CN101883582B

CN101883582B - 激发一种对抗鸟分枝杆菌副结核亚种的免疫反应的合成物

Info

Publication number: CN101883582B
Application number: CN200880119048.7A
Authority: CN
Inventors: 张永富
Original assignee: Cornell University
Current assignee: Cornell University
Priority date: 2007-10-13
Filing date: 2008-10-09
Publication date: 2014-03-19
Anticipated expiration: 2028-10-09
Also published as: IN2010DN02553A; ZA201002553B; CO6270338A2; RU2489165C2; PT2200641E; CA2704178A1; AU2008310767A1; KR20100098602A; BRPI0817892A2; US20090099083A1; EP2200641A4; EP2200641A1; MX2010003972A; CN101883582A; JP2011500587A; ES2390996T3; US7732580B2; PL2200641T3; RU2010119046A; WO2009049097A1

Abstract

本发明提供了一种在哺乳动物内激发对抗鸟分枝杆菌副结核亚种(MAP)的免疫反应的合成物和方法。所述合成物包括一重组多肽，而所述重组多肽是由联结一个MAP蛋白Map3527的C-末端片段至一Map1519蛋白氨基酸序列，接着再联结一个Map3527的N-末端部分。所述方法包括对一动物施予一有效份量，可激发对抗MAP细菌的免疫反应的合成物。所述方法是预期对任何容易受MAP感染的哺乳类动物有益的，尤其是对反刍动物有益。

Description

激发一种对抗鸟分枝杆菌副结核亚种的免疫反应的合成物

相关申请参照

本申请要求同时待定的美国临时专利申请号61/094,552(申请日为2008年9月5日)和60/979,882(申请日期为2007年10月13日)的优先权，在此全部引入作参考。

联邦政府支助研究或发展的声明

没有。

附加参考

没有。

技术领域

本发明普遍关于刺激免疫反应，更特别是关于适合刺激对抗鸟分枝杆菌副结核亚种的预防性和/或治疗上的免疫反应的合成物和方法。

背景技术

鸟分枝杆菌副结核亚种(MAP)是约尼氏病(JD)的致病原，可在反刍动物中引致慢性肉芽肿肠炎。临床症状明显的动物会发展出慢性腹泻和渐进的体重下降，最后引致死亡，而临床症状不明显的动物主要会降低产奶量。JD对环球奶类工业有惊人的经济重要性，估计有20％的美国奶类动物受减低产量和过早淘汰影响而引起每年2.2亿的损失(Wells，et al.2000.J.Am.Vet.Med.Assoc.216：1450-1457)。牛在生命中的首六个月是最易受这种致病原的感染，但这种疾病通常直到3到5岁时才会变成明显的。感染的发生是因为进食了受污染的粪便，初乳，或从受感染的牛的奶(Sweeney，1996.Vet.Clin.N.Am.Food Anim.Pract.12：305-312)。尤其是在疾病晚期的怀孕牛只中，胎儿亦会受到感染(Sweeney，etal.1992.Am.J.Vet.Res.53：477-480)。此外，因为这种疾病是人类克隆氏症的病原，所以MAP的重要性亦显着提高(Chamberlin，et al.AlimentPharmacol Ther 2001；15(3)：337-46；Naser SA，et al..Mol Cell Probe 2002；16(1)：41-8).

现时被批准适合于现场使用的JD疫苗是一种已死的MAP品种的油性悬浮，但其有着明显的限制。首先，这种疫苗的效能是令人怀疑的，因为在不同的接种试验中得出不同的结果。另一种忧虑是全菌疫苗与诊断上的测试有干扰，因为已接种的动物会对结核病和副结核病皆有假阳性反应。如此，对改良疫苗的需求有上升趋势，但它们需要是有效的而同时不会干扰结核病和JD的诊断。为达成这目标，有几个途径已经尝试过，包括重组疫苗，DNA疫苗和亚单位疫苗13；ShinSJ，et al.Infect Immun 2005；73(8)：5074-85)。然而，发展改良MAP疫苗的需求是继续不断的。

发明内容

本发明提供了一种在哺乳动物内激发对抗MAP的免疫反应的合成物和方法。所述合成物包括一种新的79kDa重组多肽，在此称为″Map74F″。Map74F是由联结一个Map3527蛋白的～17.6-kDa C-末端片段至一个Map1519蛋白片段，接着在C末端再联结一个Map3527蛋白的14.6-kDa N-末端部分所产生的。

在Map74F之外，本发明的所述合成物亦可以包括其它MAP蛋白，例如MAP蛋白85A，85B，85C，35kDa，SOD，MptC，MptD和类ESAT-6蛋白，和其组合。

所述方法包括对一哺乳类动物施予一有效份量，可激发对抗MAP细菌的免疫反应的合成物。所述方法是预期对任何容易受MAP感染的哺乳类动物有益的，尤其是对反刍动物有益。

所述合成物可以与标准药物载体一同制备，并可以经任何一种不同的传统途径施予。所述合成物可以在任何时候施予容易受MAP感染或已受MAP感染的动物。然而，最优选是在受MAP感染之前施予所述合成物，例如经施予所述合成物的怀孕动物，可以经其初乳传送可预防疾病的免疫成分给其婴儿，或在出生后一至五周时施予所述合成物。

附图说明

图1A提供一个建构Map74F的图解。Map74F的产生是从其N到C末端序贯连合ORFs编码一个Map 3527蛋白的C末端至一个ORF编码Map 1519蛋白的氨基酸1-460，并以一个ORF编码Map 3527的一个N-末端片段的ORF作终结。所述ORF编码Map74F是由2397个核苷酸(nt)组成和编码一个有预计分子量大约是79kDa的799个氨基酸的多肽。

图1B提供一个从以编码Map74F的表达载体所转化的大肠杆菌(BL21/pLysE)所得的大肠杆菌溶解产物的考马斯亮蓝染色10％SDS-PAGE的照片表达。培育所述杆菌并以1mM IPTG诱导。线道显示IPTG诱导前的溶解产物(UI行)或IPTG诱导3小时后的溶解产物(I行)。纯化的重组Map74F在P行显示与分子量标记(M行)并行。

图2A-2D提供从加强免疫接种3周后牺牲的老鼠所得的数据的图解。将施予了Map74F+单磷酰脂A(MPL)和只有MPL的老鼠脾细胞在10μg/ml的Map74F，ConA和培养基中受刺激两日。图2A所显示的数据是培养物上清液以ELISA化验IFN-γ水平。图2B所显示的数据是以ELIspot试验，确定在已免疫的和在控制组的老鼠在受到和没有受到抗原刺激的单细胞脾悬浮液内的IFN-γ表达细胞的相关数目。图2C显示，为从已接种的(Map74F+MPL)和控制组的动物(MPL，ConA-MPL)受重组和控制组抗原刺激后的淋巴球增生子集特定群的脾细胞以FACS分析所得的数据。图2D显示对用家务基因GAPDH正常化的Map74F做出细胞因子信使核糖核酸表达的数据。三个独立实验的数据是有代表性的。

图3A和3B显示从已接种的和控制组的动物在不同时间点(接种前/初步接种(PV)，加强接种(B)，刺激前(BC)，刺激后4，8，12和16周)所得的血清对抗体的反应的数据。图3A显示的数据是从血清检验Map74F特异抗体所得。图3B显示以ELISA检验IgG1∶IgG2比例的数据。三个独立实验的数据是有代表性的。

图4A和4B提供接种Map74F+MPL后，在脾(图4A)，肝(图4B)和肠系膜淋巴结(MLN)(图4C)所表达的保护性免疫力数据的图标。Map74F明显地减低脾内(在刺激后8-16周)，肝(在刺激后12-16周)和MLN(在刺激后8-16周)的MAP负担。三个独立实验的数据是有代表性的。

图5A-5D提供已接种的和没有接种的老鼠组织的组织病理学检查的照片图标。图5A是代表从没有接种的控制组老鼠的肝。为数众多的大型肉芽肿随意地散布在肝内。苏木精和伊红染色法。压力是100um。内图：更高放大倍数的肉芽肿，显示很多的抗酸杆菌。齐尼氏染色。图5B是代表已接种Map74F的老鼠的肝。显示了只有稀疏的小型淋巴集合伴随着很少的巨噬细胞。图5C是一只没有接种的控制组老鼠的脾，在白髓中显示偶然的肉芽肿。图5D是代表已接种Map74F的老鼠的脾。白髓和红髓都没有肉芽肿。苏木精和伊红染色法。压力是100nm。内图：更高放大倍数的肉芽肿，显示没有抗酸杆菌。齐尼氏染色。

图6A-6C提供从对于重组抗原(85A，85B，Map74F和SOD)，Con A和PPD已免疫的(群组I和II)和控制组(群组III)的动物所得的周围血液单核细胞(PBMC)的淋巴组织增生反应的数据的图标。结果表达为刺激指数(SI)，而误差棒表示从平均数所得的标准差。

图7A-7C提供从已免疫的(群组I和II)和控制组(群组III)的动物的PBMC抗原特异IFN-γ反应的数据图标。结果表达为OD值，而误差棒表示从平均数所得的标准差。

图8A-8F提供在重组和控制组抗原刺激后的特定时间内，由已免疫的群组(I和II)和控制组群组(III)所得的PBMC内所收集的淋巴球增生子集作流式细胞计分析的数据的图标。结果表达为与没有诱导样本(以培养基培养)比较的正染色细胞百分比。误差棒表示从平均数所得的标准差。

图9A和9B提供对在已免疫群组(I和II)和控制群组(III)内的重组抗原作出反应的细胞因子基因信使核糖核酸的表达。结果表达为平均数以倍数增大超越没有受刺激的PBMC(作为校准)。误差棒表示从平均数所得的标准差。

