KR20230139754A - 코로나 19 바이러스 감염 예방 및 감염증 치료용 조성물 - Google Patents
코로나 19 바이러스 감염 예방 및 감염증 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 코로나 19 (COVID 19) 바이러스의 수용체 결합 도메인(Receptor Binding Domain; RBD)과 인간 Immunoglobulin G-FC 프레그먼트의 융합을 통한 항원 단백질을 이용한 코로나바이러스 감염증-19의 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물에 관한 기술이다.
Description
본 발명은 코로나 19 (COVID 19) 바이러스의 수용체 결합 도메인(Receptor Binding Domain; RBD)과 인간(human) Immunoglobulin G-FC 프레그먼트의 융합을 통한 RBD-FC 융합 단백질 및 이를 함유하는 코로나 19 바이러스 감염을 예방하고 감염증을 치료할 수 있는 조성물을 관한 것이다.
코로나 19 바이러스 감염증의 원인인 SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 바이러스는 인간 세포 내부로 침입하여 바이러스의 유전적 복제를 통하여 증식하며 고열, 기침, 인후통, 가래, 근육통, 두통, 폐렴 및 호흡곤란 등의 다양한 증상을 동반한다.
바이러스 SARS-CoV2는 기도의 상피세포(airway epithelial cells), 폐포 상피세포(alveolar epithelial cells), 혈관 내피 세포(vascular endothelial cells), 폐 내의 대식세포(macrophage)) 표면에 존재하는 안지오텐신-전환 효소 2 (angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)에 결합하며 증상을 발현하는데, 바이러스 표면에 위치한 왕관 모양의 스파이크 단백질(Spike protein, S protein)의 S1 domain의 리셉터 바인딩 도메인(receptor binding domain, RBD)이 숙주세포의 수용체와 결합하여 숙주세포에 침투하게 된다.
SARS-CoV-2의 인체 내 감염의 예방은 숙주 세포의 hACE2 수용체와 바이러스 간의 결합을 방해함으로써 막을 수 있으므로 수용체의 결합 영역 (receptor-binding domain)인 RBD와 hACE2의 결합을 차단하여 코로나 바이러스의 세포 침입을 막을 수 있으며 결과적으로 코로나 바이러스의 인체 감염에 대한 방어가 가능하다.
수용체 결합부위인 RBD를 항원으로 하는 예방 및 치료 효과에서 코로나 19 바이러스 감염 억제를 위해서는 중화항체 형성이 필수적이며 현재 재조합 단백질을 이용하는 방법이 안전하고 효율적인 기술로서 알려져 있다.
그 예로 한국 공개특허 10-2021-0123155의 경우, 코로나 19 (COVID 19) 백신 및 치료제를 위한 기술로 스파이크 단백질을 이용한 기술이며, 자세하게는 코로나 19 바이러스의 예방 및 치료학적으로 면역을 상승시키기 위해 가장 중요한 재조합 융합 단백질을 이용한 기술이나, 융합 단백질의 강력한 중화 활성 작용을 포함하지 않으며 단순한 면역원성 단클론항체를 대체하고 코로나 19 바이러스 항원검출 진단용으로 사용하기 위한 기술이다.
