interacções TNF-α (lado direito) e TNF-R 62 (lado esquerdo). A porção escurecida da estrutura em alça em TNF-R representa a localização da alça 1 do dominio 3. 0 âmbito da presente divulgação não deve ser limitado pelas concretizações exemplificadas que se destinam a ser meras ilustrações de aspectos individuais da divulgação e quaisquer sequências que seja funcionalmente equivalentes são incluídas no âmbito da divulgação. De facto, várias modificações, para além das aqui apresentadas e descritas, tornar-se-ão evidentes para os especialistas na técnica a partir da descrição anterior e figuras anexas.

LISTA DE SEQUÊNCIAS

(1) INFORMAÇÕES GERAIS (i) REQUERENTE: Greene, Mark I. Murali, Ramachandran Takasaki, Wataru

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: PEPTÍDEOS E ANÁLOGOS DE PEPTÍDEO

CONCEBIDOS A PARTIR DE SÍTIOS DE LIGAÇÃO DA SUPERFAMÍLIA DO

RECEPTOR DO FACTOR DA NECROSE DO TUMOR E SUAS UTILIZAÇÕES (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 27 (iv) ENDEREÇO POSTAL: (A) (B) (C) (D) (E) (F)

ENDEREÇO: Pennie & Edmonds LLP RUA: 1155 Avenue of the Américas CIDADE: New York

ESTADO: NI

PAÍS: EUA ZIP: 10036-2811 (v) FORMA DE LEITURA INFORMÁTICA: (A) (B) (C) (D) TIPO DE MEIO: Disquete COMPUTADOR: Compatível IBM SISTEMA OPERATIVO: DOS SOFTWARE: FastSEQ Versão 2.0 (vi) DADOS ACTUAIS DA APLICAÇÃO: (A) NÚMERO DA APLICAÇÃO: 08/866,545 (B) DATA DE ARQUIVO: 30 de Maio de 1997 (C) CLASSIFICAÇÃO: 63 (vii) DADOS ANTERIORES DA APLICAÇÃO: (A) NÚMERO DA APLICAÇÃO: (B) DATA DE ARQUIVO: (viii) INFORMAÇÃO ADVOGADO/AGENTE:

(A) NOME: Coruzzi, Laura A (B) NÚMERO DE REGISTO: 30,742 (C) NÚMERO REFERÊNCIA/CASO: 009113-0004-999 (ix) INFORMAÇÃO DE CONTACTO: (A) TELEFONE: 650-493-4935 (B) TELEFAX: 650-493-5556

(C) TELEX: 66141 PENNIE (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 74 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:l:

Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Aen His 1 5 10 15 Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Mefc Gly Gin 20 2S 30 vai Glu Ile Ser Ser cys Thr Vai ASp Arg Asp Thr vai Cys Gly Cys 35 40 45 Arg Lys Asn Gin Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gin Cys 50 55 60 Phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr 65 70 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 77 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 64 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2: Vâl Cys ÃSp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gin Leu Trp Asn Trp 1 5 10 15 Vai Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gin Vai 20 25 30 Glu Thr Gin Ala Cys Thr Arg Glu Gin ASÍJ Arg Ile Cys Thr Cys Arg 35 40 45 Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gin Glu Gly Cys Arg Leu Cys SO 55 60 Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala 65 70 75 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 77 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3:

Val Cys Ala Thr Cys Ala Glu Asn Ser Tyr Asn Glu Bis Trp Asn Tyr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Cys Gin Leu Cys Arg Pro Cys Asp Pro Val Met Gly Leu 20 25 30 Glu Glu Ile Ala Pro Çys Thr Ser Lys Arg Lys Thr Gin Cys Arg Cys 35 40 45 Gin Pro Gly Met Phe Cys Ala Ala Trp Ala Leu Glu Cys Thr Bis Cys 50 55 60 Glu Leu Leu Ser ASP cys Pro Pro Gly Thr Glu Ala Glu 65 70 75 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 76 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4: 65 cys Glu Pro Cys Leu ASp Ser Vai Thr Phe Ser Asp Vai Vai Ser Ala 1 5 10 15 Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Vai Gly Leu Gin Ser Met 20 25 30 Ser Ala Pro Cys Vai Glu Ala Asp Asp Ala Vai Cys Arg Cys Ala Tyr 35 40 AS Gly Tyr Tyr 01» Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Vai 50 55 €0 Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Vai Phe Ser Cys Gin 55 70 75 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 53 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5:

Gin Cys Asp Pro Cys He Pro Gly Vai Ser Phe Ser Pro Asp Sis Bis 15 10 15

Thr Arg Pro His Cys Glu Ser Cys Arg His Cys Asn Ser Gly Leu Leu 20 25 30

Vai Arg Abo cys Thr Xle Thr Ala Asn Ala Glu Cys Ala Cys Arg Asn 35 40 45

Gly Trp Gin Cys Arg 50 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 74 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:6:

Cys Arg Lyç Gin Cys Gin Pro Asp Tyr Tyr Leu Asp Gin Ala Asp Arg 1 5 10 15

Cys Thr Ala Cys Vai Thx Cys Ser Arg Asp Asp Leu Vai Glu Lys Thr 20 25 30

Pro Cys Ala Trp Asn Ser Ser Arg Vai Cys Glu Cys Arg Pro Gly Mefc 35 40 45

Phe Cys Ser Thr Ser Ala Vai Asn Ser Cys Ala Arg cys phe Phe His 50 55 SQ

Ser Vai Cys Pro Ala Gly Met lie Vai Lys 55 70 66 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 74 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7:

