PT2200641E - Composições para estimular uma resposta imune a mycobacterium avium subespecies paratuberculosis - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÕES PARA ESTIMULAR UMA RESPOSTA IMUNE A MYCOBACTERIUM AVIUM SUBESPECIES PARATUBERCULOSIS"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito no geral a estimulação de respostas imunológicas e, mais especificamente as composições e métodos para estimular respostas imunológicas profiláticas e ou terapêuticas contra Mycobacterium avium subespecies paratuberculosis.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Mycobacterium avium subespecies paratuberculosis (MAP) é o agente causador da doença de Johne (JD), que causa a enterite granulomatosa crónica nos ruminantes. Os animais clinicamente afetados desenvolvem diarreia crónica e perda de peso progressiva que eventualmente resulta na morte, enquanto os animais subclinicamente infetados principalmente tem produção diminuída de leite. JD é de importância económica tremenda para a indústria de laticínios em todo o mundo, causando grandes perdas devido à produção reduzida e abate precoce dos animais com estimativas de 20% dos rebanhos leiteiros dos EUA afetados e os custos de S220 milhões por ano para a indústria de laticínios (Wells, et al. 2.000. J. Am, Vet. Med. Assoe. 216:1450-1457). Os bovinos são mais suscetíveis a infeção com este organismo dentro dos primeiros 6 meses de vida, mas a doença tipicamente não se torna evidente até 3 a 5 anos de idade. A infeção ocorre pela ingestão de estrume contaminado, colostro ou leite de vacas infetadas (Sweeney, 1996. Vet. Clin. N. Am.: Food Anim. Pract, 12: 305-312). A infeção fetal também ocorre, principalmente em vacas 3 gestantes com doença avançada (Sweeney et al. 1992. Am. J. Vet. Res, 53: 477 - 480) . Além disso, a significância de MAP tem aumentado significativamente por causa do seu papel potencial como um agente causador da doença de Crohn em pessoas (Chamberlin, et al. Aliment Pharmacol Ther 2001; 15 (3) :337-46; Naser SA, et al Mol Cell Probs 2002: 16 (1) : 41-8). A vacina JD correntemente aprovada para o uso no campo é uma suspensão oleosa de uma cepa morta de MAP, que tem limitações significativas. Primariamente, a eficácia desta vacina é questionável, com resultados variados em testes de vacinação diferentes. Uma outra preocupação é a interferência de bacterianas de célula inteira com os testes de diagnóstico, visto que os animais vacinados têm reações positivas falsas à tuberculose e paratuberculose). Assim, a demanda quanto a vacinas melhoradas está em ascensão, mas elas precisam ser potentes e ao mesmo tempo não devem interferir com o diagnóstico de tuberculose e JD. Para atingir esse objetivo, vários métodos têm sido tentados, que incluem vacinas recombinantes, vacinas de ADN e vacinas de subunidade (13; Shin SJ, et al. Infect Immun 2005; 73 (8) : 5074-85) . Entretanto, continua a haver uma necessidade para o desenvolvimento quanto a vacinas de MAP aperfeiçoadas. A patente nos EUA No. 7074559 82 divulga moléculas de ácido nucleico específicas da Mycobacterium paratuberculosis compreendendo uma sequência particular, polipeptídeos codificados por estas moléculas de ácido nucleico especificas da Mycobacterium paratuberculosis e anticorpos que têm afinidade de ligação específica para os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico 4 específicas da Mycobacterium paratuberculosis. Também descreve métodos para detetar a M. paratuberculosis numa amostra, utilizando as moléculas de ácido nucleico, polipeptídeos e anticorpos divulgados e divulga métodos para prevenir uma infeção por M. paratuberculosis em animais com base nas moléculas de ácidos nucleicos, polipeptídeos e anticorpos descritos.

Li et al. "The complete genome sequence of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis ", PNAS, vol. 102, n. 35, 30 de agosto de 2005, páginas 12344-12349 está relacionado com o fornecimento de um teste de diagnóstico para a doença de Johne em bovinos. O texto divulga a sequência do genoma de um clone comum de MAP, bem como sequências específicas de MAP que são suscetíveis de servir como alvos potenciais para testes de diagnóstico moleculares e imunogénicos sensíveis e específicos.

Finalmente, a publicação do pedido de patente nos EUA N°. 2007/0134274 Al descreve um certo número de identificadores genómicos como potenciais alvos para vacinas e outros medicamentos contra a doença de Johne. São descritos métodos, que podem ser utilizados para entregar um composto de imunização a um mamífero e para fornecer uma resposta imune contra a doença de Johne ou de Crohn no mamífero.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece composições e métodos para estimular uma resposta imunológica em mamíferos contra MAP. As composições compreendem um novo polipeptídeo recombinante de 79 kDa aqui referido como "Map74F". Map74F foi gerado pela ligação de um fragmento de terminal C de ~17,6 kDa da proteína Map3527 a um fragmento de proteína 5

Mapl519, seguido no terminal C por uma porção terminal N de 14,6 kDa da proteína Map3527.

Além da Map741, as composições da invenção também podem 5 compreender outras proteínas MAP, tais como as proteínas MAP 85A, 85B, 85C, 35kDa, SOD, MptC, MptD e proteína equivalente a ESAT-6, e suas combinações. 0 método compreende administrar a composição de a um mamífero numa quantidade eficaz para estimular uma resposta imunológica contra bactérias MAP. Espera-se que o método seja de benefício a qualquer mamífero suscetível a infeção pela MAP, mas é particularmente benéfico para os ruminantes.

As composições podem ser formuladas com carregadores farmacêuticos padrão e podem ser administradas através de qualquer de uma variedade de vias convencionais. As composições podem ser administradas a qualquer momento para um animal suscetível de contrair infeções MAP ou a um animal que esta infetado com MAP. Entretanto, é preferível administrar as composições antes da infeção pela MAP, tal como pela administração a animais prenhes que podem transferir componentes imunológicos profiláticos para seus recém-nascidos através do colostro, ou pela administração durante o período de um a cinco semanas após o nascimento.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura IA fornece uma representação esquemática da construção de Map74F. Map74F foi gerado pela ligação sequencial do seu terminal N para C das ORFs que codificam um fragmento de terminal C da proteína Map3527 ligada a uma ORF que codifica os aminoácidos de 1-460 da proteína 6

Mapl519, e terminando com uma ORF que codifica um fragmento de terminal N de Map3527. A ORF que codifica Map74F tem 2397 nucleótidos (nt) e a mesma codifica um polipeptídeo 799 aminoácidos com uma massa molecular prognosticada de ~79 kDa. A Figura 1B fornece uma representação fotográfica de SDS-PAGE a 10% tingido com Coomassie Blue de lisados de E. coil (BL21/pLysE) transformados com um vetor de expressão que codifica Map74F. As células foram cultivadas e induzidas com IPTG 1 mM. As linhas representam lisados antes (linha UI) ou 3 horas depois (linha I) da indução de IPTG. Map74F recombinante purificada e mostrada na linha P juntamente com marcador de massa molecular (linha M).

As Figuras 2A - 2D fornecem representações gráficas de dados obtidos de ratinhos sacrificados 3 semanas após a vacinação de reforço. As células do baço de ratinhos, administrados com Map74F+ Monofosforil lipídeo A (MPL) e MPL sozinho foram estimuladas por 2 dias com 10 yg/mL de Map74F, ConA e meio. Para os dados apresentados na Fig. 2A, sobrenadantes de cultura foram ensaiados quanto aos níveis de IFN-γ por ELISA. Para os dados apresentados na Fig. 2B, o ensaio de ELispot para determinar os números relativos de células que expressam IFN-γ em suspensões de baço de célula imica de ratinhos imunizados e de controlo estimulados com e sem antígenos. Na Fig. 2C, os dados da análise FACS de células do baço para as populações de subconjunto de linfócito recolhidas dos animais vacinados (Map74F+MPL) e de controlo (MPL, ConA-MPL) após a estimulação com os antígenos recombinantes e de controlo são apresentados. Na Fig. 2D, os dados são apresentados para a expressão do mRNA de citocina em resposta a Map74F normalizados para o gene 7 de manutenção GAPDH. Os dados são representativos de três experiências independentes.

As Figuras 3A e 3B apresentam dados obtidos a partir de soros recolhidos de animais vacinados e de controlo em pontos de tempo diferentes (pré- vacinação/vacinação primária (PV), vacinação de reforço (B) , antes da inoculação (BC), 4, 8, 12 e 16 semanas após a inoculação) e verificação quanto a resposta de anticorpo. Os dados apresentados na Fig. 3A são de soros testados quanto aos anticorpos específicos de Map74F. A Fig. 3B apresenta os dados de teste para razões IgGl:IgG2, por ELISA. Os dados são representativos de três experiências independentes.

As Figuras 4A e 4B fornecem representações gráficas de dados mostrando a expressão de imunidade protetiva em baço (Fig. 4A), fígado (Fig. 4B) e linfonodos mesentéricos (MLN) (Fig. 4C), conferida pela vacinação com Map74F+MPL. Map74F significativamente reduziu a carga de MAP no baço (em 8 -16 semanas após a inoculação), fígado (em 12 - 16 semanas após a inoculação) e MLN (em 8-16 semanas após a inoculação) . Os dados são representativos de três experiências independentes.

As Figuras 5A a 5D fornecem representações fotográficas de examinação histopatológica dos tecidos de ratinhos vacinados e não vacinados. A Fig. 5A é representativa do fígado de um ratinho de controlo não vacinado. Numerosos granulomas grandes estão aleatoriamente dispersos por todo o fígado. Hematoxilina e eosina. Bar = 100 nm. Inserto: Amplificação mais alta de um granuloma demonstrando numerosos bacilos resistentes a acido. Tingimento de Ziehl-Neelsen. A Fig. 5B e representativa do fígado de um ratinho vacinado com Map74F. Apenas números esparsos de pequenos agregados linfoides acompanhados por uns poucos macrófagos estão presentes. A Fig. 5C é representativa do baço de um ratinho de controlo não vacinado mostrando granulomas ocasionais na polpa branca. A Fig. 5D representativa do baço de um ratinho vacinado com Map74F. As polpas branca e vermelha são desprovidas de granulomas. Tingimento com Hematoxilina e eosina. Bar = 100 nm. Inserto: A ampliação mais alta de um granuloma demonstrando a ausência de bacilos rápidos em ácido. Tingimento de Ziehl-Nielsen.

As Figuras 6A-6C fornecem representações gráficas de dados que mostram respostas linfoproliferativas de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de animais imunizados (grupos I e II) e de controlo (grupo III) para os antigenos recombinantes (85A, 85B, Map74F e SOD), ConA e PPD. Os resultados são expressos como índice de estimulação (SI), e as barras de erro indicam o desvio padrão da média.

As Figuras 7A-7C fornecem representações gráficas de dados que mostram respostas de IFN-γ específicas de antígeno de PBMC de animais imunizados (grupos I e II) e de controlo (grupo III). Os resultados são expressos como valores OD e as barras de erro indicam o desvio padrão da média.

As Figuras 8A-8F fornecem representações gráficas de dados 10 mostrando a expressão de subconjuntos de linfócito de PBMC recolhidos dos grupos imunizados (I e II) e do grupo de controlo (III) em tempos especificados, após a estimulação com os antigenos recombinantes e de controlo como analisada pela citometria de fluxo. Os resultados são expressos como percentagem de células com tingimento positiva em relação a amostra não induzida (cultivadas com 9 o meio). As barras de erro indicam o desvio padrão da média.

