CN102839127B - 一种微藻培养及采收耦合快速积累藻油的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微藻培养及采收耦合快速积累藻油的方法：将新鲜微藻细胞接种在相应的微藻培养液中培养，获得藻液，将藻液调节pH值静置分层，上层清液回收循环用于微藻培养，下层沉淀采用有机溶剂浸提、索氏抽提或酸法提取藻油。本发明方法在微藻生长前期，通过调节培养液中氮、磷浓度，提高微藻生物量；微藻生长后期，通过调节藻液的pH值，形成强碱或强酸环境，胁迫微藻快速积累藻油，同时使微藻絮凝脱水，采收微藻，从而实现培养与采收耦合，简化操作过程，缩短生产时间；培养液的循环利用既节省了培养成本，又避免了培养液排放对环境造成的污染。
Description
（一）技术领域
本发明属于微藻生物能源技术领域，涉及一种产油微藻胁迫培养快速积累大量藻油和微藻采收耦合的方法。
（二）背景技术
随着工业和经济的快速发展，能源短缺和环境污染问题日益严重，寻求可以替代石油的可再生清洁能源成为世界能源工业的发展方向。藻类具有光合作用效率高、生长周期短，环境适应能力强、藻油含量丰富的特点，是富有前景的生产生物能源的原料之一。目前，微藻生物能源的关键问题在于培养成本高、微藻采收困难。培养成本高的原因主要有两个方面，其一是未能找到协调好微藻高生物产量和高藻油含量矛盾的微藻自养培养方法；其二是未能找到协调好培养盐的重复利用和采收成本之间矛盾的微藻采收方法。为了提高微藻的生物量和藻油含量，目前常用的培养方式是异养培养，即在培养过程中加入大量的葡萄糖等有机物质促使微藻的生长和藻油积累。由于加入了大量的有机物，异养培养的成本高。微藻的自养是在自然光照下，利用大气中的CO2及培养液中的N、P等无机盐培养微藻，相对于异养，自养的培养成本较低，但藻的脂质含量也较低。在自养培养微藻产油的过程中，常通过培养液营养成分特别是一些必须营养盐的缺陷，来诱导微藻产生藻油，但是在营养盐缺乏的情况下，大部分微藻不能实现高密度生长，因此，尽管提高了脂质含量，但藻油的产量不高。微藻的采收一般采用离心或絮凝的方法。离心采收的设备投资大和采收能耗高。絮凝采收常采用在藻液中加入絮凝剂促使藻细胞絮凝沉降的方法，由于加入了絮凝剂，微藻采收后的上清液不能循环用于微藻的培养，造成培养盐和水的浪费，增加了培养成本，同时，絮凝后的上清液中富含有絮凝剂、营养盐以及藻细胞，直接排放会污染环境，净化处理又增加了成本。在此背景下，本发明提出了一种通过调节pH值促进微藻大量积累藻油的同时采收微藻的耦合方法：在微藻生长的前期，通过调节培养液中氮、磷的浓度及比例提高微藻的生物质产量；在微藻生长的后期，通过调节培养液的pH值，形成强碱或强酸的环境，胁迫微藻快速积累大量藻油，同时使微藻絮凝脱水，采收微藻。采收微藻后的培养液调节pH后循环用于微藻的培养。
（三）发明内容
本发明目的是提供一种增产、促油培养微藻和采收微藻的方法。
本发明采用的技术方案是：
一种微藻培养及采收耦合快速积累藻油的方法，所述方法为：
（1）将新鲜微藻细胞以体积分数5%的接种量接种在相应的微藻培养液（所述微藻培养液为本领域公知技术，不同的微藻种类对应不同的微藻培养液，海水微藻可以采用基础F/2培养液或调整氮磷比后的改良F/2培养液，淡水微藻可以采用CHU培养液）中，通入空气，在自然光照下，5~40℃培养至对数生长期后，再在同样条件下培养1~33d，获得藻液；
（2）在步骤（1）获得的藻液中加入碱性水溶液调节pH值为10~13，或在步骤（1）获得的藻液中加入酸性水溶液调节pH值为1~5，室温静置1~5d使藻液分层，获得上层清液和下层沉淀，将下层沉淀过滤，取滤饼即获得藻泥，将藻泥采用有机溶剂A浸提、索氏抽提或酸法提取处理，获得所述藻油；所述有机溶剂A为下列之一：乙醇、乙醚、乙酸乙酯或石油醚；
（3）将步骤（2）的上层清液调节pH至7~8，获得调节pH值后的上层清液并检测上层清液组成，将调节pH值后的上层清液各个组成补足至相应微藻培养液组分，获得再生微藻培养液，循环用于微藻培养。
进一步，步骤（1）所述微藻优选为淡水微藻或海洋微藻。
更进一步，步骤（1）所述微藻优选为下列之一：眼拟点微绿球藻、杜氏盐藻、葡萄藻或小球藻，所述眼拟点微绿球藻、杜氏盐藻为海洋微藻，葡萄藻或小球藻为淡水微藻。
