JP2011500587A - マイコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスに対する免疫応答を誘発するための組成物 - Google Patents

Abstract

マイコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス（Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis）（ＭＡＰ）に対する免疫応答を刺激するための組成物及び方法が提供される。本発明の組成物は、そのＮ末端からＣ末端に、ＭＡＰタンパク質Ｍａｐ３５２７のＣ末端フラグメント、Ｍａｐ１５１９タンパク質のアミノ酸配列、その後にＭａｐ３５２７タンパク質のＮ末端部分を含有する組換えタンパク質を含む。本発明の方法は、本発明の組成物を、ＭＡＰ細菌に対する免疫学的応答を刺激するために効果的な量で動物に投与することを含む。本発明の方法は、ＭＡＰ感染に罹りやすい任意の動物に対して有益であり、しかし、反芻動物については特に有益である。

Description

関連出願に対する相互参照
本出願は、同時係属中の米国仮特許出願第６１／０９４，５５２号（２００８年９月５日出願）及び同第６０／９７９，８２２号（２００７年１０月１３日出願）の優先権及び利益を主張する（これらの仮特許出願はともに、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）。

連邦政府援助による研究又は開発に関する言及
該当せず

付録への参照
該当せず

発明の分野
本発明は、一般には、免疫学的応答を刺激することに関し、より具体的には、マイコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス（Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis）に対する予防的又は／及び治療的な免疫学的応答を刺激するための組成物及び方法に関する。

発明の背景
マイコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス（ＭＡＰ）は、慢性的な肉芽腫性腸炎を反芻動物において引き起こすヨーネ病（ＪＤ）の原因病原体である。臨床的に罹患している動物は、慢性的な下痢、及び、最終的には死を生じさせる進行性の体重減少を発症し、一方、無症状の感染している動物は主に、低下した乳汁産生を有する。ＪＤは世界中の酪農産業にとって極めて経済的に重要であり、推定では米国の乳牛群の２０％が罹ることによる低下した生産及び動物の早期の間引きに起因する大きな損失を生じさせ、毎年２億２千万ドルの損害を酪農産業に生じさせている（Wellsら、2000, J. Am. Vet. Med. Assoc., 216:1450-1457）。ウシは、生後６ヶ月以内がこの生物による感染を最も受けやすく、しかし、疾患が典型的には、３歳〜５歳になるまで明らかにならない。感染が、感染している雌牛からの汚染された糞、初乳又は乳汁の摂取によって生じる（Sweeney、1996, Vet. Clin. N. Am. Food Anim. Pract., 12:305-312）。胎児感染もまた、特に、進行した疾患を有する妊娠している雌牛において生じる（Sweeneyら、1992, Am. J. Vet. Res., 53:477-480）。その上、ＭＡＰの重要性が、ヒトにおけるクローン病の原因因子としてのその潜在的役割のために著しく増大している（Chamberlineら、Aliment Pharmacol Ther, 2001, 15(3):337-46；Naser SAら、Mol Cell Probes, 2002, 16(1):41-8）。

屋外使用のための現在承認されているＪＤワクチンはＭＡＰの死菌株のオイル懸濁物であり、これには著しい限界がある。第１に、種々のワクチン接種試験における結果が異なることにより、このワクチンの効力が疑わしい。別の問題が、ワクチン接種された動物は結核及びパラ結核についての偽陽性反応を有するので、全細胞バクテリンが診断検査を妨害することである。従って、改善されたワクチンに対する要望が増大しており、しかし、そのようなワクチンは、強力である必要があり、また、同時に、結核及びＪＤの診断を妨害してはならない。この目標を達成するために、いくつかの取り組みがこれまで試みられており、これらには、組換えワクチン、ＤＮＡワクチン及びサブユニットワクチンが含まれる（Shin SJら、Infect Immun, 2005, 73(8):5074-85）。しかしながら、改善されたＭＡＰワクチンのための開発が引き続き求められている。

発明の概要
本発明は、免疫学的応答を哺乳動物においてＭＡＰに対して刺激するための組成物及び方法を提供する。本発明の組成物は、本明細書中では「Ｍａｐ７４Ｆ」として示される新規な７９ｋＤａの組換えポリペプチドを含む。Ｍａｐ７４Ｆは、Ｍａｐ３５２７タンパク質の約１７．６ｋＤａのＣ末端フラグメントをＭａｐ１５１９タンパク質のフラグメントに連結し、その後に、Ｃ末端において、Ｍａｐ３５２７タンパク質の１４．６ｋＤａのＮ末端部分に連結することによって作製された。

Ｍａｐ７４Ｆに加えて、本発明の組成物はまた、他のＭＡＰタンパク質、例えば、ＭＡＰタンパク質の８５Ａ、８５Ｂ、８５Ｃ、３５ｋＤａ、ＳＯＤ、ＭｐｔＣ、ＭｐｔＤ及びＥＳＡＴ−６様タンパク質、並びに、これらの組合せなどを含むことができる。

本発明の方法は、本発明の組成物を、ＭＡＰ細菌に対する免疫学的応答を刺激するために効果的な量で哺乳動物に投与することを含む。本発明の方法は、ＭＡＰ感染に罹りやすい任意の哺乳動物に対して有益であることが予想され、しかし、反芻動物については特に有益である。

本発明の組成物は標準的な医薬用キャリアとともに配合することができ、様々な従来の経路のいずれかにより投与することができる。本発明の組成物は、ＭＡＰ感染に罹りやすい動物に対して、又は、ＭＡＰに感染している動物に対していつでも投与することができる。しかしながら、例えば、予防的な免疫学的成分を、初乳を介してその新生児に移行させることができる妊娠している動物に投与することによって、又は、生後１週間〜５週間の期間中に投与することによって、組成物をＭＡＰ感染の前に投与することが好ましい。