As Figuras 9A e 9B fornecem representações gráficas de dados que mostram a expressão do mRNA de gene da citocina em resposta aos antigenos recombinantes nos grupos imunizados (I e II) e grupo de controlo (III) . Os resultados são expressos como o aumento médio de vezes em relação às PBMC não estimuladas, que serviram como calibradores. As barras de erro indicam o desvio padrão da média. A Fig. 10. Respostas de anticorpo aos antigenos recombinantes individuais nos animais do grupo vacinado I e II e nos animais do grupo de controlo III. As barras de erro representam o desvio padrão da média. A Fig. 11 fornece um resumo tabular dos resultados da cultura de MAP (CFU) medidos em vários tecidos recolhidos na necropsia.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção fornece composições e métodos para estimular uma resposta imune contra a MAP num animal. As composições compreendem um polipeptídeo recombinante aqui referido como Map74F. A matriz de leitura aberta (ORF) que codifica Map74F tem 2397 nucleótidos no comprimento e codifica um polipeptídeo de 799 aminoácidos. A sequência da proteína Map74F é fornecida na SEQ ID NO: 1. Map74F tem uma massa molecular calculada com base na sua composição de aminoácidos que é de 7 9 kDa, a despeito de sua massa molecular aparente de cerca de 74 kDa, como estimado pela análise SDS-PAGE. A sequência fornecida na 10 SEQ ID NO: 1 e mostrada sem um rótulo de purificação opcional, tal como um rótulo de histidina.

Map74F foi construída, ligando-se a partir do terminal N para o terminal C um fragmento de terminal C de ~17,6 kDa de proteína Map3527, um fragmento de 46,8 kDa da proteína Mapl519, seguido por um fragmento de terminal N de -14,6 kDa da proteína Map3527. Uma representação esquemática de Map74F é fornecida na Figura 1.

As sequências de aminoácidos completas de Map3527 e Mapl519 são fornecidas como SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3, respetivamente. O fragmento de terminal C de 17,6 kDa da proteína Map3527 presente no Map74F é representado pelos aminoácidos 183 a 361 da SEQ ID NO: 2. O fragmento de 46,8 kDa da proteína Mapl519 presente na Map74F é representado pelos aminoácidos de 1-460 da SEQ ID NO: 3. O fragmento de terminal N de 14,6 kDa de Map3527 presente em Map74F é representado pelos aminoácidos de 33-180 da SEQ ID NO: 2. É esperado que os fragmentos mais longos de Mapl519 e dos terminais N e C de Map3527 possam ser incluídos numa proteína recombinante que seja útil no método da invenção.

Além da MAP74F, as composições da invenção podem compreender outros agentes que podem estimular uma resposta imune contra bactérias MAP. Por exemplo, as composições podem compreender uma ou mais outras proteínas MAP, tais como as proteínas MAP 85A, 85B, 85C, 35 kDa, Superóxido dismutase (SOD), MptC, MptD e proteína equivalente a ESAT-6 e suas combinações. Estas proteínas são descritas no pedido U.S. N. 11/816,365.

Numa forma de realização a composição compreende 11 MAP74F e uma ou mais das proteínas MAP 85A, 85B ou SOD. A sequência de ADN que codifica o gene MAP 85A e a sequência de aminoácidos do gene 85A são fornecidas no acesso do GenBank AF280067 (10 de outubro de 2003, entrada) . A sequência de ADN que codifica o gene MAP 85B e a sequência de aminoácidos do gene 85A são fornecidas no acesso do GenBank AF219121 gene 85B (21 de novembro de 2002, entrada) . A sequência de ADN que codifica o gene MAP 85C e a sequência de aminoácidos do gene 85C são fornecidas no acesso do GenBank AF280068 (21 de novembro de 2002, entrada) . A sequência de ADN que codifica o gene MAP SOD e a sequência de aminoácidos do gene SOD são fornecidas no acesso do GenBank AF180816 (30 de novembro de 2001, entrada). O método da invenção compreende administrar uma composição que compreende Map74F a um mamífero numa quantidade eficaz para estimular uma resposta imune contra o MAP. A resposta imune estimulada pode compreender a estimulação de qualquer componente do sistema imunológico, incluindo mas não limitado à geração de anticorpos reativos aos antígenos de MAP, a estimulação da proliferado de linfócito, a produção de citocinas associadas com Thl, tais como IFN-γ, e combinações do precedente.

Também

Map74F pode ser administrada a um animal na forma de um vetor. Por exemplo, sequências de ácido nucleico que codificam Map74F podem ser clonadas no genoma de uma bactéria (por exemplo, Salmonella) ou um virus (por exemplo, virus do herpes bovino-1 (BHV-1)), e a bactéria ou vírus recombinantes resultantes podem ser administrados aos animais. Assim, a presente invenção também inclui vetores bacterianos e virais que expressam Map74F. 12 consideradas dentro do escopo desta invenção estão as metodologias de vacina de ADN em que as moléculas de ácido nucleico que codificam Map74F, sozinhas ou em combinação com um adjuvante ou agente facilitador de transfecção, são administrados diretamente aos animais. 0 método pode fornecer o beneficio a qualquer animal suscetivel a infeção pela MAP. As composições e método são particularmente bem adequadas para a profilaxia ou terapia para infeção pela MAP de ruminantes, incluindo mas não limitados a bovinos, ovinos, caprinos, cervos e alces, antílopes e búfalos Numa forma de realização, o método pode ser usado para a profilaxia ou terapia da Doença de Johne.

As composições podem ser administradas a qualquer animal infetado ou não infetado pela MAP. A administração das composições aos animais infetados de acordo com o método da invenção é considerada para estimular uma resposta terapêutica imunológica. No entanto, a invenção também inclui administrar as composições antes da infeção pela MAP para estimular uma resposta profilática. Por exemplo, as composições podem ser administradas a um animal em prenhez que pode transferir componentes imunológicos profiláticas para os seus recém-nascidos não infetados através do colostro ou leite durante a lactação. Alternativamente, as composições podem ser administradas durante o período de uma a cinco semanas após o nascimento para fornecer um efeito profilático que possa prevenir a infeção pela MAP ou reduzir a severidade da doença se a infeção ocorrer. Assim, numa forma de realização, o método da invenção é a profilaxia para a infeção pela MAP, enquanto que noutra forma de realização, o método é terapêutico para a infeção 13 pela MAP.

As composições podem ser formuladas com carregadores farmacêuticos padrão e podem ser administradas através de qualquer uma de uma variedade de vias convencionais. Alguns exemplos de carregadores farmacêuticos aceitáveis para o uso com proteínas são descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences (18a Edição, A. R. Gennaro et al. Eds., Mack Publishing. Co., Easton, Pa., 1990).

As composições usadas no método da invenção também podem ainda compreender adjuvantes. Qualquer adjuvante convencional pode ser usado.

Numa forma de realização, o adjuvante pode ser Monofosforil lipídeo A (MPL) , que pode ser fornecido em combinação com dicorinomicolato de trealose sintético. Numa outra forma de realização, o adjuvante pode ser brometo de dimetildioctadecil amónio (DDA).

As composições da invenção podem ser administradas por qualquer via aceitável. As vias adequadas de administração incluem oral, mucósica e parenteral (por exemplo, injeção intravascular, intramuscular e subcutânea). As composições podem ser administradas em qualquer tempo a um animal suscetível de contrair infeção pela MAP ou a um animal que esta infetado com MAP.

Os peritos na técnica reconhecerão que a quantidade de MAP74F e quaisquer outros agentes antigénicos na composição administrada a um animal particular dependerá de vários fatores, tais como a via de administração, e o tamanho, condição física e a situação da MAP do animal, e pode ser 14 ajustada pelos peritos na técnica para se obter o resultado desejado. As composições podem ser usadas numa administração única ou numa série de administrações para reforçar a resposta imunológica. No geral, uma dosagem total entre 10 e 200 yg de proteina pode ser administrada.

Os seguintes exemplos descrevem as várias formas de realização da invenção. Estes exemplos são ilustrativos e não são intencionados a serem restritivos. EXEMPLO 1

Este exemplo fornece uma descrição da clonagem, expressão e purificação de Map74F.

Geração de uma ORF ligada em tandem que codifica Map74F.

Map74F foi gerado pela ligação sequencial em tandem das ORFs do fragmento de terminal C de ~17,6 kDa de Map3527 a uma ORF que codifica uma Proteina tendo uma massa molecular de 46,8 kDa, seguido no terminal C com a porção de terminal N de ~14.6 kDa de Map3527.

Geração de construção Map3527c desprovida de um códon de parada.

Os oligonucleotídeos de 5' e 3' para a porção de terminal C de Map3527 (Map3527c) foram designados como segue: 5' (TA CATATG CAT CAT CAT CAT CAT CAT CTC AAC CAG AGC GTC TCG GC 3' (SEQ ID NO: 4)) e (5' TA GAATTC GGC CGG CGG CCC CTC CGC C 3' (SEQ ID NO: 5) ) . O oligonucleotideo 5' conteve um sitio de restrição Ndel precedendo um códon de iniciação ATG, seguido pelas sequências de nucleótido que codificam seis residuos de histidina (itálicos). O oligonucleotideo 15 3' conteve um sítio de restrição EcoRI. Estes oligos foram usados para amplificar Map3527c, a porção carboxila de 540 nucleótidos (uma de 14,6 kDa, 180 resíduos de aminoácidos) de Map3527 e o produto amplificado pela PCR resultante foi ligado a um vetor Topo PCR2.1. O ADN plasmídico com o inserto correto foi digerido com Ndel e EcoRI, e ligado no vetor de expressão pET17b cortado com as mesmas enzimas. Os produtos ligados foram transformados em células DH5oí de Escherichia coli e um transformante com o inserto correto (Map3527c) foi identificado pela digestão com enzima de restrição e sequenciamento de ADN. A amplificação pela PCR das sequências codificadoras de tamanho natural de Mapl519 e ligação no plasmídeo Map3527c-PET.

Os oligos 5' e 3' de Mapl519 contiveram as seguintes sequências: 5'(5'-CTA ATC GAATTC ATG TTC TAT GGG GCC TTT C SEQ ID NO: 6)) e 3' (5' TA ATC GATATC CAG GAC CTT GGA CTT GTC-3' SEQ ID NO: 7)). O oligonucleotídeo 5' conteve um sítio de restrição EcoRI. O oligonucleotídeo 3' teve um sítio de restrição EcoRV, seguido imediatamente pelas sequências que compreendem os seis resíduos de aminoácidos de terminal C e desprovido de um códon de parada. A amplificação da sequência codificadora de Mapl519 (1380 pares de base, um trecho de 460 aminoácidos com um tamanho previsto de -46,8 kDa), e o produto amplificado pela PCR resultante foi ligado ao vetor Topo pCR2.1 cortado com as mesmas enzimas. O clone com o inserto correto foi digerido com EcoRI e EcoRV e ligado ao plasmídeo Map3527c-PET pré-digerido com EcoRI/EcoRV. Os produtos ligados foram depois transformados em células DH5a da E. coli e um transformante com o inserto correto (Map3527c-Mapl519) foi identificado 16 pela digestão com a enzima de restrição e verificado pelo sequenciamento de ADN.

Clonagem do fragmento de terminal N de Map3527 na construção de Map3527C-Mapl519.

Os oligonucleotídeos 5' e 3' do fragmento de terminal N de Map3527 foram planejados como descrito abaixo: 5'(5'-AT GATATC GGG CTG GCG CCG GCG TCC-3' SEQ ID NO: 8)) e 3'(5'-AT CTCGAG TCA CGC GAC CTT GCC GGC-3' SEQ ID NO: 9)). 0 oligonucleotideo 5' conteve um sitio de restrição EcoRV. O oligonucleotideo 3' conteve um sitio de restrição Xhol.