图10显示在已接种群组I和II的动物和控制组III的动物对个别重组抗原的抗体反应。误差棒表示从平均数所得的标准差。

图11提供一个在尸体解剖中收集得来的不同组织所量度到的MAP培养物结果(CFU)的表格式概要。

具体实施方式

本发明提供了在一动物中激发对抗MAP的免疫反应的合成物和方法。所述合成物包括一重组多肽在此称为Map74F。编码Map74F的开放读码区(ORF)的长度为2397个核苷酸和编码成一个799个氨基酸的多肽。Map74F蛋白序列在SEQ IDNO：1内提供。根据其氨基酸合成物计算Map74F的分子量为79kDa，尽管其表面上的分子量是大约74kDa如SDS-PAGE分析所估计。在此显示的SEQ ID NO：1所提供的序列没有一个可选择的提纯标签，例如一个组胺酸标签。

Map74F是以连结N-末端至C-末端的方式，将一个Map3527蛋白的约17.6-kDa的C-末端片段，一个Map 1519蛋白的46.8kDa片段，和一个Map3527蛋白约14.6-kDa的N-末端片段来建构而成的。图1显示了Map74F的图解。

Map 3527和Map 1519的完整氨基酸序列分别在SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3提供。所述呈现在Map74F内的Map 3527蛋白的17.6-kDa C-末端片段是由SeqID：2的氨基酸183-361所代表。所述呈现在Map74F内的Map 1519的46.8kDa片段是由Seq ID No：3的氨基酸1-460所代表。所述呈现在Map74F内的Map3527的14.6-kDa N-末端片段是由Seq ID：2的氨基酸33-180所代表。预计中，较长的Map 1519片段和Map 3527的N-和C-末端可以包括在一对本发明所述的方法有用的重组蛋白。

除Map 74F之外，本发明的合成物亦可包含其它可以激发对抗MAP细菌的免疫反应的药剂(agent)。例如，所述合成物可以包含一个或多个其它MAP蛋白，如MAP蛋白85A，85B，85C，35kDa，过氧化物岐化酶(SOD)，MptC，MptD和类ESAT-6蛋白，和以上组合。这些蛋白在美国专利申请号11/816,365有描述过，而所述适合于激发对抗MAP的免疫反应的合成物之中的蛋白，其编码脱氧核糖核酸序列，和使用所述蛋白及其编码脱氧核糖核酸序列在此全部引入作参考。

在一实施例中，所述合成物包括MAP74F和一个或多个MAP蛋白85A，85B或SOD。编码MAP 85A基因的脱氧核糖核酸序列和85A基因的氨基酸序列在GenBankaccession no.AF280067提供(于2003年10月10日登录)。编码MAP 85B基因的脱氧核糖核酸序列和85A基因的氨基酸序列在GenBank accession no.AF219121提供(于2002年11月21日登录)。编码MAP 85C基因的脱氧核糖核酸序列和85C基因的氨基酸序列在GenBank accession no.AF280068提供(于2002年11月21日登录)。编码MAP SOD基因的脱氧核糖核酸序列和SOD基因的氨基酸序列在GenBank accession no.AF 180816提供(于2001年11月30日登录)。

本发明所述方法包括对一哺乳类动物施用一包含Map74F的合成物，其有效份量可激发对抗MAP细菌的免疫反应。激发后的免疫反应可包含免疫系统的任何组成部分，包括但不限于产生对MAP抗原有反应的抗体，刺激淋巴球增生，产生与Th1有关的细胞因子如IFN-γ，和前述的组合。

Map74F可以载体方式施予一动物。例如，编码Map 74F的核酸序列可以克隆进入细菌的基因组(如沙门氏菌属)或一病毒中(如牛科疱疹病毒一型(BHV-1))，而完成的重组细菌或病毒可以施用于动物。如此，本发明亦包括表达Map74F的细菌和病毒载体。本发明范围亦预期包含脱氧核糖核酸疫苗的方法，其中编码Map74F的核酸分子，不论是单独的或与一佐药结合的或促进转染的媒介，都可以直接施用于动物。

所述方法对任何易于受MAP感染的动物有益。所述合成物和方法尤其适合于预防或治疗反刍动物的MAP感染，包括但不限于牛，绵羊，山羊，鹿和麇鹿，羚羊，和水牛。在一实施例中，所述方法可以用于预防或治疗约尼氏病。

所述合成物可以施予任何感染了或没有感染MAP的动物。依照本发明所述方法将所述合成物施予受感染的动物被认为可刺激治疗上的免疫反应。然而，本发明亦包括在受到MAP感染之前施用所述合成物以刺激预防疾病反应。例如，所述合成物可以施予一怀孕的动物，然后可将预防疾病的免疫成份经初乳或授乳期的奶水传送到其没受感染的婴儿中。所述合成物亦可选择地在出生后一到五周时施予，以提供一种防止MAP感染或减低感染后疾病严重性的预防疾病作用。如此，在一实施例中，本发明所述方法是预防MAP感染，而在另一实施例中，所述方法是治疗MAP感染。

所述合成物可以与标准药物载体制备，和可以经众多传统途径中的任何一个途径施予。Remington’s Pharmaceutical Sciences(18th Edition，A.R.Gennaro et al.Eds.，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1990)公开了一些可与蛋白使用的可接受药物载体。

本发明所述方法所使用的合成物亦可以包含佐药。任何传统佐药也可使用。

在一实施例中，所述佐药可以是单磷酰脂A(MPL)，其可以与合成海藻糖二霉菌酸脂联合提供。在另一实施例中，所述佐药可以是双十八烷基二甲基溴化铵(DDA)。

本发明所述合成物可以任何可接受的途径施予。合适的施予途径包括口服，经粘膜和非肠道的(如血管内，肌肉内，和皮下注射)。所述合成物可以在任何时候施予容易受MAP感染的动物或已受MAP感染的动物。

为达至预期的效果，本发明所属领域的技术人员会意识到，施予至一个别动物的MAP74F份量和任何其它在合成物内的抗原药剂是基于一些因数来调较的，例如给药途径，和动物的大小，动物体格状况，和在动物内MAP状况。所述合成物可以用于一次性给药或一系列的给药以加强所述免疫反应。普遍来说，可施予的总剂量是在10-200μg蛋白之间。

以下例子描述本发明不同的实施例。这些例子是用于说明而不是限制本发明的。

例子1

本例子提供Map 74F的克隆，表达和纯化的描述。

产生一编码Map74F的串联连接ORF。

Map74F是以序贯连接串联Map3527约17.6-kDa的C-末端片段的ORFs至编码Map 1519蛋白的一段分子量为46.8kDa的ORF，接着是在Map74F的C末端连接约14.6-kDa的Map3527的N-末端部分。

产生没有终止密码子的Map3527c构体。

Map 3527C-末端部分(Map3527c)的5’和3’寡核苷酸的设计如下：5’(TA CATATG CAT CAT CAT CAT CAT CAT CTC AAC CAG AGC GTC TCG GC 3’(SEQ ID NO：4))和(5’TA GAATTC GGC CGG CGG CCC CTC CGC C 3’(SEQ ID NO：5))。所述5’寡核苷酸包含一个在ATG起始密码子之前的一个NdeI限制部位，接着是编码六个组胺酸残基的核苷酸序列(斜体)。所述3’寡核苷酸包含一个EcoRI限制性内切位点。这些寡核苷酸使用作扩增Map3527c，Map 3527的羧基540-nt部份(14.6kDa，180氨基酸残基)和将PCR扩增结果连接至一PCR2.1Topo载体。备有正确插入片段的质粒脱氧核糖核酸以NdeI和EcoRI消化，和连接入以相同酶切割的pET17b表达载体。所述连接后的结果转化进入大肠杆菌DH5α细胞和以消化限制性内切酶和DNA测序鉴定备有正确插入片段(Map 3527c)的一个转化株。

PCR 扩增Map1519全长编码序列和连接进Map3527c-pET质粒。

Map1519的5’和3’寡核苷酸包含以下序列：5’(5’-CTA ATC GAATTC ATG TTCTAT GGG GCC TTT C-3’SEQ ID NO：6))和3’(5’-TA ATC GATATC CAG GAC CTT GGACTT GTC-3’SEQ ID NO：7))。所述5’寡核苷酸包含一个EcoRI限制性内切位点。所述3’寡核苷酸有一个EcoRV限制性内切位点，然后是包含六个C-末端氨基酸残基而没有一个停止密码子的序列。所述Map1519编码序列的扩增(1380bp；一个460-aa伸延成一个预计大小有～46.8kDa)和所得出的PCR-扩增结果是连结至以相同酶切割的PCR2.1Topo载体。有正确插入片段的克隆以EcoRl和EcoRV消化，并连结至以EcoRl/EcoRV预先消化的Map3527c-pET质粒。连结后的结果然后转化进大肠杆菌DH5α细胞，而一个备有正确插入片段的转化株(Map3527c-Map1519)以限制性内切酶消化来识别，并以DNA序列确认。

将Map3527 N-末端片段克隆进入Map3527C-Map1519构体。

Map 3527N-末端片段的5’和3’寡核苷酸的设计如下：5’(5’-AT GATATC GGGCTG GCG CCG GCG TCC-3’SEQ ID NO：8))和3’(5’-AT CTCGAG TCA CGC GAC CTTGCC GGC-3’SEQ ID NO：9))。所述5’寡核苷酸包含一个EcoRV限制性内切位点。所述3’寡核苷酸包含一个XhoI限制性内切位点。它们设计成扩增Map3527的N-末端的447-bp(149-氨基酸残基)部份。所得出的PCR-扩增结果以EcoRV和XhoI消化，并连接进以EcoRV和XhoI消化的Map3527c-Map1519融合pET质粒。所述已连接的混合物用以转化大肠杆菌DH5α细胞，而所述正克隆以限制性内切酶消化来识别并以DNA序列确认。最后的构体，其编码一个74-kDa的多蛋白(Map74F)，包含一个以线性顺序排列的单一的ORF，Map3527C-Map1519-Map3527N 。