본 발명에서는 코로나 19 바이러스의 감염을 억제하고 면역을 상승시키는 강력한 중화 활성반응과 세포 무독성의 효과를 포함한 코로나 19 (COVID 19) 바이러스의 수용체 결합 도메인(Receptor Binding Domain; RBD)과 인간(human) Immunoglobulin G-FC 프레그먼트의 융합을 통한 RBD-FC 융합단백질을 생산하여 코로나 19 (COVID 19) 바이러스의 침입을 차단하고 코로나 19 감염을 예방하는 백신 효과와 코로나 19 (COVID 19) 예방 및 치료를 위한 기술로서 개발하고자 한다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 코로나 19 (COVID 19) 바이러스의 수용체 결합 도메인(Receptor Binding Domain; RBD)과 인간 Immunoglobulin G-FC 프레그먼트 (Fc region)의 융합을 통한 항원 단백질을 이용하여 코로나 19 (COVID 19) 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것으로서 특히 오미크론 변이의 감염까지 예방 및 치료 가능한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명이 상기 해결하고자 하는 과제를 달성하기 위하여 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 코로나 19 (COVID 19) 바이러스의 수용체 결합 도메인(Receptor Binding Domain; RBD)과 인간 Immunoglobulin G-FC 프레그먼트의 융합 단백질임을 특징으로 하는 코로나 19 바이러스(SARS-CoV-2)에 대한 항원 단백질을 제공한다.
또한, 다른 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 항원 단백질을 유효성분으로 포함하는 코로나 19 바이러스(SARS-CoV-2) 예방 백신용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또 다른 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 코로나 19 (COVID 19) 바이러스의 수용체 결합 도메인(Receptor Binding Domain; RBD)과 인간 Immunoglobulin G-FC 프레그먼트의 융합 단백질임을 특징으로 하는 코로나 19 바이러스(SARS-CoV-2)에 대한 항원 단백질을 유효성분으로 포함하는 코로나 19 바이러스(SARS-CoV-2) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 항원 단백질은 코로나 19 바이러스(SARS-CoV-2)가 이의 수용체인 ACE2(Angiotensin-converting enzyme 2)와 결합하여 세포 내로 유입되는 것을 차단함을 통해 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19)을 예방 또는 치료할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 코로나 19 (COVID 19) 바이러스의 수용체 결합 도메인(Receptor Binding Domain; RBD)과 인간 Immunoglobulin G-FC 프레그먼트의 융합을 통한 항원 단백질을 이용하여 코로나 19 바이러스 및 그 변이인 오미크론 변이 바이러스까지 대응하는 효과로서 인체 면역력을 향상시켜 코로나 19 바이러스 감염증 질환을 예방하고 치료를 위한 효과를 나타낸다.
도 1은 코로나 19 (COVID 19) 바이러스의 수용체 결합 도메인(Receptor Binding Domain; RBD)과 인간 Immunoglobulin G-FC 프레그먼트의 융합 단백질에 대한 구조이다.
도 2는 재조합 발현 벡터를 구조를 예시한다.
도 3은 SARS-CoV-2에 대한 특이적 항체 생산 및 ELISA 역가를 나타낸 결과이다.
도 4는 SARS-CoV-2에 대한 중화항체가를 나타낸 결과이다.
도 5는 체중변화를 나타낸 결과이다.
도 6은 사료 섭취량을 나타낸 결과이다.
도 7의 a와 b는 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 중화반응을 백분율로 나타낸 결과이다.
도 2는 재조합 발현 벡터를 구조를 예시한다.
도 3은 SARS-CoV-2에 대한 특이적 항체 생산 및 ELISA 역가를 나타낸 결과이다.
도 4는 SARS-CoV-2에 대한 중화항체가를 나타낸 결과이다.
도 5는 체중변화를 나타낸 결과이다.
도 6은 사료 섭취량을 나타낸 결과이다.
도 7의 a와 b는 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 중화반응을 백분율로 나타낸 결과이다.
이하 본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 상세하게 설명한다.
첨부한 도 1을 참조하면 본 발명은 SPF로 표시되는 코로나 19 (COVID 19) 바이러스의 수용체 결합 도메인(Receptor Binding Domain; RBD)과 FC로 표시되는 인간 Immunoglobulin G-FC 프레그먼트의 융합 단백질 및 이를 포함하는 백신 조성물, 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
RNA 바이러스 일종인 코로나 19 바이러스(SARS-CoV-2)은 바이러스 표면의 스파이크 단백질(spike glycoprotein)이 구조상 수용체 결합 도메인 (receptor binding domain, RBD)에 돌출된 구조를 형성하고 수용체 리셉터인 ACE2(angiotensin 2) 효소와 강력한 결합의 구조로, 세포 내로 내재화된 침투를 더 용이하게 하여 전염력을 높이는 원인으로 작용한다.