Eles foram planejados para amplificar a porção de 447 pares de base do terminal N (resíduos de 14 9 aminoácidos) de Map3527. 0 produto amplificado pela PCR resultante foi digerido com EcoRV e Xhol, e ligado no plasmídeo pET da fusão Map3527c-Mapl519 digerido com EcoRV e Xhol. A mistura de ligação foi usada para transformar células de DH5oí da E coli e os clones positivos foram identificados pela digestão de restrição e verificados pelo sequenciamento de ADN. A construção final, codifica uma poliproteína de 74 kDa (Map74F), que compreende uma única ORF organizada na ordem linear, Map3527C-Mapl519-Map3527N. com

Expressão e purificação da proteína recombinante Map74F A construção de ADN plasmídico foi transformada em células de E. coli BL21 (DE3 pLysE). As células de E. coli transformadas foram plaqueadas em LB agar suplementado com ampicilina (100 yg/mL). A colonia única foi inoculada em 10 mL de caldo LB com ampicilina (100 yg/mL) e cultivada a 37 °C durante a noite com agitação. A cultura foi diluída 1:100 no caldo LB contendo ampicilina (100 yg/mL) e cloranfenicol (34 yg/mL) e cultivados a 37 °C, 17 agitação. Após 3 horas de indução com IPTG 1 mM (Invitrogen Co, Carlsbad, CA) , as células foram colhidas por centrifugação (5000Xg) e lavadas uma vez em PBS. As células foram colocadas em suspensão em tampão A (50 mM de TrisHCl, 1 mM de EDTA, 50 mM de NaCl, pH 8,0) e lisadas numa prensa de célula French ou rompedor de célula. Depois de girar os corpos de inclusão, as pelotas foram lavadas três vezes com o tampão de lavagem de corpo de inclusão (Tampão A + 1% de Triton X-100) e duas vezes com tampão CHAPS (Sigma-Aldrich, St. Louis. MO) (1% de CHAPS em 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0) de modo a remover lipopolissacarideos (LPS). Os corpos de inclusão foram dissolvidos em tampão B (100 mM de fosfato de sódio. 10 mM de Tris-HCl, 8 M de ureia. 2 mM de PMSF (Sigma) e 20 pg/mL de leupeptina (Sigma), pH 8,0) e purificada com coluna de agarose Ni-NTA (Invitrogen). As frações eluidas foram verificadas pela SDS-PAGE e as frações contendo a proteína recombinante foram agrupadas e dialisadas contra 10 mM de Tris-HCl (pH 7,8) durante a noite a 4 °C por duas vezes. A proteína foi passada através do Gel de Remoção de Endotoxina Detoxi-Gel (Pierce, Rockford, IL) e a proteína purificada foi verificada quanto aos níveis de endotoxina pelo ensaio de amebócitos Limulus. A proteína purificada teve níveis negligenciáveis de endotoxina (10 pg/mL).

Uma representação diagramática de Map74F mostrando a organização e sítios de enzima de restrição usados para construir a poliproteína e mostrada na Figura 1. A ORF de Map74F tem 2397 nucleótidos de comprimento, que codifica um polipeptídeo de 799 aminoácidos (Fig. 1B) com uma massa molecular prognosticada de ~79 kDa. O planejamento e construção da ORF resultou na introdução de duas sequências de dobradiça (EcoRI e EcoRV) de seis nucleótidos, que 18 codificam dois aminoácidos em cada um dos sitios de junção que conectam os três. Além disso, a ORF foi planejada para ter seis residuos de histidina no terminal N para purificação usando a matriz Ni-NTA. Depois da expressão na E. coli, a proteina recombinante foi purificada a partir de corpos de inclusão e analisada pela SDS-PAGE (Figura 1B) com rendimentos que variam em torno de 1,5 a 2,0 mg de proteina purificada a partir de um litro de cultura induzida. EXEMPLO 2

Este exemplo demonstra o uso de Map74F para simular uma resposta imune contra o MAP num modelo de ratinho.

Os ratinhos foram descobertos ser um modelo adequado para escudos de infeção pela MAP. A carga bacteriana e a patologia de oragos específicos são bons indicadores da situação de infeção de ratinhos a seguir da inoculação com MAP. Nos ratinhos, o fígado, baço e linfonodos mesentéricos são os órgãos de escolha para avaliar a carga bacteriana a seguir da inoculação de MAP. Neste exemplo, a carga de MAP nesses órgãos foi avaliada para medir a eficácia protetiva de Map74F a seguir da inoculação. É evidente a partir dos resultados apresentados abaixo que os animais imunizados com Map74F foram capazes de matar ou inibir a proliferação de MAP num curso de 16 semanas de infeção. No baço, fígado e MLN, o número de CFU diminuiu em 8 semanas após a inoculação, sugerindo a eliminação da MAP. Além da carga bacteriana, o número reduzido de granulomas e menos organismos rápidos em acido observados no fígado e no baço de animais vacinados indicaram a eficácia protetiva da poliproteína. A carga de MAP substancialmente reduzida nos órgãos e a patologia no fígado e baço melhorada indicam que 19 a imunização com 74F protegeu os ratinhos contra a infeção da MAP diminuindo-se ou eliminando-se rapidamente a carga de MAP. Map74F também evoca altos niveis de IFN-γ'. Map74IF induziu uma boa resposta Thl.

Os seguintes materiais e métodos foram usados neste exemplo.

Animais

Experiências foram realizadas usando ratinhos C57/13L6 fêmeas de 6 a 8 semanas de idade (Harlan Sprague, Indianapolis, Indiana). Os animais foram mantidos numa instalação de biossegurança de nivel II e tiveram livre acesso a ração e água. Todo o trabalho experimental foi conduzido em conformidade com os regulamentos, políticas e princípios do Animal Welfare Act, the Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animais used in Testing. Research, and Training, the NHI Guide for the Care and Use of Laboratory Animais and the New York State Department of Public Health.

Variedade bacteriana

Uma MAP isolada de uma vaca infetada, designada MAP 66115-98, foi usada para inocular ratinhos e para o isolamento do ADN genómico A MAP 66115-98 foi cultivada em meio 7H9 suplementado com 10% de ácido oleico-albumina-dextrose-catalase (Becton, Dickinson and Co, Sparks, MD) e micobactina J (Allied Monitor, Inc, Fayette, MO) . Após o cultivo por 6-8 semanas, os organismos foram colhidos por centrifugação a 10.000 X g e lavados duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS: pH 7,2). Os organismos foram diluídos em PBS na concentração requerida e usados para inocular os ratinhos. 20

Imunização de Ratinhos

Os ratinhos foram divididos em dois grupos com 36 animais em cada grupo. Os animais do Grupo I foram imunizados duas vezes, três semanas separadamente com 50 pg/animal, da proteina de fusão formulada com Emulsão MPL + TDM (Ribi adjuvant systems, Corixa Hamilton, MT), num volume total de 100 pL por dose, via injeção subcutânea no dorso. Os animais do Grupo II foram mantidos como controlos não vacinados e administrados apenas com Emulsão MPL + TDM. Três semanas após a segunda imunização, 12 animais em cada grupo, designados para estudos de imunogenicidade, foram sacrificados e as células do baço foram obtidas por procedimentos convencionais. As células do baço foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY) , contendo 10% de FBS (Gibco) a 37 °C em 5% de CO2. As experiências de imunização foram repetidas duas vezes com a mesma dose e programa.

Inoculação dos ratinhos com MAP

Três semanas após a segunda imunização, 24 animais de cada Grupo I e II foram inoculados pela injeção intraperitoneal de 109 unidades CFU de Mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis. Seis animais cada em ambos os grupos foram sacrificados em 4, 8, 12 e 16 semanas após a

inoculação e o baço, figado e linfonodos mesentéricos (MLN) foram recolhidos e divididos em duas partes. Um conjunto de tecidos foi homogeneizado em PBS (100 mg/mL) e 100 pL de homogeneizados de tecido individual foram inoculados nos inclinados de gema de ovo de Herald (HEY) (Becton, Dickinson and Co, Sparks, MD) , contendo micobactina J. de modo a estimar a carga bacteriana. As inclinações foram verificadas quanto ao crescimento bacteriano através da contagem de colónias após 8-12 semanas de inoculação. O 21 outro conjunto de tecidos foi usado para exame histopatológico.

Exame Histopatológico

Partes do baço, figado e MLN foram fixados pela imersão em formalina a 10% tamponada neutra, embutidas em parafina, seccionadas em 4 pm e tingidas com hematoxilina e eosina e mancha de Ziehl-Neelsen por métodos histológicos convencionais e examinados por microscopia de luz. ELISA para resposta de anticorpo A resposta de IgG especifica de antigeno foi medida por ELISA convencional. As placas de ELISA (módulo Nunc-imuno, Nunc, Roskilde, Dinamarca) foram revestidas com 200 ng/poço de proteína recombinante e incubadas a 4 °C, durante a noite. Depois de lavar uma vez com PBST (0,05% de Tween 20 em PBS) , 300 pL de tampão de bloqueio (BSA a 1% em PBST) foram adicionados e incubados a 25 °C por 1 hora. As placas foram lavadas 3 vezes com PBST e 100 pL de amostras de soro diluídas foram adicionados aos poços e incubados a 37 °C por 1 hora. Para a resposta de IgG total, após a lavagem, 50 ng de IgG anti-ratinho de cabra conjugada a fosfatase alcalina (KPL, Gaithersburg, MD) foram adicionados aos poços e incubados a 25 °C por 30 minutos. Após a lavagem, 50 pL de substrato BluePhos (KPL) foram adicionados e incubados por 10 minutos. As placas foram lidas num leitor de microplacas ELX 808 Ultra (Bio-Tek Instruments, Inc, Winooski, VT) em 630 nm após a adição de 50 pL de solução de interrupção (KPL) . Para a resposta de isótopo, após a lavagem, 25 ng de IgGl ou IgG2a anti-ratinho de cabra conjugado a biotina (Southern Biotech, Birmingham, AL) foram adicionados aos poços e incubados a 25 °C por 30 minutos. Após a lavagem, 0,2 pg/mL de estreptavidina 22 rotulada com peroxidase de rabano (KPL) foi adicionado e incubado a 25 °C por 30 minutos. Após a lavagem, 50 yL de 3,3',5,5'-Tetrametilbenzidina (TMB) foram adicionados aos poços e incubados por 15 minutos. As placas foram lidas numa leitor de microplaca ELX 808 Ultra (Bio-Tek Instruments) pelo método de ponto final a 450 nm após a adição de 50 yL de H2SO4 1 N como solução de conclusão.

Ensaio de IFN-γ

As células do baço obtidas por processos convencionais foram plaqueadas em duplicata em 5 X 105 células/poço e cultivadas com e sem o antigeno recombinante por 48 horas. Os sobrenadantes de cultura foram colhidos e analisados quanto IFN-γ usando um kit de ELISA intercalado de fase sólida (Biosource, Camarillo, CA), de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, 50 yL de sobrenadantes de cultura foram adicionados aos poços revestidos com anticorpo monoclonal especifico para IFN-γ de ratinhos. Após 2 horas de co-incubação à temperatura ambiente com anticorpo policlonal biotinilado, os poços foram lavados e estreptavidina-peroxidase foi adicionada. Após 30 min de incubação e lavagem, solução de tetrametilbenzidina (TMB) foi adicionada aos poços e os resultados foram lidos a 450 nm no leitor de microplaca ELX 808 Ultra (Bio-Tek Instruments).

Ensaio de ELispot

Um kit ELispot (KPL) foi utilizado para determinar o número relativo de células que expressam IFN-γ nas suspensões de baço de célula única de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 10 yg/mL de Ab de captura de IFN-γ (BD Biosciences, San Jose, CA) foram revestidos sobre a placa de filtro de 96 poços MultiScreen (Millipore, 23

Bedford, MA) durante a noite a 4 °C. Após a lavagem com lx solução de lavagem, as placas foram bloqueadas por lx solução de BSA por 1 hora a 25 °C e lavadas mais uma vez. As células do baço foram plaqueadas em duplicata a 5 X 105 células / poço e cultivadas com e sem o antigeno por 48 horas a 37 °C. As placas foram lavadas com lx solução de lavagem e incubadas 1 hora a 25 °C com 5 yg/mL de Ab secundário IFN-γ anti-ratinho de rato conjugados com biotina (BD Biosciences). As placas foram lavadas e incubadas por 30 min a 25 °C com 0,2 yg/mL de HRP-estreptavidina. Os filtros foram desenvolvidos pelo substrato TureBlue por 15 minutos, secados no escuro e as manchas foram contadas.