Ｍａｐ７４Ｆ構築物の略図を提供する。Ｍａｐ７４Ｆが、そのＮ末端からＣ末端に、Ｍａｐ３５２７タンパク質のＣ末端フラグメントをコードするＯＲＦがＭａｐ１５１９タンパク質のアミノ酸１〜アミノ酸４６０をコードするＯＲＦに連結され、Ｍａｐ３５２７のＮ末端フラグメントをコードするＯＲＦで終わる逐次連結によって作製された。Ｍａｐ７４ＦをコードするＯＲＦは２３９７ヌクレオチド（ｎｔ）であり、これは、予測分子量が約７９ｋＤａである７９９ａａのポリペプチドをコードする。 Ｍａｐ７４Ｆをコードする発現ベクターにより形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１／ｐＬｙｓＥ）から得られるＥ．ｃｏｌｉ溶解物のクーマシーブルー染色された１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真図を提供する。細胞を成長させ、１ｍＭのＩＰＴＧにより誘導した。レーンはＩＰＴＧ誘導前での溶解物（レーンＵＩ）又はＩＰＴＧ誘導後３時間での溶解物（レーンＩ）を示す。精製された組換えＭａｐ７４Ｆが、分子量マーカー（レーンＭ）と一緒にレーンＰに示される。 図２Ａ〜Ｄは、ブースターワクチン接種後３週間で犠牲にされたマウスから得られたデータのグラフ図を提供する。Ｍａｐ７４Ｆ＋モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）が投与されたマウス、及び、ＭＰＬだけが投与されたマウスに由来する脾臓細胞を、１０μｇ／ｍｌのＭａｐ７４Ｆ、ＣｏｎＡ及び培地により２日間刺激した。図２Ａに示されるデータについては、培養上清をＥＬＩＳＡによってＩＦＮ−γのレベルについてアッセイした。図２Ｂに示されるデータについては、抗原の存在下及び非存在下で刺激された免疫化マウス及びコントロールマウスの単一細胞脾臓懸濁物におけるＩＦＮ−γ発現細胞の相対的な数を求めるためのＥＬＩｓｐｏｔアッセイ。図２Ｃでは、ワクチン接種された動物（Ｍａｐ７４Ｆ＋ＭＰＬ）及びコントロール動物（ＭＰＬ、ＣｏｎＡ−ＭＰＬ）から組換え抗原及びコントロール抗原による刺激の後で採取されたリンパ球サブセット集団についての脾臓細胞のＦＡＣＳ分析からのデータが示される。図２Ｄでは、データが、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化された、Ｍａｐ７４Ｆに対する応答におけるサイトカインｍＲＮＡ発現について示される。データは３回の独立した実験を表す。 図３Ａ及び図３Ｂは、ワクチン接種された動物及びコントロール動物から異なる時点（プレワクチン接種／初回ワクチン接種（ＰＶ）、ブースターワクチン接種（Ｂ）、抗原投与前（ＢＣ）、抗原投与後４週間、８週間、１２週間及び１６週間）で採取された血清から得られ、抗体応答について調べられたデータを示す。図３Ａに示されるデータは、Ｍａｐ７４Ｆ特異的抗体について試験された血清から得られる。図３Ｂは、ＥＬＩＳＡによってＩｇＧ１：ＩｇＧ２比率について試験するデータを表す。データは３回の独立した実験を表す。 図４Ａ及び図４Ｂは、Ｍａｐ７４Ｆ＋ＭＰＬによるワクチン接種によってもたらされる、脾臓（図４Ａ）、肝臓（図４Ｂ）及び腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）（図４Ｃ）における保護免疫性の発現を示すデータのグラフ表示を提供する。Ｍａｐ７４Ｆは、ＭＡＰ負荷を、脾臓（抗原投与後８週間〜１６週間で）、肝臓（抗原投与後１２週間〜１６週間で）及びＭＬＮ（抗原投与後８週間〜１６週間で）において著しく低下させた。データは３回の独立した実験を表す。 図５Ａ〜図５Ｄは、ワクチン接種されたマウスの組織及びワクチン接種されていないマウスの組織の組織病理学的試験の写真図を提供する。図５Ａは、ワクチン接種を受けないコントロールマウスに由来する肝臓を表す。無数の大きい肉芽腫が肝臓全体にランダムに分散する。ヘマトキシリン及びエオシン。横棒＝１００ｕｍ。挿入図：無数の抗酸性桿菌を明らかにする肉芽腫のより大きい倍率。チール・ネールゼン染色。図５Ｂは、Ｍａｐ７４Ｆによるワクチン接種を受けたマウスに由来する肝臓を表す。少数のマクロファージを伴うほんのわずかな数の小さいリンパ球様凝集物が存在する。図５Ｃは、ワクチン接種を受けないコントロールマウスに由来する脾臓を表し、肉芽腫が白色脾髄において所々に存在することを示す。図５Ｄは、Ｍａｐ７４Ｆによるワクチン接種を受けたマウスに由来する脾臓を表す。白色脾髄及び赤色脾髄には、肉芽腫がない。ヘマトキシリン及びエオシン染色。横棒＝１００ｎｍ。挿入図：抗酸性桿菌が存在しないことを明らかにする肉芽腫のより大きい倍率。チール・ネールゼン染色。 組換え抗原（８５Ａ、８５Ｂ、Ｍａｐ７４Ｆ及びＳＯＤ）、ＣｏｎＡ及びＰＰＤに対する、免疫化動物（群Ｉ及び群ＩＩ）及びコントロール動物（群ＩＩＩ）から得られる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のリンパ球増殖応答を示すデータのグラフ表示を提供する。結果が刺激指数（ＳＩ）として表され、誤差棒が平均からの標準偏差を示す。 組換え抗原（８５Ａ、８５Ｂ、Ｍａｐ７４Ｆ及びＳＯＤ）、ＣｏｎＡ及びＰＰＤに対する、免疫化動物（群Ｉ及び群ＩＩ）及びコントロール動物（群ＩＩＩ）から得られる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のリンパ球増殖応答を示すデータのグラフ表示を提供する。結果が刺激指数（ＳＩ）として表され、誤差棒が平均からの標準偏差を示す。 組換え抗原（８５Ａ、８５Ｂ、Ｍａｐ７４Ｆ及びＳＯＤ）、ＣｏｎＡ及びＰＰＤに対する、免疫化動物（群Ｉ及び群ＩＩ）及びコントロール動物（群ＩＩＩ）から得られる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のリンパ球増殖応答を示すデータのグラフ表示を提供する。結果が刺激指数（ＳＩ）として表され、誤差棒が平均からの標準偏差を示す。 免疫化動物（群Ｉ及び群ＩＩ）及びコントロール動物（群ＩＩＩ）から得られるＰＢＭＣの抗原特異的なＩＦＮ−γ応答を示すデータのグラフ表示を提供する。結果がＯＤ値として表され、誤差棒が平均からの標準偏差を示す。 免疫化動物（群Ｉ及び群ＩＩ）及びコントロール動物（群ＩＩＩ）から得られるＰＢＭＣの抗原特異的なＩＦＮ−γ応答を示すデータのグラフ表示を提供する。結果がＯＤ値として表され、誤差棒が平均からの標準偏差を示す。 免疫化動物（群Ｉ及び群ＩＩ）及びコントロール動物（群ＩＩＩ）から得られるＰＢＭＣの抗原特異的なＩＦＮ−γ応答を示すデータのグラフ表示を提供する。結果がＯＤ値として表され、誤差棒が平均からの標準偏差を示す。 組換え抗原及びコントロール抗原による刺激の後での指定された時間で免疫化群（Ｉ及びＩＩ）及びコントロール群（ＩＩＩ）から採取されたＰＢＭＣに由来するリンパ球サブセットの、フローサイトメトリーによって分析されたときの発現を示すデータのグラフ表示を提供する。結果が、（培地とともに培養された）非誘導のサンプルに対する陽性染色の細胞の百分率として表される。誤差棒が平均からの標準偏差を示す。 組換え抗原及びコントロール抗原による刺激の後での指定された時間で免疫化群（Ｉ及びＩＩ）及びコントロール群（ＩＩＩ）から採取されたＰＢＭＣに由来するリンパ球サブセットの、フローサイトメトリーによって分析されたときの発現を示すデータのグラフ表示を提供する。結果が、（培地とともに培養された）非誘導のサンプルに対する陽性染色の細胞の百分率として表される。誤差棒が平均からの標準偏差を示す。 組換え抗原及びコントロール抗原による刺激の後での指定された時間で免疫化群（Ｉ及びＩＩ）及びコントロール群（ＩＩＩ）から採取されたＰＢＭＣに由来するリンパ球サブセットの、フローサイトメトリーによって分析されたときの発現を示すデータのグラフ表示を提供する。結果が、（培地とともに培養された）非誘導のサンプルに対する陽性染色の細胞の百分率として表される。誤差棒が平均からの標準偏差を示す。 組換え抗原及びコントロール抗原による刺激の後での指定された時間で免疫化群（Ｉ及びＩＩ）及びコントロール群（ＩＩＩ）から採取されたＰＢＭＣに由来するリンパ球サブセットの、フローサイトメトリーによって分析されたときの発現を示すデータのグラフ表示を提供する。結果が、（培地とともに培養された）非誘導のサンプルに対する陽性染色の細胞の百分率として表される。誤差棒が平均からの標準偏差を示す。 組換え抗原及びコントロール抗原による刺激の後での指定された時間で免疫化群（Ｉ及びＩＩ）及びコントロール群（ＩＩＩ）から採取されたＰＢＭＣに由来するリンパ球サブセットの、フローサイトメトリーによって分析されたときの発現を示すデータのグラフ表示を提供する。結果が、（培地とともに培養された）非誘導のサンプルに対する陽性染色の細胞の百分率として表される。誤差棒が平均からの標準偏差を示す。 組換え抗原及びコントロール抗原による刺激の後での指定された時間で免疫化群（Ｉ及びＩＩ）及びコントロール群（ＩＩＩ）から採取されたＰＢＭＣに由来するリンパ球サブセットの、フローサイトメトリーによって分析されたときの発現を示すデータのグラフ表示を提供する。結果が、（培地とともに培養された）非誘導のサンプルに対する陽性染色の細胞の百分率として表される。誤差棒が平均からの標準偏差を示す。 免疫化群（Ｉ及びＩＩ）及びコントロール群（ＩＩＩ）における組換え抗原に対する応答でのサイトカイン遺伝子のｍＲＮＡ発現を示すデータのグラフ表示を提供する。結果が、較正物として役立った非刺激ＰＢＭＣに対する平均増大倍数として表される。誤差棒が平均からの標準偏差を示す。 免疫化群（Ｉ及びＩＩ）及びコントロール群（ＩＩＩ）における組換え抗原に対する応答でのサイトカイン遺伝子のｍＲＮＡ発現を示すデータのグラフ表示を提供する。結果が、較正物として役立った非刺激ＰＢＭＣに対する平均増大倍数として表される。誤差棒が平均からの標準偏差を示す。 ワクチン接種を受けた群Ｉ及び群ＩＩの動物並びにコントロールの群ＩＩＩの動物における個々の組換え抗原に対する抗体応答。誤差棒が平均からの標準偏差を表す。 検死解剖時に採取された様々な組織で測定されたＭＡＰ培養結果（ＣＦＵ）の表によるまとめを提供する。

発明の詳細な説明
本発明は、ＭＡＰに対する免疫応答を哺乳動物において刺激するための組成物及び方法を提供する。本発明の組成物は、本明細書中ではＭａｐ７４Ｆとして示される組換えポリペプチドを含む。Ｍａｐ７４Ｆをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は長さが２３９７ヌクレオチドであり、７９９アミノ酸のポリペプチドをコードする。Ｍａｐ７４Ｆタンパク質の配列が配列番号１に提供される。Ｍａｐ７４Ｆは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって推定されたときの約７４ｋＤａのその見かけの分子量にもかかわらず、７９ｋＤａであるとそのアミノ酸組成に基づいて計算された分子量を有する。配列番号１に提供される配列は、必要な場合には使用される精製タグ（例えば、ヒスチジンタグなど）を伴うことなく示される。

Ｍａｐ７４Ｆは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｍａｐ３５２７タンパク質の約１７．６ｋＤａのＣ末端フラグメント、Ｍａｐ１５１９タンパク質の４６．８ｋＤａのフラグメント、その後にＭａｐ３５２７タンパク質の約１４．６ｋＤａのＮ末端フラグメントを連結することによって構築された。Ｍａｐ７４Ｆの概略的表示が図１に提供される。

Ｍａｐ３５２７及びＭａｐ１５１９の完全なアミノ酸配列が配列番号２及び配列番号３としてそれぞれ提供される。Ｍａｐ７４Ｆに存在するＭａｐ３５２７タンパク質の１７．６ｋＤａのＣ末端フラグメントが配列番号２のアミノ酸１８３〜アミノ酸３６１によって表される。Ｍａｐ７４Ｆに存在するＭａｐ１５１９タンパク質の４６．８ｋＤａのフラグメントが配列番号３のアミノ酸１〜アミノ酸４６０によって表される。Ｍａｐ７４Ｆに存在するＭａｐ３５２７タンパク質の１４．６ｋＤａのＮ末端フラグメントが配列番号２のアミノ酸３３〜アミノ酸１８０によって表される。Ｍａｐ１５１９のより長いフラグメント、並びに、Ｍａｐ３５２７のＮ末端及びＣ末端のより長いフラグメントが、本発明の方法において有用である組換えタンパク質に含まれ得ることが予想される。

ＭＡＰ７４Ｆに加えて、本発明の組成物は、ＭＡＰ細菌に対する免疫応答を刺激することができる他の作用因を含むことができる。例えば、組成物は、１つ又はそれ以上の他のＭＡＰタンパク質（例えば、ＭＡＰタンパク質の８５Ａ、８５Ｂ、８５Ｃ、３５ｋＤａ、スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）、ＭｐｔＣ、ＭｐｔＤ及びＥＳＡＴ−６様タンパク質、並びに、これらの組合せなど）を含むことができる。これらのタンパク質が米国特許出願第１１／８１６，３６５号に記載され、これらのタンパク質、これらのタンパク質をコードするＤＮＡ配列の記載、並びに、これらのタンパク質、及び、これらのタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ＭＡＰに対する免疫学的応答を刺激するために組成物において使用する方法は、参照により本明細書中に組み込まれる。

１つの実施形態において、組成物は、ＭＡＰ７４Ｆと、ＭＡＰタンパク質の８５Ａ、８５Ｂ又はＳＯＤの１つ又はそれ以上とを含む。ＭＡＰ８５Ａ遺伝子をコードするＤＮＡ配列、及び、８５Ａ遺伝子のアミノ酸配列が、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ２８００６７（２００３年１０月１０日、入力）において提供される。ＭＡＰ８５Ｂ遺伝子をコードするＤＮＡ配列、及び、８５Ｂ遺伝子のアミノ酸配列が、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ２１９１２１ ８５Ａ遺伝子（２００２年１１月２１日、入力）において提供される。ＭＡＰ８５Ｃ遺伝子をコードするＤＮＡ配列、及び、８５Ｃ遺伝子のアミノ酸配列が、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ２８００６８（２００２年１１月２１日、入力）において提供される。ＭＡＰ ＳＯＤ遺伝子をコードするＤＮＡ配列、及び、ＳＯＤ遺伝子のアミノ酸配列が、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ１８０８１６（２００１年１１月３０日、入力）において提供される。

