CN109097283B - 一种微藻碱性絮凝收获及循环培养的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种微藻碱性絮凝收获及循环培养的方法。本发明利用碳酸氢盐为碳源培养微藻，培养过程中随着微藻生物量生长和碳酸氢盐的消耗，pH上升，形成高碱性环境可诱导微藻自絮凝，实现微藻生物质的收获；在高碱性环境下向培养液中加入低浓度的钙、镁、铁等絮凝离子，可促进此絮凝的发生，实现微藻生物质的高效快速收获，避免了使用代价高昂的高浓度絮凝剂，而且避免了生物质污染的问题。絮凝收获后，利用富含碳酸盐的高碱性培养基吸收CO₂，再生碳酸氢盐作为碳源并再次用于微藻的培养，实现水和营养盐的再次利用，降低微藻培养的成本。因此，本发明可同时降低微藻培养和收获成本，在微藻大规模培养等领域具有推广应用前景。

Description

一种微藻碱性絮凝收获及循环培养的方法

技术领域

本发明涉及微藻生物技术领域，具体涉及一种利用循环培养微藻及碱性絮凝收获微藻的方法。

背景技术

微藻是一类可光合自养的微生物，含有丰富的蛋白质、多不饱和脂肪酸、色素等营养物质。同时因其具有环境适应能力强、生长速度快、固碳效率高、生物量高等特点，在医药工业、食品工业、动物饲料、生物能源以及环境保护等领域都有着重要的应用。但微藻的大规模培养仍然受到高成本的限制，这其中包括碳源成本、水和营养盐的成本以及微藻采收的成本。

其中，碳源成本是限制微藻大规模培养的主要因素。传统藻类培养系统通过向培养体系中连续鼓入CO₂为藻体提供碳源，虽能够保证高效气液传质效果，但是该技术仍然存在不足：一是CO₂的高运输成本、高耗能、低利用效率使藻类培养成本居高不下。有文献报道可利用烟道气中CO₂，但是由于从烟道气中分离出高浓度的CO₂需要消耗巨大的能量；其次，分离出来的CO₂需要通过管道运输至藻类培养基地，这其中管道成本较高；再者，烟道气中含有大量的有毒物质，包括富含硫和氮的物质，这些有毒物质会严重影响藻体的正常生长；二是CO₂鼓气使得微藻培养反应器放大存在问题，限制其大规模商业化生产。利用碳酸氢盐可以克服这些问题，但是碳酸氢盐本身成本较高，因此，需要进行循环利用。另外，碳酸氢盐消耗产生的高pH不仅抑制了微藻的生长，而且高pH下碳酸盐并不能被微藻所利用，使微藻生长受到碳源的限制。另外，如果微藻培养基不能够重复利用而直接排放，其富含的大量营养物质不仅具有巨大的环境破坏作用，如水体污染等，更是成资源的浪费，降低微藻的收益也会造成。

除此之外，由于微藻细胞的特性，采收比较困难、成本高，微藻采收成本占整个产业链条的20-30％。而传统微藻生物质收获方法主要是离心、过滤、添加无机或有机絮凝剂进行絮凝等，在这些采收方式当中，均有优缺点：离心采收的效率较高且适用性广泛但耗能较大，对藻体有损伤，不适于大规模应用；过滤较为经济，但容易造成膜污染，降低采收效率；絮凝剂采收的效果明显，但向水体中添加絮凝剂一方面会引入外来化合物造成水体污染，影响下游的操作造成再次分离困难。另一方面由于絮凝剂价格昂贵，使用絮凝剂会增加生产成本，在微藻大规模商业化生产中使用受到限制。

综上所述，利用传统微藻培养方法以及生物质收获方法仍存在高耗能、高成本等不足，从而阻碍了微藻大规模生产的商业化进程。因此，需要开发低能耗、生产成本低、操作容易的藻类培养系统及藻类生物质采收方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种实现微藻培养、碱性絮凝收获及培养基循环使用的方法，通过使用碳酸氢盐作为碳源培养微藻，并利用碳酸盐消耗后产生的碱性条件来絮凝收获微藻细胞，建立低成本的收获方法，之后通入二氧化碳使碳酸氢盐再生和降低培养基的pH，并多次重复利用培养基来降低营养盐及水成本，从而实现微藻生产的低成本化。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