Analise FACS para marcadores de superfície celular

As células do baço foram plaqueadas em duplicata em placas de cultura de tecido de 96 poços a 1 x 106 células / poço e cultivadas por 24 horas. A análise FACS, foi realizada após a estimulação das células do baço com 74F e concanavalina A com as células de controlo não estimuladas adequadas. Após a lavagem três vezes em tampão FACS (1% de BSA e 0,05% de azida de sódio em PBS), as células foram colocadas em suspensão em 50 yL de tampão FACS e misturadas com 0,5 yL de FITC ou anticorpos CD3, CD4 e CD8 conjugados a PE (eBioscience, San Diego, CA) e incubadas em gelo por 30 minutos. As células foram lavadas com tampão FACS duas vezes e colocadas em suspensão em 100 yL de formaldeido a 3% em PBS e transferidas para tubos FACS contendo 500 yL de PBS. Os dados foram recolhidos sobre 10.000 eventos usando um citómetro de fluxo calibrador FACS (Becton-Dickinson. San Jose, CA) e analisados usando o software Cellquest. Os resultados foram expressos como a percentagem média aumentada de células com coloração positiva em relação àquela da amostra não induzida manchada com o mesmo anticorpo. RT-PCR em tempo real, para a expressão de mRNA de citocina 0 RNA total foi isolado dos tecidos do baço de ratinhos imunizados com kit RNeasy mini (Qiagen, Valência, CA) . 0 RNA mensageiro foi transcrito no sentido inverso usando SuperScript® II (Invitrogen) e usado como cADN padrão. Os detalhes de iniciador e sonda utilizados são apresentados na Tabela 1. As seguintes anotações são usadas na Tabela 1: FW, iniciador avançado; RV, iniciador inverso; TP sonda TaqMan, rotulada dual com 5'FAM e 3'TAMRA; aComprimento de Amplicon em pares de base. bNúmero de acesso no Genbank de cADN e gene correspondente. cSonda de anti-sentido.

As sondas foram rotuladas com o corante repórter fluorescente, β-Carboxifluoresceina (FAM) na extremidade 5' e o corante extintor, N',N',N',N',N'-6-

Carboxitetrametilrodamina (TAMRA) na extremidade 3'. A reação foi realizada em duplicata em volumes de 25 pL contendo 2 pL dos iniciadores avançado e reverso a 10 pM, 2 pL de sonda a 2 pM, 12,5 pL de Mistura mestra de PCR TaqMan e 9,5 pL de cADN diluído, usando as seguintes condições: 10 min a 94 °C, seguido por um total de 40 ciclos de duas temperaturas (15 segundos a 95 °C e 1 min a 60 °C), num fluorómetro automatizado (Detetor de sequência 7700,

Applied Biosystems, Foster City, CA) . A quantificação foi feita usando o método do limiar de ciclo comparativo (Ci) e relatado como a transcrição relativa ou a diferença n vezes em relação a um cADN calibrador. 25

Tabela 1. N° Acesso X017722 M16760 AF195956 M866712 S82420-6 M130492 Y00467 K00832 M74466 M28381 M325991

Gene Sequência (5'->3') Corrpri- mento IL-2 FW CCTGAGCAGGATGGAGAATTACA (SEQ ID NO:10) 141 RV TCCAGAACATGCCGCAGAG (SEQ ID NO:11) TP CCCAAGCAGGCCACAGAATTGAAAG (SEQ ID NO:12) IL- FW GGAAGCACGGCAGCAGAATA (SEQ ID NO:13) 180 12p40 RV AACTTGAGGGAGAAGTAGGAATGG (SEQ ID NO:14) TP CATCATCAAACCAGACCCGCCCAA (SEQ ID NO:15) TNF-α FW CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA (SEQ ID NO:16) 175 RV TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC (SEQ ID NO:17) TP CACGTCGTAGCAAACCACCAAGTGGA (SEQ ID NO:18) INF-γ FW TCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAA (SEQ ID NO: 19) 92 RV TGGCTCTGCAGGATTTTCATG (SEQ ID NO:20) NO:21) GAPDH FW TCACCACCATGGAGAAGGC (SEQ ID NO:22) 168 RV GCTAAGCAGTTGGTGGTGCA (SEQ ID NO:23) TP ATGCCCCCATGTTTGTGATGGGTGT (SEQ ID NO:24)

Análise estatística

Os dados foram estatisticamente analisados com o software Excel. As diferenças entre os grupos e antigenos individuais foram analisadas com uma análise de uma via de variância seguido pela comparação múltipla de Takey-Kramer ou teste t de Student. As diferenças foram consideradas significativas quando um valor de probabilidade <0,05 foi obtido.

Os seguintes resultados foram obtidos usando os materiais e métodos apresentados neste Exemplo. 26

Resposta imune em ratinhos imunizados com a proteína Map 74F

Três semanas após a vacinação de reforço, quatro ratinhos de cada grupo foram sacrificados, e a resposta de anticorpo anti-Map74F e a resposta de célula T foram avaliadas. Os ratinhos imunizados com Map 74F tiveram uma resposta de IgGl significativamente mais forte (P <0,01) contra Map 74F, mas não IgG2a. Ao contrário, nenhum anticorpo especifico de Map 74F foi detetado no grupo de controlo.

As respostas de IFN-γ foram avaliadas por ELISA de IFN-γ do sobrenadante de cultura e o ensaio ELISPOT de IFN-γ. A resposta de IFN-γ especifica de antigeno foi significativamente mais alta (P <0,05) em ratinhos imunizados com o Map 74F quando comparados aos animais de controlo que receberam apenas MPL (Fig. 2A). O resultado de ELISPOT de IFN-γ também foi comparável ao resultado de ELISA de IFN-γ (Fig. 2B), que confirmou ainda a resposta de IFN-γ aumentada nos animais vacinados. O grupo vacinado teve uma média de colónias que formam células únicas (SFC) de 20, em contraste com 7 no grupo de controlo. A distribuição de células T CD3+, CD4+ e CD8+ especificas de antigeno em células do baço foi avaliada por FACS. As células T CD3+ e CD4+ foram significativamente mais altas (P <0,01) em ratinhos imunizados com Map 74F (Fig. 2C) do que os animais de controlo. Ao contrário, nenhuma diferença significativa foi observada nas populações de célula T CD8+ entre animais vacinados e os animais controlo. Os niveis de expressão de gene de citocina foram avaliados pela PCR em tempo real. Nenhuma diferença significativa (P > 0,05) foi detetada nos niveis de expressão dos genes de citocina IL-2, IL-12, TNF-cx e IFN-γ entre os animais vacinados e de 27 controlo (Fig. 2D). O Map 74F protege ratinhos C57/BL6 contra a infeção de MAP Com base nas respostas imunes obtidas em ratinhos vacinados, nós planeámos avaliar a eficácia protetiva da proteína Map 74F contra a infeção pela MAP em ratinhos. Os soros recolhidos em pontos de tempo diferentes foram testados por ELISA quanto a resposta de IgG total (Fig. 3A) e a razão IgGl/IgG2a (Fig. 3B). Os ratinhos imunizados com 74F mostraram um aumento significativo (P <0,01) na resposta de anticorpo específica de 74F em 3 e 7 semanas (4 semanas após a inoculação) após a vacinação de reforço comparado com os animais de controlo. Embora os níveis de anticorpos aumentassem nos animais de controlo a seguir da inoculação, a resposta foi mais alta nos animais vacinados nas semanas 8, 12 e 16 após a inoculação. Diferenças significativas foram detetadas nas razoes de IgGl/IgG2a de animais vacinados e de controlo em 3 semanas após a vacinação de reforço. Nos animais vacinados as razões de IgGl/IgG2a aumentaram após a vacinação de reforço até 4 semanas após a inoculação. A partir daí, uma queda nas razões de IgGl/IgG2a foi observada nos animais vacinados até o final do período de observação de 16 semanas após a inoculação.

Para avaliar a eficácia protetiva da 74F, o baço, fígado e MLN foram cultivados quanto a MAP em diferentes pontos de tempo a seguir da inoculação com MAP. No baço, a carga de MAP foi significativamente (P <0,01) mais baixa nos animais vacinados comparados com os animais de controlo nas semanas 8, 12 e 16 após a inoculação (Fig. 4A) . No fígado, os

animais vacinados apresentaram menor peso MAP que os animais controlo e o encargo foi significativamente (P 28 <0,01) inferior a 12 semanas após a inoculação (Fig. 4B) . Em animais vacinados, a carga de MAP no MLN foi significativamente mais baixa a partir de 8 semanas após a inoculação (Fig. 4C) . O exame histopatológico do figado (Fig. 5. A & B) e baço (Fig. 5. C & D) mostrou que a inoculação intraperitoneal de MAP resultou em mais granulomas nos animais de controlo em 8, 12 e 16 semanas após a inoculação. Nos animais de controlo não vacinados, o figado teve numerosos granulomas grandes aleatoriamente dispersos (Fig. 5A) , enquanto que o figado dos animais vacinados tiveram apenas números esparsos de agregados linfoides pequenos (Fig. 5B). Similarmente, o baço de animais de controlo não vacinados teve mais granulomas (Fig. 5. C) do que os animais vacinados (Fig. 5.D). Quando os tecidos do figado e baço de animais de controlo foram tingidos com Ziehl-Nielsen, numerosos bacilos rápidos em ácido foram observados. Em contrapartida, o número de granulomas e bacilos rápidos em ácido foram menores nos animais imunizados com 74F.

Assim, neste exemplo, nos usamos células do baço de animais vacinados e de controlo para verificar o tipo de resposta de célula T induzida pela proteína de fusão. Em infeções microbacterianas, as células Thl são cruciais para a proteção durante a fase inicial da infeção. As estratégias de vacinação mais eficazes contra patógenos intracelulares são consideradas ser aquelas que estimulam respostas de célula T tanto CD4+ quanto CD8+ a produzir citocinas associadas com Thl. Em geral, IFN-γ é considerado como o componente principal na ativação de macrófagos e a sua produção nas células T CD4+ Thl é considerada essencial para conter a infeção pela MAP. Os nossos resultados indicam que a vacinação com a proteína de fusão evocou uma 29 resposta de IFN-γ significativa. Similarmente, nos também descobrimos que a imunização com Map74F evocou uma resposta de célula T de CD3+ e CD4+ forte nos animais vacinados em contraste com as células T CD8+, indicando que o aumento nos niveis de IFN-γ seria devido ao aumento das populações de células T CD4+. Os resultados sustentam a conclusão de que a expressão de IFN-γ foi predominantemente pelas células T CD4+ ativadas. A resposta de célula T CD4 + aumentada e os niveis de proteção obtidos no nosso estudo a seguir da inoculação de MAP indicam a eficácia protetiva de Map74F.

Os nossos estudos de imunogenicidade apresentados neste

Exemplo também indicam que 74F com MPL, induziram uma resposta de anticorpo boa nos animais vacinados. A razão IgGl/IgG2a aumentou até 4 semanas após a inoculação de MAP, indicando uma resposta especifica Th2. Entretanto, a razão IgGl/IgG2a, diminuiu gradualmente, começando em 8 semanas, indicando uma mudança possível para a resposta Thl. É evidente a partir dos resultados apresentados neste Exemplo que 74F induziu tanto respostas Thl quanto Th2, com a primeira sendo mais pronunciada, como exibido por uma resposta de IFN-γ significativa. EXEMPLO 3

Este Exemplo demonstra o uso de Map74F e outras proteínas MPA selecionadas para simular uma resposta imune contra o MAP em ruminantes.

Os seguintes materiais e métodos foram usados para obter os dados apresentados neste Exemplo.

