CN101423508A

CN101423508A - 荷叶黄酮的制备方法及其药物应用

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Publication number: CN101423508A
Application number: CNA2008101363011A
Authority: CN
Inventors: 许杨; 杨冀艳; 吴酬飞; 陶勇; 胡磊; 黄志兵; 李燕萍; 何庆华
Original assignee: Nanchang University
Current assignee: Nanchang University
Priority date: 2008-11-26
Filing date: 2008-11-26
Publication date: 2009-05-06
Anticipated expiration: 2028-11-26
Also published as: CN101423508B

Abstract

荷叶黄酮的制备方法及其药物应用，反应温度控制在50℃以下，对荷叶黄酮粗提并浓缩，聚酰胺层析柱层析，用水－乙醇梯度洗脱，收集50％～90％乙醇洗脱部分，减压条件下浓缩至干，再用蒸馏水溶解，将本发明制备所得黄酮加入药用载体和/或药学上可接受的辅助剂，作为注射剂、片剂、丸剂、胶囊、糖锭剂、悬浮剂、乳剂、栓剂或者气溶胶，本发明所述的黄酮具有激活葡萄糖激酶活性的作用，可用于防治葡萄糖激酶介导的病症。

Description

荷叶黄酮的制备方法及其药物应用

技术领域

本发明属于植物药用成份的提取和应用领域，特别涉及从荷叶中提取分离黄酮类化合物及其药物利用。

背景技术

葡萄糖激酶(GK)是己糖激酶(HK)家族中的一员(HKIV)，有465个氨基酸，分子量为50KDa，特异性存在于成熟的肝细胞和胰岛细胞中。GK是这两种细胞中葡萄糖代谢的限速酶，在ATP存在下，催化葡萄糖转变成6-磷酸葡萄糖，此反应是葡萄糖代谢的第一步反应，也是糖代谢过程的关键因素。GK的Km值较高，与葡萄糖亲和力低，不受产物6-磷酸葡萄糖的反馈抑制，因而与其它己糖激酶有所不同，能够保证生理范围内波动的血糖被充分磷酸化而进入代谢过程。胰岛β-细胞中的葡萄糖激酶与肝脏中的葡萄糖激酶不全相同。胰岛β-细胞中的葡萄糖激酶受葡萄糖浓度调节，当血糖升高时，该酶活性升高，葡萄糖代谢加速。而肝脏中的葡萄糖激酶受胰岛素的调节，当血糖升高时，血浆胰岛素水平相应升高，葡萄糖激酶活性增强，糖原合成增加。由于胰岛β-细胞分泌胰岛素主要受细胞内葡萄糖代谢的调节，故葡萄糖激酶活性改变所导致的细胞内葡萄糖代谢改变，可间接调节胰岛素分泌，因而该酶也有葡萄糖感受器之称。

近年来，人们发现GK基因突变与某些特殊类型糖尿病的发病有着密切联系。青年发病的成年型糖尿病(MODY)是一种特殊类型的糖尿病(美国糖尿病协会(ADA)糖尿病分型)，主要是由GK基因突变引起的。大约60％的MODY患者中有GK基因突变，现已证实GK基因突变是儿童、青少年发病的MODY中最常见的原因。除此之外，GK基因变异还易于导致妊娠糖尿病，进而造成婴儿糖尿病。并且对于一般的糖尿病患者而言，也普遍存在GK活性下降的现象。