Cys Arg Lys Gin Cys glu Pr© Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Ala Gly Arg 1 5 10 15 Cys Thr Ala Cys val Ser Cys Ser Arg Asp Asp Leu Val Glu Lys Thr 20 25 30 Pro Cys Ala Trp Asn Ser Ser Arg Thr cys Glu Cys Arg Pr© Gly Mec 35 40 45 n* Cys Ala Thr Ser Ala Thr Asn Ser Cys Ala Arg Cys Val Pro Tyr 50 55 60 Pr© lie Cys Ala Ala Glu Thr Vai Thr Lys 65 70 (2) (i) (ii) INFORMAÇÃO DA SEQ ID NO:8: CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 75 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:8: Leu Pro Cys Gly Glu Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg 5 10 15 His Cys His Gin His Lys Tyr Cys Asp Pro Asn. Leu Gly Leu 20 25 30 Gin Gin Lys Gly Thr Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys 35 40 45 Gly Trp His Cys Thr Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu 55 60 Ser Cys Ser Pro Gly Phe Gly Val Lys 70 75 (xi)

Glu Cys 1

Glu Thr

Arg Vai

Glu Glu 50

His Arg 65 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 34 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples 67 (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:9:

Asp Cys Vai Pro Cys ãln Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His 1 S 10 15

Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His Gly 20 25 30

Leu Gl« (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID NO:10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 56 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:10:

Cys Arg Rro Cys Gly Pro Gly Phe Tyx Asn Asp Vai vai Ser Ser Lys 1 5 10 15

Pro Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg 20 25 30

Lys Gin Leu Cys Thr Alá Thr Gin Asp Thr Vai Cys Arg Cys Arg Ala 35 40 45

50 55 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID NO:11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 69 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO

Gly Thr Gin Pro Leu Asp Ser Tyr 68 68 Cys Ser Pro Cys Pro Pro Aon Ser Phe Ser Ser Ale Gly Gly Gin Arg 1 5 10 15 Thr Cys Asp lie Cys Arg Gin Cys LyS Gly Vai Phe Arg Thr Arg Lys 20 25 30 Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ale Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe 35 40 45 His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gin Asp Cys Lys Gin 50 S5 60 Gly Gin Glu Leu Thr 65 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID NO:12: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:12:

Tyr Cys Glu Leu Ser Gin Tyr Leu Cys Tyr* 15 10 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID NO:13: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:13:

Tyr Cys Trp Ser Gin Âsn Leu Cys Tyr 1 5 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID NO:14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum 69 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:14 1 S (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID NO:15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:15:

Tyr Cys Trp Ser Gin hsn Tyr Cys Tyr

Tyr Cys trp Ser Gin Tyr l*eu Cys Tyr 1 5 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID NO:16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:16:

Tyr Cys Phe Thr Ala Ser Glu Asn Ris Cys Tyr 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID NO:17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:17:

Tyr Cys Pàe Thr Mn Ser Glu Asn His Cys Tyr 1 S iõ (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID NO:18: 70 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:18:

Tyr Cys Phe Thr ftrg Ser Glu Asn His Cys Tyr 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID NO:19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:19

Phe Cys Ala Ser Glu Âsn His Cys Tyr 1 5 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID NO:20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:20

Tyr Cys Ala Ser Glu Asn His Cys Tyr 1 s (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID NO:21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples 71 (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:21:

Phe tCys Asn Ser Glu Asa. His Cys 3Tyr X 5 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID NO:22: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:22:

Phe Cys Asn Ser Glu Asu Arg Cys Tyr 1 s (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID NO:23: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:23:

Phe Cys hsn Ser Vai Glu Asn Ârg Cys Tyr 1 S 10 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID NO:24: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:24: 72

Tyr θ'/s Arçj Lys Glu Leu GXy Gin Vai Cys Tyr 1 S 10 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID NO:25: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:25:

Lys Glu Pro Gly Gin Cys Tyr (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID NO:26: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:26:

Tyr Cys Arg Lye Glu Mefc Gly Cys Tyr (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID NO:27: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:27: í>he Cys Arg Lys Glu Met Gly Cys Tyr X 5

LISTA DE SEQUÊNCIAS

<110> CURADORES DA UNIVERSIDADE DA PENSILVÂNIA 73 receptor do factor <120> análogos de peptídeo derivados do da necrose do tumor <130> P023476EP <140> EP 98923839.9 <141> 1998-05-29 <150> US 08/866545 <151> 1997-05-30 < 16 0 > 30 <17 0> SeqWin99, versão 1.02 <210> 1 <211> 74 <212> PRT <213> Homo sapiens <40G> 1

Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His

1 5 10 iS

Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Glu 20 25 30

Vai Glu I.le Ser Ser Cys Thr Vai Asp Arg Asp Thr Vai Cys Gly Cys 35 40 45

Arg Lys Asn Gin Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Aso Leu Phe Gin Cys 50 55 60

Phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr 65 70 <210> 2 <211> 77 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Vai Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gin Lôu Trp Asn Trp 1-5 10 IS

Vai Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gin. Vai 20 25 30

Glu Thr Gin Ala Cys Thr Arg Glu Gin Asn Arg Ile Cys Thr Cys àrg 35 40 4S

Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gin Glu Gly Cys Arg Leu Cys 50 55 60