Map74F重组蛋白的表达与纯化

质粒DNA构体转化入大肠杆菌BL21(DE3pLysE)细胞内。将所述已转化的大肠杆菌细胞接种在有氨苄青霉素(100μg/mL)补充的LB琼胶上。再将一个单一菌落接种入10ml备有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基，在37℃ 下摇动培养过夜。将所述培养物与包含氨苄青霉素(100μg/mL)和氯霉素(34μg/m)的LB液体培养基中稀释为1∶100，并在37℃下摇动培养。经过三小时的1mM IPTG(Invitrogen Co.，Carlsbad，CA)诱导后，以离心机(5000Xg)收集细胞并在磷酸盐缓冲盐水中清洗一次。在缓冲液A(50mM TrisHCl，1mM EDTA，50mM NaCl，pH8.0)中悬浮细胞，并在一个弗氏细胞压碎器或细胞分裂器中将细胞裂解。在转低包含体后，将重新悬浮的颗粒以包含体清洗缓冲液(缓冲液A+1％Triton X-100)清洗三次和以CHAPS(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)缓冲液(1％CHAPS在10mM Tris-HCl中，pH8.0)清洗两次以去除脂多糖(LPS)。将包含体溶于缓冲液B(100mM磷酸钠，10mM Tris-HCl，8M尿素，2mMPMSF(Sigma)和20μg/ml的亮抑酶肽(Sigma)，pH8.0)并以Ni-NTA琼脂糖柱(Invitrogen)纯化。洗脱后的部份以SDS-PAGE检查，而将包含所述重组蛋白的部份合并并以10mM Tris-HCl(pH7.8)在4℃下透析过夜两次。所述蛋白通过Detoxi-GelTM内毒素清除凝胶(Pierce，Rockford，IL)，所述纯化后的蛋白以鲎变形细胞溶解试验检查内毒素水平。所述已纯化的蛋白有微不足道的内毒素水平(10pg/ml)。

Map74F的图表显示出用以建构图1所示的多蛋白的组织和限制性内切位点。所述Map74F的ORF长度是2397nt，编码一个有预计分子量约为79kDa的799氨基酸多肽(图1B)。所述ORF的设计和建构导入了两个六个核苷酸的铰链序例(EcoRI和EcoRV)，在三者连接的每个交汇点编码两个氨基酸。此外，所述ORF是设计为在N-末端备有六个组胺酸残基以供使用Ni-NTA基质纯化用。在大肠杆菌表达后，所述重组蛋白从包含体中纯化出来，并以SDS-PAGE(图1B)分析，其产量范围大约是每一公升的诱导培养物有大约1.5-2.0mg的纯化蛋白。

例子2

本例子示范使用Map74F以激发在一老鼠模型内对抗MAP的免疫反应

老鼠是研究MAP感染的合适模型。老鼠接受MAP挑战后，细菌载量和具体器官病理是感染情况的良好指示。老鼠的肝，脾和肠系膜淋巴结是适合于评估MAP挑战后细菌负担的器官。在本例子中，评估这些器官内的MAP负担来估计Map挑战后，Map74F的保护效能。从以下结果可证实接受Map74F免疫接种的动物能够在为期十六周的感染过程，可杀死或限制MAP的增殖。在脾，肝和MLN，CFU数目在挑战后八周下降，暗示MAP的消灭。除了细菌负担外，肉芽肿数目的减少和在已接种的动物的肝和脾中发现很少抗酸生物都表示所述多蛋白的保护效能。器官内实质上减少的MAP载量与肝和脾的病理改善表示74F的免疫作用快速降低或消灭MAP载量，保护老鼠对抗MAP感染。Map74F亦诱发高水平的IFN-γ。Map74F诱导一个良好的Th1反应。

本例子使用以下物料和方法。

动物

本动物实验使用6-8周大的雌性C57/BL6老鼠进行(Harlan Sprague，Indianapolis，Indiana)。将动物保持在一个生物安全水平II的设备中，任意喂食和喂水。所有实验工作在符合动物福利法案，人道对待及使用实验室动物在测试，研究和训练的公共卫生服务政策，NIH照顾及使用实验室动物的指引，和纽约州公共卫生部门的规定，政策和原则下进行。

细菌品种

从已感染MAP的牛只分离出MAP，将之标签为MAP 66115-98，用以挑战老鼠和分离染色体组DNA。MAP 66115-98在有10％油酸-白蛋白-右旋糖-过氧化氢酶(Becton，Dickinson and Co，Sparks，MD)和分支杆菌生长素J(AlliedMonitor，Inc，Fayette，MO)补充的7H9培养基中培养。培养6-8周后，用离心机以10,000X g将细胞收集，并以磷酸盐缓冲盐水清洗两次(磷酸盐缓冲盐水；pH 7.2)。所述细胞在磷酸盐缓冲盐水中稀释至所需浓度并用于挑战老鼠。

老鼠的免疫接种

将老鼠分成两组，每组36只动物。群组I动物是已接受免疫接种两次，两次接种相距三周，每次接种50μg/动物以MPL+TDM乳剂(Ribi adjuvant system，Corixa，Hamilton，MT)制备的融合蛋白，总容量为每剂100μl，在背部经皮下注射。群组II动物保持为没有接受接种的控制组，只给予MPL+TDM乳剂。在第二次接种三周后，将12只指定作免疫原性研究的动物杀死并将其脾细胞以常规步骤收集。将脾细胞以包含10％FBS(Gibco)的RPMI 1640培养基(Gibco，GrandIsland，NY)在37℃，5％CO2下培养。用相同剂量和计划将免疫接种实验重复两次。

以MAP挑战老鼠

在第二次接种三周后，将群组I和II每组24只动物以腹膜内注射10⁹CFU单位的鸟分枝杆菌副结核亚种作挑战。在挑战后4，8，12和16周后，将两组每组六只动物杀死，收集脾，肝和肠系膜淋巴结(MLN)并将之分成两部分。将一部分的组织在磷酸盐缓冲盐水(100mg/ml)打匀，而100μl的个别组织匀浆接种在包含分支杆菌生长素J的Herald’s egg yoke(HEY)斜面(Becton，Dickinson and Co，Sparks，MD)上，以便估计细菌载量。接种8-12周后，以菌落数目检查所述斜面上的细菌生长。另一部分的组织用于组织病理学检查。

组织病理学检查

将用作组织病理学检查的脾，肝和MLN部分浸入10％中性缓冲甲醛溶液中固定，包埋在石蜡中，切片成4μm，用苏木素，曙红和齐尼氏抗酸性染色剂以常规组织学方法染色，然后以光学显微镜检查。

抗体反应的ELISA

以常规ELISA方法量度抗原特异的IgG反应。将ELISA板块(Nunc-immunomodule，Nunc，Roskilde，Denmark)以200ng/反应孔的重组蛋白覆盖，并在4℃下培养过夜。用PBST(在磷酸盐缓冲盐水中0.05％Tween 20)清洗一次后，加入300μl的封闭缓冲液(PBST加入1％BSA)并在25℃下培养1小时。将所述板块以PBST清洗三次，然后在反应孔上加入100μl已稀释的血清样本并在37℃下培养一小时。为测量总IgG反应，在清洗后在反应孔中加入50ng与碱性磷酸酶缀合的羊抗小鼠IgG(KPL，Gaithersburg，MD)，并在25℃下培养30分钟。清洗后，加入50μl的BluePhos底物(KPL)，并培养10分钟。加入50μl的停止溶液(KPL)后，将板块放在一个ELx 808Ultra microplatereader(Bio-Tek Instruments，Inc，Winooski，VT)中，在630nm下解读。为测量同位素反应，清洗后在反应孔中加入25ng与生物素缀合的羊抗小鼠IgG1或IgG2a(Southern Biotech，Birmingham，AL)，并在25℃下培养30分钟。清洗后，加入0.2μg/ml以山葵过氧化物酶(KPL)标签的抗生蛋白链菌素，并在25℃下培养30分钟。清洗后，在反应孔中加入50μl的3，3’，5，5’-四甲基对二氨基联苯(TMB)并培养15分钟。加入50μl 1N的H₂SO₄为停止溶液后，将板块放在一个ELx 808Ultra microplate reader(Bio-Tek Instruments)以终点方法在450nm下解读。

IFN-γ试验

在5X 10⁵细胞/反应孔中将以常规步骤所得的脾细胞接种一式两份，并在有所述重组抗原和没有所述重组抗原下培养48小时。收集培养物的上清液并使用固相夹心ELISA工具套件(Biosource，Camarillo，CA)，依照厂家提供的计划方法分析IFN-γ。简单地说，将50μl的培养物上清液加入已经用小鼠IFN-γ特异的单克隆抗体覆盖的反应孔中。与生物素化的多克隆抗体在室温下共同培养两小时后，将所述反应孔清洗并加入抗生蛋白链菌素-过氧化物酶。培养30分钟和清洗后，将四甲基对二氨基联苯(TMB)溶液加入反应孔中，而结果以ELx 808Ultra microplate reader(Bio-Tek Instruments)在450nm下解读。

ELIspot分析

依照厂家的指引，使用ELIspot工具套件(KPL)测定在脾单细胞悬液内表达IFN-γ细胞的相关数目。简单地说，将10μg/ml的IFN-γ捕获抗体(BDBioscience，San Jose，CA)在4℃下覆盖进MultiScreen 96-反应孔过滤板块(Milipore，Bedford，MA)过夜。用1x清洗溶液清洗后，用1x BSA溶液在25℃下封闭板块一小时并再次清洗。在5X10⁵细胞/反应孔中接种一式两份的脾细胞，并在37℃下将细胞与所述重组抗原和没有所述重组抗原的情况下培养48小时。所述板块以1x清洗溶液清洗，并在25℃下和5μg/ml与生物素缀合的小鼠抗小鼠IFN-γ二次抗体(BD Bioscience)培养一小时。清洗所述板块，并与0.2μg/ml的HRP-抗生蛋白链菌素在25℃下培养30分钟。以TureBlue底物将过滤器显影15分钟，在黑暗处干燥并计算班点数目。

细胞表面标记的FACS分析

将一式两份1x10⁶细胞/反应孔的脾细胞接种于96-反应孔的组织培养碟，并培养24小时。将用74F激发的脾细胞和有伴刀豆球蛋白A的合适没有激发的控制组细胞进行FACS分析。将所述细胞用FACS缓冲液(在磷酸盐缓冲盐水中有1％BSA和0.05％叠氮化钠)清洗两次，并在50μl的FACS缓冲液中悬浮，和0.5μg与FITC或PE缀合的CD3，CD4和CD8抗体(eBioscience，SanDiego，CA)混合并在冰上培养30分钟。再以FACS缓冲液清洗细胞两次，并在100μl含有3％甲醛的磷酸盐缓冲盐水中悬浮和转移到载有500μl磷酸盐缓冲盐水的FACS试管中。使用一个FACS水平的流式细胞仪(Becton-Dickinson，San Jose，CA)和Cellquest软件分析10,000个结果后收集数据。所述结果表达为正染色的细胞与以相同抗体染色的未经诱导的样本相比下所增加平均百分比。

细胞因子信使核糖核酸表达的实时RT-PCR

使用RNeasy mini kit(Qiagen，Valencia，CA)从已接受免疫接种的老鼠身上所获得的脾脏组织中分离出总核糖核酸。使用Superscript ^TM II(Invitrogen)逆转录信使核糖核酸，并用作模板cDNA。所使用的引物和探针序列的详细资料在表1显示。以下是表1所用的注解：FW，正向引物；RV，反向引物；TP，以5’FAM和3’TAMRA双标记的TaqMan探针；^a扩增子的对硷基长度。 ^bcDNA及其对应基因的Genbank保藏编号。^c反义探针.