糖尿病是继肿瘤、心血管病之后第三大严重威胁人类健康的慢性疾病。据世界卫生组织预计，到2025年，全球成人糖尿病患者人数将增至3亿。在糖尿病患者中90％以上为II型糖尿病，其患者体内缺乏胰岛素或已有的胰岛素不能正常发挥作用，所以无法及时降解葡萄糖，使血液中葡萄糖含量异常升高，并导致并发症。随着对II型糖尿病的发病机制进一步研究发现，GK活性降低可能参与胰岛素抵抗机制，导致血糖升高，胰岛功能受损和胰岛素抵抗加重。寻找能增加GK活性的药物或措施，以阻止或延缓疾病的发展，有可能为早期预防和治疗II型糖尿病开辟一条新途径。由此引发的以GK作为靶点来开发新的药物将成为研究的热点，其中以该靶点的小分子活化剂研究较为活跃。自2001年罗氏公司筛选出第一个合成的小分子活化RO-28-1675[3-环戊基-2-(4-甲黄酰基-苯基)-N-噻唑-2-基丙酰胺]以来，目前报道的以葡萄糖激酶为靶点的小分子活性化合物有200余个，其中大部分是化学合成的化合物，而从天然植物中提取分离得到的具有GK激活作用的物质报道很少。由于化学合成的激活剂有明显的药用局限性，且可能引起低血糖和肝脂肪蓄积等问题，所以不可避免地存在一些安全问题。而天然产物普遍具有多种生理活性，且毒性低，应用安全，是作为药物研发最具潜力的资源之一。近年来，许多中外学者研究发现黄酮类化合物具有抗氧化、抑制α-葡萄糖苷酶、抗病毒、抗血小板凝集和抑制醛糖还原酶等作用，对糖尿病及其并发症均有一定的防治作用。

荷叶(Nelumbo nucifera)为我国民间常用的中药材，分布于我国大部分地区，主产于湖南、湖北、浙江、江苏、江西等地。荷叶味苦，性平，归肝、脾、胃，具有清暑利湿、升发清阳、清心去热、止血利水、降脂减肥等功效。荷叶中的黄酮类化合物是一类重要的高药理活性的天然多酚类化合物，近年来研究表明，荷叶黄酮类化合物具有降低甘油三酯、降低胆固醇、抗氧化、消除自由基、抑菌、抗病毒和止痉挛等作用。但是还没有关于荷叶黄酮防治糖尿病的报道。

发明内容

本发明目的是提供荷叶黄酮作为制备预防和治疗与葡萄糖激酶活性介导的疾病药物的应用，并且提供了一种荷叶黄酮的制备方法。

本发明所述的黄酮的制备方法具体步骤如下：

1、荷叶黄酮粗提。在反应温度控制在50℃以下的情况下，按常规方法粗提荷叶黄酮并浓缩；

2、层析。将上述浓缩滤液经聚酰胺层析柱层析，用水-乙醇梯度洗脱，收集50％～90％乙醇洗脱部分，温度控制在50℃以下，在减压条件下浓缩至干，然后用蒸馏水溶解，即得具有激活葡萄糖激酶活性的黄酮类化合物。

本发明所述的聚酰胺以60～90目为宜。

本发明所述的荷叶黄酮的粗提，在粗提温度控制在50℃以下的情况下，可以采用浸提法、超声辅助提取法、微波辅助提取法、酶解法、超滤法或超临界萃取法中的任一种。

本发明所述的荷叶黄酮的粗提，可以采用以下工艺：将干燥的荷叶粉碎后，以溶剂/原料的重量比为10～50:1，加入30％～90％的含水乙醇超声提取，温度控制在50℃以下，重复提取1～3次，去渣，滤液在减压条件下浓缩。本工艺所用的提取溶液是30％～95％的含水乙醇，溶剂/原料的重量比以40:1为最佳；也可以是水、甲醇、30％～95％含水甲醇、乙醇、丙酮、30％～95％含水丙酮或乙酸乙酯等。

本发明所述的预防和治疗葡萄糖激酶介导的病症的黄酮的应用为：将得到的黄酮与药用载体和/或药学上可接受的辅剂组合制成用于治疗葡萄糖激酶介导的的病症的药物。该药物组合物可以口服给药，例如注射剂、片剂、丸剂、胶囊、糖锭剂、悬浮剂或者乳剂的形式。给药也可以通过直肠进行，例如使用栓剂；或者胃肠外给药，例如使用可注射溶液的静脉内、肌肉内、皮下或者经皮给药；或者是舌下给药或作为气溶胶如喷雾剂的形式给药。

本发明所述荷叶黄酮的制备方法环境污染小，所述的黄酮具有激活葡萄糖激酶活性的作用，可用于防治葡萄糖激酶介导的病症，为荷叶黄酮的药用提供了一条新途径，可使荷叶资源得到更广泛地利用。