Ala Prô Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Vai Ala ÊS 70 15 74 <210> 3 <211 > 77 <212> PRT < 213 > 3 Homo sapiens Vai Cys Ala Thr Cys Ala Glu Asn Ser Tyr Asn Glu His Trp Asn Tyr X 5 10 15 Leu Thr Ile Cys Gin Leu Cys Arg Pro Cys Asp Pro Vai fitefc Gly Leu 20 25 30 Glu Glu Ile Ala Pro· Cys Thr Ser Lys Arg Lys Thr Gin Cys Arg Cys 35 40 45 Gin pro Gly Mer Phe Cys Ala Ala Trp Ala Leu Glu Cys Thr His Cys 50 55 50 Glu Leu Leu Ser Asp Cys Pro Pro Gly Thr Glu Ala Glu 6$ 70 75 < 210 > 4 <211> 76 < 212 > PRT <213> ‘4 Homo sapiens Cys Glu Pro Cys Lee Asp Ser Vai Thr Phe Ser Asp Vai Vai Ser Ala 1 5 10 15 Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Vai Gly Leu Gin Ser Het 20 25 30 Ser Ala Pro Cys Vai Glu Ala Asp Asp Ala Vai Cys Arg Cys Ala Tyr 35 40 45 Gly Tyr Tyr Gin Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Vai 50 55 €0 Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Vai Phe Ser Cys Gin 63 70 7S <210> 5 <211> 53 <212> PRT <213> Homo sapiens 75 <400>5

Gin Cys ASf> Pro Cys He Pro Gly Vai Ser Phe Ser pro Asp hís hís J 5 10 15

Thr Arg Pro His Cys Glu Ser Cys Arg His Cys Asn Ser Gly Leu Leu 20 25 jg

Vai Arg Asn Cys Thr He Thr Ala Asn Ala Glu Cys Ala Cys Arg Asn 35 40 45

Gly Trp Gin Cys Arg 50 < 210 > 6 <211> 74 < 212 > PRT <213> Homo sapiens <4Q0>6

Cys Arg Lys Gin Cys Glu Pro Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Ala Asp Arg 15 10 15

Cys Thr Ala Cys Vai Thr Cys Ser Arg Asp Aso Leu Vai Glu Lys Thr 20 25 30

Pro Cys Ala Trp Asn Ser Ser Arg Vai Cys Glu Cys Arg Pro Gly Mec 35 40 45

Phe Cys Ser Thr Ser Ala Vai Asn Ser Cys Ala Arg Cys Phe Phe His 50 55 «0

Ser Vai Cys Pro Ala Gly Met Ha Vai Lys 65 70 <210> 7 <211> 74

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7

Cys Arg Cys Gin Cys Glu Pro Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Ala Gly Arg 15 10 15

Cys Thr Ala Cys Vai Ser Cys Ser Arg Asp Asp Leu Vai Glu Lys Thr 20 25 30

Pro Cys Ala Trp Asn. Ser Ser Arg Thr Cys Glu Cys Arg Pro Gly Met 35 40 45

He Cys Ala Thr Ser Ala Thr Asn Ser Cys Ala Arg Cys Vai Pro Tyz ' · 50 55· · 60

Pro He Cys Ala Ala Glu Thr Vãl Thr Lys 65 70 76 76 <210> 8 <211> 75 <212> PRT <213> . O Homo sapiens

Glu Cys leu Pro cys Gly Glu Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asa Arg 15 10 15

Glu Thr His Cys His Gin His Lys Tyr Cys Asp Pro Asn teu Gly teu 20 25 3D

Arg Vai Gin Gin Lys Gly Thr Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys 35 40 45

Glu Glu Gly Trp Hís Cys Thr Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Vai teu 50 55 60 Hís Arg Ser Cys Sçr Pro Gly Phe Gly Vai Lys 65 70 75 < 210 > 9 <211> 34

<212> PRT <213> Homo sapiens <4Q0>9

Asp Cys Vai Pro Cys Sln Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His 15 10 15

Phe Ser Ser Lys Cys Are Arg 20

Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His Gly 25 30

Leu Glu < 210 > 10 <211> 56

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10

Cys Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Vai vai Ser Ser Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Pro Cys Thr Trp cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg 20 25 30 Lys Gin Leu Cys Thr Ala Thr Gin Asp Thr Vai Cys Arg Cys Arg Ala 35 40 45 Gly Thr Gin Pro Leu Asp Ser Tyr 50 55 77 <210> 11 <211> 69

<212> PRT <213> Homo sapiens <4S0> 11

Cys Ser pro cys Pro Pro Asa Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gin Arg l 5 10 15 Thr Cys Así> 11© Cys Arg Gltx Cys Lys Gly Vai Phe Arg Thr Arg Lys 20 25 30 Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ale Glu cys ASp cys ffcr PXQ Gly Phe 35 40 45 Hi3 Cys Leu Gly Ala Giy Cys Ser Met Cys Glu Gin Asp Cys Lys Gin SÓ S5 60 Gly Gin Glu Leu Thr

6S

<210> 12 < 211> 10 < 212 > PRT <213> Sequência artificial <2 2 0> <223> Peptídeo sintético <400> 12

Leu cys Tyr 10

Tyr Cys Glu Leu Ser Qln l 5

<210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Peptídeo sintético <400> 13

Tyr Cys Trp Ser Gin Mn Leu Cys Tyr 1 $

<210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Peptídeo sintético 78 <40Ο> 14

Tyr Cys Trp Ser Gla Asn Tyr Cys Tyr 1 S <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> <220> Sequência artificial <223> Peptideo sintético <4QÕ> 15

Tyr Cys Trp Ser Gin Tyr Seu Cys Tyr l 5 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> <2 2 0 > Sequência artificial <223> Peptideo sintético

Tyr Cys Tfce Thr Ala Ser Glu Asn His Cys Tyr 15 10

<210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Peptideo sintético <400> 17

Tyr Cys Phe Thr Asn Ser Glu Asn His Cys Tyr 1 5 10

< 210 > 18 <211> 11 < 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Peptideo sintético 79 <4QD> 18