본 발명에서는 코로나 19 바이러스(SARS-CoV-2) 감염의 주요 증상의 원인을 차단하기 위한 가장 효율적인 방어 작용인 세포 내재성 감염을 방지 작용인 SARS-CoV-2 중화 활성 반응에 대한 입증으로서 코로나 19 바이러스가 세포 내로 유입 시 복제를 위한 비리온(Virion) 분비 및 생산을 억제하는 융합적 항원 단백질을 생산하는 제조합 단백질 발현 시스템을 이용하였다.
이를 통하여 지속적으로 환경에 따라 다양한 변이로 진화하는 코로나 19 바이러스에 대하여 수용체 역할을 하는 결합부위인 RBD(receptor-binding domain) 단백질이 감염의 주요 부위임을 입증하였다.
첨부한 도 1로 표시되는 융합 단백질은 서열번호 2로 표시되는 RBD 단백질은 인간(human) IgG(immunoglobulin G)의 Fc 단편인 (RBD-Fc)에 겹합된 코로나 19 바이러스(SARS-CoV) 단백질의 RBD를 함유한 융합단백질로서 서열번호 1인 염기서열로 암호화되어 있는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 항원 단백질은 코로나 19 바이러스(SARS-CoV)의 감염을 유발하는 항원에 대하여 강력한 중화 작용을 통하여 코로나 19 바이러스(SARS-CoV-2)를 예방하고 차단하는 코로나 19 바이러스(SARS-CoV-2) 예방 백신용 조성물로 사용된다.
본 발명에서의 상기 RBD 단백질은 코로나 19 바이러스의 변이체 중에서 2021년 11월 9일 남아프리카공화국에서 최초 검출된 오미크론 변이에서 유래한 것으로서 서열번호 3으로 나타냈다.
오미크론 변이체는 발견 된 초기 시점인 2021년 11월 26일 세계보건기구 바이러스 진화 기술자문그룹(Technical Advisory Group on Virus Evolution, TAG-VE) 긴급회의를 통해서 오미크론으로 명명되었으며, 바이러스 특성을 고려하여 주요 변이(Variants of Concern, VOC)로 분류되었으며, 수용체 결합부위(Receptor binding domain, RBD)에 15개 아미노산 변이 등 스파이크 단백질(Spike protein, S 단백질) 내 32개의 변이가 발견되어 기존의 코로나 19 바이러스 증상에 비하여 전파력은 빠른 속도로 증가하고 면역회피 등의 바이러스 특성 변화가 있으며 이에 대한 중증 코로나바이러스 감염증 증상보다 고열을 동반한 감기 증세를 유발하고 있으나 감염자 간의 증상적인 면에서 개인차가 존재한다.
2022년 현재 우리나라를 포함하여 63개국으로 빠르게 전파된 오미크론 변이 바이러스의 경우, 국내에서 빠르게 증가하는 오미크론 변이 감염환자를 위한 코로나 19 바이러스 감염증의 적용 백신 평가와 치료제로서 기술 개발이 절실하게 요구되고 있는데, 이에 대하여 본 발명에서는 상기, 서열번호 2로 표시되는 RBD 단백질의 아미노산 서열로 이루어진 코로나 19 바이러스(SARS-CoV-2)에 대한 재조합 기술을 이용한 인간 IgG 유래 RBD-Fc 항원 단백질을 특징으로 하며, 상기 코로나 19 바이러스, 특히 오미크론 변이체에 의한 코로나 19 바이러스 감염증에 대한 예방 백신용 조성물로서 효과가 유효함을 입증한다.