所述探针以荧光报导染料，6-羧基萤光素(FAM)在5’端染色，和以抑制荧光染料，N’，N’，N’，N’，N’-6-羧基四甲基罗丹明(TAMRA)在3’端染色。所述反应是一式两份的在25μl容量内进行，所述容量包含2μl 10pM的正向和反向引物，2μl 2pM的探针，12.5μl的TaqMan PCR master Mix和9.5μl已稀释的cDNA，所述反应使用以下条件：在一个自动的荧光计中(7700SequenceDetector，Applied Biosystems，Foster City)在94℃下运行10分钟，然后是总共40个双温度循环(95℃15秒和60℃1分钟)。使用比较性循环阀值(C_T)方法来作测数量，并且报告成相对转录或相对校准cDNA的n-倍差别。

表1

统计分析

数据以Excel软件作统计分析。群组和个别抗原的差异以单因子变异数分析然后再以Tukey-Kramer多重比较法或学生t检定分析。明显的差异是当得到一个少于0.05的或然率。

以下是通过本例子所述的物料和方法所得的结果

在已接受Map74F蛋白免疫接种的老鼠的免疫反应

加强接种后三周，杀死从每组而来的四只老鼠，然后评估抗Map74F抗体反应和T细胞反应。已接受Map74F免疫接种的老鼠有明显(P＜0.01)强烈对抗Map 74F的IgG1反应但不是IgG2a反应。相比之下，在控制组内并没有检测到Map74F-特异抗体。

所述培养物上清液的IFN-γ反应是以IFN-γELISA和IFN-γELISPOT试验方法来评估。相比只接受MPL的控制组动物(图2A)，已接受Map74F免疫接种的老鼠的抗原特异IFN-γ反应是明显地比较高(P＜0.05)。IFN-γELISPOT的结果亦可比得上IFN-γELlSA的结果(图2B)，所述结果进一步肯定在已接受免疫接种的动物有已增加的IFN-γ反应。所述已接种的群组的平均单细胞形成菌落数值为20，对比控制组的数值为7。以FACS评估脾细胞内的抗原特异CD3⁺，CD4⁺，和CD8⁺T细胞。CD3⁺和CD4⁺T细胞在已接受Map 74F免疫接种后的老鼠(图2C)中是明显地高于(P＜0.01)控制组动物。相比之下，已接种的动物和控制组动物之间的CD8⁺T细胞数量并没有显着差异。细胞因子基因表达水平以实时PCR评估。在已接种的动物和控制组动物(图2D)之间的细胞因子基因IL-2，IL-12，TNF-α和IFN-γ的表达水平并没有显着差异(P＞0.05)。

Map74F保护C57/BL6老鼠对抗MAP感染

基于从已接种的老鼠中所得的免疫反应，我们计划评估Map74F蛋白在老鼠中对抗MAP感染的保护效能。从不同时间点所收集的血清用ELISA测试IgG反应(图3A)和IgG1/IgG2a比例(图3B)。在接受加强接种后的3和7周(挑战后4周)，相对于控制组的动物，已接受74F免疫接种的老鼠显示出一个明显(P＜0.01)增强的74F特异抗体反应。虽然抗体水平在接受挑战后的控制组动物有所上升，但在已接种的动物接受挑战后8，12和16周的反应更高。在接受加强接种后三周，已接种的动物和控制组动物的IgG1/IgG2a比例有明显差异。在已接种的动物中，所述IgG1/IgG2a比例在加强接种后有所上升直至挑战后四周。其后，在已接种的动物中的IgG1/IgG2a比例会下跌直至挑战后16周的观察期结束为止。

为评估74F的保护效能，在MAP挑战后，脾，肝和MLN会在不同时间点培养MAP。已接种的动物在接受挑战后8，12和16周的脾内MAP负载与控制组动物相比是明显地较低的(P＜0.01)(图4A)。已接种的动物在接受挑战后12周的肝内MAP负载与控制组动物相比是明显地较低的(P＜0.01)(图4B)。已接种的动物在接受挑战后8周的MLN内MAP负载与控制组动物相比是明显地较低的(P＜0.01)(图4C)。肝(图5A和B)和脾(图5C和D)的组织病理学检查显示，在控制组动物的腹膜内接受MAP挑战8，12和16周后会引致更多的肉芽肿。在没有接受接种的控制组动物内，肝脏有数目众多和随意地分散的大型肉芽肿(图5A)而已接种的动物的肝只有数目稀少的小型淋巴结集(图5B)。同样地，没有接受接种的控制组动物的脾脏(图5C)比已接种的动物(图5D)有更多的肉芽肿。当控制组动物的肝和脾组织以齐尼氏抗酸性染色法染色后，可以见到有大量的抗酸杆菌。相比之下，在已接受74F免疫接种的动物，其肉芽肿和抗酸杆菌的数目比较少。

如此，在本例子中，我们使用从已接受免疫接种和控制组动物所得的脾细胞来确定被融合蛋白诱导的T细胞反应的种类。在分支杆菌感染中，Th1细胞是在感染初期的保护有关键性的作用。最有效对抗胞内病原体的免疫接种策略，应该是可刺激CD4⁺和CD8⁺T细胞反应两者以产生与Th1有关的细胞因子。普遍来说，IFN-γ被认为是启动巨噬细胞的主要成分，而其由Th1CD4⁺T细胞的生产对遏制MAP感染是被认为很重要的。我们的结果显示，接种融合蛋白可诱发重要的IFN-γ反应。同样地，我们亦发现，Map74F的免疫作用在已接受免疫接种的动物中，诱发一可与CD8⁺T细胞反应对比的强烈CD3⁺和CD4⁺T细胞反应，这表示IFN-γ水平的增加可以是因为CD4⁺T细胞数目的增加。所述结果支持CD4⁺T细胞是占主导地激活IFN-γ这个结论的。在我们的研究中，MAP挑战后CD4⁺T细胞反应和保护水平的增加显示Map74F的保护效能。

我们在这个例子所呈现的免疫原性研究亦显示，备有MPL的74F在已接受免疫接中的动物中引发一个良好的抗体反应。直至MAP挑战后4周，IgG1/IgG2_a比例的上升表示着有一个Th2特异的反应。然而，IgG1/IgG2_a比例在第8周的开始逐步下降，表示着有可能是转为Th1反应。在这个例子所呈现的结果显示74F诱导ThI和Th2两者反应的证据，而从一个明显的IFN-γ反应可以显示前者反应更显着。

例子3

本例子示范使用Map74F和其它选定的MPA蛋白激发一个在反刍动物内对抗MAP的免疫反应。

本例子使用下列物料和方法获得所呈现的数据。

动物。本研究使用从没有受到MAP感染的羊群中取得的总共25只介乎5和10日大的小山羊。在这个免疫接种实验之前，从所述的羊中取得的粪便样本经细菌培养和IS900基因PCR测试显示MAP阴性的结果。所有实验工作在符合动物福利法案，人道对待及使用实验室动物在测试，研究和训练的公共卫生服务政策，NIH照顾及使用实验室动物的指引，和纽约州公共卫生部门的规定，政策和原则下进行。

细菌。使用临床分离的MAP 66115-98挑战所述经过免疫接种之后的羊。这个品种是IS900阳性和依赖分支杆菌生长素的。MAP 66115-98是在有10％油酸-白蛋白-右旋糖-过氧化氢酶(Becton Dickinson Co，Sparks，MD)和分支杆菌生长素J(Allied Monitor，Inc，Fayette，MO)补充的7H9培养基上培养。在培养后8周，细胞是由离心机在4000x g和10分钟的情况下收集，并且以磷酸盐缓冲盐水(PBS；pH 7.2)清洗两次。所述生物在磷酸盐缓冲盐水内稀释至所需的浓度并用于挑战小牛。

抗原和佐药。如美国专利号11/816,365所载，使用标准技术克隆，表达和纯化三个重组MAP抗原，85A，85B，SOD和融合多肽Map74F，所述克隆，表达和纯化的描述在此全部引用作参考。使用Ni-NTA琼脂糖柱(Qiagen，Valencia，CA)纯化所述已表达的蛋白。内毒素污染用Affinity Pak Detoxi Gel(Pierce，Rockford，IL)移除，而所述抗原经过鲎变形细胞溶解试验测定有微不足道的内毒素水平(10pg/ml)。将DDA(Sigma，USA)混进无菌蒸馏水至浓度是2.5mg/ml，持续搅伴加热至80℃20分钟，并冷却至室温。DDA与所述重组抗原彻底混合至最终浓度为250μg/剂量。