Animais. Um total de 25 cabritos, entre 5 e 10 dias de 30 idade, de rebanhos isentos de MAP foi usado neste estudo. As amostras de fezes colhidas das cabras antes das experiências de imunização foram negativas quanto a MAP, tanto pela cultura quanto pela PCR para o gene IS900. Todo o trabalho experimental foi conduzido em conformidade com os regulamentos, políticas e princípios do Animal Welfare Act, the Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animais used in 20 Testing, Research, and Training, the NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animais and the New York State Department of Public. Health.

Bactérias. MAP 66.115-98, um isolado clínico, foi utilizado para inocular as cabras após a imunização. Esta variedade é positiva a IS900 e dependente de micobactina. A MAP 66115-98 foi cultivada em meio 7H9 suplementado com 10% de ácido oleico-albumina-dextrose-catalase (Becton Dickinson Co, Sparks, MD) e micobactina J (Allied Monitor, Inc, Fayette, MO) . Após o cultivo por 8 semanas, os organismos foram colhidos por centrifugação a 4000 x g por 10 min e lavados duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,2) . Os organismos foram diluídos em PBS até a concentração requerida e utilizados para inocular os animais.

Antígenos e adjuvantes. Três antígenos MAP recombinantes, 85A, 85B, SOD, e o polipeptídeo de fusão Map74F foram clonados, expressados e purificados usando técnicas padrão e como apresentadas no Pedido nos EUA N9 11/816, 365. As proteínas expressadas foram purificadas usando colunas de Ni-NTA agarose (Qiagen, Valência, CA) . A contaminação por endotoxina foi removida pelo uso de Affinity Pak Detoxi Gel (Pierce, Rockford, IL) e os antígenos tiveram níveis 31 negligenciáveis (10 pg/mL) de endotoxina num ensaio de amebócito Limulus. DDA (Sigma, EUA) foi misturado em água destilada estéril até uma concentração de 2,5 mg/mL, aquecido até 80 °C com agitação constante por 20 min e resfriado até a temperatura ambiente, DDA foi cuidadosamente misturado com os antigenos recombinantes até uma concentração final de 250 yg/dose.

Imunização de animais. As cabras foram divididas em três grupos, com oito animais nos grupos I e II e 9 animais no Grupo III (visto que tivemos um cabrito extra). Todos os cabritos permaneceram com as suas mães até aos três meses de idade. Os animais do grupo I foram imunizados com 100 yg de cada um dos quatro antigenos (85A, 85B, SOD, e Map 74F) em DDA, pela injeção subcutânea. Os animais do Grupo II foram imunizados com 100 yg de cada antigeno sem DDA. O Grupo III foi mantido como animais de controlo e administrados apenas com DDA. Três semanas após a imunização primária, as cabras foram reforçadas com o mesmo regime de antigenos e adjuvante.

Inoculação de animais com MAP. Três semanas após o reforço, todos os 24 caprinos foram inoculados oralmente, com 5 x 108 células de MAP/animal em 10 mL de substituto de leite por 7 dias consecutivos. As culturas fecais foram realizadas em cada animal nos dias 2, 4, 6, 8 e 10 depois de cada inoculação e, em seguida, uma vez por mês.

Isolamento e cultura de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) . As PBMC foram isoladas a partir de cabras experimentais usando técnicas padrão. Resumidamente, 10-15 mL de sangue periférico foram recolhidos da veia jugular em tubos vacutainer com EDTA (Becton Dickinson and 32

Co, Franklin Lakes, NJ). Os linfócitos foram isolados pela centrifugação diferencial usando Histopaque 1.077 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). As células mononucleares foram lavadas três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,2). As pelotas de célula lavadas foram colocadas em suspensão em PBS e contadas após o tingimento com azul de tripano a 0,4% quanto a viabilidade. Os linfócitos foram recolocados em suspensão em meio RPMI-1640 contendo 10% de soro bovino fetal (Gibco, Grand Island, NY) , 2 mM de L-glutamina, 100 mM de HEPES, 100 IU/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina e 50 pg/mL de gentamicina (Gibco) , a uma concentração final de 2 x 106 células viáveis/mL. As células foram semeadas (200 pL/ poço) em placas de fundo redondo ou piano de 96 poços, dependendo do tipo de experiência.

Ensaio de proliferação de linfócito. Os ensaios de proliferação de linfócito foram realizados usando técnicas padrão. Em resumo, PBMC, em placas de fundo piano de 96 poços foram incubadas a 37 °C em atmosfera Amida em 5% de CO2 e estimulados com cada um dos quatro antigenos recombinantes purificados (10 pg /mL), concanavalina A (ConA; 10 pg/mL, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e derivado de proteína purificado (PPD; 10 pg/mL, DBL, National Veterinary Services Laboratory, Ames, IA) por 72 horas. A síntese de ADN nas células estimuladas e de controlo não estimuladas foi medida pela incorporação de bromodesoxiuridina (BrdU) por ELISA de proliferação de célula, kit colorimétrico BrdU (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), conforme o protocolo do fabricante. Resumidamente, as células foram rotuladas por 2 horas com 10 pL de solução de rotulação de BrdU. O anticorpo anti-BrdU conjugado com peroxidase foi adicionado e incubado por 33 90 min. Isto foi seguido pela adição da solução de substrato de enzima e incubação na temperatura ambiente por 15 min. A reação enzimática foi interrompida pela adição de H2SO4 1M e a densidade ótica (OD) foi lida a 450 nm usando um leitor de microplaca ELX 808 Ultra (Bio-Tek Instruments, Inc, Winooski, VT) . Os testes foram conduzidos em triplicata e os resultados foram expressos como o indice de estimulação médio (SI), calculado como a razão entre a OD média de células cultivadas com os antigenos e a OD média de células cultivadas sem os antigenos.

Ensaio de IFN-γ. Os níveis de IFN-γ foram medidos nos sobrenadantes de cultura de PBMC usando um imuno ensaio de enzima intercalado com base em anticorpo monoclonal (BOVIGAM; Biocor Animal Health, Omaha, NE) , conforme as instruções do fabricante. As placas foram lidas a 450 nm usando um leitor de microplaca ELx 808 Ultra (Bio-Tek Instruments, Inc) . Os resultados foram interpretados com base numa comparação da densidade ótica de controlo positiva e negativa (OD). Os resultados foram determinados como positivos (se a OD é maior do que aquela do controlo positivo) ou negativos (se a OD é menor que aquela do controlo positivo), em relação aos valores de corte, como sugerido pelo fabricante.

Analise citométrica de fluxo de marcadores de linfócito. A análise citométrica de fluxo de cor única foi realizada para os antigenos de diferenciação de superfície de linfócito, usando anticorpos monoclonais específicos de cabra (CD2-MUC2A;CD4-17D-IgGi; CD4-GClAl-IgG2a; CD8-CACT80C-IgGi; CD8-7C2B-IgG2a; CD25-CACT116A-IgGi; CD45RO-ILA116A-IgG3; IgG2b-GB21Al específico de cadeia yóTCR alfa; ACTl-CACT7A-IgM; ACT16-GB11OA-IgM) (VMRD, Inc, Pullman, 34 WA) , de acordo com protocolos padrão. Resumidamente, as células foram lavadas três vezes em tampão de classificador de célula ativado por fluorescência (FACS) e incubadas com o anticorpo primário previamente titulado para a reatividade ótima por 30 min a 4 °C. A seguir disto, as amostras foram lavadas três vezes e incubadas com imunoglobulina anti-ratinho de cavalo rotulada com isotiocianato de fluorescina (Vector Laboratories. Burlingame, CA) por 30 min a 4 °C. As células foram lavadas duas vezes em tampão FACS e colocadas em suspensão em 100 μΐ de formalina tamponada neutra a 3% em PBS. Finalmente, as células foram transferidas para um tubo de FACS, e o volume foi completado para 500 yL com PBS antes da medição usando um citómetro de fluxo FACS calibre (Becton Dickinson, San Jose, CA) . Os dados foram recolhidos em 5.000-10.000 eventos e foram analisados usando o software Cellquest. PCR quantitativa em tempo real para a expressão de gene de citocina. A isolação do RNA total, a sintese do cADN, e a RT-PCR em tempo real foram realizadas de acordo com os métodos convencionais. Em resumo, o RNA foi isolado de PBMC lisadas usando um Kit RNeasy mini (Qiagen, Valência, CA). As amostras de RNA isoladas foram tratadas com 10 U/yL de DNase 1 isenta de RNase (Qiagen) , a 37 °C por 10 min, seguida pela inativação térmica a 95 °C por 5 minutos e depois congeladas em gelo. A transcrição reversa das amostras de RNA foi realizada, num volume de reação de 20 yL (1,6 yL de RNA total, 200 U de transcriptase reversa Superscript II da Invitrogen, 50 mM de Tris-HCl. 75 mM de KC1, 3 mM de 20 MgCl2, ditiotreitol 0,01 Me dNTPs 0,5 mM) a 42 °C por 50 min, seguido pela inativação a 70 °C por 15 min. As sondas e iniciadores para a RT-PCR em tempo real 35 foram planejados com o software Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, CA) usando as sequências de beta actina bovina e genes de citocina derivadas de GenBank. Os detalhes de sondas e iniciadores usados neste estudo são apresentados na Tabela 2.

Tabela 2

Citocina

Sequência (5'->3')

Compri- N° mento Acesso IFN-γ FP-CAAATTCCGGTGGATGATCTG (SEQ ID) NO:25) RP-GCGACAGGTCATTCATCACCTT (SEQ ID NO:26) Sonda- atccagcgcaaagccataaatgaactca (SEQ ID NO:27) 1L-10 FP- CCAGGATGGTGACTCGACTAGAC (SEQ ID NO:28) RP- TGGCTCTGCTCTCCCAGAAC (SEQ ID NO:29) Sonda- ccgcataaacctctgaaatccgaccca (SEQ ID NO:30) β-actina FP- GCCCCTCTGAACCCCAAA (SEQ ID NO:31) RPGCAGGAGTGTTGAAAGTCTCGAA (SEQ ID NO:32) Sonda- ccaaccgtgagaagatgacccagatca (SEQ ID NO:33) 358-378 433-412 382-409 338-360 413-394 364-391 67-84 137-115 86-112 AY603405 DQ837159 AF481159

As sondas foram rotuladas com o corante repórter fluorescente, 6-carboxifluoresceina (FAM) na extremidade 5', e o corante extintor, Ν', Ν', Ν',Ν', Ν'-6-carboxitetrametilrodamina (TAMRA) na extremidade 3'. A PCR foi realizada num volume de reação de 25 pL com 10 pL de cADN diluido, 400 nM de concentrações de iniciadores, 80 nM de sonda (Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IO) e mistura mestra de PCR universal (Applied Biosystems), contendo 10 mM de Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM de KC1, 5 mM de 36

MgCl2, concentrações de 2,5 mM de concentrações de trifosfatos de desoxinucleótido, 0,625 U de AmpliTaq Gold ADN polimerase e 0,25 U de AmpErase uracil-N glicosilase por reação. Amostras duplicadas foram mantidas em placas de 96 poços e amplificadas num fluorómetro automatizado (7700 Sequence Detector, Applied Biosystems). As condições de PCR foram de 2 min a 50 °C e 10 min a 95 °C, seguidas por 40 ciclos de 95 °C por 15 segundos e 60 °C por 1 min. A quantificação foi feita usando o método do limiar de ciclo comparativo (Cr) e relatada como a transcrição relativa ou a diferença relativa n vezes para um cADN calibrador.