进一步，所述一种微藻培养及采收耦合快速积累藻油的方法推荐按如下步骤进行：（1）将新鲜微藻细胞以体积分数5%的接种量接种在相应微藻培养液中，通入空气，在自然光照下，5~40℃（优选20~25℃）培养至对数生长期后，再在同样条件下培养1~15d（优选15d），获得藻液；所述微藻为海洋微藻；所述相应微藻培养液为改良F/2培养液，终浓度组成为：NaNO325~1350mg/L、NaH2PO4·2H2O 5~270mg/L、Na2SiO3·9H2O20mg/L、Na2EDTA 4.36mg/L、FeCl3·6H2O 3.16mg/L、CuSO4·5H2O0.01mg/L、ZnSO4·7H2O 0.023mg/L、CoCl2·6H2O 0.012mg/L、MnCl2·4H2O0.18mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.07mg/L、VB10.1μg/L、VB20.5μg/L、生物素0.5μg/L，溶剂为水，pH值为7~8；（2）在步骤（1）获得的藻液中加入碱性水溶液调节pH值为10~13，或在步骤（1）获得的藻液中加入酸性水溶液调节pH值为1~5，室温静置1~5d（即pH胁迫1~5d，同时使微藻絮凝采收）使藻液分层，获得上层清液和下层沉淀，将下层沉淀过滤，取滤饼即获得藻泥，将藻泥采用有机溶剂B浸提、索氏抽提或酸法提取处理，获得所述藻油；所述有机溶剂B为下列之一：乙醇、乙醚、乙酸乙酯或石油醚；（3）将步骤（2）的上层清液调节pH至7~8（上层清液的pH在10~13时，用磷酸调节pH至7~8；上层清液的pH在3~5时，用氢氧化钾或氢氧化钠水溶液调节pH至7~8），获得调节pH值后的上层清液，在调节pH值后的上层清液中加入硝酸钠（NaNO3）和磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O），使NaNO3的终浓度为25~1350mg/L，NaH2PO4·2H2O的终浓度为5~270mg/L，获得再生后的改良F/2培养液，循环用于微藻培养。
进一步，步骤（1）所述微藻更优选为眼拟点微绿球藻。
进一步，步骤（1）所述培养温度优选为25~30℃。
进一步，步骤（1）所述改良F/2培养液中NaNO3的终浓度优选为225~1350mg/L，相应氮磷质量比为4:1，最优选NaNO3的终浓度225mg/L，NaH2PO4·2H2O的终浓度优选为45mg/L，相应氮磷质量比为4:1。
进一步，步骤（2）所述碱性水溶液优选为氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液，更优选质量浓度5~10%的氢氧化钠水溶液或质量浓度5~10%的氢氧化钾水溶液，所述酸性水溶液优选为硫酸水溶液或盐酸水溶液，更优选体积浓度5~10%的硫酸水溶液或体积浓度10~15%的盐酸水溶液。
进一步，优选步骤（2）所述在步骤（1）获得的藻液中加入碱性水溶液调节pH值为11，室温静置3d（pH胁迫3d）使藻液分层，获得上层清液和下层沉淀。
进一步，所述微藻培养及采收耦合快速积累藻油的方法中所述微藻藻油的提取方法为本领域公知方法，通常步骤（2）藻泥按下列方法之一进行处理提取藻油：
①有机溶剂浸提：将步骤（2）获得的藻泥在70℃下干燥12小时，获得干藻粉a，在干藻粉a中以质量比2:1加入石英砂a，碾磨30min，再加入有机溶剂C，在室温下浸提12小时，过滤，获得滤液和滤饼，将滤饼用相同有机溶剂C在同样条件下浸提3次，合并所有滤液，将滤液减压浓缩脱除溶剂，得到藻油；所述有机溶剂C为下列之一：乙醇、乙醚、乙酸乙酯或石油醚；所述有机溶剂C的体积用量以干藻粉a质量计为5ml/g；②索氏抽提：将步骤（2）获得的藻泥在70℃下干燥12小时，获得干藻粉b，在干藻粉b中以质量比2:1加入石英砂b，碾磨30min，加入有机溶剂D，在索氏抽提器中（在有机溶剂D的沸点下）抽提10小时，将抽提液减压浓缩脱除溶剂，即得藻油；所述有机溶剂D为下列之一：乙醇、乙醚、乙酸乙酯或石油醚；所述有机溶剂D的体积用量以干藻粉b质量计为5ml/g；③酸性溶液提取：将步骤（2）获得的藻泥在70℃下干燥12小时，获得干藻粉c，在干藻粉c中加入蒸馏水和浓盐酸（质量浓度36~38%），在70℃水浴中放置20min，再加入无水乙醇，冷却，加入乙醚a，振荡1min，4000rpm离心2min，获得上层乙醚相和下层沉淀，在下层沉淀中加入乙醚b，振荡1min，4000rpm离心2min，合并所有上层乙醚相，减压浓缩脱除溶剂，获得藻油；所述蒸馏水、浓盐酸、无水乙醇、乙醚a和乙醚b的体积用量均以干藻粉c质量计分别为4ml/g、5ml/g、5ml/g、10ml/g和5ml/g。