本発明の方法は、Ｍａｐ７４Ｆを含む組成物を、ＭＡＰに対する免疫応答を刺激するために効果的な量で哺乳動物に投与することを含む。刺激された免疫応答は、ＭＡＰ抗原に対して反応性の抗体の生成、リンパ球増殖の刺激、Ｔｈ−１関連サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γなど）の産生、及び、前記の組合せ（これらに限定されない）を含めて、免疫系のいずれかの成分を刺激することを含むことができる。

Ｍａｐ７４Ｆはベクターの形態で動物に投与することができる。例えば、Ｍａｐ７４Ｆをコードする核酸配列を細菌（例えば、サルモネラ）又はウイルス（例えば、ウシヘルペスウイルス−１（ＢＨＶ−１））のゲノムにクローン化することができ、得られた組換え細菌又は組換えウイルスを動物に投与することができる。従って、本発明にはまた、Ｍａｐ７４Ｆを発現する細菌ベクター及びウイルスベクターが含まれる。本発明の範囲において同様に意図されるものが、Ｍａｐ７４Ｆをコードする核酸分子が、単独で、或いは、アジュバント又はトランスフェクション促進剤との組合せでのどちらかで動物に直接に投与されるＤＮＡワクチン方法論である。

本発明の方法は、ＭＡＰ感染に罹りやすい任意の動物に対して利益を提供することができる。本発明の組成物及び方法は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカ及びヘラジカ、アンテロープ並びにスイギュウ（これらに限定されない）を含めて、反芻動物のＭＡＰ感染の予防又は治療のために特に良く適する。１つの実施形態において、本発明の方法は、ヨーネ病の予防又は治療のために使用することができる。

本発明の組成物は任意のＭＡＰ感染動物又は非感染動物に投与することができる。本発明の方法に従った感染動物への組成物の投与は、治療的な免疫学的応答を刺激すると見なされる。しかしながら、本発明にはまた、予防的応答を刺激するために、組成物をＭＡＰ感染の前に投与することが含まれる。例えば、組成物を、予防的な免疫学的成分を、授乳期間中に初乳又は乳汁を介してその感染していない新生児に移行させることができる妊娠している動物に投与することができる。代替では、組成物を、ＭＡＰ感染を防止し得るか、又は、感染が生じる場合、疾患の重篤度を軽減し得る予防的効果を提供するために、生後１週間〜５週間の期間中に投与することができる。従って、１つの実施形態において、本発明の方法はＭＡＰ感染について予防的であり、一方、別の実施形態において、本発明の方法はＭＡＰ感染について治療的である。

本発明の組成物は標準的な医薬用キャリアとともに配合することができ、様々な従来的経路のいずれかにより投与することができる。タンパク質との使用のための許容され得る医薬用キャリアのいくつかの例が、Remington's Pharmaceutical Sciences（第１８版、A.R. Gennaroら編、Mack Publishing Co.、Easton、Pa.、1990）に記載される。

本発明の方法において使用される組成物はまた、アジュバントを含むことができる。任意の従来のアジュバントを使用することができる。

１つの実施形態において、アジュバントは、合成トレハロースジコリノミコラートとの組合せで提供され得るモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）であり得る。別の実施形態において、アジュバントはジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）であり得る。

本発明の組成物は任意の許容され得る経路によって投与することができる。好適な投与経路には、経口、粘膜及び非経口（例えば、血管内注射、筋肉内注射及び皮下注射）が含まれる。組成物は、ＭＡＰ感染に罹りやすい動物に対して、又は、ＭＡＰに感染している動物に対していつでも投与することができる。

当業者は、特定の動物に投与される組成物におけるＭＡＰ７４Ｆ及び何らかの他の抗原性作用因の量が数多くの要因（例えば、投与経路、並びに、動物のサイズ、身体状態及びＭＡＰ状態など）に依存し、所望される結果を達成するために当業者によって調節され得ることを認識する。組成物は１回だけの投与で使用することができ、又は、免疫学的応答を高めるために一連の投与で使用することができる。一般には、１０μｇ〜２００μｇの間のタンパク質の総投薬量を投与することができる。

下記の実施例は本発明の様々な実施形態を記載する。これらの実施例は例示的であり、限定的であることが意図されない。

本実施例は、Ｍａｐ７４Ｆのクローニング、発現及び精製の記載を提供する。

Ｍａｐ７４Ｆをコードするタンデム連結されたＯＲＦの作製
Ｍａｐ７４Ｆを、Ｍａｐ３５２７の約１７．６ｋＤａのＣ末端フラグメントを、４６．８ｋＤａの分子量を有するＭａｐ１５１９タンパク質をコードするＯＲＦに、その後に、Ｃ末端において、Ｍａｐ３５２７の約１４．６ｋＤａのＮ末端部分とタンデムに順次連結することによって作製した。

停止コドンを欠くＭａｐ３５２７ｃ構築物の作製。
Ｍａｐ３５２７のＣ末端部分（Ｍａｐ３５２７ｃ）に対する５’側オリゴヌクレオチド及び３’側オリゴヌクレオチドを下記のように設計した：５’（ＴＡ ＣＡＴＡＴＧ ＣＡＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＣＴＣ ＡＡＣ ＣＡＧ ＡＧＣ ＧＴＣ ＴＣＧ ＧＣ ３’（配列番号４））及び（５’ＴＡ ＧＡＡＴＴＣ ＧＧＣ ＣＧＧ ＣＧＧ ＣＣＣ ＣＴＣ ＣＧＣ Ｃ ３’（配列番号５））。５’側オリゴヌクレオチドはＮｄｅＩ制限部位をＡＴＧ開始コドンの前に含有し、その後に、６個のヒスチジン残基をコードするヌクレオチド配列（斜字体）が続いた。３’側オリゴヌクレオチドはＥｃｏＲＩ制限部位を含有した。これらのオリゴを使用して、Ｍａｐ３５２７ｃ、すなわち、Ｍａｐ３５２７のカルボキシル側の５４０ｎｔ部分（１４．６ｋＤａ、１８０ａａ残基）を増幅し、得られたＰＣＲ増幅生成物をＰＣＲ２．１Ｔｏｐｏベクターに連結した。正しい挿入物を有するプラスミドＤＮＡをＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩにより消化し、同じ酵素により切断されたｐＥＴ１７ｂ発現ベクターに連結した。連結生成物を大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ５α細胞に形質転換し、正しい挿入物（Ｍａｐ３５２７ｃ）を有する１つの形質転換体を制限酵素消化及びＤＮＡ配列決定によって特定した。

Ｍａｐ１５１９の全長コード配列のＰＣＲ増幅及びＭａｐ３５２７ｃ−ｐＥＴプラスミドへの連結。
Ｍａｐ１５１９の５’側オリゴ及び３’側オリゴは下記の配列を含有した：５’（５’−ＣＴＡ ＡＴＣ ＧＡＡＴＴＣ ＡＴＧ ＴＴＣ ＴＡＴ ＧＧＧ ＧＣＣ ＴＴＴ Ｃ−３’（配列番号６））及び３’（５’−ＴＡ ＡＴＣ ＧＡＴＡＴＣ ＣＡＧ ＧＡＣ ＣＴＴ ＧＧＡ ＣＴＴ ＧＴＣ−３’（配列番号７））。５’側オリゴヌクレオチドはＥｃｏＲＩ制限部位を含有した。３’側オリゴヌクレオチドはＥｃｏＲＶ制限部位を有し、その直後に、６個のＣ末端アミノ酸残基を含み、かつ、停止コドンを欠く配列が続いた。Ｍａｐ１５１９のコード配列（１３８０ｂｐ；予測されたサイズが約４６．８ｋＤａである４６０ａａの領域）の増幅、及び、得られたＰＣＲ増幅生成物を、同じ酵素により切断されたＰＣＲ２．１Ｔｏｐｏベクターに連結した。正しい挿入物を有するクローンをＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶにより消化し、ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶにより事前に消化されたＭａｐ３５２７ｃ−ｐＥＴプラスミドに連結した。その後、連結生成物をＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞に形質転換し、正しい挿入物（Ｍａｐ３５２７ｃ−Ｍａｐ１５１９）を有する１つの形質転換体を制限酵素消化によって特定し、ＤＮＡ配列決定によって確認した。

Ｍａｐ３５２７Ｃ−Ｍａｐ１５１９構築物へのＭａｐ３５２７のＮ末端フラグメントのクローニング。
Ｍａｐ３５２７のＮ末端フラグメントの５’側オリゴヌクレオチド及び３’側オリゴヌクレオチドを下記に記載されるように設計した：５’（５’−ＡＴ ＧＡＴＡＴＣ ＧＧＧ ＣＴＧ ＧＣＧ ＣＣＧ ＧＣＧ ＴＣＣ−３’（配列番号８））及び３’（５’−ＡＴ ＣＴＣＧＡＧ ＴＣＡ ＣＧＣ ＧＡＣ ＣＴＴ ＧＣＣ ＧＧＣ−３’（配列番号９））。５’側オリゴヌクレオチドはＥｃｏＲＶ制限部位を含有した。３’側オリゴヌクレオチドはＸｈｏＩ制限部位を含有した。これらのオリゴヌクレオチドは、Ｍａｐ３５２７のＮ末端の４４７ｂｐ（１４９アミノ酸残基）部分を増幅するために設計された。得られたＰＣＲ増幅生成物をＥｃｏＲＶ及びＸｈｏＩにより消化し、ＥｃｏＲＶ及びＸｈｏＩにより消化されたＭａｐ３５２７ｃ−Ｍａｐ１５１９融合ｐＥＴプラスミドに連結した。連結混合物を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞を形質転換し、陽性クローンを制限消化によって特定し、ＤＮＡ配列決定によって確認した。最終的な構築物は、直線順序で編成された単一ＯＲＦ（Ｍａｐ３５２７Ｃ−Ｍａｐ１５１９−Ｍａｐ３５２７Ｎ）を含む７４ｋＤａのポリタンパク質（Ｍａｐ７４Ｆ）をコードする。