动物的免疫接种。所述羊分为三组，群组I和II有八只动物物，而群组III 有九只动物(因为我们有多出一只的小山羊)。所有小山羊依靠母羊直至三个月大。群组I的动物是已接受在DDA中的四种抗原(85A，85B，SOD，和Map74F)以每种100μg的皮下注射免疫接种。群组II的动物是已接受没有DDA，每种100μg抗原的免疫接种。群组III维持作控制组动物，并只施予DDA。首次免疫接种后三周，所述羊以相同制度的抗原和佐药作加强接种。

以MAP挑战动物。加强接种后三周，全部24只羊连续7日以口服方法接受在10ml奶内有5X 10⁸MAP细胞/动物的挑战。在接受挑战的2，4，6，8和10日后，每只动物皆需要进行粪便细菌培养，然后是每月一次。

周围血液的单核细胞(PBMC)的分离和细菌培养。使用标准技术，从所述实验用羊群中分离出PBMC。简单来说，使用EDTA真空采血管(Becton Dickinson andCo.，Franklin Lakes，NJ)从颈静脉抽取10-15ml的周围血液。使用Histopaque1.077(Sigma-Aldrich，St.Louise，MO)以差分离心将淋巴细胞分离。所述单核细胞以磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.2)清洗三次。将清洗过的细胞颗粒悬浮在PBS内，并以0.4％的锥蓝将之染色后计算细胞存活。将淋巴细胞重新悬浮在包含10％胎牛血清(Gibco，Grand Island，NY)，2mM L-谷氨酸，100mM HEPES，100IU/ml盘尼西林，100μg/ml链霉素和50μg/ml庆大霉素(Gibco)至最终浓度是2x 10⁶存活细胞/ml的RPMI-1640介质。所述细胞然后播种在有96-反应孔的圆或平底板(200μl/wel l)，视乎实验种类而定。

淋巴细胞增殖化验。使用标准技术进行淋巴细胞增殖化验。简单来说，将放有PBMC的96-反应孔平底板放在潮湿大气环境，5％CO2，37℃下培养，并以四个所述已纯化的重组抗原(10μg/ml)，伴刀豆球蛋白A(ConA；10μg/ml，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和已纯化的蛋白衍生物(PPD；10μg/ml，DBL，National Veterinary Services Laboratory，Ames，IA)刺激72小时。根据厂家的实验计划，用细胞增殖ELISA编入的溴脱氧尿苷(BrdU)，再以BrdUcolorimetric kit(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)量度在刺激后和没有刺激过的控制细胞内的DNA合成。简单来说，所述细胞以10μl的BrdU标记溶液标记两小时。将与过氧化物酶共轭的抗BrdU抗体加入并培养90分钟。接着是加入酶底物溶液并在室温下培养15分钟。加入1M硫酸停止酶反应，并以ELx 808Ultra microplate reader(Bio-Tek Instruments，Inc，Winooski，VT)在450nm下读取光学密度(OD)。将所述实验一式三份进行，并将结果表达为平均刺激指数(SI)，计算与抗原一起培养的细胞的平均OD值和没有与抗原一起培养的细胞的平均OD值之间的比例。

IFN-γ化验。根据厂家的指引，使用单克隆抗体基础三明治酵素免疫分析法(BOVIGAM；Biocor Animal Health，Omaha，NE)来量度PBMC的培养上清液内的 IFN-γ水平。使用ELx 808Ultra microplate reader(Bio-Tek Instruments，Inc)在450nm下解读培养板。结果基于负与正控制光学密度(OD)的比较来诠释。相对于厂家建议的截断值，结果诠释为正(如果OD是大过正控制)或负(如果OD是少于正控制)。

淋巴细胞标记的流式细胞仪分析。根据标准实验计划，使用羊特异单克隆抗体(CD2-MUC2A；CD4-17D-IgG1；CD4-GClAl-IgG2a；CD8-CACT80C-IgG，；CD8-7C2B-IgG2_a；CD25-CACT116A-IgG1；CD45RO-ILA116A-IgG3；γδTCR alpha链特异IgG2b-GB21Al；ACT1-C ACT7A-IgM；ACT16-GB 110A-IgM)(VMRD，Inc，Pullman，WA)对淋巴细胞表面分化抗原作单色流式细胞仪分析。简单来说，所述细胞用荧光活化细胞分拣器(FACS)缓冲剂清洗三次，并与先前以滴定达致最佳反应的一抗在4℃下培养30分钟。然后，将所述样本清洗三次，用异硫氰酸荧光素酯标记的马抗小鼠免疫球蛋白(Vector Laboratories，Burlingame，CA)在4℃下培养30分钟。所述细胞用FACS缓冲剂清洗两次，并悬浮在100μl有3％中性缓冲甲醛溶液的PBS。最后，所述细胞转移至一FACS试管，并在使用FACS水平流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)量度之前将容量以PBS加至500μl。在5,000-10,000结果时收集数据和以Cellquest软件分析。

实时定量PCR表达细胞因子基因。依照常规方法进行总RNA分离，cDNA合成和实时定量RT-PCR。简单来说，使用RNeasy mini Kit(Qiagen，Valencia，CA)从裂解的PBMC中分离出RNA。所述已分离的RNA样本以10U/μl的RNase-freeDNase I(Qiagen)在37℃下处理10分钟，接着在95℃热灭活5分钟然后冰上冷冻。RNA样本的逆转录在20μl的反应容量中(1.6μl的总RNA，从Invitrogen所得200U的Superscript II逆转录酶，50mM Tris-HCl，75mM氯化钾，3mM氯化镁，0.01M二硫苏糖醇和0.5mMdNTPs)在42℃下进行50分钟，接着是在70℃下灭火15分钟。实时定量RT-PCR所用的探针和引物是以Primer Express software(Appl ied Biosystems，Foster city，CA)用牛beta肌动蛋白和源自GenBank的细胞因子基因序列所设计的。表2显示在这研究中使用的探针和引物的详细内容。

表2

细胞因子序列(5’-3’) 长度保藏编号

IFN-γ FP-CAAATTCCGGTGGATGATCTG(SEQ ID 358-378 AY603405

NO：25)

433-412

RP-GCGACAGGTCATTCATCACCTT(SEQ ID

NO：26) 382-409

探针-atccagcgcaaagccataaatgaactca

(SEQ ID NO：27)

IL-10 FP-CCAGGATGGTGACTCGACTAGAC(SEQ ID 338-360 DQ837159

NO：28)

413-394

RP-TGGCTCTGCTCTCCCAGAAC(SEQ ID NO：29)

364-391

探针-ccgacataaacctctgaaatccgaccca

(SEQ ID NO：30)

β-肌动蛋 FP-GCCCCTCTGAACCCCAAA(SEQ ID NO：31) 67-84 AF481159

白

RP-GCAGGAGTGTTGAAAGTCTCGAA(SEQ ID 137-115

NO：32)

86-112

探针-ccaaccgtgagaagatgacccagatca(SEQ

ID NO：33)

所述探针以荧光报导染料6-羧基荧光素(FAM)在5’端标记，和以抑制荧光染料，N’，N’，N’，N’，N’-6-羧基四甲基罗丹明(TAMRA)在3’端标记。在一25μl备有10μl已稀释的cDNA，400nM浓度的引物，80nM的TaqMan探针(Integrated DNA Technologies，Inc.，Coralville，IO)，和universal PCRmaster mix(Applied Biosystems)内含每个反应有10mM Tris-HCl(pH 8.3)，50mM氯化钾，5mM氯化镁，2.5mM浓度的脱氧核苷三磷酸，0.625U的Ampl iTaq金DNA聚合酶和0.25U的AmpErase尿嘧啶-N-糖苷酶的反应容量内进行PCR。重复的样本保持在96-反应孔板并在一个自动荧光计(7700Sequence Detector，Applied Biosystems)内扩增。PCR的条件是在50℃下2分钟和在95℃下10分钟，接着是在95℃下运行40个循环15秒和在60℃下1分钟。使用比较性循环阀值(C_T)方法来作测数量，并且报告成相对转录或相对校准cDNA的n-倍差别。

抗体对重组抗原的反应。依照常规的实验计划以ELISA评估抗体对四个重组抗原，con A和PPD的反应。用覆盖有每一个抗原每个有100μl的96-反应孔平底板进行间接ELISA，保持在4℃下过夜，并以包含0.05％Tween20的PBS(PBST)清洗两次。没有结合的部位以放有5％脱脂奶的PBST在37℃下封闭一小时，并以PBST清洗两次。将100μl与山葵过氧化酶(Sigma)共轭的1∶25,000稀释的抗羊IgG加入所述反应孔并在37℃下培养一小时。所述培养板用PBST清洗三次，并在每一个反应孔中加入2，2’-联氮双噻唑啉-6-磺酸(Sigma)。将培养板在37℃黑暗中培养30分钟，接着加入停止溶液(1M盐酸)，然后使用微型板块阅读器(BioTEK Instruments，Inc，Winooski，VT)在405nm下解读三次，每次的间隔是2分钟。合适的正和负血清和抗原和抗体控制都包括在每一块板中。

粪便和器官的MAP培养。紧随着挑战后，根据标准实验计划使用Herald’segg yolk(HEY)培养基(Becton，Dickinson and Co.，Sparks，MD)来尝试从粪便中分离出MAP生物。用作分离MAP的粪便样本是从所有动物在接受挑战后2，4，6，8和10日，及其后的每一个月所收集得来的。同样地，从24只动物在死体解剖时收集的23个组织样本亦以细菌培养检测MAP。细菌培养由康奈尔动物健康诊断中心的细菌学部进行，而他们对治疗组是遮盲的。

大体病理学和组织病理学检查。所有羊在首轮防疫注射后38周进行安乐死和进行死体解剖。从每一只动物中收集总共23个组织样本，其包括脾，扁桃腺，肠系膜淋巴结(3)，颚淋巴结，回盲淋巴结，肝淋巴结，十二指肠(升和降)，空肠(从近端到远程大概等同间隔的三个部位)，回肠(近端两个部位，中回肠两个部位和远程两个部位)，回盲瓣口，盲结肠瓣口，盲肠，和结肠螺旋，全部在死体解剖时收集。将收集到的组织浸入10％中性缓冲甲醛溶液固定，包埋在石蜡中，切片成4μm并以传统组织学的苏木素和曙红染色法染色。切片是由合资格的兽医病理学家(SM)检验，他也对治疗组是遮盲的。

