CN101418034A

CN101418034A - 一种麻疯树种子油体蛋白质提取方法

Info

Publication number: CN101418034A
Application number: CNA2007101950020A
Authority: CN
Inventors: 沈世华; 刘玉君; 苟平
Original assignee: YUNNAN SHENYU NEW ENERGY CO Ltd
Current assignee: YUNNAN SHENYU NEW ENERGY CO Ltd
Priority date: 2007-12-10
Filing date: 2007-12-10
Publication date: 2009-04-29
Anticipated expiration: 2027-12-10
Also published as: CN101418034B

Abstract

本发明公开了一种麻疯树种子油体蛋白质提取方法，包括油体的分离和从分离的油体中提取蛋白质步骤，用本发明的方法提取麻疯树种子的贮油细胞器——油体及油体蛋白，有利于了解生物柴油的重要植物储藏库，为运用生物技术手段进一步改良品种，提高种子的油脂含量打下基础。

Description

一种麻疯树种子油体蛋白质提取方法

一、技术领域

本发明涉及一种植物种子油体蛋白质提取方法，更特别的涉及一种麻疯树种子油体蛋白质提取方法。

二、背景技术

随着石化能源的日趋枯竭和生态环境的日渐恶化，可再生且清洁的生物能源的研究开发已成为近年来的热点课题，以植物油为主要原料的生物柴油作为—种可再生的替代能源，以其良好的环境效应已引起广泛关注。植物油主要作为营养贮存物质积累于种子中，因而筛选和种植优质的油料作物作为制备生物柴油的原料，已成为解决能源危机的重要途径。麻疯树(Jatropha curcas L.)是大戟科麻疯树属多年生亚乔木。对麻疯树种子油脂成分，理化性质，十六烷值等研究表明麻疯树种子油是制备生物柴油的理想材料。目前国内内非常重视利用麻疯树种子生产生物柴油产业，云南、四川等地已投巨资建成麻疯树种植基地。

油分是以油体的形式存在于细胞中。油体外部被一层磷脂和蛋白质镶嵌而成的半单位膜，脂肪酸以三酰甘油的形式储存其内。油体膜及膜上附着的蛋白占油体重量的1％～4％，参与油体的结构建成，并在油体的形成、稳定及油脂代谢利用过程中发挥关键作用，对油体发挥其生物功能十分关键。提取麻疯树种子的贮油细胞器-油体及油体蛋白，有利于了解生物柴油的重要植物储藏库，为运用生物技术手段进一步改良品种，提高种子的油脂含量打下基础。

三、发明内容

本发明的目的是提供一种植物种子油体蛋白质提取方法，更特别的是提供一种麻疯树种子油体蛋白质提取方法。

本发明的这些以及其它目的将通过在下面的详细描述来进一步体现和说明。

本发明的麻疯树种子油体蛋白质提取方法，包括油体的分离和从分离的油体中提取蛋白质步骤，其中所述的油体分离步骤为取5克种仁在25-35ml、PH7-8的GM I匀浆液中研磨成匀浆后，8000-12,000转/分钟离心25-35min后取上层油层，油层重悬于25-35ml GM II匀浆液后，再在8000-12,000转/分钟离心25-35min后取上层油层，上层油层重悬于25-35ml GM I溶液后，再在8000-12,000转/分钟离心25-35min后取上层油层，室温重悬于10-20ml GM II溶液中，振荡25-35min，悬浮液再在8000-12,000转/分钟离心25-35min后取上层油层，油体层悬浮于25-35ml GM I匀浆液中，在8000-12,000转/分钟离心25-35min，最终油体层悬浮于2-4ml GM I匀浆液中。

所述的从分离的油体中提取蛋白质步骤为取上述0.5ml分离的油体按1:1加入石油醚，振荡，10,000-15,000转/分钟离心4-6min后，去除上层石油醚相，重复此程序两次以上，用冷干机抽气4-6min，除去残余的石油醚，加入0.5-1.0ml氯仿/甲醇(2:1V/V)，振荡，10,000-15,000转/分钟离心4-6min，富含蛋白的中间层重悬于0.2-0.3ml去离子水中，加入0.5-1.0ml氯仿/甲醇(2:1V/V)，振荡，10,000-15,000离心4-6min，重复此程序两次以上，最终，中间层重悬于0.4-0.6ml水中，超声波处理4-6min，加入3-5倍体积的冷丙酮，于-20℃沉淀16小时以上，在15,000转/分钟离心20min后得到蛋白沉淀、冻干。

可以选择的是，本发明的麻疯树种子油体蛋白质提取方法，包括油体的分离和从分离的油体中提取蛋白质步骤，其中所述的油体分离步骤为取5克种仁在30ml、PH7.5的GM I匀浆液中研磨成匀浆后，10,000转/分钟离心30min后取上层油层，油层重悬于30ml GM II匀浆液后，再在10,000转/分钟离心30min后取上层油层，上层油层重悬于30mlGMI溶液后，再在10,000转/分钟离心30min后取上层油层，室温重悬于15ml GM II溶液中，振荡30min，悬浮液再在10,000转/分钟离心30min后取上层油层，油体层悬浮于30ml GM I匀浆液中，在10,000转/分钟离心30min，最终油体层悬浮于3ml GM I匀浆液中。