보다 자세하게는 상기의 예방 백신용 조성물로서 효과가 유효함을 입증하기 위하여 오미크론 변이 바이러스 분리는 오미크론 감염이 확인된 사례의 호흡기 검체를 바이러스 감수성 세포에 접종한 후 배양하였고 바이러스 배양 여부는 감염된 세포의 형태 변화 등을 확인하는 세포성 분석을 통하여 세포병변효과와 세포 배양액을 이용한 유전자 검출검사 및 유전자 염기서열 분석을 통해 오미크론 분리를 확인한 후, 분리된 오미크론 변이 바이러스는 진단 및 치료제, 백신 개발 등 폭넓게 활용될 수 있도록 실시예를 통한 입증을 위해 캐나다의 Intergrated DNA Technology에 의하여 분양과 검증을 받아 활용하였다.
그리고 첨부한 도 1로 표시되는 융합 단백질을 구성은 Fc 단편은 인간(human) IgG(immunoglobulin G)에서 유래한 것으로서 그 아미노산 서열을 서열번호 4로 나타냈다.
상술한 서열번호 1, 2, 3, 및 4에 하기 표에 나타낸 바와 같다.
또한, 본 발명에서는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 코로나 19 바이러스(SARS-CoV-2)에 대한 항원 단백질을 유효성분으로 포함하는 코로나 19 바이러스(SARS-CoV-2) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 특징으로 한다.
본 발명에서 코로나 19 바이러스(SARS-CoV-2) 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 코로나 19 바이러스에 대한 감염 수용체인 ACE2(angiotensin-coverting enzyme 2)와 결합하여 세포내 유입 및 내재화를 통한 감염을 억제하고 방해하는 작용을 통하여 감염을 차단하는 효과로서 코로나 19 바이러스를 중화시켜 최종적으로 코로나 19 바이러스 (SARS-CoV-2) 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서 제공할 수 있다.
본 발명에서는 상기 코로나 19 바이러스(SARS-CoV-2) 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 항원 단백질은 인간 IgG(immunoglobulin G)의 Fc 단편인 (RBD-Fc)에 결합된 코로나 19 바이러스(SARS-CoV) 단백질의 RBD를 함유한 융합단백질로서 코로나 19 바이러스(SARS-CoV)의 감염을 유발하는 항원에 대하여 강력한 중화 작용을 통하여 코로나 19 바이러스(SARS-CoV-2)를 예방하고 차단하는 코로나 19 바이러스(SARS-CoV-2) 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용된다.
본 발명에서는 코로나 19 바이러스 감염을 유발하는 항원에 대하여 강력한 중화작용을 입증하기 위하여 SARS-CoV-2 에 대한 단백질 항체 시료 1종의 in-vitro 바이러스 중화능 평가를 수행하고자 하였으며 이에 대하여 세포 병변 효과 (cytopathic effect; CPE) 기반 어세이를 통해 SARS-CoV-2 에 대한 단백질 항체시료의 바이러스 중화능력을 검증하여 코로나 19 바이러스(SARS-CoV-2) 예방 또는 치료용 약학적 조성물임을 입증하였다.
결과적으로, SARS-CoV-2에 대한 특이적 단백질 항체 시료 항체 시료의 바이러스 SARS-CoV-2 세포 감염모델에서 SARS-CoV-2 에 대한 아이프라임 테라퓨틱스 단백질 항체시료의 바이러스 중화능력을 검증하였으며 실시예 1에서 자세히 분석 내용과 결과를 나타내었다.
또한, 본 발명에서는 상기 RBD 항체단백질을 효과적이고 안전하게 생산하기 위하여 SARS-CoV-2의 단백질에 대한 중화 결정자로서 RBD-Fc를 마우스의 복강에 예방접종 위한 면역원으로서 사용하고 RBD 항체단백질을 생산하여 이에 대한 RBD 항체단백질의 중화 활성 결과를 통하여 코로나 19 바이러스(SARS-CoV-2)의 변이체인 오미크론에 대한 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 입증하였다.