Tyr Cys Fhe Thr Arg Ser Glu Asn His Cys Tyr 1 5 10

<210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Peptideo sintético <400> 19

Phe Cys Ala Ser Clu Asn His Cys Tyr 1 S

<210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Peptideo sintético <'400> 20

Tyr Cys Ala Ser Glu Asn His Cys Tyr 1 5

<210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Peptideo sintético *!400> 21

Phe Cys Asn Ser Glu Asn His Cys Tyr

<210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220>

Peptideo sintético <223> 80 <400> 22

Pfce cys Asn ser siu hm Arg Cys Tyr 1 5

<210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Peptídeo sintético <400 > 23 phe Cys Asn Ser Vai Giu Aso Arg Cys ΤΥ1" 1 5 i0

<210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Peptídeo sintético <4Q0> 24

Tyr cys Arg Lys Glu Leu Gly Gin vai cys Tyr 1 5 10

<210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Peptídeo sintético <40B:> 25

Tyr Cys Lys Glu pro Gly Oln Cys Tyr 1 5

<210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Peptídeo sintético <4Q0> 26

Tyr Cys Arg Lys Glu Mét Gly Cy® Tyr 1 5 81 <210> 27

<211> 9 < 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Peptídeo sintético <400> 27

Phe Cys Arg Lys Glu Met Giy Cys Tyr

<210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Peptídeo sintético WPl <220> <223> Sequência de peptídeo derivada de um anticorpo anti TNF-alfa (Di62, CDRlL) •"•400: > 28 fyr Cys Ser Gin Ser Vai Ser Aso Asp Cys Phe 15 10

<210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Peptídeo sintético WPl R <220> <223> Sequência de peptídeo derivada de um anticorpo anti TNF-alfa (Di62, CDRlL) <400> 23

Phe Cys Vai Ser Ssn Asp Arg Cys Tyr 1 5

<210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <220>

Sequência modelo <223> <220> 82 <223> Sequência do sítio de ligação TNF-alfa de um anticorpo anti-TNF-alfa (Di62, CDR1L) . <4Q0> 30'

Gin Ser Vai Ser Asn Asp Vai 1 5

LISTA DE SEQUÊNCIAS

<110> CURADORES DA UNIVERSIDADE DA PENSILVÂNIA < 120> análogos de peptídeo derivados do receptor do factor da necrose do tumor

<13 0 > P023476EP <140> EP 98923839.9 <141> 1998-05-29 <150> US 08/866545 <151> 1997-05-30 <16 0 > 30 <170> SeqWin99, versão 1.02 <210> 1 <211> 74

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Asp GyS Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn Hls 15 10 15

Leu Arg Hi3 Cys Leu Ser cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Ket Gly Gin 20 25 30

Vai Glu ile Ser Ser Cys Thr Vai Asp Arg Asp Thr Vai Cys Gly Cys 35 40 45

Arg Lys Asn Gin Tyr Arg His Tyr Trp Ser Giu Asn Leu Phe Gin Cys 50 55 60 phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr 65 ?0 <210> 2 <211> 77

<212> PRT <213> Homo sapiens 83 <400> 2

Vai Cys Asp Ser Cys Glu Asp ser Thr Tyr Thr Gin Leu Trp Asa Trp 1 5 10 15 Vai Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gin vai 20 25 20 Glu Thr Gin Ala cys Thr Axg Glu Gin Asn Arg lie Cys Thr Cys Arg 55 40 45 Pro Gly T3φ Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gin Glu Gly Cys Arg Leu Cys 50 55 60 Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Vai Ala 65 70 75 <210 > 3 < 211> 77 <212> PRT <213> Homo sapiens

Vai Cys Ala Thr Cys Ala Glu Asn Ser Tyr Asn Glu HiS Trp Asa Tyr 1 5 10 15 Leu Thr ll© Cys Gin Leu Cys Arg Pro Cys Asp Pro Vai Met Gly Leu 20 25 30 Glu Glu Xle Ala Pro Cys Thr Ser Lys Arg Lys Thr Gin Cys Arg Cys 35 40 45 Gin Pro Gly Mel Phe Cys Ala Ala Trp Ala Leu Glu Cys Thr «is Cys 50 55 50 Glu Leu Leu Ser Asp Cys Pro Pro Gly Thr Glu Ala Glu &5 70 75 < 210 > 4 <211> 76 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 4 84

Cys Glu Pro Cys Leu Asp Ser Vai Thr Phe Ser Asp Vai Vai Ser Ala 1 5 1.0 15

Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Vai Gly Leu Gin Ser Met 20 25 30

Ser Ala Pro Cys VaX Glu Ala Asp Asp Ala Vai Cys Arg Cys Ala Tyr 35 40 45

Gly Tyr Tyr Gin Asp Glu Thr Thr Gly Arg cys Glu Ala Cys Arg Vai 50 55 60

Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Vai Phe Ser Cys Gin 65 70 75 <210> 5 <211> 53 <212> PRT <213> 5-5 Homo sapiens Gin Cys Asp Pro Cys Ile Pro Gly Vai Ser Phe Ser Pro Asp His His 1 5 i 10 15 Thr Arg Pro His Cys Glu Sex Cys Arg His Cys Asn Ser Gly Leu Leu 20 25 30 Vai Arg Asn Cys Thr Ile Thr Ala Asn Ala Glu Cys Ala Cys Arg Asn 15 40 45 Gly Trp Gin Cys Arg 50 <210 > 6 <211 > 74 <212> PRT <213> Homo sapiens •4CC>6