本发明获得的藻油以中性脂为主，甘油三酯的含量约90%。组成甘油三酯的脂肪酸主要是棕榈酸C16:0，约30~35%，十六碳烯酸C16:1，约25~30%，油酸C18:1，约10~15%，二十碳五烯酸（EPA）C20:5，约15~28%。
本发明所述生物量是指每升培养液中获得的干藻粉质量，通过生物量及生长曲线可以判断微藻生长状况，还可以通过微藻培养前及培养后藻液中细胞个数来判断生长情况。
本发明所述微藻采收率根据公式（1）计算：
公式（1）中OD650nm原藻液是指新鲜微藻细胞接种在改良F/2培养液中，通入空气，在自然光照下，5~40℃培养至对数生长期后，再在同样条件下培养1~15d，获得的藻液（即为原藻液）在650nm处的吸光度，OD650nm， pH絮凝后上清液是指将原藻液调整pH值静置分层后上层清液在650nm处的吸光度。所述采收率还可以通过微藻pH絮凝采收前及絮凝采收后藻液中细胞个数来判断，计算方法为：原藻液中细胞密度减去pH胁迫后上层清液中细胞密度后除以原藻液中细胞密度的百分比。
微藻的含油率是指1g干藻粉中含有的藻油质量(g)，本发明所述微藻的含油率根据公式（2）计算：
本发明所述有机溶剂A~有机溶剂D均为有机溶剂，为便于区分不同步骤所用有机溶剂不同而命名；所述干藻粉a、干藻粉b和干藻粉c均为干藻粉，为便于区分不同步骤所得的干藻粉量不同而命名；所述乙醚a和乙醚b均为乙醚，为便于区分不同步骤加入乙醚量不同而命名，所述石英砂a和石英砂b均为石英砂，为便于区分不同步骤所用石英砂不同而命名，字母本身均无含义。
与现有技术相比，本发明具有以下优势：
1）在微藻生长前期，通过调节培养液中氮、磷终浓度，提高微藻生物量，以眼拟点微绿球藻为例，与基础F/2培养液比较，培养液中NaNO3终浓度调整到0.225g/L，N/P质量比调整到4:1（对应NaH2PO4·2H2O的终浓度为45mg/L），眼拟点微绿球藻的生物量从0.42g/L增加到2.53g/L，生物量提高了6倍；
2）微藻生长后期，通过调节藻液的pH值，胁迫微藻快速积累藻油，以眼拟点微绿球藻为例，与正常培养相比，藻液的pH调节至11胁迫三天，微藻的藻油含量从6.89%提高到48.2%；藻液的pH调节至3胁迫三天，微藻的藻油含量从6.89%提高到35.0%；
3）微藻生长至对数期，通过调节藻液的pH值，在胁迫微藻快速积累藻油的同时，藻细胞发生絮凝沉降，藻细胞与培养液分离，从而实现培养与采收耦合，简化操作过程，缩短生产时间；
4）调节pH絮凝采收微藻后的上层清液，根据上层清液的酸碱性，用磷酸或氢氧化钠调节pH值至7.0~8.0，补加相应培养液组分，可以循环用于微藻的培养，培养液的循环利用既节省了培养成本，又避免了培养液排放对环境造成的污染。
（四）附图说明
图1本发明的工艺流程图；
图2微藻在新鲜改良F/2培养液及再生的改良F/2培养液中的生长曲线；
图3不同NaNO3浓度对微藻生长曲线的影响，图中不同的标记表示曲线表是不同浓度氮（NaNO3）下培养情况：实心三角形
表示NaNO3浓度为25mg/L，实心正方形
表示NaNO3浓度为75mg/L，空心三角形
表示NaNO3浓度为225mg/L，空心正方形
表示NaNO3浓度为450mg/L，空心菱形
表示NaNO3浓度为900mg/L，空心圆形
表示NaNO3浓度为1350mg/L，实心圆形为对照组的基础F/2培养液，表示NaNO3浓度为75mg/L。
图4改良F/2培养液中不同氮磷质量比对微藻生长曲线的影响，图中的N:P的含义是改良F/2培养液中氮磷质量比，实心三角形
表示氮磷质量比为1:1，实心正方形
表示氮磷质量比为4:1，实心无边形表示氮磷质量比为16:1，实心凌形
表示氮磷质量比为32:1，空心正方形表示对照组中基础F/2培养液中氮磷质量比12:1。
图5不同pH值及胁迫时间对微藻含油率的影响。
图6实施例4所获得藻油GC-MS分析结果图。
（五）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