在微藻培养系统中利用碳酸氢盐作为碳源来培养微藻，其可以避免传统微藻培养使用CO₂气体所具有的碳源成本较高的问题，微藻培养系统可以是任何一种形式的光生物反应器，包括开放池系统、封闭式反应器、漂浮式光生物反应器等。利用碳酸氢盐作为微藻生长所需碳源，随着微藻的消耗，培养液中的pH会上升，增高的pH一方面可以诱导微藻的自絮凝来收获微藻，另外一方面，在该碱性条件下也可添加一定浓度的絮凝离子，如钙、镁、铁等，促进微藻的絮凝从而收获微藻。由于培养液中的pH升高导致可利用碳源(碳酸氢盐)浓度降低，且较高的pH会降低微藻的生长速度。因此，需要向上述絮凝收获微藻后得到的上清液中鼓入CO₂用于碳酸氢盐的再生和pH的调节，CO₂吸收后的培养基可用于微藻的再培养。这不仅实现了碳酸氢盐的循环利用，同时也实现的水及其他营养盐的重复利用大大降低了微藻的营养盐成本；此外，在循环培养中，微藻的生长所需的其他营养元素如氮、磷等，其浓度随着循环次数的增加逐渐降低很低，并限制了微藻的生长，因此还需要向上清中定期添加其他被微藻消耗的除碳源之外的其他营养元素，然后将其用于微藻的再培养。

其具体可分为以下步骤：

(1)将微藻藻种接种在含有一定浓度的碳酸氢盐培养基中，在微藻培养系统培养微藻。

(2)培养一段时间后，待培养液pH升高一定数值时，此时收获部分或全部的微藻培养液(藻液)，并向培养系统中添加相同体积的初始培养基。

(3)将步骤(2)中取出的微藻培养液转移至沉降池中，利用由微藻培养液自身高碱性环境导致的自絮凝和/或向培养液中加入一定浓度的絮凝离子絮凝微藻细胞；经过一段时间后，分离藻泥和上清液。

(4)将步骤(3)中得到的上清液转移至CO₂吸收系统中并鼓入CO₂，待其pH下降至一定数值时停止CO₂的通气。

(5)由于步骤(4)调节pH后的上清液培养液中除碳源之外其他营养元素也被消耗，因此还需要对照步骤(1)所述的培养基的成分，向补充CO₂后的上清液中添加培养基中除碳酸氢盐之外的成分，避免因其他营养物质限制而导致微藻生长的抑制作用。

(6)利用步骤(5)中得到的培养基，依次重复上述(1)-(5)的方法以实现微藻的循环培养与碱絮凝收获。

根据上文技术方案，步骤(1)中所述微藻藻种为富油新绿藻(Neochlorisoleoabundans)，或其它嗜盐碱微藻，如嗜盐碱小球藻、螺旋藻，特氏杜氏藻等。

根据上文技术方案，步骤(1)中所述碳酸氢盐优选为碳酸氢钠或碳酸氢钾，更优选为碳酸氢钠。

根据上文技术方案，步骤(1)中所述培养基中碳酸氢盐浓度优选为0.01mol/L至饱和浓度之间，优选为0.1-0.3mol/L，更优选为0.3mol/L，进一步优选为碳酸氢钠浓度0.3mol/L。

根据上文技术方案，步骤(1)中所述富油新绿藻的培养基配方如下：

所述富油新绿藻的培养基配方优选为如下：

根据上文技术方案，步骤(1)中所述微藻培养系统可以是任何一种形式的光生物反应器，包括开放池系统、封闭式反应器、漂浮式光生物反应器等。

根据上文技术方案，步骤(2)中所述培养液培养前pH为5.0-11.0，优选为8.0-10.0，更优选为8.0-9.0，培养结束后即培养液pH值上升至8.0-12.0，优选为9.0-12.0，更优选为10.0-12.0，形成高碱性环境，此时收获部分或全部的微藻培养液(藻液)，并向培养系统中添加相同体积的初始培养基。

根据上文技术方案，步骤(2)中所述收获藻液时，取10-90％体积的微藻培养液进行絮凝沉降，则剩余10-90％体积的微藻在微藻培养系统中，当做下一次培养的藻种。

根据上文技术方案，步骤(2)中所述添加的初始培养基配方如步骤(1)中培养基配方所示。

根据上文技术方案，步骤(3)中所述微藻自絮凝pH为8.0-12.0，优选为9.0-12.0，更优选为为10.0-12.0。其中步骤(1)中所述培养液培养结束后pH为9.0-12.0用于微藻自絮凝收获，且不加入任何辅助絮凝离子。

根据上文技术方案，步骤(3)中所述添加絮凝离子选自Ca²⁺、Mg²⁺和Fe³⁺的一种或几种，所述Ca²⁺来自可溶性钙盐，如氯化钙、硝酸钙等；所述Mg²⁺来自可溶性镁盐，如氯化镁、硫酸镁、硝酸镁等；所述Fe³⁺来自可溶性铁盐，如三氯化铁、硝酸铁、硫酸铁等。