统计分析。数据以Excel软件作统计分析。群组和个别抗原的差异以单因子变异数分析然后再以Tukey-Kramer多重比较法或学生t检定分析。明显的差异是当得到一个少于0.05的或然率。

以下是通过本例子所述的物料和方法所得的结果。

淋巴组织增生对抗原的反应：虽然抗原特异的淋巴组织增生反应是在首轮防疫注射后(APV)六周检测到的，但所述反应在已接受免疫接种的群组(I和II)与没有接受免疫接种的控制组(III)在APV 10周(图6)比较下是明显地高的(P＜0.05)。然而，在测试过的不同抗原之间的反应没有检测到明显地差别。

抗原特异IFN-γ反应：在APV 6和10周检测到在已接受免疫接种的和控制组动物(图7)之间的所述IFN-γ反应的明显差别(P＜0.01)。在已接受免疫接种的动物中所检测到的最佳反应是Map74F。在APV 10周，群组I的动物对抗原85A和Map74F的IFN-γ反应是明显地高过(P＜0.05)群组II的动物。然而，在其它重组抗原测试中并没有检测到明显的差异。虽然重组抗原特异的IFN-γ水平从APV 18周到38周有下降，但是在已接受免疫接种的动物中它们是明显地高于(P＜0.05)控制组的。

对应重组抗原的淋巴细胞子集分布反应：使用流式细胞检查抗原激发的淋巴细胞子集的百分比差别。在已接受免疫接种的群组中，CD4⁺IgG1，CD4⁺IgG2a，CD8⁺IgG1，CD8⁺IgG2a细胞子类型比起控制组有明显的增长(图8A-D)。所述增长在APV六周开始，并在整个实验的过程中持续至APV 38周。重组抗原特异CD4⁺和CD8⁺T细胞数目在已接受免疫接种的动物中较高，但CD4⁺细胞部份比CD8⁺细胞部分更高。然而，在APV 26和38周时，CD8⁺T细胞数目有增长，虽然并不显着。当所有重组抗原在我们的研究中被试验后，γδTCR⁺细胞的数目在已接受免疫接种的群组中相比于控制组动物有所增长，而85A和Map74F抗原的增长是明显地较高的(P＜0.05)。再者，如在CD4⁺和CD8⁺T细胞数目的情况中，我们留意到γδTCR+细胞数目持续增加直至实验结束阶段(图8E)。在已接受免疫接种的动物，抗原特异的CD25⁺T细胞部份在四种实验过的重组抗原中是较高的。虽然在不同实验过的抗原之间，CD25⁺T细胞反应有少量差别，但它们并不显着。

细胞因子基因特异的mRNA表达：与控制组动物在APV六周开始时(图9A)，在已接受免疫接种的动物中可检测到重组抗原特异IFN-γ表达有明显增加(P＜0.01)。虽然所述表达水平在APV 10周到达顶峰，但直至APV 38周时，在已接受免疫接种的动物中的水平相比起控制组动物的仍然是明显地较高。对照起来，除了所有三个群组在APV 26-38周时，整体的IL-10表达都有所增加之外(图9B)，任何时候在我们的研究中，在已接受免疫接种和控制组动物之间，所检测到的IL-10表达都是没有明显差别的。

抗体的重组抗原特异反应：在这个研究中，所有测试过的四个重组抗原在已接受免疫接种群组中可诱发强健的抗体反应。从APV六周到整个实验过程中(图10)，所述反应在已接受免疫接种群组中比起控制组是明显更高的(P＜0.01)。在多种使用过的重组抗原之间，所检测到的抗体反应并没有明显差别。

在死体解剖时所收集的组织病理学组织：在死体解剖中对从每一只动物收集得来的组织进行组织病理学检验，结果显示，75％没有接受免疫接种的控制组动物(群组III)在最少一个组织中有肉芽肿，然而群组I和群组II分别只有25和50％的动物有肉芽肿。在群组1中一只动物的肠系膜淋巴结和空肠中发现肉芽肿，而在同组另一只动物的回盲淋巴结中肉芽肿。相比之下，在群组II和III中的肉芽肿主要是在回肠，回盲交合处，或盲肠，虽然这两组内有五只动物的回盲淋巴结也有受影响。在任何动物中的十二指肠并没有发现肉芽肿，而只有2只动物，一只从群组I而另一只在群组III，的空肠有肉芽肿。在群组III中的两只没有接受免疫接种的动物，其受影响的组织包括盲结肠交合处和肝淋巴结。

紧接挑战后，MAP在组织的负载：以细菌培养评估从每一只动物的死体解剖中所获得的23个组织的MAP负载(图11)。在已接受免疫接种的动物之间，只有群组I的一只动物呈现有非常低CFU的阳性培养。在群组II中，虽然5/8的动物是MAP阳性，但在五只动物的其中四只可分离出MAP的动物(＜5)中，其细菌载量是非常低的。在没有接受免疫接种的群组III中，全部九只动物都是MAP阳性的，而大部分动物都有最少5个组织有＞300CFU的MAP阳性(太多，不能尽数)。

如前面证明，在这例子中，我们在山羊模型中评估重组85A，85B，SOD和Map74F的保护效能。因为MAP是一种细胞内的生物，所以激活后的T细胞所介导的Th1反应，尤其是可分泌IFN-γ的激活后的T细胞，被认为在保护中扮演重要的角色。在多种使用过的工具中，最被广泛利用作确定细胞免疫反应的是量度淋巴细胞在特异抗原测试中的增殖反应。在加强免疫接种后三个星期，我们示范了检测重组抗原特异淋巴细胞增殖，在已接受免疫接种群组中的结果与控制组接受挑战后比较是明显较高的，这表示抗原特异细胞免疫的诱导。

IFN-γ是主要细胞因子基因的其中一种，在牛只中会因受到MAP感染而激活。此外，人们都相信主要组织兼容性复合体第一型可限制生产细胞因子如IFN-γ的CD8⁺T细胞在对抗其它分支杆菌感染如结核杆菌中是必须的。在这例子中，在接受加强免疫接种和挑战后可检测到Map74F介导的IFN-γ反应。在没有意图被任何个别理论约束下，可考虑以IFN-γ介导的巨噬细胞讯号转导的IFN-γ水平的增强在山羊接受活MAP挑战后的保护性免疫中扮演重要的角色。

在这例子中呈现的结果亦显示出在已接受免疫接种的动物有较高的CD4⁺和CD8⁺T细胞反应。我们的结果亦支持CD4⁺T细胞对周围IFN-γ水平和紧随着重组抗原免疫接种后的增殖性反应有贡献。CD25是由已激活的T-细胞所表达的。我们的结果清楚表示，已激活的T-细胞在已接受免疫接种的动物内会扩充。虽然γδTCR⁺细胞数目维持在较小于CD4⁺和CD8⁺T细胞地数目，但它们在已接受免疫接种的动物中是明显地高于(P＜0.05)控制组动物的。CD4⁺T细胞的效应机理是与IFN-γ的分泌有关，其可在巨噬细胞，淋巴毒素，穿孔素和粒溶素中激活细菌活动力。CD8⁺和γδ⁺T细胞亦分泌粒溶素。这和我们的挑战实验的结果一致，并且支持我们的重组抗原的保护效能。所述已增加的IFN-γmRNA表达水平，在已接受免疫接种的动物中清楚表示这里有一个明确的抗原特异Th1反应，而不明显的Th2特异IL-10表达支持这论点。

随着淋巴组织增生反应，IFN-γ反应，CD4⁺T和CD8⁺T细胞反应为在已接受免疫接种群组的显着Th1反应提供证据。我们分析挑战实验的结果，以评估所述重组抗原在山羊内的保护效能。在没有典型的临床征象下，死体解剖时所收集的组织的组织病理学和细菌负载被认为是最佳评估MAP防疫注射的保护效能的标准。我们从25只动物中每只收集23个组织，分析其组织病理损害和以细菌培养分析MAP负载。我们观察到曾接受重组抗原和DDA的动物和组织的损害数目有显着下降，这表示有保护效能。

与抗酸菌染色法或显微镜观察法比较下，从细菌培养中分离出MAP这种方法对检测组织内MAP的敏感度较高，尤其是在感染非常初期的时候。然而，肉芽肿损害的分布普遍可以反映MAP细菌培养结果。本例子所呈示的MAP细菌培养结果清楚证明所使用的四个重组抗原的保护效能。当所述抗原与DDA一起施予时有近乎完整的保护。在群组I中，八只动物只有一只可以获得MAP，而这只动物只有一个阳性组织有明显较低的MAP载量，那就是远程回肠。抗原在没有佐药的情况下施用亦显示有保护能力，虽然在没有佐药的情况下的保护效能较低。这种情况可以在给予抗原但没有佐药的群组II动物的细菌培养结果中观察得到。虽然5/8的动物是MAP阳性，其细菌载量是明显地较群组III的控制组动物的低，这表示所述抗原即使在没有佐药的情况下依然具有保护性。在所有没有接受免疫接种的控制组动物中，所获得的MAP数目是明显地较高，这再次显示所述抗原的保护效能。山羊的重组抗原免疫注射在一段时间中产生持续的抗体反应。因此，本例子所呈示的结果表示所述重组抗原激发了细胞介导免疫和体液免疫系统。已接受免疫注射的群组在加强免疫注射后，与所述没有接受过免疫注射的群组比较下其检测到的所有重组抗原的抗体反应有所增加。接受抗原和佐药的群组I动物中，所述反应虽然不显着但倾向较高。紧随着血清转化后的早发性细胞介导免疫反应是反刍动物受分支杆菌感染后的恒常特征。然而，相对于接受假免疫注射的山羊，我们在这例子中所使用到的多成份亚单位在降低目标器官中的杆菌负载而言是可给予明显的保护。