Cys Arg Lys Gin Cys Glu Pro ASp Tyr Tyr Leu ASp Glu Ala Asp Arg 1 5 10 15 Cys Thr Ala Cys Vai Thr Cys Ser Arg Asp ASP Leu Val Glu Lys Thr 20 25 30 Pro Cys Ala Trp Asn Ser Ser Arg val Cys Glu Cys Arg Pro Gly Met 35 40 45 Phe Cys Ser Thr Ser Ala vai Asn Ser Çys Ala Arg Cys Phe Phe His 50 55 60 Ser Vai Cys Pro Ala Gly Met Ile Val Lys 65 70 85 < 210 > 7 <211> 74

<212> PRT <213> Homo sapiens <400 > 7

Cys Arg Lys Gin Cys Glu Pro Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Ala Gly Arg 1 5 10 15 Cys Thr Ala Cys Vai Ser Çys Ser Arg ASp ASp Leu Vai Glu Lys Thr 20 25 30 Pro Cys Ala Trp Asn. Ser Ser Arg Thr Cys Glu Cys Arg Pro Gly Met 35 40 45 Xle cys Ala Thr Ser Ala Thr Asn Ser Cys Ala Arg Cys Vai Prp Tyr 50 55 ' ' 60 ‘ '· Pro Ile Cys Ala Ala Glu Thr Vai Thr Lys 65 70 < 210 > 8 < 211> 75

< 212 > PRT <213> Homo sapiens <4Q0> 8

Glu Cys Leu Pro Çys Gly Glu Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg X S 10 15

Glu Thr Hís Cys His Gin His Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu 20 25 30

Arg Vai Gin Gin Lys Gly Thr Ser Glu Thr Asp Thr lie Cys Thr Cys 35 40 45

Glu Glu Gly Trp His Cys Thr Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Vai Leu 50 55 60

His Arg Ser Cys Ser Pro Gly Phe Gly Vai Lys «5 70 75 <210> 9 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <4Q0> 9

Asp tys 1 Phe Ser

Vai Pro Cys Gin Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His 5 10 15

Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His Gly 20 25 30

Leu Glv <210> 10 <211> 56.

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10

Cys Arg Pro Cys Gly Pco Gly Phe Tyr Asn Asp V&l Vãl Ser ser Lys 1 S 10 15

Pro Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg 20 25 30

Lys Gin Leu Cys Thr Ala Thr Gin Asp Thr Vai Cys Arg Cys Arg Ala 35 40 45

Gly Thr Gin Pro Leu Asp Ser Tyx 50 55 <210> 11 <211> 69 < 212 > PRT <213> Homo sapiens <4D0> 11

Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gin Arg 1 5 10 15 Thr Cys Asp ile Cys Arg Gin Cys Lys Gly Vai Phe Arg Thx Arg Lys 20 25 30 Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys ASp Cys Thr Pro Giy Phe 35 40 45 His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Hefc Cys Glu Gin Asp Cys Lys Gin 50 55 50 Gly Gin Glu Leu Thr 55

<210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial 87 < 2 2 Ο > <223> Peptídeo sintético <400> 12

Tyr- Cys Glu Leu Ser Gin Tyr Leu Cys Tyr 1 5 10

<210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Peptídeo sintético <400> 13

Tyr Cys Trp Ser Gin Asn Leu Cys Tyr 1 5

<210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <2 2 0 > <223> Peptídeo sintético <400> 14

Tyr çys Trp Ser Gin Mn Tyr Cys Tyr 1 5

<210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Peptídeo sintético

Tyr Cys Trp Ser Gin Tyr Leu Cys Tyr 1 5

<210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <220>

Peptídeo sintético <223> 88 <4Q0> 16

Tyr Cys Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Cys Tyr 15 10 < 210 > 17 <211 > 11 < 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Peptideo sintético <400> 17

Tyr Cys Pt» Thr Asn Ser Glu hsn His Cys tyr 1 5 10 < 210 > 18 <211> 11

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Peptideo sintético <400> 18

Tyr Cys Phe Thr hxg Ser Glu Asn His Cys tyr 1 5 10 < 210 > 19 <211> 9

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Peptideo sintético '· 400> 19

Phs Cys Ala Ser Glu Am His C^s tyr 1 s < 210 > 20 <211> 9

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Peptideo sintético 89 <40G> 20

Tyr Cys Ala Ser Glu Asn His Cys Tyr 1 5

<210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Peptideo sintético 400> 21

Phô CyS Asa Ser Qlu Am His Cys Tyr 1 5

<210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Peptideo sintético <400> 22 phe Cys Asn Ser Glu Asn Arg Cys Tyr 1 5

<210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Peptideo sintético <4Q0> 23 phe Cys Asn Ser Vai Glu Asn Arg Cys Tyr 1 S 10

<210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Peptideo sintético <400> 24

Tyr Cys Arg Lys Glu Leu Gly Gin VaX Cys Tyr i 5 10 90

<210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Peptideo sintético <400> 25

Tyr Cys Lys Glu Pro Gly Gin Cys Tyx 1 5

<210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Peptideo sintético <400> 26

Tyr Cys Arg Lys fílu Met Gly Cys Tyr 1 s

<210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Peptideo sintético <400> 27 fhe Cys Arg Lys Glu Met Gly Cys Tyr 1 ^

<210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Peptideo sintético WP1 <220> <223> Sequência de peptideo derivada de um anticorpo anti-TNF-alfa (Di62, CDR1L)

Tyr Cys Ser Gin Ser Vai S#r Asa A§p Cy.$ Fhe 1 5 10 91

<210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Peptideo sintético WP1 R <220> <223> Sequência de peptideo derivada de um anticorpo anti-TNF-alfa (Di62, CDR1L) <400> 29