所述的从分离的油体中提取蛋白质步骤为取上述0.5ml分离的油体按1:1加入石油醚，振荡，13,000转/分钟离心5min后，去除上层石油醚相，重复此程序两次以上，用冷干机抽气5min，除去残余的石油醚，加入0.75ml氯仿/甲醇(2:1V/V)，振荡，13,000转/分钟离心5min，富含蛋白的中间层重悬于0.25ml去离子水中，加入0.75ml氯仿/甲醇(2:1V/V)，振荡，13,000离心5min，重复此程序两次以上，最终，中间层重悬于0.5ml水中，超声波处理5min，加入4倍体积的冷丙酮，于-20℃沉淀16小时以上，在15,000转/分钟离心20min后得到蛋白沉淀、冻干。

在本发明的麻疯树种子油体蛋白质提取方法中，所述的GM I匀浆液含有1mM EDTA、10mM KCl、1mM MgCl、2mM DTT、0.6mM Sucrose和0.15M Tcicine-KOH，余量为去离子水。所述的GM II匀浆液含有1mMEDTA、10mM KCl、1mM MgCl、2mM DTT、0.6mM Sucrose、0.15M Tcicine-KOH和2M NaCl，余量为去离子水。

本发明采取先完整分离麻疯树油体再获得油体全蛋白质的策略，使油体能稳定、完整、大量富集，提取液离心后油体始终悬浮于上层，便于收集，经盐洗后除掉油体以外附着的蛋白及其它杂质，能得到均匀纯净的油体以及油体蛋白质。同时直接离心代替纱布过滤残渣，冷干机抽干代替氮气瓶吹干等，操作科学简便，稳定重复性好，效率高。

四、附图说明

图1是麻疯树种子油体蛋白双向电泳图谱(PH4-7预制胶条分离)

图2是麻疯树种子油体蛋白双向电泳图谱(PH6-11预制胶条分离)

在本发明中使用的所有原材料等均是常规使用的，可以从市场购得。在本发明中，如非特指，所有的量、百分比均为重量单位。

下面结合实施例对本发明进行具体的描述，由技术常识可知，本发明可以通过其他的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，下列实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或等同本发明的范围内的改变均被本发明包含。

五、具体实施方式

实施例1：按以下步骤进行

1、油体的分离

取5克种仁在30ml含有1mM EDTA、10mM KCl、1mM MgCl、2mM DTT、0.6mM Sucrose、0.15M Tcicine-KOH和余量水，PH7.5匀浆液(简称GMI匀浆液)中研磨成匀浆后，10,000g离心30min后取上层油层。油层重悬于30ml GM II(GM I+2M NaCl)溶液后，如上离心。上层油层重悬于30mlGM I溶液后，10000g离心30min。然后取上层油层，室温重悬于15ml GMII溶液，振荡30min。悬浮液如上离心。油体层悬浮于30ml GM I，10000g离心30min。最终油体层悬浮于3ml GM I。

2、从分离的油体中提取蛋白

0.5ml分离的油体按1:1加入石油醚，振荡，13,000g离心5min后，去除上层石油醚相。重复此程序两次以上。用冷干机抽气5min，除去残余的石油醚。加入0.75ml氯仿/甲醇(2:1V/V)，振荡，13,000g离心5min。富含蛋白的中间层重悬于0.25ml水，加入0.75ml氯仿/甲醇(2:1V/V)，振荡，13000g离心5min。重复此程序两次以上。最终，中间层重悬于0.5ml水，超声波处理5min。加入4倍体积的冷丙酮，于-20℃沉淀16h以上。15000g离心20min，所得蛋白沉淀冻干备用。经聚丙烯酰胺凝胶双向电泳得到蛋白质分离图谱(图1、图2)。

实施例2

取5克种仁在30ml、PH7.6的GM I匀浆液中研磨成匀浆后，11,000转/分钟离心31min后取上层油层，油层重悬于30ml GM II匀浆液后，再在11,000转/分钟离心28min后取上层油层，上层油层重悬于30ml GMI溶液后，再在11,000转/分钟离心28min后取上层油层，室温重悬于15ml GM II溶液中，振荡30min左右，悬浮液再在11,000转/分钟离心30min左右后取上层油层，油体层悬浮于30ml GM I匀浆液中，在11,000转/分钟离心27min，最终油体层悬浮于3ml GM I匀浆液中。

所述的GM I匀浆液含有1mM EDTA、10mM KCl、1mM MgCl、2mM DTT、0.6mM Sucrose和0.15M Tcicine-KOH。所述的GM II匀浆液含有1mMEDTA、10mM KCl、1mM MgCl、2mM DTT、0.6mM Sucrose、0.15M Tcicine-KOH和2M NaCl。