본 발명에서 서열번호 2로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 코로나 19 바이러스(SARS-CoV-2)에 대한 항원 단백질은 코로나 19 바이러스(SARS-CoV-2)가 이의 수용체인 ACE2(Angiotensin-converting enzyme 2)와 결합하여 세포 내로 유입되는 것을 차단함을 통해 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19)을 예방 또는 치료할 수 있는 것을 특징으로 하는, 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 특징으로 한다.
보다 자세하게는 본 발명의 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 RBD 항체단백질이 코로나 19 바이러스의 수용체인 ACE2와 결합하여 세포 내로 유입되는 것을 차단하고 바이러스를 중화시키는 중화 활성 작용에 의하여 코로나 19 바이러스 변이인 오미크론의 감염에 대한 예방 또는 치료용 조성물로서 작용한다.
상기 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 유효한 양으로 투여할 수 있다. 상기 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 활용하기 위하여 인간 IgG Fc에 결합된 코로나 19 바이러스 항원 단백질의 RBD를 함유한 융합단백질로서 마우스에서 매우 강력한 중화작용을 확인하여 이를 입증하였다.
결과적으로, 코로나 19 바이러스 항원 단백질에 대한 중화 결정자를 식별하는 RBD-Fc를 마우스에 접종하여 면역원으로 이용하여 매우 강력한 중화 활성에 대하여 입증하였다.
이는, 본 발명에서의 코로나 19 바이러스 항원 단백질의 RBD가 인간 IgG Fc에 결합된 RBD-Fc의 융합 항원 단백질은 코로나 19 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서 중요한 역할을 제시함을 입증하는 것이다.
이에 대해서는 후술하는 실시예에 의해 상세하게 설명하기로 하지만, 본 발명의 범위가 이들 예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 대장균에서 융합 단백질의 생산
융합 단백질을 구성하는 RBD 단백질의 제조는 코로나19 바이러스(SARS-CoV-2)의 변이체인 오미크론(omicron)의 스파이크 DNA를 주형으로 사용하였으며, 대장균에서 융합 단백질의 발현을 유도하기 위하여 발현벡터에 서열번호 1로 표시되는 RBD 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 클로닝하였으며 5kbs pCDNA3.1(＋) 플라스미드 백터는 프라이머를 정방향과 역방향으로 동시에 사용하였으며, 하기 표 5에 나타내었다
또한, 제조된 플라스미드 백터는 도 2로 나타냈으며 자세하게는 프로모터 하류 부분에 클로닝하여 삽입하였으며 삽입물은 동일한 몰비로 혼합하여 최종 전환(transfom)된 형태인 E. Coli DH5α로 확인하여 친화성 수지를 이용하여 정제 후 염기서열 분석을 수행하였다.
정제 결과, 정제한 재조합 단백질을 SDS-PAGE를 통해서 순도 95% 이상의 우수한 RBD 단백질로 확인되었고, 아미노산 서열을 분석한 결과, 융합 단백질에 대한 아미노산 서열을 서열번호 1과 일치하였다.
실시예 2 : 동물세포에서 융합 단백질의 생산
본 발명에서는 융합 단백질을 진핵생물 시스템을 통해 재조합 유전자 분석을 통해 제조 및 결과를 확인하기 위하여 실시예 1의 PCR 분석을 통해 획득한 항원 DNA 증폭 산물을 동물 세포에서 발현하도록 5kbs pCDNA3.1(＋) 플라스미드 백터는 정방향과 역방향의 프라이머를 동시에 추가로 삽입하였다.
또한, 정확하게 유전자 단편의 특징을 파악하기 위하여 5’말단과 3’말단에 25개 추가 염기쌍과 측면 말단에 다중 클로닝 부위의 상류 및 하류 서열이 각각 상보적인 특징을 살려 유전자 단편으로서 2회 이상 확인하여 클로닝하였다.