Ｍａｐ７４Ｆ組換えタンパク質の発現及び精製
プラスミドＤＮＡ構築物をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３ｐＬｙｓＥ）細胞に形質転換した。形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）が補充されたＬＢ寒天に置床した。１つの単一コロニーを、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む１０ｍＬのＬＢブロスに接種し、振とうとともに３７℃で一晩培養した。培養物を、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）及びクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍ）を含有するＬＢブロスにおいて１：１００で希釈し、振とうとともに３７℃で成長させた。１ｍＭのＩＰＴＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）による３時間の誘導の後、細胞を遠心分離（５０００Ｘｇ）によって集め、ＰＢＳで１回洗浄した。細胞を緩衝液Ａ（５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に懸濁し、フレンチ細胞プレス又は細胞破砕器で溶解した。封入体を遠心分離した後、ペレットを封入体洗浄緩衝液（緩衝液Ａ＋１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）により３回洗浄し、次いで、リポ多糖（ＬＰＳ）を除くために、ＣＨＡＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌにおける１％ ＣＨＡＰＳ、ｐＨ８．０）により２回洗浄した。封入体を緩衝液Ｂ（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８Ｍ尿素、２ｍＭ ＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ）及び２０μｇ／ｍｌのロイペプチン（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ８．０）に溶解し、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースカラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により精製した。溶出された分画物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって調べ、組換えタンパク質を含有する分画物をプールし、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）に対して４℃で一晩、２回透析した。タンパク質をＤｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌ（商標）エンドトキシン除去ゲル（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）に通し、精製されたタンパク質をカブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ）変形細胞アッセイによってエンドトキシンレベルについて調べた。精製されたタンパク質は、無視できるレベル（１０ｐｇ／ｍｌ）のエンドトキシンを有した。

ポリタンパク質を構築するために使用された構成及び制限酵素部位を示すＭａｐ７４Ｆの概略的表示が図１に示される。Ｍａｐ７４ＦのＯＲＦは２３９７ｎｔの長さであり、予測された分子量が約７９ｋＤａである７９９アミノ酸のポリペプチドをコードする（図１Ｂ）。このＯＲＦの設計及び構築は、３つをつなぐ接合部位のそれぞれにおいて２つのアミノ酸をコードする６ヌクレオチドの２つのヒンジ配列（ＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶ）の導入をもたらした。加えて、ＯＲＦは、６個のヒスチジン残基を、Ｎｉ−ＮＴＡマトリックスを使用する精製のためにＮ末端に有するように設計された。Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現の後、組換えタンパク質を封入体から精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図１Ｂ）。およそ１．５ｍｇ〜２．０ｍｇに及ぶ収量の精製されたタンパク質が１リットルの誘導された培養物から得られた。

本実施例は、ＭＡＰに対する免疫応答をマウスモデルにおいて刺激するためのＭａｐ７４Ｆの使用を明らかにする。

マウスが、ＭＡＰ感染研究のための好適なモデルであることが見出されている。特定の器官の細菌負荷量及び病理学が、ＭＡＰによる抗原投与の後でのマウスの感染状態の良好な指標である。マウスにおいて、肝臓、脾臓及び腸間膜リンパ節が、細菌負荷をＭＡＰ抗原投与後に評価するための選ばれた器官である。本実施例では、これらの器官におけるＭＡＰ負荷が、抗原投与後のＭａｐ７４Ｆの保護的効力を測るために評価された。Ｍａｐ７４Ｆにより免疫化された動物は１６週間の感染経過中にＭＡＰを殺すことができたか、又は、ＭＡＰの増殖を阻害することができたことが、下記に示される結果から明白である。脾臓、肝臓及びＭＬＮにおいて、ＣＦＵの数字が抗原投与後８週間で低下した。このことはＭＡＰの排除を示唆する。細菌負荷のほかに、ワクチン接種された動物の肝臓及び脾臓において認められる肉芽腫の低下した数及びより少ない抗酸性生物は本発明のポリタンパク質の保護的効力を示していた。これらの器官における実質的に低下したＭＡＰ負荷量、並びに、肝臓及び脾臓の改善された病理学は、７４Ｆによる免疫化が、ＭＡＰ負荷量を迅速に低下させるか、又は排除することによって、マウスをＭＡＰ感染から保護したことを示している。Ｍａｐ７４Ｆはまた、高レベルのＩＦＮ−γを誘発する。Ｍａｐ７４Ｆは良好なＴｈ１応答を誘導した。

下記の材料及び方法を本実施例において使用した。

動物
実験を、６週齢〜８週齢のメスのＣ５７／ＢＬ６マウス（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ）を使用して行った。動物はバイオセイフティーレベルＩＩの施設で管理され、餌及び水を自由に摂取した。すべての実験作業を、動物保護法、試験、研究及び訓練で使用される実験動物の人道的管理及び使用に関する公衆衛生局規範、実験動物の管理及び使用のためのＮＩＨガイド、並びに、ニューヨーク州公衆衛生局の規則、規範及び原則に従って行った。

細菌株
ＭＡＰ６６１１５−９８と称される、感染ウシから得られたＭＡＰ単離体を使用して、マウスに抗原投与し、また、ゲノムＤＮＡを単離した。ＭＡＰ６６１１５−９８を、１０％のオレイン酸−アルブミン−デキストロース−カタラーゼ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）及びマイコバクチンＪ（Ａｌｌｉｅｄ Ｍｏｎｉｔｏｒ、Ｉｎｃ、Ｆａｙｅｔｔｅ、ＭＯ）が補充された７Ｈ９培地において成長させた。６週間〜８週間の培養の後、生物を１０，０００Ｘｇでの遠心分離によって集め、リン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．２）により２回洗浄した。生物を、要求される濃度にＰＢＳで希釈し、マウスに抗原投与するために使用した。

マウスの免疫化
マウスを、３６匹の動物がそれぞれの群に有する２つの群に分けた。群Ｉの動物は、ＭＰＬ＋ＴＤＭのエマルジョン（Ｒｉｂｉ ａｄｊｕｖａｎｔ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）と配合された融合タンパク質の５０μｇ／動物による、３週間離した２回の免疫化を、背中における皮下注射により１回の用量あたり１００μｌの総体積で受けた。群ＩＩの動物はワクチン非接種のコントロールとして保たれ、ＭＰＬ＋ＴＤＭのエマルジョンだけが投与された。２回目の免疫化の３週間後、それぞれの群における１２匹の動物（これらは免疫原性研究のために指定された）を犠牲にし、脾臓細胞を従来の手順によって得た。脾臓細胞を、１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）において、３７℃で、５％ＣＯ２で培養した。免疫化実験を同じ用量及びスケジュールにより２回繰り返した。

ＭＡＰによるマウスへの抗原投与
２回目の免疫化の３週間後、群Ｉ及び群ＩＩにおいて各２４匹の動物に、１０^９ＣＦＵユニットのマイコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスの腹腔内注射による抗原投与を行った。両方の群において各６匹の動物を、抗原投与後４週間、８週間、１２週間及び１６週間で安楽死させ、脾臓、肝臓及び腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）を採取し、２つの部分に分けた。細菌負荷量を推定するために、一方の一組の組織をＰＢＳ（１００ｍｇ／ｍｌ）においてホモジネートし、１００μｌの個々の組織ホモジネートを、マイコバクチンＪを含有するヘラルド卵黄（ＨＥＹ）斜面培地（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）に接種した。斜面培地を、８週間〜１２週間の接種の後、コロニー計数によって細菌成長について調べた。もう一方の一組の組織を組織病理学的検査のために使用した。

組織病理学的検査
脾臓、肝臓及びＭＬＮの一部を１０％中性緩衝化ホルマリンにおける浸漬によって固定処理し、パラフィンワックスに包埋し、４μｍで切片化し、従来の組織学的方法によるヘマトキシリン・エオシン染色及びチール・ネールゼン染色により染色し、光学顕微鏡観察によって調べた。

抗体応答についてのＥＬＩＳＡ
抗原特異的なＩｇＧ応答を従来のＥＬＩＳＡによって測定した。ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ−ｉｍｍｕｎｏモジュール、Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を２００ｎｇ／ウェルの組換えタンパク質により被覆し、４℃で一晩インキュベーションした。ＰＢＳＴ（ＰＢＳにおける０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）により１回洗浄した後、３００μｌのブロッキング緩衝液（ＰＢＳＴにおける１％ ＢＳＡ）を加え、２５℃で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴにより３回洗浄し、１００μｌの希釈された血清サンプルをウェルに加え、３７℃で１時間インキュベーションした。総ＩｇＧ応答のために、洗浄後、５０ｎｇのアルカリホスファターゼコンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）をウェルに加え、２５℃で３０分間インキュベーションした。洗浄後、５０μｌのＢｌｕｅＰｈｏｓ基質（ＫＰＬ）を加え、１０分間インキュベーションした。プレートを、５０μｌの停止溶液（ＫＰＬ）を加えた後、ＥＬ_Ｘ８０８Ｕｌｔｒａマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）で６３０ｎｍにおいて読み取った。イソ型応答のために、洗浄後、２５ｎｇのビオチンコンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧ１又はビオチンコンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）をウェルに加え、２５℃で３０分間インキュベーションした。洗浄後、０．２μｇ／ｍｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ標識されたストレプトアビジン（ＫＰＬ）を加え、２５℃で３０分間インキュベーションした。洗浄後、５０μｌの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）をウェルに加え、１５分間インキュベーションした。プレートを、５０μｌの１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を停止溶液として加えた後、ＥＬ_Ｘ８０８Ｕｌｔｒａマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で４５０ｎｍにおいて終点法によって読み取った。

ＩＦＮ−γアッセイ
従来の手順によって得られた脾臓細胞を５×１０^５細胞／ウェルで二連で置床し、組換え抗原の存在下及び非存在下で４８時間培養した。培養上清を集め、固相サンドイッチＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）を製造者のプロトコルに従って使用してＩＦＮ−γについて分析した。簡単に記載すると、５０μｌの培養上清を、マウスＩＦＮ−γに対して特異的なモノクローナル抗体により被覆されたウェルに加えた。ビオチン化ポリクローナル抗体との室温での２時間の共インキュベーションの後、ウェルを洗浄し、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼを加えた。３０分のインキュベーション及び洗浄の後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液をウェルに加え、結果をＥＬ_Ｘ８０８Ｕｌｔｒａマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で４５０ｎｍにおいて読み取った。