本发明内所述的具体实施例并不限制本发明的保护范围。事实上，本领域技术人员可从前面所描述的实施方式中轻易地对本发明作出不同的修改。这些修改包含在本发明附属权利要求范围之内。

这里引用的所有文献都在此整体引入作参考，而所有目的在相同程度上就如每一个别文献，专利或专利申请都是特别地和个别地在此整体引入作参考。

任何文献的引证都是为了证明其公开是在申请日期之前，但不应该被认为是本发明因为在先的发明，而承认本发明没有权利去宣告其发明是比这些文献居先的。

序列表

<110>张永富

<120>激发一种对抗鸟分枝杆菌副结核亚种的免疫反应的合成物

<130>1258_4222PCT

<150>US 61/094,552

<151>2008-09-05

<150>US 60/979,822

<151>2007-10-13

<160>33

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>788

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>Mqp74F protein

<400>1

Leu Asn Gln Ser Val Ser Ala Thr Asp Thr Leu Thr Gly Ala Gln Glu

1 5 10 15

Asn Leu Gly Gly Leu Ile Gln Ala Asp Ala Pro Ile Lys Pro Gly Asp

20 25 30

Ser Gly Gly Pro Met Val Asn Ser Ala Gly Gln ValIle Gly Val Asp

35 40 45

Thr Ala Ala Thr Asp Ser Tyr Lys Met Ser Gly Gly Gln Gly Phe Ala

50 55 60

Ile Pro Ile Gly Arg Ala Met Ala Val Ala Asn Gln Ile Arg Ser Gly

65 70 75 80

Ala Gly Ser Asn Thr Val His Ile Gly Pro Thr Ala Phe Leu Gly Leu

85 90 95

Gly Val Thr Asp Asn Asn Gly Asn Gly Ala Arg Val Gln Arg Val Val

100 105 110

Asn Thr Gly Pro Ala Ala Ala Ala Gly Ile Ala Pro Gly Asp Val Ile

115 120 125

Thr Gly Val Asp Thr Val Pro Ile Asn Gly Ala Thr Ser Met Thr Glu

130 135 140

Val Leu Val Pro His His Pro Gly Asp Thr Ile Ala Val His Phe Arg

145 150 155 160

Ser Val Asp Gly Gly Glu Arg Thr Ala Asn Ile Thr Leu Ala Glu Gly

165 170 175

Pro Pro Ala Met Phe Tyr Gly Ala Phe Pro Pro Glu Phe Asn Ser Gly

180 185 190

Arg Met Tyr Ser Gly Pro Gly Ala Gly Ser Phe Val Ala Ala Ala Thr

195 200 205

Ala Trp Gln Asn Leu Ala Ala Glu Leu Gln Ser Ala Ala Ala Ser Tyr

210 215 220

Ser Thr Val Leu Ser Gly Leu Thr Ala Gly Pro Trp Val Gly Pro Ser

225 230 235 240

Ser Leu Ala Met Ala Ser Ala Ala Ala Pro Tyr Val Ala Trp Met Gln

245 250 255

Gln Thr Ala Ala Gln Ala Ala Glu Thr Ala Ala Gln Ala Thr Ala Ala

260 265 270

Ala Thr Ala Tyr Glu Thr Ala Phe Ala Ala His Val Pro Pro Ala Val

275 280 285

Ile Thr Glu Asn Arg Ala Leu Leu Ala Gln Leu Val Ala Thr Asn Ile

290 295 300

Phe Gly Gln Asn Thr Ala Ala Ile Ala Ala Asn Glu Ala Gln Tyr Gly

305 310 315 320

Glu Phe Trp Ala Gln Asp Ala Thr Ala Met Asp Thr Tyr Phe Ala Ala

325 330 335

Ser Ala Thr Ala Ala Asn Lys Leu Thr Glu Phe Gly Pro Ala Pro Lys

340 345 350

Thr Thr Asn Glu Ala Ala Gln Pro Met Gln Ala Ala Ala Val Ser Ser

355 360 365

Ala Ala Ser Thr Pro Ala Ala Asn Val Ala Gln Thr Ala Ala Ser Ala

370 375 380

Ala Ser Thr Thr Leu Pro Tyr Ser Gly Pro Phe Ser Gly Pro Ala Asn

385 390 395 400

Leu Ala Tyr Leu Tyr Gln Thr Phe Met Thr Asn Leu Phe Asn Thr Val

405 410 415

Pro Gly Gly Ala Ser Phe Tyr Thr Ser Met Tyr Asn Ala Val Lys Val

420 425 430

Pro Leu Gly Leu Thr Thr Gln Phe Asn Asp Val Gly Leu Leu Val Asn

435 440 445

Phe Pro Leu Ser Gln Trp Leu Lys Phe Ala Pro Pro Ile Gly Tyr Gly

450 455 460

Ala Leu Pro Lys Asp Ala Leu Gly Ala Gly Leu Gly Ala Leu Gly Phe

465 470 475 480

Gly Arg Gly Thr Leu Tyr Ser Ala Ile Ser Pro Val Ala Gly Met Gly

485 490 495

Asn Ala Gly Thr Leu Val Gly Lys Leu Ser Ile Pro Pro Ser Trp Ala

500 505 510

Thr Ala Thr Pro Ser Ile Arg Thr Val Ala Ala Ala Leu Ser Ala Ala

515 520 525

Gly Ala Glu Ala Val Pro Ala Ala Ala Leu Gly Glu Gly Ser Leu Phe

530 535 540

Ser Ser Met Gly Leu Ala Gly Met Leu Gly Ser Ala Val Gly Ser Gly

545 550 555 560

Gly Pro Thr Met Val Arg Gly Gly Val Arg Asn Arg Met Thr Ala Ile

565 570 575

Lys Asp Leu Lys Asp Lys Gln Ser Pro Glu Gln Leu Lys Arg Leu Val

580 585 590

Ala Gln Ile Ser Glu Gln Pro Glu Ser Val Gln His His Asn Val Asp

595 600 605

Gln Glu Asn Leu Asp Ala Leu Leu Glu Gln Leu Ala Lys Lys Pro Gly

610 615 620

Ile His Ala Val His Leu Lys Lys Gly Asp Lys Ser Lys Val Leu Gly

625 630 635 640

Leu Ala Pro Ala Ser Ala Ala Pro Ser Gly Leu Ala Leu Asp Arg Phe

645 650 655

Ala Asp Arg Pro Leu Ala Pro Ile Asp Pro Ser Ala Met Val Gly Gln

660 665 670

Val Gly Pro Gln Val Val Asn Ile Asp Thr Lys Phe Gly Tyr Asn Asn

675 680 685

Ala Val Gly Ala Gly Thr Gly Ile Val Ile Asp Pro Asn Gly Val Val

690 695 700

Leu Thr Asn Asn His Val Ile Ser Gly Ala Thr Glu Ile Ser Ala Phe

705 710 715 720

Asp Val Gly Asn Gly Gln Thr Tyr Ala Val Asp Val Val Gly Tyr Asp

725 730 735

Arg Thr Gln Asp Ile Ala Val Leu Gln Leu Arg Gly Ala Ala Gly Leu

740 745 750

Pro Thr Ala Thr Ile Gly Gly Glu Ala Thr Val Gly Glu Pro Ile Val

755 760 765

Ala Leu Gly Asn Val Gly Gly Gln Gly Gly Thr Pro Asn Ala Val Ala

770 775 780

Gly Lys Val Ala

785

<210>2

<211>361

<212>PRT

<213>鸟分枝杆菌副结核亚种

<400>2

Met Ser Lys Ser His His His Arg Ser Val Trp Trp Ser Trp Leu Val

1 5 10 15

Gly Val Leu Thr Val Val Gly Leu Gly Leu Gly Leu Gly Ser Gly Val

20 25 30

Gly Leu Ala Pro Ala Ser Ala Ala Pro Ser Gly Leu Ala Leu Asp Arg

35 40 45

Phe Ala Asp Arg Pro Leu Ala Pro Ile Asp Pro Ser Ala Met Val Gly

50 55 60

Gln Val Gly Pro Gln Val Val Asn Ile Asp Thr Lys Phe Gly Tyr Asn

65 70 75 80

Asn Ala Val Gly Ala Gly Thr Gly Ile Val Ile Asp Pro Asn Gly Val

85 90 95

Val Leu Thr Asn Asn His ValIle Ser Gly Ala Thr Glu Ile Ser Ala

100 105 110

Phe Asp Val Gly Asn Gly Gln Thr Tyr Ala Val Asp Val Val Gly Tyr

115 120 125

Asp Arg Thr Gln Asp Ile Ala Val Leu Gln Leu Arg Gly Ala Ala Gly

130 135 140

Leu Pro Thr Ala Thr Ile Gly Gly Glu Ala Thr Val Gly Glu Pro Ile

145 150 155 160

Val Ala Leu Gly Asn Val Gly Gly Gln Gly Gly Thr Pro Asn Ala Val

165 170 175

Ala Gly Lys Val Val Ala Leu Asn Gln Ser Val Ser Ala Thr Asp Thr

180 185 190

Leu Thr Gly Ala Gln Glu Asn Leu Gly Gly Leu Ile Gln Ala Asp Ala

195 200 205

Pro Ile Lys Pro Gly Asp Ser Gly Gly Pro Met Val Asn Ser Ala Gly

210 215 220

Gln Val Ile Gly Val Asp Thr Ala Ala Thr Asp Ser Tyr Lys Met Ser

225 230 235 240

Gly Gly Gln Gly Phe Ala Ile Pro Ile Gly Arg Ala Met Ala Val Ala

245 250 255

Asn Gln Ile Arg Ser Gly Ala Gly Ser Asn Thr Val His Ile Gly Pro

260 265 270

Thr Ala Phe Leu Gly Leu Gly Val Thr Asp Asn Asn Gly Asn Gly Ala

275 280 285

Arg Val Gln Arg Val Val Asn Thr Gly Pro Ala Ala Ala Ala Gly Ile

290 295 300

Ala Pro Gly Asp Val Ile Thr Gly Val Asp Thr Val Pro Ile Asn Gly

305 310 315 320

Ala Thr Ser Met Thr Glu Val Leu Val Pro His His Pro Gly Asp Thr

325 330 335

Ile Ala Val His Phe Arg Ser Val Asp Gly Gly Glu Arg Thr Ala Asn

340 345 350

Ile Thr Leu Ala Glu Gly Pro Pro Ala

355 360

<210>3