분리 정제를 위한 C-말단에 Human Fc(hFc)를 부착하여 RBD-Fc 단백질을 생산하고자 하였으며, RBD 단백질을 안정적으로 발현하기 위하여 RBD와 Fc 사이에 글리신과 세린 잔기를 포함시켜 안정화를 높였으며, Fc 벡터에 클로닝한 후 동물세포인 마우스 세포에 형질 전환 시켜 RBD-Fc 단백질을 제조하였다.
실시예
3 :
CHO
cell에서
RBD
-
Fc
항원 단백질의 발현하기 위한 형질 주입(transient transfection)
(1) 세포 배양
RBD-Fc 항원 단백질의 발현 효율에 의한 면역원성을 정확하게 확인하기 위하여 높은 단백질 발현 효율을 가지는 CHO 세포주인 ExpiCHO-S cell를 사용하여 수행하였으며, ExpiCHO expression medium을 배양 및 형질주입 진행에 사용하였다. Erlenmeyer flask에 CHO-S cell 0.5 x 106 cells/mL density로 seeding하여 suspension 형태로 8% CO2, 37℃의 orbital shaker platform 조건의 세포배양기에서 성장시키고, 3~4 x 106 cells/mL density에 도달하였을 때 계대 배양하여 세포 성장을 유지하였다.
(2) RBD-Fc 항원 단백질 형질주입
CHO cell에서 RBD-Fc 항원 단백질을 발현하기 위해 형질주입 하루 전날, 세포 생성을 확인하기 위해 CHO-S cell을 trypan blue 염색 후, CHO-S cell은 대략 17 시간의 간격을 두며, 3.0 x 108 cells/50 mL의 세포(cell density)를 확보하기 위해 3 x 106~4 x 106 cells/mL로 seeding하여 다음날 7 x 106~10 x 106 cells/mL의 cell density에 도달할 수 있도록 하고, 형질주입 당일, trypan blue 염색을 이용하여 세포 수(cell density) 측정 후 hemocytometer에 분주하여 최종 측정하였다.
ExpiFectamine CHO reagent 160 μL와 OptiPRO SFM 1.84 mL을 혼합하여 RBD-Fc 발현 유전자 형질주입 mixture를 만들어 실온에서 5 분간 배양 후 CHO-S cell에 천천히 분주하며 잘 섞어은 후 형질주입을 마친 CHO-S 세포는 8% CO2, 37℃에서 배양하였다. 형질주입 20 시간 후, ExpiCHO Feed 12 ml과 ExpiCHO Enhancer 300 μL를 첨가하여 7일 동안 배양하여 RBD-Fc 항원을 획득한다.
실시예 4 : RBD-Fc 항원 단백질의 마우스 면역원성 확인
RBD-Fc 항원 단백질을 4주령, 암컷인 BALB/c 마우스에 면역원성을 확인하기 위하여 접종하였고, 그룹으로는 PBS 그룹(음성대조군), RBD-Fc 1μg, 4μg, 10μg 의 총 4개의 그룹으로 나누어 각 5마리씩 면역화 진행하였으며, 100㎕/마리의 양으로 2주 간격, 2회 피하 접종을 진행하였다. 최초의 접종일로부터 면역화 2주차와 4주차의 채혈을 통해 항혈청을 수득하였으며, 수득한 마우스 항혈청과 코로나19 바이러스 스파이크 단백질(spike protein)의 항체 반응을 확인하기 위하여, 다음과 같은 결합 반응을 진행하였다. RBD-Fc에 의한 SARS-CoV-2 spike protein(스파이크 단백질) 항체가를 측정하기 위해 상업적을 구입한 Spike protein (Sino 사)을 250ng/100㎕씩 ELISA 측정용 96 well plate에 coating 하여 일반적인 ELISA 측정 방법에 따라 항체가를 측정한 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, RBD-Fc 항원 단백질을 접종한 그룹의 코로나19 바이러스 스파이크 단백질(spike protein) IgG 항체가가 대조군과 유의한 차이를 나타내는 것을 확인하였으며, 1㎍의 항원 농도에서보다 10㎍의 항원농도에서 항체가가 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해서 본 발명의 RBD-Fc 항원 단백질을 통해 코로나 19 바이러스 스파이크 단백질(spike protein)에 대한 마우스 IgG 항체 형성이 효과적인 것을 확인하였다.