ＥＬＩｓｐｏｔアッセイ
ＥＬＩｓｐｏｔキット（ＫＰＬ）を使用して、単一細胞脾臓懸濁物におけるＩＦＮ−γ発現細胞の相対的な数を製造者の説明書に従って求めた。簡単に記載すると、１０μｇ／ｍｌのＩＦＮ−γ捕獲Ａｂ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）をＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ９６ウェル・フィルター・プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）に４℃で一晩被覆した。１×洗浄溶液により洗浄した後、プレートを１×ＢＳＡ溶液によって２５℃で１時間ブロッキング処理し、再び洗浄した。脾臓細胞を５×１０^５細胞／ウェルで二連で置床し、抗原の存在下及び非存在下で４８時間培養した。プレートを１×洗浄溶液により洗浄し、５μｇ／ｍｌのビオチンコンジュゲート化ラット抗マウスＩＦＮ−γ二次Ａｂ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と２５℃で１時間インキュベーションした。プレートを洗浄し、０．２μｇ／ｍｌのＨＲＰ−ストレプトアビジンと２５℃で３０分間インキュベーションした。フィルターをＴｕｒｅＢｌｕｅ基質によって１５分間発色させ、暗所で乾燥し、スポットを計数した。

細胞表面マーカーについてのＦＡＣＳ分析
脾臓細胞を１×１０^６細胞／ウェルで９６ウェル組織培養プレートに二連で置床し、２４時間培養した。ＦＡＣＳ分析を、好適な刺激されていないコントロール細胞とともに、脾臓細胞を７４Ｆ及びコンカナバリンＡにより刺激した後で行った。ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳにおける１％ ＢＳＡ及び０．０５％アジ化ナトリウム）で３回洗浄した後、細胞を５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し、０．５μｇのＦＩＴＣコンジュゲート化又はＰＥコンジュゲート化されたＣＤ３抗体、ＣＤ４抗体及びＣＤ８抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｎｅｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）と混合し、氷上で３０分間インキュベーションした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液により２回洗浄し、１００μｌの３％ホルムアルデヒド／ＰＢＳに懸濁し、５００μｌのＰＢＳを含有するＦＡＣＳチューブに移した。データを、ＦＡＣＳカリバーフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して１０，０００の事象について集め、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを使用して分析した。結果を、同じ抗体により染色された非誘導サンプルの陽性染色細胞に対する、陽性染色細胞の増大平均百分率として表した。

サイトカインのｍＲＮＡ発現についてのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して免疫化マウスの脾臓組織から単離した。メッセンジャーＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して逆転写し、テンプレートｃＤＮＡとして使用した。使用されたプライマー配列及びプローブ配列の詳細が表１に示される。下記の注釈が表１では使用される：ＦＷ、フォワードプライマー；ＲＶ、リバースプライマー；ＴＰ、ＴａｑＭａｎプローブ、５’側のＦＡＭ及び３’側のＴＡＭＡＲにより二重標識される；^ａアンプリコンの長さ（塩基対）、^ｂｃＤＮＡ及び対応する遺伝子のＧｅｎＢａｎｋアクセション番号、^ｃアンチセンスプローブ。

プローブは、５’末端において蛍光性レポーター色素の６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）により標識され、３’末端において消光剤色素のＮ’，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−６−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＡＲ）により標識された。反応を、下記の条件を使用して、２μｌの１０ｐＭのフォワードプライマー及びリバースプライマー、２μｌの２ｐＭのプローブ、１２．５μｌのＴａｑＭａｎ ＰＣＲマスターミックス及び９．５μｌの希釈されたｃＤＮＡを含有する２５μｌの体積において二連で行った：自動化された蛍光計（７７００Ｓｅｑｕｅｎｃｅ検出器、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ ｃｉｔｙ、ＣＡ）において、９４℃で１０分、その後に、合計で４０回の２温度サイクル（９５℃で１５秒及び６０℃で１分）。定量化が、比較サイクル閾値（Ｃ_Ｔ）法を使用して行われ、較正物ｃＤＮＡに対する相対的転写又はｎ倍差として報告された。

統計学的分析
データをＥｘｃｅｌソフトウェアにより統計学的に分析した。群間の差及び個々の抗原の間における差を、１元配置の分散分析、その後で、チューキー・クラマー多重比較又はスチューデントｔ検定により分析した。差は、０．０５未満の確率値が得られたとき、有意であると見なした。

下記の結果が、本実施例において示される材料及び方法を使用して得られた。

Ｍａｐ７４Ｆタンパク質により免疫化されたマウスにおける免疫応答
ブースターワクチン接種の３週間後、それぞれの群からの４匹のマウスを犠牲にし、抗Ｍａｐ７４Ｆ抗体応答及びＴ細胞応答を評価した。Ｍａｐ７４Ｆにより免疫化されたマウスは、ＩｇＧ２ａではなく、Ｍａｐ７４Ｆに対する著しくより強いＩｇＧ１応答（ｐ＜０．０１）を有した。対照的に、Ｍａｐ７４Ｆ特異的な抗体がコントロール群では検出されなかった。

ＩＦＮ−γ応答を、培養上清のＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡ、及び、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって評価した。抗原特異的なＩＦＮ−γ応答が、ＭＰＬだけを受けたコントロール動物と比較されたとき、Ｍａｐ７４Ｆにより免疫化されたマウスでは著しくより高かった（Ｐ＜０．０５）（図２Ａ）。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴの結果もまた、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡの結果と同程度であった（図２Ｂ）。このことから、ワクチン接種された動物における増大したＩＦＮ−γ応答がさらに確認された。ワクチン接種群は、コントロール群における７とは対照的に、２０の平均単一細胞形成コロニー（ＳＦＣ）を有した。脾臓細胞における抗原特異的なＣＤ３^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の分布をＦＡＣＳによって評価した。ＣＤ３^＋Ｔ細胞及びＣＤ４^＋Ｔ細胞が、コントロール動物よりも、Ｍａｐ７４Ｆにより免疫化されたマウスでは著しく高かった（Ｐ＜０．０１）（図２Ｃ）。対照的に、有意差が、ワクチン接種動物と、コントロール動物との間で、ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団において認められなかった。サイトカイン遺伝子の発現レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって評価した。有意でない差（Ｐ＞０．０５）が、ワクチン接種動物と、コントロール動物との間でサイトカイン遺伝子（ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γ）の発現レベルにおいて検出された（図２Ｄ）。

Ｍａｐ７４ＦはＣ５７／ＢＬ６マウスをＭＡＰ感染から保護する
ワクチン接種されたマウスにおいて得られる免疫応答に基づいて、本発明者らは、ＭＡＰ感染に対するＭａｐ７４Ｆタンパク質の保護的効力をマウスにおいて評価することを計画した。異なる時点で採取された血清を総ＩｇＧ応答（図３Ａ）及びＩｇＧ／ＩｇＧ２ａ比率（図３Ｂ）についてＥＬＩＳＡによって試験した。７４Ｆにより免疫化されたマウスは、コントロール動物と比較して、ブースターワクチン接種後３週間及び７週間（抗原投与後４週間）で、７４Ｆ特異的な抗体応答における有意な増大（Ｐ＜０．０１）を示した。抗体レベルが抗原投与後のコントロール動物において増大したが、応答は、抗原投与後８週間、１２週間及び１６週間において、ワクチン接種動物の方が高かった。有意差が、ブースターワクチン接種後３週間までに、ワクチン接種動物及びコントロール動物のＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比率において検出された。ワクチン接種動物において、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比率が、ブースターワクチン接種後、抗原投与後４週間まで増大した。その後、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比率における低下が、抗原投与後１６週間の観測期間が終了するまでワクチン接種動物において認められた。

７４Ｆの保護的効力を評価するために、脾臓、肝臓及びＭＬＮを、ＭＡＰによる抗原投与の後の異なる時点でＭＡＰについて培養した。脾臓において、ＭＡＰ負荷が、抗原投与後８週間、１２週間及び１６週間で、コントロール動物と比較して、ワクチン接種動物では著しくより低かった（Ｐ＜０．０１）（図４Ａ）。肝臓において、ワクチン接種動物はコントロール動物よりも低いＭＡＰ負荷を有し、その負荷は抗原投与後１２週間で著しくより低かった（Ｐ＜０．０１）（図４Ｂ）。ワクチン接種動物において、ＭＬＮにおけるＭＡＰ負荷が抗原投与後８週間以降はより低かった（図４Ｃ）。肝臓の組織病理学的検査（図５Ａおよび図５Ｂ）及び脾臓の組織病理学的検査（図５Ｃおよび図５Ｄ）は、ＭＡＰの腹腔内抗原投与が、より多くの肉芽腫を、抗原投与後８週間、１２週間及び１６週間でコントロール動物において生じさせたことを示した。ワクチン非接種のコントロール動物において、肝臓は数多くの大きいランダムに散らばった肉芽腫を有し（図５Ａ）、一方、ワクチン接種を受けた動物の肝臓はほんのわずかな数の小さいリンパ球様凝集物を有した（図５Ｂ）。同様に、ワクチン非接種のコントロール動物の脾臓は、ワクチン接種を受けた動物（図５Ｄ）よりも多くの肉芽腫を有した（図５Ｃ）。コントロール動物からの肝臓組織及び脾臓組織がチール・ネールゼンにより染色されたとき、無数の抗酸性桿菌が認められた。対照的に、肉芽腫及び抗酸性桿菌の数が、７４Ｆにより免疫化された動物ではより少なかった。

従って、本実施例において、本発明者らは、ワクチン接種動物及びコントロール動物からの脾臓細胞を使用して、融合タンパク質によって誘導されるＴ細胞応答のタイプを確認した。マイコバクテリア感染において、Ｔｈ１細胞が、感染の初期段階の期間中における保護のために非常に重要である。細胞内病原体に対する最も効果的なワクチン接種戦略は、Ｔｈ１関連のサイトカインを産生させるためにＣＤ４^＋Ｔ細胞応答及びＣＤ８^＋Ｔ細胞応答の両方を刺激するワクチン接種戦略であると見なされる。一般には、ＩＦＮ−γが、マクロファージの活性化における主要成分と見なされており、Ｔｈ１のＣＤ４^＋Ｔ細胞によるその産生が、ＭＡＰ感染を抑えるために不可欠であると見なされる。本発明者らの結果は、本発明の融合タンパク質によるワクチン接種が著しいＩＦＮ−γ応答を誘発したことを示している。同様に、本発明者らはまた、Ｍａｐ７４Ｆによる免疫化が、ＣＤ８^＋Ｔ細胞とは対照的に、強いＣＤ３^＋Ｔ細胞応答及びＣＤ４^＋Ｔ細胞応答をワクチン接種動物において誘発したことを見出した。このことは、ＩＦＮ−γレベルにおける増大がＣＤ４^＋Ｔ細胞集団における増大に起因し得ることを示している。これらの結果は、ＩＦＮ−γの発現が主として活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞によるものであったという結論を裏付けている。本発明者らの研究においてＭＡＰ抗原投与後に得られる増大したＣＤ４^＋Ｔ細胞応答、及び、ＭＡＰ抗原投与後に得られる保護レベルは、Ｍａｐ７４Ｆの保護的効力を示している。

