CN103266063B

CN103266063B - 一种原位絮凝分离微藻的方法及其应用

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Publication number: CN103266063B
Application number: CN201310228929.5A
Authority: CN
Inventors: 张渊明; 朱毅; 刘洁霞; 陶玉君; 张成武; 李爱芬; 李涛
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2013-04-22
Filing date: 2013-06-08
Publication date: 2015-02-11
Anticipated expiration: 2033-06-08
Also published as: CN103266063A

Abstract

本发明属于生物质能源领域，特别涉及一种原位絮凝分离微藻的方法及其应用。该方法包含以下具体步骤：向培养有微藻的培养液中加入酸液，调节pH值至酸性，使微藻絮凝沉降，静置分层后，分离上清液，得到分离后培养液及微藻。分离后微藻培养液通过碱液中和、调节后，循环用于培养微藻。本发明方法具有操作简单、试剂来源广泛、成本廉价、效率高、能耗小、30min沉降分离率达到90%以上的优点。

Description

一种原位絮凝分离微藻的方法及其应用

技术领域

本发明属于生物质能源领域，特别涉及一种原位絮凝分离微藻的方法及其应用。

背景技术

微藻（Microalga）是体积小、结构简单、生长迅速的单细胞藻类，其分布极其广泛。同时也是营养丰富、光合作用强的自养放氧植物，每年固定的CO₂约占全球净光合作用的40%，在能量转化和碳元素循环中起到举足轻重的作用。

微藻是一种经济、高效的生物质能源，其中富含的油脂（20～80%）可作为原料获取生物柴油，相比其他生物能源（如玉米、木薯等植物），微藻具有不与人争地、不与人争粮、生长速率快、生长周期短、含油量高等诸多优势，在生物能源领域中占用重要地位。但目前通过微藻获取生物柴油的生产成本极高（$8.67/L），相对传统的化石能源（2009年3月20日国际原油价格为$0.32/L）在价格上缺乏竞争力。因此，对能源微藻制备生物柴油过程中的各个环节进行成本压缩尤为重要。而分离作为其中一个重要的环节占整个成本的20～30%，这是由于微藻个体微小（3～30μm），细胞表面多带负电荷，容易在培养液中均匀地分散悬浮形成稳定的分散体系。而且在其生长后期，随着油脂含量的不断积累，密度越小越不易沉降，这给分离工作带来很大难度。因此，寻求一种高效率、低成本的分离方法对实现能源微藻制备生物柴油的工业化具有重要的意义。

微藻分离的主要方法有离心法、过滤法、气浮法、重力沉降法以及絮凝法。离心法应用最为普遍，该分离方法对微藻个体大小要求不高，在合适的条件下微藻分离效率可达95%。但是这种方法对转速要求较高，能耗较大，而且藻类培养基中盐浓度相当高，离心机需要精密制造工艺和特殊耐腐蚀处理，投资成本高；且很多微藻细胞无细胞壁，在离心过程中易破裂造成胞内有机物质损失，降低提取率（Aquacultural Research,2000(31):637-659.）。过滤法是较古老的分离微藻方法，但过滤介质极易被堵塞，而且藻质较轻容易飘起，滤饼较难形成，效率低（Desalination,2008(222):74-80.）。气浮法的原理是在微藻的培养液内鼓进大量的微气泡，以形成水、气、微藻细胞的三项混合体，在界面张力、气泡上升浮力和静水压力差等多种力的共同作用下，微藻个体粘附到气泡表面上，浮到水面，进而采用刮板进行采集（Biotechnol.Bioeng.,1966,8(1):135-151.）。但此法的供气设备价格昂贵，能耗大。重力沉降法主要是通过薄层分离器或者是沉降槽来实现微藻的分离。此法虽然经济简单，但是应用有限，在无絮凝剂投加的情况下，效率较低，耗费时间。