Respostas de anticorpos aos antígenos recombinantes. As respostas de anticorpo para os quatro antigenos recombinantes, con A e PPD foram estimadas por ELISA seguindo um protocolo convencional. Um método de ELISA indireto foi realizado com placa de fundo chato de 96 poços revestidas com 100 pL de cada antigeno, mantidas a 4 °C durante a noite, e lavadas três vezes com PBS contendo 0,05% de Tween 20 (PBST) . Os sitios não ligados foram bloqueados com leite desnatado a 5% em PBST a 37 °C por uma hora e lavados duas vezes com PBST. 100 pL de IgG anti-cabra diluido 1:25.000, conjugado com peroxidase de rabano (Sigma) foram adicionados aos poços e incubados a 37 °C durante uma hora. As placas foram lavadas três vezes em PBST e 200 pL de ácido 2,2'-azinobis-tiazolino-6-sulfónico (Sigma) foram adicionados a cada poço. As placas foram incubadas a 37 °C por 30 min no escuro seguido pela adição da solução de interrupção (HC1 1 M) , e lidas três vezes a 405 nm em intervalos de 2 minutos usando um leitor de microplaca (BioTEK Instruments, Inc. Winooski, VT) . Soros positivos e negativos adequados e os controlos de antigeno e anticorpo foram incluídos em cada placa. 37

Cultura fecal e de órgãos de MAP. A seguir à inoculação, tentativas foram feitas para isolar organismos MAP de fezes usando o meio de gema de ovo de Herald (HEY) (Becton, Dickinson and Co. Sparks, MD), seguindo os protocolos padrão. As amostras fecais foram recolhidas de todos os animais de 2, 4, 6, 8 e 10 dias após a inoculação, e a cada mês depois disso para a isolação de MAP. Similarmente, 23 amostras de tecido recolhidas de cada um dos 24 animais na necropsia também foram testadas quanto ao MAP pela cultura. As culturas foram realizadas pela secção de Bacteriologia no Cornell Animal Health Diagnostic Center, e eles foram cegos para o grupo de tratamento.

Patologia geral e examinação histopatológica. Todos os caprinos foram sacrificados 38 semanas após a vacinação primária e necrosados. Um total de 23 amostras de tecido de cada animal, que incluia o baço, amigdalas, linfonodos mesentéricos (3) , linfonodo mandibular, linfonodos ileocecal, linfonodos hepáticos, duodeno (ascendente e descendente), jejuno (de 3 sítios de intervalos aproximadamente iguais da extremidade proximal para a distai), ileo (2 sitios na extremidade proximal, 2 sítios no meio do íleo e 2 sítios na extremidade distai), orifício ileocecal, orifício cecocólico, ceco e cólon espiral foram recolhidos no momento da necropsia. Os tecidos recolhidos foram fixados por imersão em formalina tamponada neutra a 10%, embutidos em parafina, seccionados em 4 ym e tingidos com hematoxilina e eosina pelos métodos histológicos convencionais. As secções foram examinadas por uma comissão de patologistas veterinários certificados (SM), que foram cegos para o grupo de tratamento. 38

Analise estatística. Os dados foram analisados estatisticamente com o software Excel. As diferenças entre os grupos e antigenos individuais foram analisadas com uma análise de uma via de variância seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey-Kramer ou teste t de Student. As diferenças foram consideradas significativas quando um valor de probabilidade de <0,05 foi obtido.

Os seguintes resultados foram obtidos usando os materiais e métodos estabelecidos acima neste Exemplo.

Respostas linfoproliferativas aos antigenos: Embora as respostas linfoproliferativas especificas de antigeno fossem detetadas em 6 semanas após a vacinação primária (APV), as respostas foram significativamente mais altas (P <0,05) em ambos os grupos vacinados (I e II) comparados com o grupo de controlo não vacinado (III) em 10 semanas de APV (Fig. 6) . No entanto, não foi detetada nenhuma diferença significativa nas respostas entre os antigenos testados.

Respostas de IFN-γ especificas de antigeno: Diferenças significativas (P <0,01) foram detetadas nas respostas de IFN-γ entre os animais vacinados e os de controlo em 6 e 10 semanas de APV (Fig. 7) . Nos animais vacinados a melhor resposta foi detetada para Map74F. As respostas de IFN-γ foram significativamente mais altas (P <0,05) para os antigenos 85A e Map74F nos animais do grupo I do que nos animais do grupo II em 10 semanas de APV. Entretanto, nenhuma diferença significativa foi detetada entre os outros antigenos recombinantes testados. Embora os niveis de IFN-γ declinassem de 18 semanas para 38 semanas de APV, eles foram significativamente mais altos (P <0,05) nos animais vacinados que nos controlos. 39

Distribuição de subconjunto de linfócitos em resposta aos antígenos recombinantes: Os subconjuntos de linfócitos estimulados com antígeno foram examinados quanto às diferenças em suas percentagens por citometria de fluxo. Houve aumentos significativos (P <0,01) nos subtipos de célula IgGl CD4+, IgG2a CD4+, IgGl CD8+, IgG2a CD8+ nos grupos imunizados em relação ao grupo de controlo (Fig. 8A-D) . O aumento começou em 6 semanas de APV e persistiu durante todo o período da experiência de 38 semanas de APV. Os antígenos recombinantes específicos de populações de células T CD4" e CD8+ foram mais altos nos animais imunizados, mas a proporção de células CD4+ foi maior do que aquela de células CD8+. Entretanto, houve um aumento, embora não significativo, na população de células T CD8+ em 26 e 38 semanas de APV. Embora todos os antígenos recombinantes testados em nosso estudo, aumentassem as populações de células yõTCR+ em ambos os grupos vacinados comparados com os animais de controlo, o aumento foi significativamente mais alto (P <0,05) para os antígenos 85A e Map74F. Novamente, como no caso das populações de células T CD4+ e CD8+, um aumento sustentado nas populações de células yõTCR+ foi observado até ao final do período experimental (Fig. 8E). Nos animais imunizados, a proporção de células T CD25+ específicas de antígeno foi mais alta para os quatro antígenos recombinantes testados. Embora tenha havido diferenças menores nas respostas de células T CD25+ entre os diferentes antígenos testados, elas não foram significativas.

Expressão de mRNA especifica do gene de citocina: Um aumento significativo na expressão de IFN-γ específica de antígeno recombinante foi detetado nos animais imunizados 40 (Ρ <0,01) em contraste com os animais de controlo começando em 6 semanas de APV (Fig. 9A). Embora os niveis de expressão atingissem um máximo em 10 semanas de APV, os niveis permaneceram significativamente mais altos nos animais imunizados comparados com os controlos até 38 semanas de APV. Ao contrário, nenhuma diferença significativa foi detetada na expressão de IL-10 entre os animais imunizados e os de controlo em qualquer ponto de tempo em nosso estudo, exceto para um aumento global nos niveis de expressão de IL-10 em 26-38 semanas de APV em todos os três grupos (Fig. 9B).

Respostas de anticorpos específicas de antígeno recombinante: Todos os quatro antigenos recombinantes testados neste estudo induziram respostas de anticorpo robustas em ambos os grupos vacinados. As respostas foram significativamente mais altas (P <0,01) nos grupos vacinados em relação ao grupo de controlo de seis semanas de APV durante todo o periodo experimental (Fig. 10) . Nenhuma diferença significativa foi detetada nas respostas de anticorpo entre os vários antigenos recombinantes usados.

Histopatologia de tecidos recolhidos na necropsia: A examinação histopatológica dos tecidos recolhidos de cada animal na necropsia indicou que 75% dos animais de controlo não vacinados (Grupo III) tiveram granulomas em pelo menos um tecido, enquanto que os animais do grupo I e grupo II, tiveram granulomas em apenas 25 e 50% dos animais, respetivamente. Os granulomas foram encontrados num linfonodo mesentérico e jejuno de I animal e no linfonodo ileocecal de outro animal no Grupo I. Ao contrário, granulomas nos grupos II e III estavam localizados 41 primariamente no íleo, na junção ileocecal ou ceco, enquanto que o linfonodo ileocecal foi afetado em 5 animais desses dois qrupos. Nenhum granuloma foi encontrado no duodeno de qualquer animal e apenas 2 animais, um do Grupo I e 1 do Grupo III, tiveram granulomas no jejuno. Outros tecidos afetados incluíram a junção cecocólica e os linfonodos hepáticos em dois dos animais de controlo não vacinados no Grupo III.

Carga de MAP em tecidos após a inoculação: A carga de MAP em 23 tecidos recolhidos de cada animal na necropsia foi avaliada por meio de cultura bacteriana (Figura 11). Entre os animais vacinados, apenas um animal do grupo I foi positivo em cultura, com uma CFU muito baixa. No grupo II, embora 5/8 animais fossem positivos para a MAP, a carga bacteriana foi muito baixa em quatro dos cinco animais (<5) a partir dos quais MAP foi isolada. No grupo III não vacinado, todos os nove animais foram positivos quanto ao MAP, com a maioria dos animais tendo pelo menos 5 tecidos positivos quanto ao MAP com >300 CFU (demasiadas para contar).

Como evidenciado pelo precedente, neste Exemplo, foi avaliada a eficácia protetiva de 85A, 85B, SOD e Map74F recombinantes num modelo de cabra. Visto que MAP é um organismo intracelular, uma resposta mediada pelas células T Thl sensibilizadas e, em particular, células T sensibilizadas que segregam IFN-γ, é acreditada desempenhar um papel significativo na proteção. Entre as várias ferramentas usadas, a medição da resposta de proliferação de linfócitos para o antigeno especifico testado é amplamente usada para determinar respostas imunes celulares. Nós demonstramos a deteção da proliferação de 42 linfócito específico de antígeno recombinante três semanas após a vacinação de reforço, que foi significativamente mais alta nos grupos vacinados em comparação com os controlos a seguir à inoculação, o que indica a indução de imunidade celular específica de antígeno. IFN-γ é um dos principais genes de citocinas ativados em resposta a infeção pela MAP em bovinos. Além disso, acredita-se que as células T CD8+ restritas à classe do complexo de histocompatibilidade principal que produzem citocinas, tais como IFN-γ, são requeridas para a resistência a outras infeções microbacterianas como M tuberculosis. Neste Exemplo, a resposta de IFN-γ mediada por Map74F foi detetada após a vacinação de reforço e inoculação. Sem pretender estar ligado por qualquer teoria particular, e considerado que os níveis realçados de IFN-γ podem ter desempenhado um papel importante na imunidade protetiva das cabras a seguir da inoculação com MAP viva pela sinalização mediada por IFN-γ de macrófagos

Os resultados apresentados neste Exemplo também mostram uma resposta de célula T CD4+ e CD8+ mais alta nos animais imunizados. Os nossos resultados também sustentam a contribuição das células T CD4+ para os níveis de IFN-γ periféricos e respostas proliferativas a seguir da imunização com os antígenos recombinantes. CD25 é expresso pelas células T ativadas. Os nossos resultados claramente indicam uma expansão de células T ativadas nos animais vacinados. Embora a população de células yóTCR+ permanecesse comparativamente menor do que as células T CD4+ e CD8+, ela foi significativamente mais alta (P <0,05) nos animais imunizados do que nos animais de controlo. Os mecanismos efetores de células T CD4+ estão associados com 43 a secreção de IFN-γ, que ativa a atividade bactericida em macrófagos, linfotoxina, peribrina e granulisina. As células T CD8+ e γδ+ também segregam granulisina. Isto é compativel com os resultados das nossas experiências de inoculação e sustentam a eficácia protetiva de nossos antigenos recombinantes. Os niveis de expressão de IFN-γ mRNA aumentados claramente indicaram que houve uma resposta Thl especifica de antigeno definitiva nos animais imunizados que foi sustentada pelos niveis de expressão pouco significativos da IL-10 especifica de Th2.