本実施例において示される本発明者らの免疫原性研究はまた、７４ＦはＭＰＬと一緒になって、良好な抗体応答をワクチン接種動物において誘導したことを示している。ＩｇＧ１／ＩｇＧ２_ａ比率がＭＡＰ抗原投与後の４週間まで増大した。このことはＴｈ２特異的な応答を示している。しかしながら、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２_ａ比率が、８週間から始まって徐々に低下した。このことは、Ｔｈ１応答へのシフトの可能性を示している。７４ＦがＴｈ１応答及びＴｈ２応答の両方を誘導し、前者が、著しいＩＦＮ−γ応答によって示されるように、より顕著であったことが、本実施例において示される結果から明白である。

本実施例は、ＭＡＰに対する免疫応答を反芻動物において刺激するためのＭａｐ７４Ｆ及び他の選択されたＭＰＡタンパク質の使用を明らかにする。

下記の材料及び方法を、本実施例において示されるデータを得るために使用した。

動物。ＭＡＰを有しない群に由来する合計で２５匹のヤギの子（生後５日〜１０日の間）を本研究では使用した。これらのヤギから免疫化実験の前に採取された便サンプルは、培養及びＩＳ９００遺伝子についてのＰＣＲの両方によってＭＡＰについて陰性であった。すべての実験作業を、動物保護法、試験、研究及び訓練で使用される実験動物の人道的管理及び使用に関する公衆衛生局規範、実験動物の管理及び使用のためのＮＩＨガイド、並びに、ニューヨーク州公衆衛生局の規則、規範及び原則に従って行った。

細菌。ＭＡＰ６６１１５−９８（臨床単離体）を使用して、ヤギに免疫化の後で抗原投与した。この菌株はＩＳ９００陽性であり、マイコバクチン依存性であった。ＭＡＰ６６１１５−９８を、１０％のオレイン酸−アルブミン−デキストロース−カタラーゼ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃｏ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）及びマイコバクチンＪ（Ａｌｌｉｅｄ Ｍｏｎｉｔｏｒ、Ｉｎｃ、Ｆａｙｅｔｔｅ、ＭＯ）が補充された７Ｈ９培地において成長させた。８週間の培養の後、生物を４０００ｘｇでの１０分間の遠心分離によって集め、リン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．２）により２回洗浄した。生物を、要求される濃度にＰＢＳで希釈し、子ヤギに抗原投与するために使用した。

抗原及びアジュバント。３つの組換えＭＡＰ抗原（８５Ａ、８５Ｂ、ＳＯＤ）及び融合ポリペプチドＭａｐ７４Ｆを、標準的な技術を使用して、また、米国特許出願第１１／８１６，３６５号（そのクローン化、発現及び精製の記載は本明細書により参照により組み込まれる）に示されるようにクローン化し、発現させ、精製した。発現させたタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して精製した。エンドトキシン混入を、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐａｋ Ｄｅｔｏｘｉ Ｇｅｌ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）の使用によって除いた。抗原は、無視できるレベル（１０ｐｇ／ｍｌ）のエンドトキシンをカブトガニ変形細胞アッセイにおいて有した。ＤＤＡ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を無菌の蒸留水において２．５ｍｇ／ｍｌの濃度に混合し、絶えず撹拌しながら２０分間、８０℃に加熱し、室温に冷却した。ＤＤＡを１回の用量あたり２５０μｇの最終濃度に組換え抗原と完全に混合した。

動物の免疫化。ヤギを３つの群に分け、８匹の動物が群Ｉ及び群ＩＩに有し、９匹の動物が群ＩＩＩに有した（本発明者らはさらに１匹のヤギの子を有したので）。すべてのヤギの子が、３月齢になるまでそれらの雌親と一緒にいた。群Ｉの動物が皮下注射によってＤＤＡにおける４つの抗原（８５Ａ、８５Ｂ、ＳＯＤ及びＭａｐ７４Ｆ）のそれぞれ１００μｇにより免疫化された。群ＩＩの動物が、ＤＤＡを伴うことなく、それぞれの抗原の１００μｇにより免疫化された。群ＩＩＩはコントロール動物として保たれ、ＤＤＡのみが投与された。初回免疫化の３週間後、ヤギは抗原及びアジュバントの同じ様式によるブースター注射を受けた。

ＭＡＰによる動物への抗原投与。ブースター注射の３週間後、２４匹のすべてのヤギが、７日間連続して、１０ｍｌの代用乳における５×１０^８個／動物のＭＡＰ細胞による経口抗原投与を受けた。便の培養を、それぞれの抗原投与の後の２日目、４日目、６日目、８日目及び１０日目に、その後は１ヶ月毎に１回、それぞれの動物に対して行った。

末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離及び培養。ＰＢＭＣを、標準的な技術を使用して実験ヤギから単離した。簡単に記載すると、１０ｍｌ〜１５ｍｌの末梢血を頸静脈からＥＤＴＡバキュテナーチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）に採血した。リンパ球を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ １．０７７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用する示差的遠心分離によって単離した。単核細胞をリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）により３回洗浄した。洗浄された細胞ペレットをＰＢＳに懸濁し、生存性について０．４％トリパンブルーによる染色の後で計数した。リンパ球を、１０％のウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地において、２×１０^６個／ｍｌの生細胞の最終濃度に再懸濁した。細胞を、実験のタイプに依存して９６ウェルの丸底プレート又は平底プレートに播種した（２００μｌ／ウェル）。

リンパ球増殖アッセイ。リンパ球増殖アッセイを、標準的な技術を使用して行った。簡単に記載すると、ＰＢＭＣを、９６ウェル平底プレートにおいて、５％ＣＯ_２における加湿雰囲気において３７℃でインキュベーションし、４つの精製された組換え抗原（１０μｇ／ｍｌ）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ；１０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）及び精製されたタンパク質誘導体（ＰＰＤ；１０μｇ／ｍｌ、ＤＢＬ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ａｍｅｓ、ＩＡ）のそれぞれにより７２時間刺激した。刺激された細胞及び刺激されていないコントロール細胞におけるＤＮＡ合成を、製造者のプロトコルに従って、細胞増殖ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵ比色測定キット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）によるブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みによって測定した。簡単に記載すると、細胞を２時間、１０μｌのＢｒｄＵ標識化溶液により標識した。ペルオキシダーゼコンジュゲート化抗ＢｒｄＵ抗体を加え、９０分間インキュベーションした。この後、酵素基質溶液の添加及び室温での１５分間のインキュベーションを行った。酵素反応を、１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４の添加によって停止させ、光学濃度（ＯＤ）を、ＥＬ_Ｘ８０８Ｕｌｔｒａマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用して４５０ｎｍにおいて読み取った。試験を三連で行い、結果を、抗原と一緒に培養された細胞の平均ＯＤと、抗原を伴うことなく培養された細胞の平均ＯＤとの間における比率として計算される平均刺激指数（ＳＩ）として表した。

ＩＦＮ−γアッセイ。ＩＦＮ−γのレベルを、モノクローナル抗体に基づくサンドイッチ酵素免疫アッセイ（ＢＯＶＩＧＡＭ；Ｂｉｏｃｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ、Ｏｍａｈａ、ＮＥ）を製造者の説明書に従って使用してＰＢＭＣの培養上清において測定した。プレートを、ＥＬ_Ｘ８０８Ｕｌｔｒａマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ）を使用して４５０ｎｍにおいて読み取った。結果を、陰性コントロール及び陽性コントロールの光学濃度（ＯＤ）の比較に基づいて解釈した。結果を、製造者によって提案されるようなカットオフ値と比較して、（ＯＤが陽性コントロールのＯＤよりも大きい場合）陽性として、又は、（ＯＤが陽性コントロールのＯＤよりも小さい場合）陰性として、それらのどちらかで求めた。

リンパ球マーカーのフローサイトメトリー分析。単色フローサイトメトリー分析を、ヤギ特異的なモノクローナル抗体（ＣＤ２−ＭＵＣ２Ａ；ＣＤ４−１７Ｄ−ＩｇＧ_１；ＣＤ４−ＧＣ１Ａ１−ＩｇＧ２ａ；ＣＤ８−ＣＡＣＴ８０Ｃ−ＩｇＧ_１；ＣＤ８−７Ｃ２Ｂ−ＩｇＧ２_ａ；ＣＤ２５−ＣＡＣＴ１１６Ａ−ＩｇＧ_１；ＣＤ４５ＲＯ−ＩＬＡ１６Ａ１−ＩｇＧ３；γδＴＣＲα鎖特異的ＩｇＧ２ｂ−ＧＢ２１Ａ１；ＡＣＴ１−ＣＡＣＴ７Ａ−ＩｇＭ；ＡＣＴ１６−ＧＢ１１０Ａ−ＩｇＭ）（ＶＭＲＤ，Ｉｎｃ、Ｐｕｌｌｍａｎ、ＷＡ）を標準的なプロトコルに従って使用してリンパ球表面分化抗原について行った。簡単に記載すると、細胞を蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）緩衝液で３回洗浄し、最適な反応性のために以前に力価測定された一次抗体と４℃で３０分間インキュベーションした。この後、サンプルを３回洗浄し、フルオレセインイソチオシアナート標識されたウマ抗マウス免疫グロブリン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）と４℃で３０分間インキュベーションした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１００μｌの３％中性緩衝化ホルマリン／ＰＢＳに懸濁した。最後に、細胞をＦＡＣＳチューブに移し、体積を、ＦＡＣＳカリバーフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用する測定の前にＰＢＳにより５００μｌにまでした。データを５，０００〜１０，０００の事象について集め、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを使用して分析した。