실시예
5 :
코로나19
바이러스 변이체인
오미크론의
스파이크 단백질에 대한 중화항체가 평가
대부분의 마우스는 일반적으로 SARS-CoV-2에 감수성이 없어 감염이 일어나지 않으며, Human DPP4를 발현하는 마우스 (hDPP4 knock-in mouse)는 SARS-CoV-2에 감수성을 가져 감염되나 사람의 SARS-CoV-2는 human DPP4 knock-in mouse에서 질병을 일으키지 않는 문제가 있다.
hDPP4 knock-in mouse에서 30회 이상 계대시킨 결과 만들어진 mouse-adapted SARS-CoV-2를 hDPP4 knock-in mouse에 감염을 시키면 사람과 유사한 질병이 발생하는 것을 확인하여 본 연구에서는 백신의 효능을 평가하기 위한 마우스모델로 hDPP4 knock-in mouse와 mouse-adapted SARS-CoV-2를 사용하였다.
백신 접종 4주 후, 심장 채혈을 이용해 혈액을 채취하고 2000 x g에서 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하고 분리된 혈청은 56℃에서 30분 후 중화항체가를 측정하기 위하여 96 well microplate에 Huh7 세포를 준비시킨 후, 혈청을 1:10으로 희석한 뒤, 2배 단계 희석하였다. 바이러스와 혈청 mixture를 Huh7에 접종하고 1시간 동안 배양 후 바이러스와 혈청 mixture를 제거하고 새로운 배지를 넣어준 뒤, 37도에서 18시간 배양하였다. 배지를 제거하고 1X luciferase lysis buffer를 각 well 당 50 μl씩 넣어준 뒤, -80도에 보관하였다. 결과적으로 luciferase substrate를 이용하여 luciferase activity를 측정하여 도 4에서와 같이 높은 중화 항체가 결과를 확인하였다.
실시예 6 : 항원의 독성 및 안전성 평가
항원의 독성 및 안전성 평가를 위해 50㎕의 PBS에 20㎍의 RBD-Fc 항원을 동량의 알부민과 혼합한 후 C57BL/6 마우스의 대퇴 근육에 2주 간격으로 2회 접종 한 후 4주간 체중 변화와 사료섭취량을 측정하였다. 음성 대조군은 동량의 PBS를 같은 방법으로 접종하고 각각의 시험 그룹당 마우스는 10마리로 수행한 결과, PBS 접종군과 RBD-Fc 항원 접종군 사이에 도면 5에서 나타낸 체중 변화와 도면 6에서 나타낸 사료섭취량에서 큰 차이가 없음을 확인하였다.
실시예
7 : SARS-
CoV
-2에 대한 바이러스 중화능력 검증
바이러스 SARS-CoV-2 세포 감염모델에서 감염된 세포의 세포 병변 효과 (cytopathic effect; CPE)를 확인하여 해당 농도에서의 상기 실시예에서 제조한 시료의 바이러스 중화능력을 micro-neutralization assay(MN assay)로 분석하였다.
먼저, SARS-CoV-2 (NCCP43326,βCoV/Korea/KCDC03/2020) 항원 단백질은 국가 병원체 자원은행에서 제공되었으며, 이에 대한 Vero 세포는 ATCC (ATCC-CCL81)로 부터 획득하였으며, SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike neutralizing antibody (cat # 40591- MM43)은 Sino Biological 에서 구입하여 분석에 사용하였다.