取上述0.5ml分离的油体按1:1加入石油醚，振荡，14,000转/分钟离心4.5min后，去除上层石油醚相，重复此程序两次以上，用冷干机抽气4min，除去残余的石油醚，加入0.8ml氯仿/甲醇(2:1V/V)，振荡，14,000转/分钟离心4.5min，富含蛋白的中间层重悬于0.25ml去离子水中，加入0.80ml氯仿/甲醇(2:1V/V)，振荡，12,000离心6min，重复此程序两次以上，最终，中间层重悬于0.5ml水中，超声波处理5.5min，加入4倍体积的冷丙酮，于-20℃沉淀16小时以上，在15,000转/分钟离心20min后得到蛋白沉淀、冻干。

Claims

1、一种麻疯树种子油体蛋白质提取方法，其特征在于包括油体的分离和从分离的油体中提取蛋白质步骤，其中所述的油体分离步骤为取5克种仁在25-35ml、PH7-8的GMI匀浆液中研磨成匀浆后，8000-12,000转/分钟离心25-35min后取上层油层，油层重悬于25-35ml GM II匀浆液后，再在8000-12,000转/分钟离心25-35min后取上层油层，上层油层重悬于25-35ml GM I溶液后，再在8000-12,000转/分钟离心25-35min后取上层油层，室温重悬于10-20ml GM II溶液中，振荡25-35min，悬浮液再在8000-12,000转/分钟离心25-35min后取上层油层，油体层悬浮于25-35ml GM I匀浆液中，在8000-12,000转/分钟离心25-35min，最终油体层悬浮于2-4ml GM I匀浆液中。

2、根据权利要求1所述的一种麻疯树种子油体蛋白质提取方法，其特征在于包括油体的分离和从分离的油体中提取蛋白质步骤，其中所述的油体分离步骤为取5克种仁在30ml、PH7.5的GM I匀浆液中研磨成匀浆后，10,000转/分钟离心30min后取上层油层，油层重悬于30ml GM II匀浆液后，再在10,000转/分钟离心30min后取上层油层，上层油层重悬于30ml GM I溶液后，再在10,000转/分钟离心30min后取上层油层，室温重悬于15ml GM II溶液中，振荡30min，悬浮液再在10,000转/分钟离心30min后取上层油层，油体层悬浮于30ml GMI匀浆液中，在10,000转/分钟离心30min，最终油体层悬浮于3ml GMI匀浆液中。

3、根据权利要求1或2所述的一种麻疯树种子油体蛋白质提取方法，其特征在于GM I匀浆液含有1mM EDTA、10mM KCl、1mM MgCl、2mM DTT、0.6mM Sucrose和0.15M Tcicine-KOH。

4、根据权利要求1或2所述的一种麻疯树种子油体蛋白质提取方法，其特征在于GM II匀浆液含有1mM EDTA、10mM KCl、1mM MgCl、2mM DTT、0.6mM Sucrose、0.15M Tcicine-KOH和2M NaCl。

5、根据权利要求1或2所述的一种麻疯树种子油体蛋白质提取方法，其特征在于所述的从分离的油体中提取蛋白质步骤为取上述0.5ml分离的油体按1：1加入石油醚，振荡，10,000-15,000转/分钟离心4-6min后，去除上层石油醚相，重复此程序两次以上，用冷干机抽气4-6min，除去残余的石油醚，加入0.5-1.0ml氯仿/甲醇(2：1　V/V)，振荡，10,000-15,000转/分钟离心4-6min，富含蛋白的中间层重悬于0.2-0.3ml去离子水中，加入0.5-1.0ml氯仿/甲醇(2：1　V/V)，振荡，10,000-15,000离心4-6min，重复此程序两次以上，最终，中间层重悬于0.4-0.6ml水中，超声波处理4-6min，加入3-5倍体积的冷丙酮，于-20℃沉淀16小时以上，在15,000转/分钟离心20min后得到蛋白沉淀、冻干。

6、根据权利要求1或2所述的一种麻疯树种子油体蛋白质提取方法，其特征在于所述的从分离的油体中提取蛋白质步骤为取上述0.5ml分离的油体按1∶1加入石油醚，振荡，13,000转/分钟离心5min后，去除上层石油醚相，重复此程序两次以上，用冷干机抽气5min，除去残余的石油醚，加入0.75ml氯仿/甲醇(2：1　V/V)，振荡，13,000转/分钟离心5min，富含蛋白的中间层重悬于0.25ml去离子水中，加入0.75ml氯仿/甲醇(2：1　V/V)，振荡，13,000离心5min，重复此程序两次以上，最终，中间层重悬于0.5ml水中，超声波处理5min，加入4倍体积的冷丙酮，于-20℃沉淀16小时以上，在15,000转/分钟离心20min后得到蛋白沉淀、冻干。