根据上文技术方案，步骤(3)中所述絮凝离子浓度分别为Ca²⁺浓度0-40mmol/L、Mg^{2 +}浓度0-40mmol/L、Fe³⁺浓度0-160μmol/L；富油新绿藻的优选Ca²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺浓度分别为：5-20mmol/L、0.15-10mmol/L、100-160μmol/L；更优选Ca²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺浓度分别为：20mmol/L、6mmol/L、160μmol/L。

根据上文技术方案，步骤(3)中所述絮凝沉降收获微藻的时间为10min以上，优选为24h。

根据上文技术方案，步骤(4)中所述上清液吸收CO₂后pH值下降至5.0-11.0，优选为7.0-11.0，更优选为8.0-9.0，进一步优选为8.5。

根据上文技术方案，步骤(5)中所述上清液中添加除了碳酸氢盐之外的其他成分至初始浓度，具体为：所述富油新绿藻的其他成分的种类和添加量分别为：NaNO₃，0.05-5.0g/L；NaCl，0.025g/L；MgSO₄，0.02-0.07g/L；KH₂PO₄，0.05-0.45g/L；CaCl₂，0.01-0.03g/L；FeCl₃·6H₂O，0.005-0.01g/L；A₅微量元素1mL/L。所述富油新绿藻的其他成分的种类和添加量优选为：NaNO₃，0.2-0.7g/L；NaCl，0.025g/L；MgSO₄，0.05g/L；KH₂PO₄，0.322g/L；CaCl₂，0.02g/L；FeCl₃·6H₂O，0.005g/L；A₅微量元素1mL/L。

本发明的有益效果：

1、本发明中微藻以碳酸氢盐作为碳源，同时即利用碳酸氢盐培养微藻产生的高碱性环境用于吸收CO₂使培养液中再生碳酸氢盐，处理后的培养基重新加入到培养系统中继续培养微藻，实现微藻培养液的循环使用，达到重复利用碳源、营养盐和水的目的。这首先降低了碳酸氢盐再生的高成本，避免了CO₂连续鼓入，降低了碳源供应成本；其次，实现了水和营养盐的循环使用，有效利用微藻培养基中未被利用的营养物质，降低微藻培养的生产成本；再者，在微藻培养过程中避免CO₂的连续鼓入，避免了微藻光生物反应器难放大的问题。

2、碱性絮凝收获微藻生物质的方法包括利用微藻培养系统培养微藻所产生的高碱性环境诱导微藻自絮凝或直接向藻液中添加Ca²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺等絮凝离子絮凝微藻，这两种絮凝收获微藻的方法均比目前工业中使用的其它絮凝剂的成本低，并且不会产生任何污染。因此本方法可实现微藻生物质收获的低成本、低能耗、高收率、高质量，从而满足微藻大规模生产的需求。

3、本发明提供的方法工艺简单，无毒无污染，允许使用简单地装置来收集藻液，有利于进一步降低微藻培养成本，对于微藻的大规模培养有重要的应用前景。

附图说明

图1实施例1不同浓度碳酸氢钠对富油新绿藻细胞干重的影响；

图2实施例2不添加任何絮凝剂的碱性自絮凝收获富油新绿藻的沉降效率，其中a)不同藻液浓度下碱性自絮凝沉降效率的效果图，b)不同碳酸氢钠浓度下碱性自絮凝沉降效率的效果图；

图3实施例3添加不同浓度Ca²⁺碱性絮凝收获富油新绿藻的沉降效率(藻液浓度＝0.5g/L；pH＝10.0；沉降时间＝1h)；

图4实施例4半连续循环培养富油新绿藻，其中a)两种碳酸氢钠浓度下(0.1，0.3mol/L)半连续式循环培养富油新绿藻的干重变化图；b)两种碳酸氢钠浓度下(0.1，0.3mol/L)半连续式循环培养富油新绿藻的单位面积产率变化图；

图5实施例5半连续循环培养富油新绿藻：两种碳酸氢钠浓度下(0.1，0.3mol/L)半连续式循环培养富油新绿藻自絮凝沉降效率。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

下述实施中所使用的测干重方法如下(三个重复)：

准确量取藻液40mL，10000rpm离心5分钟收集藻细胞，用0.5mol/L的碳酸氢铵水溶液清洗收集的藻细胞，重复两次。最后收集的藻细胞加入3—5mL上述的碳酸氢铵水溶液中，于105℃下烘干至重量恒定，用精密分析天平称量藻细胞干重，并计算微藻的干重。