基础F/2培养液终浓度组成为：NaNO375mg/L、NaH2PO4·2H2O5mg/L、Na2SiO3·9H2O 20mg/L、Na2EDTA 4.36mg/L、FeCl3·6H2O 3.16mg/L、CuSO4·5H2O 0.01mg/L、ZnSO4·7H2O 0.023mg/L、CoCl2·6H2O 0.012mg/L、MnCl2·4H2O 0.18mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.07mg/L、VB10.1μg/L、VB20.5μg/L、生物素0.5μg/L，溶剂为水，pH值为7~8。
所述改良F/2培养液终浓度组成为：NaNO325~1350mg/L、NaH2PO4·2H2O 5~270mg/L、Na2SiO3·9H2O 20mg/L、Na2EDTA 4.36mg/L、FeCl3·6H2O 3.16mg/L、CuSO4·5H2O 0.01mg/L、ZnSO4·7H2O 0.023mg/L、CoCl2·6H2O 0.012mg/L、MnCl2·4H2O 0.18mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.07mg/L、VB10.1μg/L、VB20.5μg/L、生物素0.5μg/L，溶剂为水，pH值为7~8。
实施例1改良F/2培养液中氮的浓度及氮磷比的优化
在基础F/2培养液中添加NaNO3和调整氮磷质量比来获得改良F/2培养液，将实验分成11个组：
组1为对照组，培养液为基础F/2培养液，即NaNO3终浓度为75mg/L，NaH2PO4·2H2O终浓度为5mg/L，对应的氮磷质量比为12:1；
组2~组11为实验组，其中组2~组7培养液为改良F/2培养液，NaNO3终浓度分别为25、75、225、450、900、1350mg/L、对应的NaH2PO4·2H2O终浓度分别为5、15、45、90、180、270mg/L，以保证氮磷质量比为4:1。组8~组11培养液为改良F/2培养液，NaNO3终浓度均为225mg/L，NaH2PO4·2H2O终浓度分别为180、45、11.25、5.63mg/L，对应的氮磷质量比分别为1:1、4:1、16:1、32:1。
将上述各组培养液中分别以体积分数5%的接种量接种新鲜的眼拟点微绿球藻细胞（购自海洋生物种质库），在室温（25~30℃）、自然光照、连续充空气培养至对数生长期后，再在同样条件下培养15天，获得藻液1~藻液11。培养过程中，每隔24小时取200μl藻液，用0.1μl鲁戈氏液（所述鲁戈氏液通常的制法为：称取6gKI溶于10~20ml水中，完全溶解后加入4gKI充分摇匀，完全溶解后，加水定容至100ml，摇匀即可）染色固定后，在显微镜下计数，得到藻液中藻细胞密度，获得眼拟点微绿球藻的生长曲线，组2~组7见图3所示，组8~组11见图4所示；
将上述获得的藻液1~藻液11分别调节pH值为11，室温静置3d使藻液分层，分别获得上层清液1~11和下层沉淀1~11，将下层沉淀分别过滤，取滤饼即获得藻泥1~11。
将上述藻泥1~11在70℃下干燥12小时，获得干藻粉1~11，根据微藻培养的生物量来判断微藻生长状况，所述微藻培养的生物量是指每升培养液中获得的干藻粉质量。组1~组11不同氮浓度和氮磷比下微藻的生物量见表1所示。
图3、图4及表1结果显示，改良F/2培养液中较适宜的氮（NaNO3）终浓度为225g~1350mg/L，较适宜的氮磷质量比为4:1，在此氮和磷的浓度范围内，微绿球藻的生物量约是对照组（基础F/2培养液，75mg/LNaNO3，5mg/L NaH2PO4·2H2O，氮磷质量比为12:1）的6倍。
表1NaNO3浓度和氮磷比对微藻生物量的影响
实施例2微绿球藻pH胁迫产油与pH絮凝采收耦合过程条件优化
调节基础F/2培养液中NaNO3的终浓度为225mg/L，氮磷质量比为4:1（对应的NaH2PO4·2H2O终浓度为45mg/L），得到改良F/2培养液。
（1）将新鲜的眼拟点微绿球藻细胞以体积分数5%的接种量接种至上述改良F/2培养液中，培养温度25~30℃，自然光照，连续充空气培养3天至对数期后，再在同样的条件下培养15天，获得藻液。取1000mL藻液，将藻液调节pH至11，室温（25~30℃）静置3d使藻液分层，获得上层清液和下层沉淀，将下层沉淀过滤后取滤饼（即藻泥）在70℃下干燥12h，制成干藻粉，每升培养液获得2.53g干藻粉。
（2）取17份步骤（1）方法获得的藻液，并从中各取1.5mL藻液用分光光度计测定OD650nm。将17份藻液分成4组，对照组（1份藻液），组1（7份藻液），组2（7份藻液），组3（2份藻液），将各组按下述方式进行实验：