Com a resposta linfoproliferativa, a resposta de IFN-γ, as respostas de células T CD4+ e CD8+ comecem evidência quanto a uma resposta Thl significativa nos grupos imunizados. Nós analisámos os resultados de experiências de inoculação para avaliar a eficácia protetiva dos antigenos recombinantes em caprinos. Na ausência de sinais clínicos característicos, a histopatologia e a carga bacteriana de tecidos recolhidos na necropsia são consideradas ser o melhor padrão na avaliação da eficácia protetiva de vacinações de MAP. Nós coletamos 23 tecidos de cada um dos 15 animais e analisámos os tecidos quanto as lesões histopatológicas e carga de MAP por cultura. Uma redução significativa foi observada no número de animais e tecidos com lesões no grupo administrado com os antigenos recombinantes e DDA, indicando eficácia protetiva. A isolação de MAP em cultura é um meio mais sensível de detetar MAP em tecidos, quando comparado com tingimento resistente ao ácido ou examinação microscópica, especialmente durante a fase muito inicial de infeção. Entretanto, a distribuição de lesões granulomatosas no geral refletiram os resultados da cultura de MAP. Os 44 resultados da cultura de MAP apresentadas neste Exemplo claramente demonstram a eficácia protetiva dos quatro antigenos recombinantes usados. A proteção foi quase completa quando os antigenos foram dados juntos com DDA. MAP foi recuperada de apenas um dos oito animais deste grupo (I) e este animal teve uma carga de MAP significativamente mais baixa em apenas um tecido positivo, a saber o ileo distai. A administração dos antigenos sem o adjuvante mostrou proteção, embora a eficácia protetiva fosse comparativamente menor quando os antigenos foram administrados sem o adjuvante. Isto pode ser observado a partir dos resultados de cultura de animais do grupo II que receberam antigenos sem o adjuvante. Embora 5/8 animais fossem positivos quanto a MAP, a carga bacteriana foi significativamente mais baixa nestes animais comparados com os animais de controlo do grupo III indicando a natureza protetiva dos antigenos mesmo sem o adjuvante. Números significativamente mais altos de MAP foram recuperados de todos os animais no grupo de controlo não vacinado, que mais uma vez demonstra a eficácia protetiva dos antigenos. A imunização de caprinos com os antigenos recombinantes resultou numa resposta de anticorpo prolongada durante um periodo prolongado. Os resultados apresentados neste Exemplo portanto indicam que os antigenos recombinantes estimularam os sistemas imunes tanto mediados por células quanto humorais. Após a vacinação de reforço, um aumento significativo na resposta de anticorpo foi detetado para todos os antigenos recombinantes em ambos os grupos de vacina comparados com o grupo de controlo não vacinado. A resposta tendeu a ser mais alta nos animais do grupo I que receberam os antigenos com o adjuvante, embora não significativamente. 0 inicio precoce da reatividade de CMI seguido pela soroconversao é uma caracteristica constante, 45 de infeções microbacterianas de ruminantes. Entretanto, as nossas subunidades de componente múltiplo usadas neste Exemplo comunicaram proteção significativa em termos de redução da carga de bacilos em Órgãos alvo quando comparados com os caprinos imunizados simulado. A citação a qualquer publicação é quanto à sua divulgação anterior à data de depósito e não deve ser interpretada como uma admissão de que a presente invenção não intitulada anteceder tal publicação em virtude da invenção anterior.

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Chang, Yung-Fu

<12 0> COMPOSIÇÕES PARA PROVOCAR UMA RESPOSTA IMUNE CONTRA MYCOBACTERIUM AVIUM SUBSPECIES PARATUBERCULOSIS

<130> 1258_4222PCT <150> US 61/094,552 <151> 2008-09-05 <150> US 60/979,822 <151> 2007-10-13 <160> 33 <170> Patentln version 3.4 <210 > 1 <211> 46

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> proteína Map74F <4 0 0> 1

Leu Asn Gin Ser Vai Ser Ala Thr 1 5

Asn Leu Gly Gly Leu Ile Gin Ala 20

Ser Gly Gly Pro Met Vai Asn Ser 35 40

Thr Ala Ala Thr Asp Ser Tyr Lys 50 55

Ile Pro Ile Gly Arg Ala Met Ala 65 70

Ala Gly Ser Asn Thr Vai His Ile 85

Gly Vai Thr Asp Asn Asn Gly Asn 100

Asn Thr Gly Pro Ala Ala Ala Ala 115 120

Asp Thr Leu Thr Gly Ala Gin Glu 10 15 Asp Ala Pro ile Lys Pro Gly Asp 25 30 Ala Gly Gin vai ile Gly Val Asp 45 Met Ser Gly Gly Gin Gly Phe Ala 60 Vai Ala Asn Gin ile Arg Ser Gly 75 80 Gly Pro Thr Ala Phe Leu Gly Leu 90 95 Gly Ala Arg Val Gin Arg vai Val 105 110 Gly Ile Ala Pro Gly Asp Val Ile 125 47

Thr Gly Vai Asp Thr Vai Pro Ile Asn Gly Ala Thr Ser Met Thr Glu 130 135 140

Vai Leu Vai Pro His Hís Pro Gly Asp Thr Ile Ala Vai His Phe Arg 145 150 155 160

Ser Vai Asp Gly Gly Glu Arg Thr Ala Asn Ile Thr Leu Ala Glu Gly 165 170 175

Pro Pro Ala Met Phe Tyr Gly Ala Phe Pro Pro Glu Phe Asn Ser Gly 180 185 190

Arg Met Tyr Ser Gly Pro Gly AJ.a Gly Ser Phe Vai Ala Ala Ala Thr 195 200 205

Ala Trp Gin Asn Leu Ala Ala Glu Leu Gin Ser Ala Ala Ala Ser Tyr 210 215 220

Ser Thr Vai Leu Ser Gly Leu Thr Ala Gly Pro Trp Vai Gly Pro Ser 225 230 235 240

Ser Leu Ala Met Ala Ser Ala Ala Ala Pro Tyr Vai Ala Trp Met Gin 245 250 255

Gin Thr Ala Ala Gin Ala Ala Glu Thr Ala Ala Gin Ala Thr Ala Ala 260 265 270

Ala Thr Ala Tyr Glu Thr Ala Phe Ala Ala His Vai Pro Pro Ala Vai 275 280 285

Ile Thr Glu Asn Arg Ala Leu Leu Ala Gin Leu Vai Ala Thr Asn ile 290 295 300

Phe Gly Gin Asn Thr Ala Ala Ile Ala Ala Asn Glu Ala Gin Tyr Gly 305 310 315 320

Glu Phe Trp Ala Gin Asp Ala Thr .Ala Met Asp Thr Tyr Phe Ala Ala 325 330 335

Ser Ala Thr Ala Ala Asn Lys Leu Thr Glu Phe Gly Pro Ala Pro Lys 340 345 350

Thr Thr Asn Glu Ala Ala Gin Pro Met Gin Ala Ala Ala Vai Ser Ser 355 360 365

Ala Ala Ser Thr Pro Ala Ala Asn Vai Ala Gin Thr Ala Ala Ser Ala 48 370 375 380

Ala Ser Thr Thr Leu Pro Tyr Ser Gly Pro Phe Ser Gly Pro Ala Asn 385 390 395 400 Leu Ala Tyr Leu Tyr Gin Thr 405 Phe Met Thr Asn Leu Phe Asn Thr Vai 410 415 Pro Gly Gly Ala Ser Phe Tyr 420 Thr Ser Met Tyr Asn Ala Vai Lys Vai 425 430 Pro Leu Gly Leu Thr Thr Gin 435 Phe Asn Asp Vai Gly Leu Leu Vai Asn 440 445 Phe Pro Leu Ser Gin Trp Leu 450 455 Lys Phe Ala Pro Pro Ile Gly Tyr Gly 460 Ala Leu Pro Lys Asp Ala Leu 465 470 Gly Ala Gly Leu Gly Ala Leu Gly Phe 475 ~ 480 Gly Arg Gly Thr Leu Tyr Ser 485 Ala Ile Ser Pro Vai Ala Gly Met Gly 490 495 Asn Ala Gly Thr Leu Vai Gly 500 Lys Leu Ser Ile Pro Pro Ser Trp Ala 505 510 Thr Ala Thr Pro Ser Ile Arg 515 Thr Vai Ala Ala Ala Leu Ser Ala Ala 520 525 Gly Ala Glu Ala Vai Pro Ala 530 535 Ala Ala Leu Gly Glu Gly Ser Leu Phe 540 Ser Ser Met Gly Leu Ala Gly 545 550 Met Leu Gly Ser Ala Vai Gly Ser Gly 555 560 Gly Pro Thr Met Vai Arg Gly 565 Gly Vai Arg Asn Arg Met Thr Ala Ile 570 575 Lys Asp Leu Lys Asp Lys Gin 580 Ser Pro Glu Gin Leu Lys Arg Leu Vai 585 590 Ala Gin Ile Ser Glu Gin Pro 595 Glu Ser vai Gin His His Asn Vai Asp 600 605 Gin Glu Asn Leu Asp Ala Leu 610 615 Leu Glu Gin Leu Ala Lys Lys Pro Gly 620 49

Ile His Ala Vai His Leu Lys Lys Gly Asp Lys Ser Lvs Vai Leu Gly 625 630 635 640

Leu Ala Pro Ala Ser Ala Ala Pro Ser Gly Leu Ala Leu Asp Arg Phe 645 650 655

Ala Asp Arg Pro Leu Ala Pro Ile Asp Pro Ser Ala Met Vai Gly Gin 660 665 670

Vai Gly Pro Gin Vai Vai Asn Ile Asp Thr Lys Phe Gly Tyr Asn. Asn 675 680 685

Ala Vai Gly Ala Gly Thr Gly Ile Vai Ile Asp Pro Asn Gly Vai Vai 690 695 700

Leu Thr Asn Asn His Vai lie Ser Gly Ala Thr Glu Ile Ser Ala Phe 705 710 715 720

Asp Vai Gly Asn Gly Gin Thr Tyr Ala vai Asp Vai Vai Gly Tyr Asp 725 730 735

Arg Thr Gin Asp Ile Ala Vai Leu Gin Leu .Arg Gly Ala Ala Gly Leu 740 145 750

Pro Thr Ala Thr Ile Gly Gly Glu Ala Thr Vai Gly Glu Pro Ile Vai 755 760 765

Ala Leu Gly Asn Vai Gly Gly Gin Gly Gly Thr Pro Asn Ala Vai Ala 770 775 * 780

Gly Lys Vai Ala 785

<210> 2 <211> 361 <212> PRT <400> <213> MYCOBACTERIUM AVIUM SUBSPECIES PARATUBERCULOSIS 2

Met 1 Ser Lys Ser His 5 His HiS Arg Ser Vai 10 Trp Trp Ser Trp Leu 15 Vai Gly Vai Leu Thr 20 Vai Vai Gly Leu Gly 25 Leu Gly Leu Gly Ser 30 Gly Vai 50 G.l.y Leu Ala Pro Ala Ser Ala Ala Pro Ser Gly Leu Ala Leu Asp Arg 35 40 45

Phe Ala Asp Arg Pro Leu Ala Pro Ile Asp Pro Ser Ala Met Vai Gly 50 55 60

Gin Vai Gly 65 Pro Gin Val Val Asn Ile Asp Thr Lys Phe Gly Tyr Asn 70 75 80 Asn Ala Vai Gly Ala Gly Thr Gly Ile Val Ile Asp Pro Asn Gly Val 85 90 95 val Leu Thr Asn Asn His Val Ile Ser Gly Ala Thr Glu Ile Ser Ala 100 105 110 Phe Asp Val 115 Gly Asn Gly Gin Thr Tyr Ala Val Asp Val Val Gly Tyr 120 ' 125 Asp Arg Thr 130 Gin Asp Ile Ala Val Leu Gin Leu Arg Gly Ala Ala Gly 135 140 Leu Pro Thr 145 Ala Thr Ile Gly Gly Glu Ala Thr val Gly Glu Pro Ile 150 155 160 Val Ala Leu Gly Asn Val Gly Gly Gin Gly Gly Thr Pro Asn Ala Val 165 170 * 175 Ala Gly Lys Val Val Ala Leu Asn Gin Ser Val Ser Ala Thr Asp Thr 180 165 190 Leu Thr Gly 195 Ala Gin Glu Asn Leu Gly Gly Leu Ile Gin Ala Asp Ala 200 205 Pro 11s Lvs 210 Pro Gly Asp Ser Gly Gly Pro Met Val Asn Ser Ala Gly 215 220 Gin Val ile 225 Gly Val Asp Thr Ala Ala Thr Asp Ser Tyr Lys Met Ser 230 235 240 Gly Gly Gin Gly Phe Ala Ile Pro Ile Gly Arg Ala Met Ala Val Ala 245 250 255 Asn Gin Ile Arg Ser Gly Ala Gly Ser Asn Thr Val His Ile Gly Pro 260 265 270