Phe Cys Vai Ser Asn Asp Arg Cys tyr 1 5

<210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência modelo <2 2 0 > <223> Sequência do sítio de ligação TNF-alfa de um anticorpo anti-TNF-alfa (Di62, CDR1L) . <4Q0> 30

Gin Ser Vai Ser hm Asp Vai i $

LISTA DE SEQUÊNCIAS

<110> CURADORES DA UNIVERSIDADE DA PENSILVÂNIA <120> análogos de peptideo derivados do receptor do factor da necrose do tumor <130> P023476EP <140> EP 98923839.9 <141> 1998-05-29 <150> US 08/866545 <151> 1997-05-30 <160> 30 <170> SeqWin99, ver <210> 1 <211> 74 92

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His 1 5 10 15 Leu Arg Hls cys Leu Ser Cys ser Lys Cys Arg Lys Glu Mac Gly Gin 20 25 30 Vai Glu xie Ser Ser Cys Thr Vai ASp Arg Asp Thr Vai Cys Gly Cys 35 40 45 Arg Lys Asn Gin Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gin cys 50 55 60 Phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr 65 70 <210> 2 <211> 77 <212> PRT <213> * 7 Homo sapiens Vai Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr tyr Thr Gin Leu Trp Asn Trp 1 5 10 15 vai Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gin Vai 20 25 30 Glu Thr Gin Ala Cys Thr Arg Glu Glu Asn Axg rie Cys Thr Cys Arg 35 40 45 Pro Gly Trp Tyr SO Cys Ala Leu Ser Lys Gin Glu Gly cys Arg Leu Cys 55 60 Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Fhe Gly Vai Ala 65 70 75 < 210 > 3 <211> 77 <212> PRT <213> Homo sapiens 93 <4Q0>3

Vai Cys Ala Thr Cys Ala Glu ftsn Ser Tyr Asm, Glu His Trp Asn Tyr 1 5 10 15 Leu Thr lie Cys Gin Leu Cys Arg Pro Cys Asp Pro Vai Met Gly Leu 20 25 30 Glu Glu Ile Ala Pro Cys Thr Ser lys Arg Lys Thr Gin Cys ArSf Cys 35 40 45 Gin Pro Gly Ket Phe Cys Ala Ala Trp Ala Leu Glu Cys Thr HiS Cys 50 55 60 Glu Leu Leu Ser Asp Cys Pro Pm Gly Thr Glu Ala Glu 6S ?0 75 <210> 4 <211> 76

<212> PRT <213> Homo sapiens <4Q0> 4

Cys Glu Pro 1 Thr Glu Pro

Cys Leu Asp Ser Vai Thr Phe Ser Asp Vai Vai Ser Ala 5 10 15

Cys cys Pro Cys Thr Glu Cys Vai Gly Leu Gin Ser Met 20 25 30

Sar Ala Pm 35 Gly Tyr Tyr 50 Cys Glu Ala 65 <210> 5 <211> 53 <212> PRT <213> Homo sapiens

Cys Vai Glu Ala Asp Asp Ala Vai Cys Arg Cys Ala Tyr 40 45

Gin Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Vai 55 60

Gly Sar Gly Leu Vai Phe Ser Cys Gin 94 4Q0> 5

Gin Cys Asp Prc> Cys Xle Pro Giy Vai Ser Phe Ser Pro Asp Hís His 1 S 10 .15

Thr Arg Fro His Cys Glu Ser Cys Arg His Cys Asn Ser Giy Leu Leu 20 25 30

Vai Arg Asn Cys Thr ne rhr Ala asa Ala Glu Cys Ala Cys Arg ftsn 35 40 45

Giy Trp Gin Cys Arg 50 <210> 6 <211> 74

<212>. PRT <213> Homo sapiens <400> 6

Cys Arg Lys Gin Cys Glu Pro Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Ala Asp Arg 15 10 15

Cys Thr Ala Cys vai Thr Cys Ser Arg Asp Asp Leu Vai Glu Lys Thr 20 25 30

Pro Cys Ala Trp Asn Ser Ser Arg Vai cys Glu Cys Arg Pro Giy Het 35 40 45

Phe Cys Ser Thr Ser Ala Vai Asn Ser Cys Ala Arg Cys Phe Phe His 50 55 60

Ser Vai Cys Pro Ala Giy Met Ile Vai Lys 65 70 <210> 7 <211> 74

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7

Cys Arg Lys Gla cys Glu Pro Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Ala Giy Arg 1 5 10 15 Cys Thr Ala Cys Vai Ser Cys Ser Arg ASP Asp Leu Val Glu Lys Thr 20 25 30 Pro Cys Ala Trp Asn Ser Ser Arg Thr Cys Glu Cys Arg Pro <siy Het 35 40 45 Ile Cys Ala Thr Ser Ala Thr Asn Ser Cys Ala Arg Cys val pro Tyr 50 5:5 ' 60 Pro Ile Cys Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys S5 70 95 95 <210> 8 <211> 75 <212> PRT <213> P Homo sapiens

Glu Cys Leu Pro CyS 1 5 Glu Thr Hi$ Cys His 20 Arg Vai Gin. Gin Lys 35

Glu Glu Gly Trp His 50

Gly Glu Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg 10 15

Gin His Lys Tyr Cys Aep Pro Asn Leu Gly Leu 25 30

Gly Thr Ser Glu Thr Asp Thr Xlâ Cys Thr Cys 40 45

Cys Thr Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Vai Leu 55 60

His Arg Ser Cys Ser 65 <210> 9 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens

Pro Gly Phe Gly Vai Lys <49G>9

Asp Cys Vai Pro Cys Gin Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His 1 5 10 15

Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His Gly 20 25 30

Leu Glu <210> 10 <211> 56 <212> PRT <213> }'J! Homo sapiens

Cys Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Vai vai Ser Ser Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg 20 25 30 Lys Gin Leu Cys Thr Ala Thr Gin ASp Thr Vai Cys Arg Cys Arg Ala 35 40 45 Gly Thr Gin Pro Leu Asp Ser Tyr 50 55 <210> 11 <211> 69 96

<212> PRT <213> Homo sapiens

Cys Ser Pro Cys Pro Pro Am Ser Phe Ser Ser Ala Gly siy Arg 15 10 1,5

Thr Cys Asp lie Cys Arg Gin Cys Lys Gly Vai Phe Arg T&r Arg Lys 20 25 30

Glvt Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe 35 40 45

Kis Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Mec Cys Glu Gin Asp Cys Lys Gin 50 55 50

Gly Gin Glu Leu Thr 65

<210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Peptideo sintético <400> 12

Tyr Cys Glu Leu Ser Gin, Tyr Leu Cys Tyr 15 10 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Peptideo sintético <40Q> 13

Tyr Cys Trp Ser Gin Asn Leu Cys Tyr 1 5 <210> 14

<211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220>

Peptideo sintético <223> 97 <4O0> 14 Tyr Cys Trp Ser Gin Asa Tyr Cys Tyr 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Peptídeo sintético <400 15 Tyr Cys Trp Ser Gin lyr Leu Cys Tyr 1 5 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> <220> Sequência Artificial <223> Peptídeo sintético <4G0> 16

Tyr Cys Phe Thr Ala Ser Slu Asn His Cys Tyr 15 XO <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Peptídeo sintético <4Q0> 17

Tyr Cys Phe Thr Asn Ser Glu Asn His Cys Tyr 15 iõ <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Peptídeo sintético Ί8 <210> 19

Tyr Cys Phe Thr Arg Ser Gin Aso His cys Tyr 1 S 10 98 <211> 9 <212> PRT < 213 > Sequência Artificial <220> <223> 40D > 19 Peptideo sintético

Phe Cys Ala Ser Glu Asn Sis Cys Tyr l S <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Peptideo sintético <400> 20

Tyr Cys Ala Ser Glu Asn 1 S ffis Cys Tyr <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> <220> Sequência Artificial <223> <'40D> 21 Peptideo sintético Phc Cys Asn Ser Glu Asn Kis 1 5 Cys Tyr <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Peptideo sintético <400> 22 Phe Cys Asn Ser Glu Asn Ar 1 5 g Cys Tyr <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> <220> Sequência Artificial 10 99 <223> Peptídeo sintético >23 Phe Cys Aân Ser Vai Glu Asn Arg Cys ’ 1 5 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Peptídeo sintético <400> 24 Tyr Cys Arg Lys Glu Leu Gly Gin Vai Cys Tyr 1 5 10 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> > 25 Peptídeo sintético Tyr Cys Lys Glu Pro Gly Gin Cys Tyr l' 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Peptídeo sintético <400> 26 Tyr Cys Arg Lys Glu Met Gly Cys Tyr 1 S <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Peptídeo sintético <40Q> 27

Phe Cys Axg Lys Glu Met Gly Cys Tyr 1 5 100

<210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> WP1 Peptideo sintético <2 2 0 > <223> Sequência de peptideo derivada de um anticorpo anti-TNF-alfa (Di62, CDR1L) <400> 28

Tyr Cys Ser Gin Ser Vai Ser Asn Asp Cys Phe 1 S 10

< 210 > 29 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Peptideo sintético WP1 R <220> <223> Sequência de peptideo derivada de um anticorpo anti-TNF-alfa (DÍ62, CDR1L) <400> 29

Phe cys Vai Ser Asn Asp Argr Cys Tyr 1 5

<210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência modelo <220> <223> Sequência do sitio de ligação TNF-alfa de um anticorpo anti-TNF-alfa (Di62, CDR1L) . <400> 30

Gin Ser Vai ser Asn Asp Vai 1 5

Lisboa, 13 de Março de 2007

Claims (13)

1 REIVINDICAÇÕES Composto com a fórmula: Bi=Z2=Xj—X, \ Xe _ / Bjo-Z9=Xa—X7 em que: Bi e Bio são cada um independentemente do outro, um peptídeo de 1 a 3 aminoácidos, pelo menos um dos quais é um aminoácido aromático; Z2 e Zg são cada um independentemente do outro, um aminoácido tipo Cys; X3 está ausente ou é um aminoácido ácido; X4 é um aminoácido aromático ou apoiar; X5 é um aminoácido polar; Χε é um aminoácido polar; X7 é um aminoácido aromático ou polar; Xs é um aminoácido aromático, apoiar ou polar seleccionado; " é uma ligação amida; "= " é uma ligação dissulfureto e "=' é uma ligação amida.

2. Composto da reivindicação 1, em que: BI e BIO são cada um independentemente do outro Tyr ou Phe; Z2 e Z9 são cada um Cys; X3 está ausente o Glu; X4 é Trp ou Leu; X5 é Ser; Χε é Gin; X7 é Tyr ou Asn; Xs é Tyr ou Leu; " é uma ligação amida; 2 "= " é uma ligação dissulfureto e "=" é uma ligação amida.

3. Composto da reivindicação 2 em que o composto mencionado é seleccionado do grupo constituído por: Tyr-Cys-Glu-Leu-Ser-Gln-Tyr-Leu-Cys-Tyr (WP9ELY, SEQ ID NO: 12) ; Tyr-Cys-Trp-Ser-Gln-Asn-Leu-Cys-Tyr (WP9Q, SEQ ID N0:13); Tyr-Cys-Trp-Ser-Gln-Asn-Tyr-Cys-Tyr (WP9Y, SEQ ID N0:14); e Tyr-Cys-Trp-Ser-Gln-Tyr-Leu-Cys-Tyr (WP9QY, SEQ ID NO:15).