下述实施中所使用的回收率测定方法如下：

使用工作体积为50mL的量筒进行絮凝实验，使收获的富油新绿藻藻液从0.5h到24h进行絮凝，通过计算750nm处的初始(C₀)和最终(C_t)的吸光度之间的差值计算效率，回收率计算公式如下：

实施例1：不同浓度碳酸氢钠对富油新绿藻生长的影响

首先探究不同浓度碳酸氢钠对富油新绿藻生长的影响，碳酸氢钠浓度设置为0、0.1、0.3、0.5、0.7mol/L，其他营养盐成分及含量保持一致，具体见配方如表1、表2所示。培养体系为1L锥形瓶，培养体积为400mL，接种密度为0.05g/L，光照强度为141.5μmol/m²·s，温度为25℃，培养时间为5天。

实验结果如图1所示，在含有不同浓度碳酸氢钠的培养基中培养5天后，其生物量浓度分别达到0.083g/L，0.91±0.04，1.64±0.03，1.50±0.05和1.52±0.02g/L，其中0.3mol/L碳酸氢钠实验组生物量明显高于其他组。同时通过计算可得到相应的前4天平均体积生产速率分别为0.213±0.01，0.40±0.01，0.36±0.01和0.29±0.01g/L/d，而比生长速率分别为1.71±0.03，1.70±0.03，1.17±0.04和1.20±0.07d^-1。这表明富油新绿藻可以在碳酸氢盐浓度高达0.7mol/L的条件下存活，其最适碳酸氢钠浓度为0.3mol/L。

表1富油新绿藻培养基

表2 A₅微量元素成分

实施例2：富油新绿藻在碱性条件下的自絮凝

在微藻培养过程中，培养基中的碳酸氢盐被消耗，产生高碱性环境，该碱性环境在不需要加任何絮凝剂的条件下可高效回收微藻生物质，且不会产生任何生物质的污染。因此首先离心收获最适碳酸氢钠浓度(0.3mol/L)培养的富油新绿藻，并用0.5mol/L的NaCl溶液对藻种进行多次洗涤，重新溶解在pH 10.0的初始新鲜培养基中得到细胞浓度为0.5、1.0和2.0g/L重悬藻液，并转移至50mL预先干燥过的量筒中，静置沉降24小时。另外，本实施例还探究了不同浓度碳酸氢钠(0.1、0.3、0.5、0.7mol/L)对自絮凝的影响。

如图2a)所示，在不添加任何絮凝离子的情况下，浓度为0.5、1.0和2.0g/L的藻液在沉降2h后沉降效率均在50％以下；24h后，沉降效率分别达到92.5±0.62％、85.3±0.01％和92.3±0.17％，这表明在不同的藻液浓度下，培养液产生的高碱性环境引起的自絮凝能够有效收获富油新绿藻。

如图2b)所示，在不添加任何絮凝离子的情况下，在沉降开始后的1h内，利用不同碳酸氢钠浓度(0.1、0.3、0.5、0.7mol/L)培养的富油新绿藻的沉降效率不同，其中0.7mol/L的沉降效率最高，达到92.8±3.14％；但是沉降24h后，它们之间且无显著性差异，其自沉降效率分别为96.6±0.67％、97.6±0.39％、96.0±0.31％、97.4±0.21％，这表明在一定的碳酸氢钠浓度范围内，培养液产生的高碱性环境引起的自絮凝也能够有效收获富油新绿藻。

实施例3：富油新绿藻在不同钙离子浓度下碱絮凝

为探讨钙离子浓度对富油新绿藻絮凝沉降的影响，首先离心收获对数生长期的富油新绿藻，并用0.5mol/L的NaCl溶液进行多次洗涤，重新溶解在pH 10.0的初始新鲜培养基中，并设置细胞浓度为0.5g/L。在250mL锥形瓶中加入40mL重悬藻液，然后将锥形瓶置于搅拌器上，以1000rpm转速搅拌藻液，将不同浓度的CaCl₂(5、10、15和20mmol/L)缓慢加入培养基，搅拌10分钟，再以250rpm的转速搅拌20分钟，转移至50mL预先干燥过的量筒中，静置沉降24小时，测定其吸光值A₇₅₀。

结果如图3所示，本发明的絮凝方式能有效地回收富油新绿藻，如当向藻液中加入20mmol/L Ca²⁺时，絮凝效率(沉降效率、回收效率)最高达到97.7±0.29％。总体而言，钙离子浓度较高回收效率较高。该方法简单、易于操作、易放大实现。在大规模培养中，钙离子可以从海水中获得以降低培养成本。故选择最优Ca²⁺浓度为20mmol/L。