a、对照组：将藻液直接通过离心（转速3000rpm）得到藻泥（即离心获得的沉淀）；将藻泥在70℃下干燥12h得到干藻粉；取1g干藻粉加入4ml蒸馏水和5ml浓盐酸（质量浓度36~38%），在70℃水浴中放置20min，加入5ml无水乙醇，冷却，加入10ml乙醚，振荡1min，4000rpm离心2min，获得上层乙醚相和下层沉淀，取下层沉淀加入5ml乙醚，振荡1min，4000rpm离心2min，合并所有上层乙醚相，减压浓缩脱除溶剂，即获得藻油，根据公式（2）计算微藻的含油率，结果见图5所示。
b、组1（pH胁迫一天产油）：7份藻液分别用1mol/L盐酸水溶液调节pH值至1、3、5，用1mol/L氢氧化钠水溶液调节pH值至10、11、12、13。将7份调节pH值后的藻液在室温（25~30℃）下静置1天使微藻分层，获得上层清液和下层沉淀。分别倾倒去上层清液，将下层沉淀分别过滤，分别取滤饼即获得7份藻泥。将上述7份上层清液各取1.5mL用分光光度计测定OD650nm，记为pH絮凝后的OD650nm，根据公式（1）计算微藻采收率，结果见表2所示；7份藻泥在70℃下干燥12小时，得到7份干藻粉。7份干藻粉各取1g加入4ml蒸馏水和5ml浓盐酸（质量浓度36~38%），在70℃水浴中放置20min，加入5ml无水乙醇，冷却，加入10ml乙醚，振荡1min，4000rpm离心2min，获得上层乙醚相和下层沉淀，将下层沉淀中加入5ml乙醚，振荡1min，4000rpm离心2min，合并所有上层乙醚相，减压浓缩脱除溶剂，即获得藻油并称重，根据公式（2）计算微藻的含油率，结果见图5所示。
c、组2（pH胁迫三天产油）：7份藻液分别用1mol/L盐酸调节pH值至1、3、5，用1mol/L氢氧化钠水溶液调节pH值至10、11、12、13。将7份调节pH值后的藻液在室温（25~30℃）静置3天，其它操作同组1，根据公式（2）计算微藻的含油率，结果见图5所示。
d、组3（pH胁迫五天产油）：将一份藻液用体积浓度为5%的盐酸水溶液调节pH值至5，将另一份藻液用质量浓度为5%的氢氧化钠水溶液调节pH值至11。将2份调节pH值后的藻液在室温（25~30℃）静置5天，其它操作同组1，根据公式（2）计算微藻的含油率，结果见图5所示。
根据公式（1）计算微藻采收率：
公式（1）中OD650nm原藻液是指新鲜微藻细胞接种在改良F/2培养液中，经步骤（1）培养后获得的藻液（即为原藻液）在650nm处的吸光度，OD650nm，pH絮凝后上清液是指将原藻液调整pH值静置分层后上层清液在650nm处的吸光度。
根据公式（2）计算微藻的含油率：
公式（2）
不同pH胁迫条件下微藻的含油率见图5，不同pH值胁迫条件下微藻的采收率见表2所示。结果表明相对于对照组（即未通过pH胁迫），藻液的pH调节至1~5，或10~13，微藻的藻油含量有明显提高；微藻藻油含量的提高幅度与胁迫时的pH值以及胁迫时间有很大关系，pH=11，胁迫时间为3天，藻油含量提高幅度最大，微藻的藻油含量从未胁迫时的6.89%提高到48.2%。另外，藻液的pH调节至1或10~13，藻细胞发生絮凝沉降；微藻的采收率与pH有很大关系，在pH=11时，微藻的采收率可达99%。培养结束后的藻液，调节pH至10-13或1-5，胁迫1至5天，优选地，pH调节至11，胁迫三天，使微藻快速积累油脂，同时絮凝沉降，使pH胁迫产油与pH絮凝采收微藻耦合进行。
表2pH对微藻采收率的影响
实施例3pH絮凝采收微藻后的上层清液循环用于微藻的培养
调节基础F/2培养液中NaNO3的终浓度为225mg/L，氮磷质量比为4:1（对应的NaH2PO4·2H2O终浓度为45mg/L），得到改良F/2培养液。
（1）将新鲜的眼拟点微绿球藻细胞以体积分数5%的接种量接种至上述改良F/2培养液中，培养温度25~30℃，自然光照，连续充空气培养3天至对数期后，再在同样的条件下培养15天，获得藻液。将藻液调节pH至11，室温（25~30℃）静置3d使藻液分层，获得上层清液和下层沉淀，倾去上层清液后将下层沉淀过滤，获得藻泥（即滤饼），将上层清液回收利用。
（2）取两份相同体积的改良F/2培养液，一份（对照组）为新鲜的改良F/2培养液，另一份（实验组）为上述步骤（1）中pH=11絮凝采收微藻后的上层清液，将上层清液用磷酸调节pH至7.5~8，补加NaNO3至培养液中NaNO3的终浓度为225mg/L，补加NaH2PO4·2H2O至培养液中NaH2PO4·2H2O的终浓度为45mg/L，控制氮磷质量比为4:1，得到再生的改良F/2培养液。