4. Composto com a fórmula: Ιΐ2=Χη—Xh f ?17 Bjj——X|» em que: Bn e B22 são cada um independentemente do outro, um peptídeo de 1 a 3 aminoácidos, pelo menos um dos quais é um aminoácido aromático; Zi2 e Z2i são cada um independentemente do outro, um aminoácido tipo Cys; Xi3 está ausente ou é um aminoácido aromático; Xi4 está ausente ou é um aminoácido polar; Xis é um aminoácido básico, polar ou apoiar; Xi6 é um aminoácido polar; Xi7 está ausente ou é um aminoácido apoiar; Xis é um aminoácido ácido; Xig é um aminoácido polar; X20 é um aminoácido básico; " é uma ligação amida; 3 "= " é uma ligação dissulfureto e "=" é uma ligação amida.

5. Composto da reivindicação 4, em que: Bll e B22 são cada um independentemente do outro Tyr ou Phe; Z12 e Z2i são cada um Cys; Xl3 está ausente ou é Phe; Xl4 está ausente ou é Thr; Xl5 é Ala, Asn ou . Arg; Xl6 é Ser; Xl7 está ausente ou é Vai; Xl8 é Glu; Xl9 é Asn; X20 é Arg ou His; " é uma ligação amida; "= " é uma ligação dissulfureto e "=" é uma ligação amida.

6. Composto da reivindicação 5 em que o composto mencionado é seleccionado do grupo constituído por: Tyr-Cys-Phe-Thr-Ala-Ser-Glu-Asn-His-Cys-Tyr (WP5, SEQ ID NO: 16); Tyr-Cys-Phe-Thr-Asn-Ser-Glu-Asn-His-Cys-Tyr (WP5N, SEQ ID NO:17); Tyr-Cys-Phe-Thr-Arg-Ser-Glu-Asn-His-Cys-Tyr (WP5R, SEQ ID NO:18); Phe-Cys-Ala-Ser-Glu-Asn-His-Cys-Tyr (WP5J, SEQ IDN0:19); Tyr-Cys-Ala-Ser-Glu-Asn-His-Cys-Tyr (WP5JY, SEQ ID NO:20); Phe-Cys-Asn-Ser-Glu-Asn-His-Cys-Tyr (WP5JN, SEQ ID N0:21); Phe-Cys-Asn-Ser-Glu-Asn-Arg-Cys-Tyr (WP5JR, SEQIDNO:22); e Phe-Cys-Asn-Ser-Val-Glu-Asn-Arg-Cys-Tyr (WP5VR, SEQ ID NO:23). 4

7. Composto com a fórmula: B23-^=^25-X26 X27 X28 X29 _ _ / B33-Z32=X3j X30 em que: B23 e B33 são cada um independentemente do outro, um peptídeo de 1 a 3 aminoácidos, pelo menos um dos quais é um aminoácido aromático; Z24 e Z32 são cada um independentemente do outro, um aminoácido tipo Cys; X25 está ausente ou é um aminoácido básico; X26 é um aminoácido básico; X27 é um aminoácido ácido; X28 é um aminoácido apoiar; X29 é um aminoácido apoiar; X30 está ausente ou é um aminoácido polar; X31 está ausente ou é um aminoácido apoiar; " é uma ligação amida; "= " é uma ligação dissulfureto e "=" é uma ligação amida.

8. Composto da reivindicação 7, em que: B23 e B33 são cada um independentemente do outro Tyr ou Phe; Z24 e Z32 são cada um Cys; X25 está ausente ou é Arg; X26 é Lys; X27 é Glu; X28 é Leu, Pró ou Met; X29 é Gly; X30 está ausente ou é Gin; 5 X3i está ausente ou é Vai; " é uma ligação amida; "= " é uma ligação dissulfureto e "=" é uma ligação amida.

9. Composto da reivindicação 8 em que o composto mencionado é seleccionado do grupo constituído por: Tyr-Cys-Arg-Lys-Glu-Leu-Gly-Gln-Val-Cys-Tyr (WP8L; SEQ ID NO:24); Tyr-Cys-Lys-Glu-Pro-Gly-Gln-Cys-Tyr (WP8JP, SEQIDNO:25); Tyr-Cys-Arg-Lys-Glu-Met-Gly-Cys-Tyr (WP8J, SEQIDNO:26); e Phe-Cys-Arg-Lys-Glu-Met-Gly-Cys-Tyr (WP8JF, SEQ ID NO:27).

10. Composição farmacêutica que inclui o composto de qualquer uma das reivindicações precedentes e um veículo excipiente farmacêutico ou um excipiente.

11. Composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 9 para utilização em terapia.

12. Utilização do composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 9 no fabrico de um medicamento para o tratamento de um estado patológico associado a TNF, seleccionado do grupo constituído por inflamação aguda ou crónica, caquéxia, choque séptico, doença enxerto contra hospedeiro, rejeição do transplante, hipersensibilidade, doença do complexo imunitário, malária, esclerose múltipla, artrite reumatóide, doença peridontal, diabetes não insulino-dependente e fibrose do pulmão.

13. Método de selecção de um agente que antagoniza as actividades TNF, incluindo a incubação de TNF com o 6 6 1 a 9 na diminuição composto de qualquer uma das reivindicações presença de um agente de ensaio e medição de uma na ligação TNF ao composto. Lisboa, 13 de Março de 2007