Thr Ala Phe Leu Gly Leu Gly Vai Thr Asp Asn Asn Gly Asn Gly Ala 51 275 280 285

Arg Vai Gin Arg Vai Vai Asn Thr Gly Pro Ala Ala Ala Ala Gly Ile 290 295 300 Ala Pro Gly Asp vai lie Thr Gly vai ASp Thr Vai Pro ile Asn Gly 305 310 315 320 Ala Thr Sei Met Thr Glu Vai Leu vai Pro His His Pro Gly Asp Thr 325 330 335 lie Ala va 1 His Phe Arg Ser vai Asp Gly Gly Glu Arg Thr Ala Asn 340 345 350 ile Thr Leu Ala Glu Gly Pro Pro Ala 355 360 <210> <211 > <212> <213> <4 Ο 0> 3 467

PRT

MYCOBACTERIUM AVIUM SUBSPECIES PARATUBERCULOSIS

Met Phe Tyr Gly Ala Phe Pro Pro Glu Phe Asn Ser Gly Arg Met Tyr 15 10 15 5er Gly Pro Gly Ala Gly Ser Phe Vai Ala Ala Ala Thr Ala Trp Gin 20 25 30

Asn Leu Ala Ala Glu Leu Gin Ser Ala Ala Ala Ser Tyr Ser Thr Vai 35 40 45

Leu Ser Gly Leu Thr Ala Gly Pro Trp Vai Glv Pro Ser Ser Leu Ala 50 55 ' 60

Met Ala Ser Ala Ala Ala Pro Tyr Vai Ala Trp Met Gin Gin Thr Ala 65 10 75 80

Ala Gin Ala Ala Glu Thr Ala Ala Gin Ala Thr Ala Ala Ala Thr Ala 85 90 95

Tyr Glu Thr Ala Phe Ala Ala His Vai Pro Pro Ala Vai Ile Thr Glu 100 105 110

Asn Arg Ala Leu Leu Ala Gin Leu Vai Ala Thr Asn Ile Phe Gly Gin 115 120 125 52

Asn Thr Aict Ala lie Ala Ala Asn Glu Ala Gin Tyr Gly Glu Phe Trp 130 135 140 Ala Gin Asp Ala Thr Ala Met Asp Thr Tyr Phs Ala Ala Ser Ala Thr 145 150 155 160 Ala Ala Asn Lys Leu Thr Glu Phe Gly Pro Ala Pro Lys Thr Thr Asn 165 170 175 Glu Ala Ala Gin Pro Met Gin Ala Ala Ala Vai Ser Ser Ala Ala Ser 180 185 190 Thr Pro Ala Ala Asn Vai Ala Gin Thr Ala Ala Ser Ala Ala Ser Thr 195 200 205 Ihr Leu Pro Tyr Ser Gly Pro Phe Ser Gly Pro Ala Asn Leu Ala Tyr 210 215 220 Leu Tyr Gin Thr Phe Met Thr Asn Leu Phe Asn Thr Vai Pro Gly Gly 225 230 235 240 Ala Ser Phe Tyr Thr Ser Met Tyr Asn Ala Vai Lys Vai Pro Leu Gly 24 5 250 255 Leu Thr Thr Gin Phe Asn Asp vai Gly Leu Leu Vai Asn Phe Pro Leu 260 265 270 Ser Gin Trp Leu Lys Phe Ala Pro Pro ile Gly Tyr Gly Ala Leu Pro 275 280 285 Lys Asp Ala Leu Gly Ala Gly Leu Gly Ala Leu Gly Phe Gly Arg Gly 290 295 300 Thr Leu Tyr Ser Ala Ile Ser Pro Vai Ala Gly Met Gly Asn Ala Gly 305 310 315 320 Thr Leu Vai Gly Lys Leu Ser Ile Pro Pro Ser Trp Ala Thr Ala Thr 325 330 335 Pro Ser Ile Arg Thr Vai Ala Ala Ala Leu Ser Ala Ala Gly Ala Glu 340 345 350 Ala Var Pro Ala Ala Ala Leu Gly Glu Gly Ser Leu Phe Ser Ser Met 355 360 365 53

Gly Leu Ala 61y Met Leu Gly Ser Ala Vai Gly Ser Gly Gly Pro Thr 370 375 380

Met Vai Arg Gly Gly Vai Arg Asn Arg Met Thr Ala Ile Lys Asp Leu 385 390 395 400

Lys Asp Lys Gin Ser Pro Glu Gin Leu Lys Arg Leu Vai Ala Gin Ile 405 410 415

Ser Glu Gin Pro Glu Ser Vai Gin His His Asn Vai Asp Gin Glu Asn 420 425 430

Leu Asp Ala Leu Leu Glu Gin Leu Ala Lys Lys Pro Gly Ile His Ala 435 440 445

Vai His Leu Lys Lys Gly Asp Lys Ser Lys Vai Leu Pro Ala Asp Ala 450 455 " 460

Gin Leu Gly 465

<210> 4 <211> 44 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador da amplificação por PCR <400> 4 tacatatgca tcatcatcat catcatctca accagagcgt ctcg 44 <210> 5 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência <22 0> artificial

<223> Iniciador de PCR 54 <4Ο0> 5 tagaattcgg ccggcggccc ctccgcc 27

<210> 6 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador de PCR <4 0 0> 6 ctaatcgaat tcatgttcta tggggccttt c 31 <210> 7 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR <4 0 0> 7 taatcgatat ccaggacctt ggacttgtc 29

<210> 8 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR 55 <4Ο0> 8 atgatatcgg gctggcgccg gcgtcc 26

<210> 9 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR <4 0 0> 9 atctcgagtc acgcgacctt gccggc 26 <210> 10 <211> 23 <212> ADN <213> Rato <400> 10 cctgagcagg atggagaatt aca 23

<210> 11 <211> 19 <212> ADN <213> Rato <4 0 0> 11 tccagaacat gccgcagag 19 <210> 12 56 <211> 25 <212> ADN <213> rato <4 0 0> 12 cccaagcagg ccacagaatt gaaag 25 <210> 13 <211> 20 <212> ADN <213> rato <4 0 0> 13 ggaagcacgg cagcagaata 20 <210> 14 <211> 24 <212> ADN <213> rato <4 0 0> 14 aacttgaggg agaagtagga atgg 24 <210> 15 <211> 24 <212> ADN <213> rato <4 0 0> 15 catcatcaaa ccagacccgc ccaa 24 <210> 16 <211> 25 57 <212> ADN <213> rato <4 0 0> 16 catcttctca aaattcgagt gacaa 25 <210> 17 <211> 23 <212> ADN <213> rato <4 0 0> 17 tgggagtaga caaggtacaa ccc 23 <210> 18 <211> 26 <212> ADN <213> rato <4 0 0> 18 cacgtcgtag caaaccacca agtgga 26 <210> 19 <211> 24 <212> ADN <213> rato <4 0 0> 19 tcaagtggca tagatgtgga agaa 24 <210> 20 <211> 21

<212> ADN 58 <213> rato <4 0 0> 20 tggctctgca ggattttcat g 21 <210> 21 <211> 27 <212> ADN <213> rato <4 0 0> 21 tcaccatcct tttgccagtt cctccag 27 <210> 22 <211> 19 <212> ADN <213> rato <4 0 0> 22 tcaccaccat ggagaaggc 19 <210> 23 <211> 20 <212> ADN <213> rato <4 0 0> 23 gctaagcagt tggtggtgca 20

<210> 24 <211> 25 <212> ADN <213> rato 59 <4Ο0> 24 atgcccccat gtttgtgatg ggtgt 25 <210> 25 <211> 21 <212> ADN <213> Bovino <4 0 0> 25 caaattccgg tggatgatct g 21 <210> 26 <211> 22 <212> ADN <213> Bovino <4 0 0> 26 gcgacaggtc attcatcacc tt 22 <210> 27 <211> 28 <212> ADN <213> bovino <4 0 0> 27 atccagcgca aagccataaa tgaactca 28 <210> 28 <211> 23 <212> ADN <213> bovino 60 <400> 28 ccaggatggt gactcgacta gac 23 <210> 29 <211> 20 <212> ADN <213> bovino <4 0 0> 29 tggctctgct ctcccagaac 20 <210> 30 <211> 28 <212> ADN <213> bovino <4 0 0> 30 ccgacataaa cctctgaaat ccgaccca 28 <210> 31 <211> 18 <212> ADN <213> bovino <4 0 0> 31 gcccctctga accccaaa 18 <210> 32 <211> 23 <212> ADN <213> bovino <400> 32 61 61 23 gcaggagtgt tgaaagtctc gaa <210> 33 <211> 27 <212> ADN <213> bovino <400> 33 27 ccaaccgtga gaagatgacc cagatca

Lisboa, 4 de Outubro de 2012

Claims (18)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Composição compreendendo uma proteína recombinante, caracterizada por a proteína compreender do terminal N ao terminal C: i) um fragmento de terminal C de proteína Map3527 que compreende os aminoácidos de 183-361 da SEQ ID NO: 2; ii) uma sequência de proteína de Map 1519 que compreende os aminoácidos de 1-460 da SEQ ID NO: 3; e iii) um fragmento de terminal N da proteína Map3527 que compreende os aminoácidos de 33-180 da SEQ ID NO: 2.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a sequência da proteína Mapl519 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3.

3. Composição de acordo caracterizada por o sequência de aminoácidos

4. Composição de acordo caracterizada por que a um adjuvante. com a reivindicação 1, polipeptídeo compreender a da SEQ ID NO: 1. com a reivindicação 1, composição compreender ainda

5. Composição de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por o adjuvante ser selecionado do grupo que consiste de monofosforil lípido A (MPI), brometo de dimetildioctadecil amónio (DDA), e combinações destes. 2

6. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender ainda uma proteina de Mycobacterium avium subespécies paratuberculosis (MAP) , em que a proteina é selecionada do grupo que consiste da proteina de MAP 85A, proteina de MAP 85B, proteina de MAP superóxido dismutase (SOD), e combinações destas.

7. Composição de acordo com a reivindicação 1, para utilização num método para estimular uma resposta imune a Mycobacterium avium subespecies paratuberculosis (MAP) num mamifero, através da administração da composição ao mamifero.

8. Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por a composição compreender ainda um adj uvante.

9. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por o adjuvante ser selecionado a partir do grupo que consiste de monofosforil lipideo A (MPL) e brometo de dimetildioctadecil amónio (DDA).

10. Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por ser administrada a um ruminante.

11. Composição de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por o ruminante ser um bovino, um ovino, um caprino, um cervo ou um alce. Composição de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por o ruminante ser um bovino.

12. 3

13. Composição de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por o ruminante não estar infetado com MAP.

14. Composição de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por o ruminante estar infetado com MAP.

15. Composição de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por o bovino ter a Doença de Johne.

16. Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por o animal estar em fase de gestação.

17. Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por a composição compreender ainda uma proteína da Mycobacterium avium subespecies paratuberculosis (MAP), em que a proteína é selecionada do grupo que consiste da proteína MAP 85A, proteína MAP 85B, proteína MAP SOD, e combinações destas.

18. Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por o polipeptídeo da composição compreender a sequência da SEQ ID NO: 1. Lisboa, 4 de Outubro de 2012