（3）在两份改良F/2培养液（对照组和实验组）中以体积分数5%的接种量分别接种相同量的新鲜的眼拟点微绿球藻，在室温（25~30℃）下培养，自然光照，连续充空气条件下培养3天至对数生长期，再培养15天，获得藻液。培养过程中，每隔2小时取200μl藻液，用0.1μl鲁戈氏液（同实施例1）染色固定后，在显微镜下计数，得到藻液中藻细胞密度，获得眼拟点微绿球藻的生长曲线，见图2所示。将培养15天后的藻液取1.5mL用分光光度计测定OD650nm，再分别用1mol/L氢氧化钠水溶液调节pH值至11，室温静置3天使其分层，获得上层清液和下层沉淀，取1.5mL上层清液用分光光度计测定OD650nm，记为pH絮凝后的OD650nm，根据实施例2中的公式（1）计算微藻采收率，结果见表3。下层沉淀分别过滤后取滤饼在70℃下干燥12小时，得到干藻粉（分别称重，计算生物量，见表3所示），在每克干藻粉中加入4ml蒸馏水和5ml浓盐酸，在70℃水浴中放置20min，再加入5ml无水乙醇，冷却，加入10ml乙醚，振荡1min，4000rpm离心2min，获得上层乙醚相和下层沉淀，在下层沉淀中加入5ml乙醚，振荡1min，4000rpm离心2min，合并所有上层乙醚相，减压浓缩脱除溶剂，获得藻油，根据实施例2中的公式（2）计算微藻含油率，结果见表3所示。
表3眼拟点微绿球藻在新鲜的和再生的改良F/2培养液中培养结果比较
实施例4微藻在优选条件下的培养、采收、提油过程
根据实施例1的结果得到优先条件，在优选条件下眼拟点微绿球藻培养、采收和藻油提取过程如下：
1）培养过程
调节基础F/2培养液中NaNO3的终浓度为225mg/L，NaH2PO4·2H2O的终浓度为45mg/L，氮磷质量比为4:1，得到改良F/2培养液。
将250mL（细胞数为15000个/0.1μL）新鲜的眼拟点微绿球藻细胞接种至5L上述改良F/2培养液中，培养温度25~30℃，自然光照，连续充空气培养3天至对数期后，再在同样的条件下培养15天，得到藻液。取1.5mL藻液，用分光光度计测定OD650nm=2.71。
2）pH胁迫快速积累藻油和pH絮凝采收微绿球藻耦合过程
将1）中获得的藻液，用1mol/L的氢氧化钠水溶液调节至pH=11，静置3天。在静置过程中，藻细胞沉降，与培养液分层分离，从而获得上层清液和下层沉淀。取1.5mL上层清液，用分光光度计测定OD650nm＝0.025，根据实施例2中的公式（1）计算微藻采收率为99.1%。将下层沉淀过滤，取滤饼（即藻泥）在70℃下干燥12小时，得到12.55g干藻粉，微绿球藻在优选条件下培养的生物量为2.51g/L。取1g干藻粉加入4ml蒸馏水和5ml浓盐酸（质量浓度36~38%），在70℃水浴中放置20min，加入5ml无水乙醇，冷却，加入10ml乙醚，振荡1min，4000rpm离心2min，获得上层乙醚相和下层沉淀，在下层沉淀中加入5ml乙醚，振荡1min，4000rpm离心2min，合并所有上层乙醚相，减压浓缩脱除溶剂，即获得0.485g藻油，根据实施例2中的公式（2）计算微绿球藻的含油率为48.5%，所述藻油的GC-MS分析结果见图6所示，通过MS碎片分析，测得组成藻油的脂肪酸主要有豆蔻酸C14:0、棕榈酸C16:0，棕榈油酸C16:1，油酸C18:1，二十碳五烯酸（EPA）C20:5。以十一酸甲酯为内标，根据各色谱峰的面积测得藻油中各脂肪酸的含量为豆蔻酸7.0%，棕榈酸35.1%，棕榈油酸26.6%，油酸15.0%，二十碳五烯酸（EPA）16.3%。
3）pH絮凝采收微藻后的上清液循环用于微藻的培养