絮凝法是通过往培养基中加入絮凝剂，利用藻细胞和絮凝剂之间的各种作用力而达到分离的目的。最初所使用的絮凝剂均为无机絮凝剂，即各种易水解的金属盐和聚合金属盐。它们水解生成带正电荷的产物，通过吸附电中和作用与带负电荷的微藻细胞形成聚集体，再以网捕形式作用于藻细胞，使微藻细胞絮凝沉降（水处理化学,北京:化学工业出版社,2002:29-36.）。但由于无机絮凝剂具有一定毒性，人们转而使用无毒的有机高分子作为絮凝剂，主要有壳聚糖、阳离子淀粉等。这些高分子絮凝剂兼有电中和絮凝和吸附絮凝的双重作用，即高分子链上的阳离子活性基团与带负电荷的微藻细胞相互吸引，中和细胞的表面电荷，使微藻细胞脱稳，同时借助高分子链的吸附粘结和架桥作用使微藻细胞絮凝沉降（Adv.Colloid Interface Sci.,2004(111):117-129.）。但有机高分子絮凝剂难降解，容易产生污染，限制其大规模的应用。为了避免污染，Benemann和Oswald提出采用微生物絮凝剂来分离微藻。微生物絮凝剂主要是微生物的代谢产物，如糖蛋白、黏多糖和蛋白质等。这些物质容易被降解，不易产生污染。其作用机理主要是这些代谢产物通过静电吸引、氢键和范德华力等，同时吸附多个藻细胞，在细胞间产生“架桥”，并以网捕的形式使微藻细胞沉降下来。但微生物絮凝剂的成本高，且培养基的循环使用也受到残留微生物絮凝剂的影响。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种原位絮凝分离微藻的方法，该方法通过调节培养液pH值至酸性，实现微藻原位絮凝、沉淀分离的目的。该方法操作简单易行，效率高、成本低、能耗小、无污染，分离后培养液能循环利用，减少资源浪费，且可应用于工业化大生产。

本发明另一目的在于提供上述一种原位絮凝分离微藻方法在分离微藻中的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：

一种原位絮凝分离微藻的方法，包括以下具体步骤：

向培养有微藻的培养液中加入酸液，调节pH值至酸性，搅拌使微藻絮凝沉降，静置分层后，分离上清液，得到分离后培养液及微藻。

所述微藻指淡水藻。

所述的调节pH值指调节pH值为3.7～4.3。调节pH值至3.7～4.3，是因为微藻表面均带有负电荷，加入的酸液电离出氢离子与其负电荷结合，从而减少微藻表面电荷，打破其在水中的稳定性，使微藻细胞团聚絮凝沉降。且实验证明，微藻的等电点均在pH=4.0左右，即此时微藻表面电荷为0，可得到最优的絮凝效果。

所述培养有微藻的培养液中微藻的含量为1.0～7.0g/L。本方法主要通过絮凝沉降的方法进行分离，当微藻含量低于1.0g/L时，由于细胞间碰撞几率低，不利于团聚絮凝；随着微藻含量的增大，微藻的采收效率越来越好，是由于微藻细胞在单位体积培养液中含量增大，有利于微藻细胞相互碰撞从而絮凝沉降。同时，本发明方法适用的淡水藻在一个培养周期后，进入增殖平台期，此时微藻含量约为7.0g/L，此后含量增长不明显，因此可进行收集工作。

所述的酸液指硝酸溶液、硫酸溶液和盐酸溶液中的至少一种。

所述硝酸溶液的浓度为1～4mol/L。

所述硫酸溶液的浓度为0.5～2mol/L。

所述盐酸溶液的浓度为1～4mol/L。

要限定投加酸的浓度，是因为当酸液浓度太低时，需要投加酸的量太大，导致培养液体积增大，不利于微藻絮凝沉降；而当酸液浓度太高时，加入到培养液后不能及时分散，会使微藻细胞部分溶解。

所述搅拌的转速为250～300rpm。搅拌转速限定为250～300rpm，是因为当搅拌转速太低时，不利于投加的酸的迅速扩散以及酸中的氢离子与微藻细胞表面电荷的迅速结合，滞后了絮凝的发生；当搅拌转速过高时，会破坏已团聚的絮凝体，从而降低絮凝效果。