<211>467

<212>PRT

<213>鸟分枝杆菌副结核亚种

<400>3

Met Phe Tyr Gly Ala Phe Pro Pro Glu Phe Asn Ser Gly Arg Met Tyr

1 5 10 15

Ser Gly Pro Gly Ala Gly Ser Phe Val Ala Ala Ala Thr Ala Trp Gln

20 25 30

Asn Leu Ala Ala Glu Leu Gln Ser Ala Ala Ala Ser Tyr Ser Thr Val

35 40 45

Leu Ser Gly Leu Thr Ala Gly Pro Trp Val Gly Pro Ser Ser Leu Ala

50 55 60

Met Ala Ser Ala Ala Ala Pro Tyr Val Ala Trp Met Gln Gln Thr Ala

65 70 75 80

Ala Gln Ala Ala Glu Thr Ala Ala Gln Ala Thr Ala Ala Ala Thr Ala

85 90 95

Tyr Glu Thr Ala Phe Ala Ala His Val Pro Pro Ala Val Ile Thr Glu

100 105 110

Asn Arg Ala Leu Leu Ala Gln Leu Val Ala Thr Asn Ile Phe Gly Gln

115 120 125

Asn Thr Ala Ala Ile Ala Ala Asn Glu Ala Gln Tyr Gly Glu Phe Trp

130 135 140

Ala Gln Asp Ala Thr Ala Met Asp Thr Tyr Phe Ala Ala Ser Ala Thr

145 150 155 160

Ala Ala Asn Lys Leu Thr Glu Phe Gly Pro Ala Pro Lys Thr Thr Asn

165 170 175

Glu Ala Ala Gln Pro Met Gln Ala Ala Ala Val Ser Ser Ala Ala Ser

180 185 190

Thr Pro Ala Ala Asn Val Ala Gln Thr Ala Ala Ser Ala Ala Ser Thr

195 200 205

Thr Leu Pro Tyr Ser Gly Pro Phe Ser Gly Pro Ala Asn Leu Ala Tyr

210 215 220

Leu Tyr Gln Thr Phe Met Thr Asn Leu Phe Asn Thr Val Pro Gly Gly

225 230 235 240

Ala Ser Phe Tyr Thr Ser Met Tyr Asn Ala Val Lys Val Pro Leu Gly

245 250 255

Leu Thr Thr Gln Phe Asn Asp Va1 Gly Leu Leu Val Asn Phe Pro Leu

260 265 270

Ser Gln Trp Leu Lys Phe Ala Pro Pro Ile Gly Tyr Gly Ala Leu Pro

275 280 285

Lys Asp Ala Leu Gly Ala Gly Leu Gly Ala Leu Gly Phe Gly Arg Gly

290 295 300

Thr Leu Tyr Ser Ala Ile Ser Pro Val Ala Gly Met Gly Asn Ala Gly

305 310 315 320

Thr Leu Val Gly Lys Leu Ser Ile Pro Pro Ser Trp Ala Thr Ala Thr

325 330 335

Pro Ser Ile Arg Thr Val Ala Ala Ala Leu Ser Ala Ala Gly Ala Glu

340 345 350

Ala Val Pro Ala Ala Ala Leu Gly Glu Gly Ser Leu Phe Ser Ser Met

355 360 365

Gly Leu Ala Gly Met Leu Gly Ser Ala Val Gly Ser Gly Gly Pro Thr

370 375 380

Met Val Arg Gly Gly Va1 Arg Asn Arg Met Thr Ala Ile Lys Asp Leu

385 390 395 400

Lys Asp Lys Gln Ser Pro Glu Gln Leu Lys Arg Leu Val Ala Gln Ile

405 410 415

Ser Glu Gln Pro Glu Ser Val Gln His His Asn Val Asp Gln Glu Asn

420 425 430

Leu Asp Ala Leu Leu Glu Gln Leu Ala Lys Lys Pro Gly Ile His Ala

435440445

Val His Leu Lys Lys Gly Asp Lys Ser Lys Val Leu Pro AlaAsp Ala

450455460

Gln Leu Gly

465

<210>4

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR扩增引物

<400>4

tacatatgca tcatcatcat catcatctca accagagcgt ctcg 44

<210>5

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>5

tagaattcgg ccggcggccc ctccgcc 27

<210>6

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>6

ctaatcgaat tcatgttcta tggggccttt c 31

<210>7

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>7

taatcgatat ccaggacctt ggacttgtc 29

<210>8

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>8

atgatatcgg gctggcgccg gcgtcc 26

<210>9

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>9

atctcgagtc acgcgacctt gccggc 26

<210>10

<211>23

<212>DNA

<213>小鼠

<400>10

cctgagcagg atggagaatt aca 23

<210>11

<211>19

<212>DNA

<213>小鼠

<400>11

tccagaacat gccgcagag 19

<210>12

<211>25

<212>DNA

<213>小鼠

<400>12

cccaagcagg ccacagaatt gaaag 25

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>小鼠

<400>13

ggaagcacgg cagcagaata 20

<210>14

<211>24

<212>DNA

<213>小鼠

<400>14

aacttgaggg agaagtagga atgg 24

<210>15

<211>24

<212>DNA

<213>小鼠

<400>15

catcatcaaa ccagacccgc ccaa 24

<210>16

<211>25

<212>DNA

<213>小鼠

<400>16

catcttctca aaattcgagt gacaa 25

<210>17

<211>23

<212>DNA

<213>小鼠

<400>17

tgggagtaga caaggtacaa ccc 23

<210>18

<211>26

<212>DNA

<213>小鼠

<400>18

cacgtcgtag caaaccacca agtgga 26

<210>19

<211>24

<212>DNA

<213>小鼠

<400>19

tcaagtggca tagatgtgga agaa 24

<210>20

<211>21

<212>DNA

<213>小鼠

<400>20

tggctctgca ggattttcat g 21

<210>21

<211>27

<212>DNA

<213>小鼠

<400>21

tcaccatcct tttgccagtt cctccag 27

<210>22

<211>19

<212>DNA

<213>小鼠

<400>22

tcaccaccat ggagaaggc 19

<210>23

<211>20

<212>DNA

<213>小鼠

<400>23

gctaagcagt tggtggtgca 20

<210>24

<211>25

<212>DNA

<213>小鼠

<400>24

atgcccccat gtttgtgatg ggtgt 25

<210>25

<211>21

<212>DNA

<213>牛

<400>25

caaattccgg tggatgatct g 21

<210>26

<211>22

<212>DNA

<213>牛

<400>26

gcgacaggtc attcatcacc tt 22

<210>27

<211>28

<212>DNA

<213>牛

<400>27

atccagcgca aagccataaa tgaactca 28

<210>28

<211>23

<212>DNA

<213>牛

<400>28

ccaggatggt gactcgacta gac 23

<210>29

<211>20

<212>DNA

<213>牛

<400>29

tggctctgct ctcccagaac 20

<210>30

<211>28

<212>DNA

<213>牛

<400>30

ccgacataaa cctctgaaat ccgaccca 28

<210>31

<211>18

<212>DNA

<213>牛

<400>31

gcccctctga accccaaa 18

<210>32

<211>23

<212>DNA

<213>牛

<400>32

gcaggagtgt tgaaagtctc gaa 23

<210>33

<211>27

<212>DNA

<213>牛

<400>33

ccaaccgtga gaagatgacc cagatca 27

Claims

1.一种包含一重组蛋白的合成物，所述重组蛋白的氨基酸序列组成为由N-末端到C-末端：

i)一由SEQ ID NO：2氨基酸183-361组成的Map3527蛋白的C-末端片段；

ii)一由SEQ ID NO：3氨基酸1-460组成的Map1519蛋白序列；和

iii)一由SEQ ID NO：2氨基酸33-180组成的Map3527蛋白的N-末端片段。

2.如权利要求1的合成物，其中所述Map1519蛋白序列由SEQ IDNO：3的蛋白序列组成。

3.如权利要求1的合成物，其中所述重组蛋白由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成。

4.如权利要求1的合成物，其中所述合成物进一步包括一佐药。

5.如权利要求4的合成物，其中所述佐药选自以下群组包括：单磷酰酯A，双十八烷基二甲基溴化铵，及其组合。

6.如权利要求1的合成物进一步包括一鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白，其中所述蛋白是选自以下群组：鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白85A，鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白85B，鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白过氧化物歧化酶，及其组合。

7.一种如权利要求1的合成物在制备在一哺乳类动物内激发对抗鸟分枝杆菌副结核亚种的免疫反应的药物中的应用，所述应用包括对所述哺乳类动物施予如权利要求1的合成物。

8.如权利要求7的应用，其中所述合成物进一步包括一佐药。

9.如权利要求8的应用，其中所述佐药是选自以下群组：单磷酰酯A和双十八烷基二甲基溴化铵。

10.如权利要求7的应用，其中所述合成物是施予一反刍动物。

11.如权利要求10的应用，其中所述反刍动物是牛，绵羊，山羊，鹿。

12.如权利要求11的应用，其中所述鹿是麋鹿。

13.如权利要求11的应用，其中所述反刍动物是牛。

14.如权利要求10的应用，其中所述反刍动物并没有受鸟分枝杆菌副结核亚种感染。

15.如权利要求10的应用，其中所述反刍动物受了鸟分枝杆菌副结核亚种感染。

16.如权利要求13的应用，其中所述牛患有约尼氏病。

17.如权利要求7的应用，其中所述动物是怀孕的。

18.如权利要求7的应用，其中所述合成物进一步包括一鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白，其中所述蛋白是选自以下群组：鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白85A，鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白85B，鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白过氧化物歧化酶，及其组合。

19.如权利要求7的应用，其中所述合成物的重组蛋白由SEQ IDNO：1的序列组成。