取2）得到的上层清液5L，加入磷酸调节pH=8.0；根据碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法（GB11894-89）测定溶液中氮的浓度为0mg/L，根据钼酸铵分光光度法（GB 11893-89）测定溶液中磷的浓度为4.27mg/L；加入1125mg NaNO3和106.5mg NaH2PO4·2H2O，根据GB11894-89测定此时培养液中总氮浓度为37.06mg/L（相当于NaNO3终浓度225mg/L），根据GB11893-89测定此时培养液中总磷浓度为8.94mg/L（相对于NaH2PO4·2H2O终浓度45mg/L），得到再生的改良F/2培养液。在此再生后的改良F/2培养液中接入25mL新鲜的眼拟点微绿球藻，眼拟点微绿球藻的初始密度为750个细胞/0.1μL。将此藻液在室温（25~30℃），自然光照，连续充空气条件下培养3天至对数期后，再在同样的条件下培养15天，得到藻液。取1.5mL藻液，用分光光度计测定OD650nm＝2.67。藻液用1mol/L氢氧化钠水溶液调节pH=11，静置3天使其分层，得到上层清液和沉淀。取1.5mL上层清液用分光光度计测定OD650nm=0.026，根据实施例2中的公式（1）计算微藻采收率为99.0%。将沉淀过滤，取滤饼（即藻泥）在70℃下干燥12小时，得到12.60g干藻粉，微绿球藻在优选条件下培养的生物量为2.52g/L。取1g干藻粉加入4ml蒸馏水和5ml浓盐酸，在70℃水浴中放置20min，加入5ml无水乙醇，冷却，加入10ml乙醚，振荡1min，4000rpm离心2min，获得上层乙醚相和下层沉淀，取下层沉淀加入5ml乙醚，振荡1min，4000rpm离心2min，合并所有上层乙醚相，减压浓缩脱除溶剂，即获得0.487g藻油，根据实施例2中的公式（2）计算微绿球藻的含油率为48.7%。
实施例5：葡萄藻pH胁迫产油与pH絮凝采收耦合培养过程
1）葡萄藻的培养
将250mL新鲜的葡萄藻（淡水藻）细胞（细胞个数为3000个/0.1uL）接种至5L CHU13培养液中，培养温度25~30℃，自然光照，连续充空气培养3天至对数期，5天后至稳定期，至稳定期后，葡萄藻细胞个数不再增加，然而在显微镜下观察其细胞体积逐步增大。培养至稳定期后，再在同样的条件下培养33天，得到藻液。取0.1μL藻液，用显微镜计数法测定藻细胞密度为=4225个/0.1μL。
CHU13培养液配方为：KNO30.371g/L，K2HPO40.08g/L，MgSO4·2H2O0.2g/L，CaCl2·2H2O 0.107g/L，Fe-Cirtrate 0.02g/L，Citric acid 0.1g/L，Stock5为1mL/L，溶剂为水，pH=7.5。
其中Stock5的配方为：MnCl2·4H2O 1.81g/L，H3BO32.86g/L，ZnSO4·7H2O 0.222g/L，Na2MnO4·2H2O 0.391g/L，CuSO4·5H2O 0.079g/L，Co（NO3）2·6H2O 0.04947g/L，溶剂为水。
2）pH胁迫快速积累藻油和pH絮凝采收微绿球藻耦合过程
将1）中获得的藻液，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节至pH=11，静置3天。在静置过程中，藻细胞沉降，与培养液分层分离，从而获得上层清液和下层沉淀，将下层沉淀过滤后取滤饼即为下层藻泥。取0.1μL上层清液，用显微镜计数法测定藻细胞密度为13个/0.1μL，微藻pH絮凝采收，采收率为99.7%。下层藻泥在70℃下干燥12小时，得到11.0g干藻粉，葡萄藻的生物量为2.2g干藻粉/L。取1g干藻粉加入4ml蒸馏水和5ml浓盐酸，在70℃水浴中放置20min，加入5ml无水乙醇，冷却，加入10ml乙醚，振荡1min，4000rpm离心2min，取上层乙醚相，剩余液中加入5ml乙醚，振荡1min，4000rpm离心2min，取上层乙醚相，合并乙醚相，脱除溶剂，即获得0.38g藻油，葡萄藻的含油率为38%。
取2）得到的上层清液5L，加入磷酸调节pH=7.5；在该溶液中加入KNO31.855g，K2HPO40.4g，MgSO4·2H2O 1.0g，CaCl2·2H2O 0.535g，Fe-Cirtrate 0.10g，Citric acid 0.5g，Stock 515mL。得到再生的CHU13培养液。在此再生后的CHU13培养液中接入250mL新鲜的葡萄藻，葡萄藻的初始密度为16个细胞/0.1μL。将此藻液在室温（25~30℃），自然光照，连续充空气条件下培养3天至对数期，5天至稳定期后，再在同样的条件下培养33天，得到藻液。取0.1μL上层清液，用显微镜计数法测定藻细胞密度为4550个/0.1μL。藻液用1mol/L氢氧化钠水溶液调节pH=11，静置3天，得到上层清液和下层藻泥。取0.1μL上层清液，用显微镜计数法测定藻细胞密度为23个/0.1μL，微藻pH絮凝采收，采收率为99.5%。下层藻泥在70℃下干燥12小时，得到11.2g干藻粉，葡萄藻的生物量为2.24g干藻粉/L。取1g干藻粉加入4ml蒸馏水和5ml浓盐酸，在70℃水浴中放置20min，加入5ml无水乙醇，冷却，加入10ml乙醚，振荡1min，4000rpm离心2min，取上层乙醚相，剩余液中加入5ml乙醚，振荡1min，4000rpm离心2min，取上层乙醚相，合并乙醚相，脱除溶剂，即获得0.391g藻油，葡萄藻的含油率为391%。