サイトカイン遺伝子発現についてのリアルタイム定量的ＰＣＲ。総ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成及びリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲを従来の方法に従って行った。簡単に記載すると、ＲＮＡを、溶解されたＰＢＭＣから、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して単離した。単離されたＲＮＡのサンプルを１０Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ非含有ＤＮａｓｅＩ（Ｑｉａｇｅｎ）により３７℃で１０分間処理し、続いて、９５℃で５分間の熱不活化に供し、その後、氷上で冷却した。ＲＮＡサンプルの逆転写を２０μｌの反応体積（１．６μｌの総ＲＮＡ、２００ＵのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得られる）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．０１Ｍジチオスレイトール及び０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ）において４２℃で５０分間行い、続いて、７０℃で１５分間の不活化を行った。リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲのためのプローブ及びプライマーを、ＧｅｎＢａｎｋに由来するウシのβアクチン遺伝子配列及びサイトカイン遺伝子配列を使用して、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ ｃｉｔｙ、ＣＡ）により設計した。本研究において使用されたプローブ及びプライマーの詳細が表２に示される。

プローブは、５’末端において蛍光性レポーター色素の６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）により標識され、３’末端において消光剤色素のＮ’，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−６−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＡＲ）により標識された。ＰＣＲ反応を、１０μｌの希釈されたｃＤＮＡ、濃度が４００ｎＭのプライマー、８０ｎＭのＴａｑＭａｎプローブ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＯ）、並びに、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、濃度が２．５ｍＭのデオキシヌクレオチド三リン酸、０．６２５Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ及び０．２５Ｕ ＡｍＥｒａｓｅウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを含有するユニバーサルＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を反応あたり伴う２５μｌの反応体積において行った。二連のサンプルを９６ウェルプレートに保ち、自動化された蛍光計（７７００Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において増幅した。ＰＣＲ条件は、５０℃で２分及び９５℃で１０分、その後で、９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間の４０サイクルが続いた。定量化を、比較サイクル閾値（Ｃ_Ｔ）法を使用して行い、較正物ｃＤＮＡに対する相対的転写又はｎ倍差として報告した。

組換え抗原に対する抗体応答。４つの組換え抗原、ｃｏｎＡ及びＰＰＤに対する抗体応答を、従来のプロトコルに従うＥＬＩＳＡによって推定した。間接的ＥＬＩＳＡを、１００μｌの各抗原により被覆され、４℃で一晩保たれ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）により３回洗浄された９６ウェル平底プレートにより行った。非結合部位をＰＢＳにおける５％スキムミルクにより３７℃で１時間ブロッキング処理し、ＰＢＳＴにより２回洗浄した。１００μｌの１：２５，０００希釈された抗ヤギＩｇＧコンジュゲート化西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）をウェルに加え、３７℃で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、２００μｌの２，２’−アジノビス−チアゾリン−６−スルホン酸（Ｓｉｇｍａ）をそれぞれのウェルに加えた。プレートを暗所において３７℃で３０分間インキュベーションし、その後、停止溶液（１Ｍ ＨＣｌ）を加え、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴＥＫ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用して２分間隔で４０５ｎｍにおいて３回読み取った。好適な陽性血清及び陰性血清並びに抗原コントロール及び抗体コントロールがそれぞれのプレートに含まれた。

ＭＡＰの便培養及び器官培養。抗原投与後、ＭＡＰ生物を、標準的なプロトコルに従ってヘラルド卵黄（ＨＥＹ）培地（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）を使用して便から単離することを試みた。便サンプルを、ＭＡＰ単離のために、抗原投与後２日、４日、６日、８日及び１０日に、その後は１ヶ月毎にすべての動物から採取した。同様に、２４匹の動物のそれぞれから検死解剖時に採取された２３個の組織サンプルもまた、培養によってＭＡＰについて試験した。培養が、Ｃｏｒｎｅｌｌ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃセンターにおいて微生物学部門によって行われた。培養は、処置群が伏せられたまま行われた。

全体的な病理学及び組織病理学的検査。すべてのヤギを初回ワクチン接種後３８週間で安楽死させ、検死解剖した。それぞれの動物から得られる合計で２３個の組織サンプル（これらには、脾臓、扁桃、腸間膜リンパ節（３）、下顎リンパ節、回盲リンパ節、肝リンパ節、十二指腸（上行部及び下行部）、空腸（近位端から遠位端までほぼ等間隔の３つの部位）、回腸（近位端での２つの部位、中央回腸での２つの部位及び遠位端での２つの部位）、回盲口、腸結腸開口部、盲腸及びらせん状結腸が含まれた）が検死解剖時に採取された。採取された組織を１０％中性緩衝化ホルマリンにおける浸漬によって固定処理し、パラフィンワックスに包埋し、４μｍで切片化し、従来の組織学的方法によってヘマトキシリン及びエオシンにより染色した。切片が、処置群が知らされていない委員会認定の獣医病理学者（ＳＭ）によって検査された。

統計学的分析。データをＥｘｃｅｌソフトウェアにより統計学的に分析した。群間の差及び個々の抗原の間における差を、１元配置の分散分析、その後で、チューキー・クラマー多重比較又はスチューデントｔ検定により分析した。差は、０．０５未満の確率値が得られたとき、有意であると見なした。

下記の結果が、本実施例において上記で示される材料及び方法を使用して得られた。

抗原に対するリンパ球増殖応答：抗原特異的なリンパ球増殖応答が初回ワクチン接種後（ＡＰＶ）の６週間で検出されたが、応答は、ＡＰＶの１０週間において、ワクチン非接種のコントロール群（ＩＩＩ）と比較して、両方のワクチン接種群（Ｉ及びＩＩ）では著しくより大きかった（Ｐ＜０．０５）（図６）。それにもかかわらず、有意な差が、試験された異なる抗原の間では応答において何ら検出されなかった。

抗原特異的なＩＦＮ−γ応答：有意な差（Ｐ＜０．０１）が、ＡＰＶの６週間及び１０週間で、ワクチン接種動物と、コントロール動物との間でＩＦＮ−γ応答において検出された（図７）。ワクチン接種動物において、最も良好な応答がＭａｐ７４Ｆについて検出された。ＩＦＮ−γ応答が、抗原８５Ａ及び抗原Ｍａｐ７４Ｆについては、ＡＰＶの１０週間で、群Ｉの動物において、群ＩＩの動物よりも著しく高かった（Ｐ＜０．０５）。しかしながら、有意な差が、試験された他の組換え抗原の間では何ら検出されなかった。組換え抗原特異的なＩＦＮ−γレベルがＡＰＶの１８週間から３８週間まで通して低下したが、組換え抗原特異的なＩＦＮ−γレベルは、ワクチン接種動物の方がコントロールよりも著しく高かった（Ｐ＜０．０５）。

組換え抗原に対する応答におけるリンパ球サブセット分布：抗原により刺激されたリンパ球サブセットをフローサイトメトリーによってそれらの割合における違いについて調べた。コントロール群を上回る免疫化群における、ＣＤ４^＋ＩｇＧ１細胞サブタイプ、ＣＤ４^＋ＩｇＧ２ａ細胞サブタイプ、ＣＤ８^＋ＩｇＧ１細胞サブタイプ、ＣＤ８^＋ＩｇＧ２ａ細胞サブタイプにおける有意な増大（Ｐ＜０．０１）が認められた（図８Ａ〜図８Ｄ）。増大がＡＰＶの６週間から始まり、全実験期間を通してＡＰＶの３８週間まで持続した。組換え抗原特異的なＣＤ４^＋Ｔ細胞集団及びＣＤ８^＋Ｔ細胞集団が免疫化動物においてより高く、しかし、ＣＤ４^＋細胞の割合がＣＤ８^＋細胞の割合よりも高かった。しかしながら、ＡＰＶの２６週間及び３８週間でのＣＤ８^＋Ｔ細胞集団において、有意ではなかったが、増大が認められた。本発明者らの研究において試験されたすべての組換え抗原が、γδＴＣＲ^＋細胞集団を、コントロール動物と比較して、両方のワクチン接種群において増大させた一方で、その増大は、８５Ａ抗原及びＭａｐ７４Ｆ抗原については著しくより高かった（Ｐ＜０．０５）。再度ではあるが、ＣＤ４^＋Ｔ細胞集団及びＣＤ８^＋Ｔ細胞集団の場合でのように、γδＴＣＲ^＋細胞集団における持続した増大が実験期間の終了まで認められた（図８Ｅ）。免疫化された動物では、抗原特異的なＣＤ２５^＋Ｔ細胞の割合が、試験された４つの組換え抗原についてはより高かった。ＣＤ２５^＋Ｔ細胞応答におけるわずかな違いが、試験された異なる抗原の間で認められたが、違いは有意でなかった。

サイトカイン遺伝子特異的なｍＲＮＡ発現：組換え抗原特異的なＩＦＮ−γ発現における有意な増大が、ＡＰＶの６週間から始まって、コントロール動物とは対照的に、免疫化動物において検出された（Ｐ＜０．０１）（図９Ａ）。発現レベルがＡＰＶの１０週間でピークに達したが、レベルは、ＡＰＶの３８週間まで、コントロールと比較して、免疫化動物では著しくより高いままであった。対照的に、有意な違いが、ＩＬ−１０の発現において、免疫化動物と、コントロール動物との間では、３つすべての群におけるＡＰＶの２６週間〜３８週間でのＩＬ−１０発現レベルにおける全体的な増大を除いて本発明者らの研究におけるどの時点においても何ら検出されなかった（図９Ｂ）。

組換え抗原特異的な抗体応答：本研究において試験された４つすべての組換え抗原は両方のワクチン接種群において堅固な抗体応答を誘導した。応答は、ＡＰＶの６週間から全実験期間を通して、コントロール群を上回ってワクチン接種群において著しくより高かった（Ｐ＜０．０１）（図１０）。有意な差が、使用された様々な組換え抗原の間では抗体応答において何ら検出されなかった。

検死解剖時に採取された組織の組織病理学。それぞれの動物から検死解剖時に採取された組織の組織病理学的検査では、ワクチン接種を受けていないコントロール動物（群ＩＩＩ）の７５％が肉芽腫を少なくとも１つの組織に有し、これに対して、群Ｉ及び群ＩＩの動物は肉芽腫をわずかに２５％及び５０％の動物においてそれぞれ有したことが示された。肉芽腫が、群Ｉでは、１匹の動物に由来する腸間膜リンパ節及び空腸において、別の１匹の動物の回盲リンパ節において見出された。対照的に、群ＩＩ及び群ＩＩＩにおける肉芽腫が、回腸、回盲結合部又は盲腸において主に突き止められ、その一方で、回盲リンパ節が、これら２つの群に由来する５匹の動物では冒されていた。肉芽腫がどの動物においても十二指腸には見出されず、２匹の動物のみ（群Ｉに由来する１匹及び群ＩＩＩに由来する１匹）が肉芽腫を空腸に有した。他の罹患組織には、群ＩＩＩにおいて、ワクチン接種されていないコントロール動物の２匹における盲腸結腸結合部及び肝リンパ節が含まれていた。