96-조직배양 플레이트에 웰당 1.5 x l04 개의 Vero 세포를 접종한 후, 기준 시료 및 본 발명의 시료를 Phosphate buffered saline (PBS) 에 2-fold, 10-point 연속적으로 희석하여 준비하고 24시간 후，BSL-3 시설에서 200 TCID50로 희석한 바이러스를 희석된 시료와 동량으로 섞은 후 37℃에서 30분 동안 반응시킨다. 그 후 100 TCID50 바이러스-항체 혼합물을 Vero 세포에 처리하고, 37℃, 5% CO2 환경에서 96시간 동안 배양하였다.
이후 4% paraformaldehyde (PFA)로 세포를 고정한 뒤，현미경으로 각 농도에 해당하는 well들의 CPE를 확인하여 기록하였으며, 정확한 비교분석을 위하여 모든 항체 시료에 대해 negative control (virus only) 및 positive control (non-infection)을 함께 확인하여 수행하였다.
이때, 각 시료의 농도별 중화능력은 백분율과 IC50가 표기되었고，이에 따라 도출된 중화능력 곡선으로서 백분율 표의 C.D.는 세포사를 의미하며, 해당 4개의 농도를 제외한 나머지 6개의 농도에서의 중화능력 곡선이 도출되었다.
또한, 기준 시료 결과에서는 중화능력 확인의 예시를 위해 4% PFA로 고정한 세포를 0.1% crystal violet으로 염색하였고，노란색 선으로 표기된 well 들이 중화능력이 나타난 것을 의미하며 도면 7의 (a)와 (b)에 나타내었으며, 결과적으로 코로나 19 바이러스 감염을 유발하는 항원에 대하여 SARS-CoV-2 에 대한 본 발명의 시료는 대조군 (reference antibody)에 비하여 강력한 중화작용을 보임을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 코로나 19 (COVID 19) 바이러스의 수용체 결합 도메인(Receptor Binding Domain; RBD)과 인간 Immunoglobulin G-FC 프레그먼트의 융합을 통한 항원 단백질을 이용하여 코로나 19 바이러스 및 그 변이인 오미크론 변이 바이러스까지 대응하는 효과로서 인체 면역력을 향상시켜 코로나 19 바이러스 감염증 질환을 예방하고 치료를 위한 효과를 나타낸다.
Claims (5)
- 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 코로나 19 (COVID 19) 바이러스의 수용체 결합 도메인(Receptor Binding Domain; RBD)과 인간 Immunoglobulin G-FC 프레그먼트의 융합 단백질임을 특징으로 하는 코로나 19 바이러스(SARS-CoV-2)에 대한 항원 단백질.
- 제 1항에 있어서,
상기 융합 단백질은 서열번호 1의 염기서열로 암호화되어 있는 것을 특징으로 하는 항원 단백질.
- 제 1항의 항원 단백질을 유효성분으로 포함하는 코로나 19 바이러스(SARS-CoV-2) 예방 백신용 조성물.
- 제 1항의 항원 단백질을 유효성분으로 포함하는 코로나 19 바이러스(SARS-CoV-2) 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 4항에 있어서,
상기 항원 단백질은 코로나 19 바이러스(SARS-CoV-2)가 이의 수용체인 ACE2(Angiotensin-converting enzyme 2)와 결합하여 세포 내로 유입되는 것을 차단함을 통해 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19)을 예방 또는 치료할 수 있는 것을 특징으로 하는, 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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Citations (1)
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| KR20210123155A (ko) | 2020-04-02 | 2021-10-13 | 조선대학교산학협력단 | 코로나바이러스 감염증１９의 백신, 치료 또는 진단을 위한 s 단백질의 용도 |
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2022
- 2022-08-22 KR KR1020220104696A patent/KR20230139754A/ko unknown
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