Claims (4)
1.一种微藻培养及采收耦合快速积累藻油的方法，其特征在于所述方法为：
（1）将新鲜微藻细胞以体积分数5%的接种量接种在相应的微藻培养液中，通入空气，在自然光照下，25～30℃培养至对数生长期后，再在同样条件下培养1～15d，获得藻液；所述微藻为眼拟点微绿球藻；所述相应的微藻培养液为改良F/2培养液，终浓度组成为：NaNO3225～1350mg/L、NaH2PO4·2H2O45～270mg/L、Na2SiO3·9H2O20mg/L、Na2EDTA4.36mg/L、FeCl3·6H2O3.16mg/L、CuSO4·5H2O0.01mg/L、ZnSO4·7H2O0.023mg/L、CoCl2·6H2O0.012mg/L、MnCl2·4H2O0.18mg/L、Na2MoO4·2H2O0.07mg/L、VB10.1μg/L、VB20.5μg/L、生物素0.5μg/L，溶剂为水，pH值为7～8，相应氮磷质量比为4:1；
（2）在步骤（1）获得的藻液中加入碱性水溶液调节pH值为10～13，或在步骤（1）获得的藻液中加入酸性水溶液调节pH值为1，室温静置1～5d使藻液分层，获得上层清液和下层沉淀，将下层沉淀过滤，取滤饼即获得藻泥，将藻泥采用有机溶剂B浸提、索氏抽提或酸法提取处理，获得所述藻油；所述有机溶剂B为下列之一：乙醇、乙醚、乙酸乙酯或石油醚；
（3）将步骤（2）的上层清液调节pH至7～8，获得调节pH值后的上层清液，在调节pH值后的上层清液中加入硝酸钠和磷酸二氢钠，使硝酸钠的终浓度为225～1350mg/L、磷酸二氢钠的终浓度为45～270mg/L，相应氮磷质量比为4:1，获得再生后的改良F/2培养液，循环用于微藻培养。
2.如权利要求1所述微藻培养及采收耦合快速积累藻油的方法，其特征在于步骤（2）所述碱性水溶液为氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液，所述酸性水溶液为硫酸水溶液或盐酸水溶液。
3.如权利要求1所述微藻培养及采收耦合快速积累藻油的方法，其特征在于步骤（2）所述在步骤（1）获得的藻液中加入碱性水溶液调节pH值为11，室温静置3d使藻液分层，获得上层清液和下层沉淀。
4.如权利要求1所述微藻培养及采收耦合快速积累藻油的方法，其特征在于步骤（2）藻泥按下列方法之一进行处理，提取藻油：①有机溶剂B浸提：将步骤（2）获得的藻泥在70℃下干燥12小时，获得干藻粉a，在干藻粉a中以质量比2:1加入石英砂，碾磨30min，再加入有机溶剂B，在室温下浸提12小时，过滤，获得滤液和滤饼，将滤饼用相同有机溶剂B在同样条件下浸提3次，合并所有滤液，将滤液减压浓缩脱除溶剂，得到藻油；所述有机溶剂B为下列之一：乙醇、乙醚、乙酸乙酯或石油醚；所述有机溶剂B的体积用量以干藻粉a质量计为5ml/g；②索氏抽提：将步骤（2）获得的藻泥在70℃下干燥12小时，获得干藻粉b，在干藻粉b中以质量比2:1加入石英砂，碾磨30min，加入有机溶剂D，在索氏抽提器中抽提10小时，将抽提液减压浓缩脱除溶剂，即得藻油；所述有机溶剂D为下列之一：乙醇、乙醚、乙酸乙酯或石油醚；所述有机溶剂D的体积用量以干藻粉b质量计为5ml/g；③酸法提取处理：将步骤（2）获得的藻泥在70℃下干燥12小时，获得干藻粉c，在干藻粉c中加入蒸馏水和浓盐酸，在70℃水浴中放置20min，再加入无水乙醇，冷却，加入乙醚a，振荡1min，4000rpm离心2min，获得上层乙醚相和下层沉淀，在下层沉淀中加入乙醚b，振荡1min，4000rpm离心2min，合并所有上层乙醚相，减压浓缩脱除溶剂，获得藻油；所述蒸馏水、浓盐酸、无水乙醇、乙醚a和乙醚b的体积用量均以干藻粉c质量计分别为4ml/g、5ml/g、5ml/g、10ml/g和5ml/g，所述乙醚a和乙醚b均为乙醚。
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