所述的淡水藻指绿球藻属（Chlorococcum）、苞球藻属（Bracteacoccus）和新绿球藻属（Neochloris）中的至少一种，优选为球型单细胞绿球藻、球型单细胞苞球藻和球型单细胞新绿球藻中的至少一种；更加优选为椭圆绿球藻、雪绿球藻、小苞球藻和富油新绿藻中的至少一种。

分离后培养液通过碱液中和、调节后，循环用于培养微藻。

所述的碱液指氢氧化钠（NaOH）溶液、氢氧化钙（Ca(OH)₂）溶液和氨水中的至少一种。

所述NaOH溶液的浓度为0.5～2mol/L。

所述Ca(OH)₂溶液的浓度为0.2～1mol/L。

所述氨水的浓度为1～2mol/L。

所述的中和指中和pH至6.2～6.7。

所述的调节指添加营养物。

所述营养物的组成及用量为：磷酸氢钾0.04g/L、七水合硫酸镁0.075g/L、二水合氯化钙0.036g/L、碳酸钠0.02g/L、六水合氯化铁0.0315g/L、柠檬酸0.006g/L、硼酸0.00286g/L、氯化锰0.00181g/L、七水合硫酸锌0.00022g/L、钼酸钠0.00039g/L、五水合硫酸铜0.00008g/L、六水合硝酸钴0.00005g/L。

上述原位絮凝分离微藻的方法在分离微藻中的应用。

本发明的机理为：

本发明通过加酸改变培养液的pH来絮凝分离微藻，是由于微藻表面分泌有胞外多糖有机物，这些多糖有机物粘附在微藻的细胞表面而使微藻细胞带负电荷，而这些胞外多糖有机物能与投加的酸电离的氢离子结合（如下公式（1）和公式（2）），并通过对微藻表面电荷的测定，证明随酸投加量的增多，微藻的表面电荷减少，从而打破了微藻在培养液中的稳定性，致使微藻细胞发生团聚而絮凝沉降。且当pH=4.0左右时，微藻细胞表面电荷为0mV，此时对应的分离率达到了90%以上。

^-OOC-cell-NH₂+H⁺HOOC-cell-NH₂ (1)

HOOC-cell-NH₂+H⁺HOOC-cell-NH₃ ⁺ (2)

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

（1）本发明方法具有操作简单，试剂来源广泛，成本低廉，分离效率高，能耗小，30min沉降分离率达到90%以上的优点。

（2）本发明利用酸液分离，如硝酸，分离后用碱液中和，如氢氧化钠，过程中使用的物质为培养液补充了各种有益元素，如氮盐和钠盐，为培养液的循环利用提供了支持。

（3）本方法处理分离后的微藻，细胞几乎没有破坏，有效防止油脂和高附加值物质的流失。

附图说明

图1是实施例1～3中3种微藻絮凝分离前后细胞形态的光学显微镜图。

图2是实施例1～3中3种微藻分离前后及培养液循环培养后的微藻细胞的光学显微图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：椭圆绿球藻的分离

（1）BG-11培养液的配制：NaNO₃（1.5g/L）；K₂HPO₄·3H₂O（40mg/L）；MgSO₄·7H₂O（75mg/L）；CaCl₂·2H₂O（36mg/L）；Na₂CO₃（20mg/L）；FeCl₃·6H₂O（3.15mg/L）；柠檬酸（6mg/L）和1ml的微量元素溶液其中包括：H₃BO₃（2.86mg/L），MnCl₂·4H₂O（1.18mg/L），ZnSO₄·7H₂O（0.22mg/L），Na₂MoO₄·2H₂O（0.39mg/L），CuSO₄·5H₂O（0.08mg/L），Co(NO₃)₂·6H₂O（0.05mg/L），加入至加有1ml浓H₂SO₄（浓度98%（v/v））的1L蒸馏水中，搅拌均匀，即得到BG-11培养液。

（2）在培养器内采用步骤（1）配制的BG-11培养液培养椭圆绿球藻（Chlorococcum ellipsoideum UTEX972，购买于美国德克萨斯大学奥斯汀分校藻种保藏中心）。量取2L BG-11培养液进行培养，微藻植入量调节为OD₇₅₀≈0.6，在温度为25℃下，用平均光强为200μmol·m^-2·s^-1冷白的日光灯照24h，并连续通入含有1%CO₂（v/v）的空气。培养时间16天为一个周期。