附图说明

附图1为本发明所述制备方法制备的黄酮不同浓度对葡萄糖激酶(GK)的激活率的实验曲线图。

附图2为葡萄糖激酶(GK)的活性测定反应路线。

具体实施方式

本发明将通过以下实施例将进一步说明。

实施例1

取荷叶粉末10g，加入70％乙醇水溶液400mL，超声提取40min，真空抽滤，滤渣重复提取2次，合并滤液，在减压条件下浓缩至干，用25mL的70％乙醇溶解。将该浓缩的粗提物过已处理好的聚酰胺层析柱，采用水-乙醇梯度洗脱，收集50％～90％的乙醇洗脱部分，在减压条件下将其浓缩至干(低于50℃)，然后用蒸馏水溶解，即得具有激活葡萄糖激酶活性的黄酮类化合物。

实施例2

取荷叶粉末5g，加入50％乙醇水溶液200mL，浸提法提取1h，真空抽滤，滤渣重复提取2次，合并滤液，在减压条件下浓缩，用10mL的70％乙醇溶解。将该浓缩的粗提物过已处理好的聚酰胺层析柱，采用水-乙醇梯度洗脱，收集50％～90％的乙醇洗脱部分，在减压条件下浓缩至干(低于50℃)，然后用蒸馏水溶解，即得具有激活葡萄糖激酶活性的黄酮类化合物。

实施例3

取荷叶粉末10g，加入90％乙醇水溶液500mL，超声提取30min，真空抽滤，滤渣重复提取2次，合并滤液，在减压条件下浓缩至干，用20mL的90％乙醇溶解。将该浓缩的粗提物过已处理好的聚酰胺层析柱，采用水-乙醇梯度洗脱，收集50％～70％的乙醇洗脱部分，在减压条件下将其浓缩至干(低于50℃)，然后用蒸馏水溶解，即得具有激活葡萄糖激酶活性的黄酮类化合物。

生物活性实施例：体外葡萄糖激酶活性

葡萄糖激酶(GK)的活性通过在340nm下NADH的光密度增加来测定。GK催化葡萄糖和Mg-ATP生成葡萄糖-6-磷酸和ADP。葡萄糖-6-磷酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的作用下生成NADH。测定反应路线如附图2所示。

GK分析在37℃下，反应的最终培养体积为150μL。培养混合物含有：60mM Tris缓冲液(pH＝7.0)，6.0mM D-葡萄糖，4.0mM ATP，0.9mM β-NADP，2.0mM MgCl₂，100U/L G6PDH和0.26 U/L GK。ATP，β-NADP，G6PDH和葡萄糖购自美国Sigma公司，其它试剂为分析纯。取10μL溶于蒸馏水的受试化合物稀释成不同的浓度，并分别加入到不含GK的不同的培养混合物中，将混合物置于紫外可见分光光度计中，然后加入5μL的GK开始反应。

反应开始后，历经10min的培养期，监测340nm处的光密度(OD)的增加并以此作为GK活性的度量。以含有蒸馏水而不含受试化合物的培养混合物作为空白对照，在空白对照中加入足够的GK，以产生历经10min培养期的OD₃₄₀的增加。预实验已确定GK反应在这段时间内呈线性，甚至在产生GK活性增加10倍的激活剂存在下亦如此。比较空白对照和含受试化合物的GK活性，并计算产生GK活性增加到50％的激活剂的浓度。

实验结果见说明书附图。采用Origin 7.5软件处理数据，使GK活性增加到50％的激活剂的浓度，表示为FA_1.5，即激活GK酶50％所需的激活剂刺激浓度，其半数有效激活浓度FA_1.5为0.0803mg·mL^-1，即FA_1.5为0.002μM。

Claims

1、一种荷叶黄酮的制备方法，其特征是反应温度控制在50℃以下，对荷叶黄酮粗提并浓缩，然后聚酰胺层析柱层析，用水-乙醇梯度洗脱，收集50％～90％乙醇洗脱部分，在减压条件下浓缩至干，之后用蒸馏水溶解。

2、权利要求1所述的黄酮作为制备治疗葡萄糖激酶介导的病症的药物的应用。

3、一种用于治疗葡萄糖激酶介导的病症的药物，其特征是含有权利要求1所述的黄酮以及药学上可接受的辅助剂。

4、根据权利要求3所述的药物，其特征是该药物作为注射剂、片剂、丸剂、胶囊、糖锭剂、悬浮剂、乳剂、栓剂或者气溶胶。