抗原投与後の組織におけるＭＡＰ負荷：それぞれの動物から検死解剖時に採取された２３個の組織におけるＭＡＰ負荷を細菌培養によって評価した（図１１）。ワクチン接種された動物では、群Ｉにおける１匹の動物のみが、非常に低いＣＦＵにより培養陽性であった。群ＩＩでは、８匹中５匹の動物がＭＡＰについて陽性であったが、細菌負荷量は、ＭＡＰが単離されたこれら５匹の動物のうちの４匹において非常に低かった（５匹未満）。ワクチン非接種の群ＩＩＩでは、９匹すべての動物がＭＡＰについて陽性であり、これらの動物の大半が、ＭＡＰについて陽性である少なくとも５つの組織を有し、これらは、３００を超えるＣＦＵ（多すぎて計数できない）を有した。

前記によって明白に示されるように、本実施例において、本発明者らは、組換え８５Ａ、組換え８５Ｂ、組換えＳＯＤ及び組換えＭａｐ７４Ｆの保護的効力をヤギモデルにおいて評価した。ＭＡＰは細胞内生物であるので、感作されたＴ細胞によって媒介されるＴｈ１応答、特に、ＩＦＮ−γを分泌する感作されたＴ細胞によって媒介されるＴｈ１応答が保護における著しい役割を果たすことが考えられる。使用される様々なツールの中で、試験された特定の抗原に対するリンパ球増殖応答の測定が、細胞免疫応答を求めるために広く使用される。本発明者らは、抗原投与後においてコントロールと比較してワクチン接種群では著しくより高かったブースターワクチン接種後３週間での組換え抗原特異的なリンパ球増殖の検出を明らかにする。このことは、抗原特異的な細胞性免疫の誘導を示している。

ＩＦＮ−γは、ウシにおけるＭＡＰ感染に応答して活性化される主要なサイトカイン遺伝子の１つである。加えて、サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γなど）を産生する、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩにより制限されたＣＤ８^＋Ｔ細胞が、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のような他のマイコバクテリウム感染に対する抵抗性のために要求されると考えられる。本実施例では、Ｍａｐ７４Ｆにより媒介されるＩＦＮ−γ応答がブースターワクチン接種及び抗原投与の後で検出された。何らかの特定の理論によってとらわれることは意図されないが、高まったレベルのＩＦＮ−γが、マクロファージのＩＦＮ−γ媒介されるシグナル伝達によって、生ＭＡＰによる抗原投与の後でのヤギの保護的免疫性において重要な役割を果たし得ることが考えられる。

本実施例において示される結果はまた、より高いＣＤ４^＋Ｔ細胞応答及びＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を免疫化動物において示す。本発明者らの結果はまた、組換え抗原による免疫化の後における末梢ＩＦＮ−γレベル及び増殖応答に対するＣＤ４^＋Ｔ細胞の寄与を裏付けている。ＣＤ２５が、活性化されたＴ細胞によって発現される。本発明者らの結果は、ワクチン接種動物における活性化Ｔ細胞の拡大を明瞭に示している。γδＴＣＲ^＋細胞集団はＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞よりも比較的より少ないままであったが、γδＴＣＲ^＋細胞はコントロール動物よりも免疫化動物において著しくより高かった（Ｐ＜０．０５）。ＣＤ４^＋Ｔ細胞エフェクター機構が、ＩＦＮ−γ（これはマクロファージにおける殺菌活性を活性化する）、リンホトキシン、パーフォリン及びグラニュライシンの分泌に関連する。ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びγδ^＋Ｔ細胞もまた、グラニュライシンを分泌する。このことは本発明者らの抗原投与実験の結果と一致しており、本発明者らの組換え抗原の保護的効力を裏付けている。ＩＦＮ−γの増大したｍＲＮＡ発現レベルは、Ｔｈ２特異的なＩＬ−１０の有意でない発現レベルによって裏付けられた限定的な抗原特異的なＴｈ１応答が免疫化動物に存在したことを明瞭に示していた。

リンパ球増殖応答とともに、ＩＦＮ−γ応答、ＣＤ４^＋Ｔ細胞応答及びＣＤ８^＋Ｔ細胞応答は、免疫化群における有意なＴｈ１応答についての証拠を提供する。本発明者らは、組換え抗原の保護的効力をヤギにおいて評価するために抗原投与実験の結果を分析した。特徴的な臨床的徴候がない場合、検死解剖時に採取された組織の組織病理学及び細菌負荷は、ＭＡＰワクチン接種の保護的効力を評価する際の最も良好な標準であると見なされる。本発明者らは２３個の組織を２５匹の動物のそれぞれから採取し、これらの組織を組織病理学的病変及び培養によるＭＡＰ負荷について分析した。有意な減少が、組換え抗原及びＤＤＡが投与された群において、病変を有する動物及び組織の数において観測された。このことは保護的効力を示している。

培養でのＭＡＰの単離は、感染の非常に早い段階の期間中では特に、抗酸性染色又は顕微鏡検査のどちらかと比較した場合、組織におけるＭＡＰを検出するためのより高感度な手段である。しかしながら、肉芽腫性病変の分布は一般に、ＭＡＰ培養結果を反映した。本実施例において示されるＭＡＰ培養結果は、使用された４つの組換え抗原の保護的効力を明瞭に明らかにする。保護が、抗原がＤＤＡと一緒に与えられたときにはほぼ完全であった。ＭＡＰがこの群（Ｉ）の８匹の動物のうちの１匹だけから回収されただけであり、この動物は、著しくより低いＭＡＰ負荷を唯一の陽性組織において、すなわち、遠位回腸において有した。アジュバントを伴わない抗原の投与は保護を示した。だが、抗原がアジュバントを伴うことなく投与されたときには、その保護的効力は相対的により小さかった。このことを、抗原をアジュバントの非存在下で受けた群ＩＩの動物の培養結果から認めることができる。８匹中５匹の動物がＭＡＰについて陽性であったが、細菌負荷量は、群ＩＩＩのコントロール動物と比較して、これらの動物では著しくより低かった。このことは、アジュバントが存在しない場合でさえ、抗原の保護的性質を示している。著しくより大きい数のＭＡＰがワクチン非接種のコントロール群における動物のすべてから回収された。このことは、再度ではあるが、抗原の保護的効力を明らかにする。組換え抗原によるヤギの免疫化は、持続した抗体応答を長期間もたらした。従って、本実施例において示される結果は、組換え抗原が細胞媒介免疫系及び体液性免疫系の両方を刺激したことを示している。ブースターワクチン接種後、抗体応答における有意な増大が、ワクチン非接種のコントロール群と比較して、両方のワクチン群において、組換え抗原のすべてについて検出された。応答は、有意により高くはなかったが、抗原をアジュバントとともに受けた群Ｉの動物においてより大きい傾向を有した。セロコンバージョンがその後に続くＣＭＩ反応性の早期開始が、反芻動物のマイコバクテリウム感染の変わらない特徴である。しかしながら、本実施例において使用された本発明者らの多成分サブユニットは、偽免疫化されたヤギと比較した場合、標的器官における桿菌負荷の減少に関して、有意な保護を与えた。

本発明は、本明細書中に記載される具体的な実施形態によって範囲が限定されることはない。実際、本発明の様々な改変が、本明細書中に記載される改変に加えて、前記の記載から当業者には明らかになる。そのような改変は、添付された請求項の範囲に含まれることが意図される。

本明細書中に引用されるすべての参考文献は、それぞれの個々の刊行物、特許又は特許出願が、すべての目的のためにその全体において参照により組み込まれることが具体的かつ個々に示されていたかのように同じ程度に、それらの全体において、また、すべての目的のために、参照により本明細書中に組み込まれる。

何らかの刊行物の引用は出願日前におけるその開示のためであり、従って、本発明は、そのような刊行物に先行する権利を先行発明によって有しないことを認めるものとして解釈してはならない。

Claims (20)

1. Ｎ末端からＣ末端に、
   ｉ）配列番号２のアミノ酸１８３〜アミノ酸３６１を含むＭａｐ３５２７タンパク質のＣ末端フラグメント、
   ｉｉ）配列番号３のアミノ酸１〜アミノ酸４６０を含むＭａｐ１５１９タンパク質配列、及び
   ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸３３〜アミノ酸１８０を含むＭａｐ３５２７タンパク質のＮ末端フラグメント
   を含む組換えタンパク質を含む組成物。
2. 前記Ｍａｐ１５１９タンパク質配列は配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
3. Ｍａｐ３５２７タンパク質の前記Ｃ末端フラグメントは１７．６ｋＤａの分子量を有する、請求項１に記載の組成物。
4. Ｍａｐ３５２７タンパク質の前記Ｎ末端フラグメントは１４．６ｋＤａの分子量を有する、請求項１に記載の組成物。
5. 前記ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
6. アジュバントをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
7. 前記アジュバントが、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）及びそれらの組合せからなる群より選択される、請求項６に記載の組成物。
8. マイコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス（Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis）（ＭＡＰ）タンパク質をさらに含み、前記タンパク質が、ＭＡＰタンパク質８５Ａ、ＭＡＰタンパク質８５Ｂ、ＭＡＰタンパク質ＳＯＤ及びそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
9. 請求項１に記載される組成物を哺乳動物に投与することを含む、マイコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス（ＭＡＰ）に対する免疫応答を哺乳動物において刺激するための方法。
10. 前記組成物はさらにアジュバントを含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記アジュバントが、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）及びジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
12. 前記組成物が反芻動物に投与される、請求項９に記載の方法。
13. 前記反芻動物が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカ又はヘラジカである、請求項１２に記載の方法。
14. 前記反芻動物がウシである、請求項１３に記載の方法。
15. 前記反芻動物がＭＡＰに感染していない、請求項１２に記載の方法。
16. 前記反芻動物がＭＡＰに感染している、請求項１２に記載の方法。
17. 前記ウシがヨーネ病に罹っている、請求項１４に記載の方法。
18. 前記動物が妊娠している、請求項９に記載の方法。
19. 前記組成物はさらにマイコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス（ＭＡＰ）タンパク質を含み、前記タンパク質が、ＭＡＰタンパク質８５Ａ、ＭＡＰタンパク質８５Ｂ、ＭＡＰタンパク質ＳＯＤ及びそれらの組合せからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
20. 前記組成物の前記ポリペプチドは配列番号１の配列を含む、請求項９に記載の方法。