当培养液中椭圆绿球藻干重大于1.0g/L，用1mol/L的HNO₃调节培养液pH值为3.7，在转速为300rpm下搅拌1min，静置分层，倒出上清液，即得到椭圆绿球藻。分离率按照以下公式计算：

分离率(%)=(1-A/B)×100%

式中A为絮凝分离后上清液在OD₇₅₀下测得的吸光度，B是絮凝分离前的培养液在OD₇₅₀下测得的吸光度。通过以上公式计算出静置30min后的分离率为92.1%。

（3）往分离后倒出的培养液中加入磷酸氢钾（0.04g/L）、七水合硫酸镁（0.075g/L）、二水合氯化钙（0.036g/L）、碳酸钠（0.02g/L）、六水合氯化铁（0.0315g/L）、柠檬酸（0.006g/L）、硼酸（0.00286g/L）、氯化锰（0.00181g/L）、七水合硫酸锌（0.00022g/L）、钼酸钠（0.00039g/L）、五水合硫酸铜（0.00008g/L）、六水合硝酸钴（0.00005g/L），即可循环用于培养微藻。

实施例2：雪绿球藻的分离

（1）BG-11培养液的配制同实施例1。

（2）在培养器内采用步骤（1）配制的BG-11培养液培养雪绿球藻（Chlorococcum nivale UTEX LB2225，购买于美国德克萨斯大学奥斯汀分校藻种保藏中心）。量取2L BG-11培养液进行培养，微藻植入量、培养条件以及培养时间同实施例1。

当培养液中雪绿球藻干重大于1.0g/L，用1mol/L的HNO₃调节培养液pH值至4.0，在转速为280rpm下搅拌1min，静置分层，倒出上清液，即得到雪绿球藻。分离率的计算方法同实施例1。通过公式计算得出静置30min的分离率为90.5%。

实施例3：小苞球藻的分离

（1）BG-11培养液的配制同实施例1；

（2）在培养器内采用步骤（1）配制的BG-11培养液培养小苞球藻（Bracteacoccus minor UTEX B66，购买于美国德克萨斯大学奥斯汀分校藻种保藏中心）。量取2L BG-11培养液进行培养，微藻植入量、培养条件和培养时间同实施例1。当培养液中小苞球藻干重大于1.0g/L，用1mol/L的HNO₃调节培养液pH值至4.3，在转速为300rpm下搅拌1min，静置分层，倒出上清液，即得到小苞球藻。（分离效率的计算方法同实施例1）通过公式计算得出静置30min分离率为91.1%。

实施例4：富油新绿藻的分离

（1）BG-11培养液的配制同实施例1；

（2）在培养器内采用步骤（1）配制的BG-11培养液培养富油新绿藻（Neochloris oleoabundans UTEX118，购买于美国德克萨斯大学奥斯汀分校藻种保藏中心）。量取2L BG-11培养液进行培养，微藻植入量、培养条件和培养时间同实施例1。

当培养液中富油新绿藻干重大于1.0g/L，用1mol/L的HNO₃调节培养液pH值至4.3，在转速为300rpm下搅拌1min，静置分层，倒出上清液，即得到富油新绿藻。（分离效率的计算方法同实施例1）通过公式计算得出静置30min分离率为90.2%。

实施例5：细胞活性观察

使用伊文思蓝溶液染色法测定实施例1～3中3种微藻絮凝前后的细胞活性（见图1）。具体操作如下：分别取实施例1～3微藻絮凝后1ml微藻液，离心后去除上层清液，然后往离心后的微藻加入100μL1wt%伊文思蓝溶液，并在室温下培养3h。随后用蒸馏水洗涤两遍去除过多以及已释放的染料。接着把洗涤好的微藻用光学显微镜观察并拍照。由于伊文思蓝溶液会扩散进入到已破坏微藻的原生质中，使其染上颜色，所以已受到破坏而溶解的微藻会由绿色变成蓝色，而完好的细胞则仍然保持原有的绿色。

其中，图1中：染色前的微藻细胞a）为雪绿球藻；b）为椭圆绿球藻；染色后的微藻细胞：c）为雪绿球藻；d）为椭圆绿球藻。

由图1可知，与分离前对比，分离后得到的微藻基本没有受到损坏，细胞完整。

对实施例1～2中分离前后及培养液循环培养后的微藻进行光学显微观察（见图2）。

向絮凝分离后的培养液中滴加2mol/L的NaOH调节pH为6.7，添加营养物（所述营养物的组成，重量（g）/体积（L）比为：磷酸氢钾0.04、七水合硫酸镁0.075、二水合氯化钙0.036、碳酸钠0.02、六水合氯化铁0.0315、柠檬酸0.006、硼酸0.00286、氯化锰0.00181、七水合硫酸锌0.00022、钼酸钠0.00039、五水合硫酸铜0.00008、六水合硝酸钴0.00005），并用高压灭菌锅调节温度121℃灭菌20min。取分离后微藻加入到上述的循环使用培养液中，调节培养液的初始OD₇₅₀≈0.6进行培养。培养二天和十六天时分别进行观察。

图2中：a、b为分离前的显微镜图，a）为椭圆绿球藻，b）为雪绿球藻；c、d为分离后的光学显微镜图，c）为椭圆绿球藻，d）为雪绿球藻；e、f为利用分离后调节的培养液对微藻进行再培养第二天的光学显微镜图，e）为椭圆绿球藻，f）为雪绿球藻；g、h为利用分离后调节的培养液对微藻进行再培养第十六天的光学显微镜图，g）为椭圆绿球藻，h）为雪绿球藻。

由图2可知，分离得到的微藻利用调节后的原培养液进行第二次培养，微藻生长状况良好，说明本发明方法分离的培养液可循环培养微藻，资源利用率高。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种原位絮凝分离微藻的方法，其特征在于包括以下具体步骤：向培养有微藻的培养液中加入酸液，调节pH值至酸性，搅拌使微藻絮凝沉降，静置分层后，分离上清液，得到分离后培养液及微藻；

所述调节pH值指调节pH值为3.7～4.3；

所述微藻指淡水藻；所述的淡水藻指绿球藻属（Chlorococcum）、苞球藻属（Bracteacoccus）和新绿球藻属（Neochloris）中的至少一种。

2.根据权利要求1所述一种原位絮凝分离微藻的方法，其特征在于：所述培养有微藻的培养液中微藻的含量为1.0～7.0 g/L。

3.根据权利要求1所述一种原位絮凝分离微藻的方法，其特征在于：所述的酸液指硝酸溶液、硫酸溶液和盐酸溶液中的至少一种。

4.根据权利要求3所述一种原位絮凝分离微藻的方法，其特征在于：所述硝酸溶液的浓度为1～4 mol/L；所述硫酸溶液的浓度为0.5～2 mol/L；所述盐酸溶液的浓度为1～4 mol/L。

5.根据权利要求1所述一种原位絮凝分离微藻的方法，其特征在于：所述搅拌的转速为250～300 rpm。

6.根据权利要求1所述一种原位絮凝分离微藻的方法，其特征在于：所述的分离后培养液通过碱液中和、调节后，循环用于培养微藻。

7.根据权利要求6所述一种原位絮凝分离微藻的方法，其特征在于：所述的碱液指氢氧化钠溶液、氢氧化钙溶液和氨水中的至少一种；所述的中和指中和pH至6.2～6.7；所述的调节指添加营养物。

8.根据权利要求7所述一种原位絮凝分离微藻的方法，其特征在于：所述营养物的组成及用量为：磷酸氢钾 0.04 g/L、七水合硫酸镁 0.075 g/L、二水合氯化钙0.036 g/L、碳酸钠 0.02 g/L、六水合氯化铁 0.0315 g/L、柠檬酸 0.006 g/L、硼酸 0.00286 g/L、氯化锰 0.00181 g/L、七水合硫酸锌 0.00022 g/L、钼酸钠 0.00039 g/L、五水合硫酸铜 0.00008 g/L、六水合硝酸钴 0.00005 g/L。

9.根据权利要求1～8任一项所述的方法在分离微藻中的应用。