实施例4：富油新绿藻的循环培养

一种富油新绿藻循环培养的方法，该方法包括如下步骤：

(1)所述微藻培养系统为基于碳酸氢盐的碳捕获及微藻培养系统(BICCAPS)，培养基配方如表1、表2所示，利用碳酸氢钠为碳源，微藻在该系统中进行培养，所培养微藻为富油新绿藻，培养体系为1L锥形瓶，作为光生物反应器，培养体积为400mL，接种密度为0.085g/L，光照强度为141.5μmol/m²·s，温度为25℃，初始pH值为8.5，培养结束后pH值为11.0；微藻培养至可采收时(pH为11.0)，并补入相同体积的循环处理液(第一次除外，第一次的为新鲜培养基)。

(2)向絮凝沉降后的上清液中补充CO₂调节pH至8.5，由于补充CO₂只是补充了碳源，其他营养盐成分可能被大量消耗且限制微藻微藻生长，因此在第6、8天向CO₂处理后上清液中添加培养基中除碳酸氢钠之外的成分，具体添加量为：NaNO₃，0.5g/L；NaCl，0.025g/L；MgSO₄，0.05g/L；KH₂PO₄，0.322g/L；CaCl₂，0.02g/L；FeCl₃·6H₂O，0.005g/L；A₅微量元素1mL/L。将处理好的循环培养液重新加入到BICCAPS中，作为循环培养基按照上述步骤(1)的微藻培养条件继续培养微藻。

(3)重复上述步骤(1)和(2)。

步骤(1)中，当富油新绿藻收获时需留取一半的生物质在锥形瓶中，当做下一次培养的藻种。

为了研究循环培养基(即利用CO₂处理藻液絮凝沉降后得到的上清液)的可回收性，利用上述方法进行半连续式循环培养富油新绿藻，碳酸氢钠浓度分别为0.1，0.3mol/L，循环培养周期为16天。设置两个实验组：实验组(循环培养基)与对照组(新鲜培养基)，即培养基进行循环时分别加入处理后的循环培养基与相同体积的新鲜培养基。

利用不同浓度碳酸氢钠(0.1，0.3mol/L)的培养基(实验组)及与实验组相同碳酸氢钠浓度的新鲜培养基(对照组)半连续循环培养富油新绿藻，培养基配方(碳酸氢钠除外)如表1、表2所示，培养基循环培养时间为16天，光照强度为141.5μmol/m²·s，初始接种量为0.085g/L，温度为25℃，初始pH值为8.5，培养两天后(结束后pH值约为9-11.0)，将锥形瓶中50％体积的藻液取出。循环培养次数为8次，每一次循环将实验组藻液利用碱性自絮凝(不添加任何絮凝剂)的收获方法收获微藻，向收获微藻后的上清液中鼓入CO₂，将pH调至8.5，并在第6、14天添加其他营养盐(碳酸氢钠除外)，具体添加量分别为：NaNO₃，0.5g/L；NaCl，0.025g/L；MgSO₄，0.05g/L；KH₂PO₄，0.322g/L；CaCl₂，0.02g/L；FeCl₃·6H₂O，0.005g/L；A₅微量元素1mL/L。并重新添加至培养系统中继续培养微藻。

参见图4a)，碳酸氢钠浓度为0.3mol/L时，在培养周期的前4天内，实验组与对照组生物质浓度没有显著差异；在碳酸氢钠浓度为0.1mol/L时，在培养周期的前6天内，实验组与对照组生物质浓度没有显著差异。然而在含有0.3mol/L碳酸氢钠的循环培养实验组中生物质浓度在4-16天时低于对照组；含有0.1mol/L碳酸氢钠的循环培养实验组中生物质浓度在6-8天时低于对照组。为了探究这一原因，猜测是由于其他微藻生长所必需的的营养物质缺乏导致生物质下降。因此，在第8和14天，向0.1和0.3mol/L碳酸氢钠循环实验组中添加其他营养物质(碳酸氢钠除外)至初始培养基浓度，具体添加量分别为：NaNO₃，0.5g/L；NaCl，0.025g/L；MgSO₄，0.05g/L；KH₂PO₄，0.322g/L；CaCl₂，0.02g/L；FeCl₃·6H₂O，0.005g/L；A5微量元素1mL/L。如图4b所示，在添加营养物质后，两个循环实验组的生物质产率都增加了，且达到对照组相同的水平。这个说明了该抑制作用是由于营养物质不足导致的，且在第八次次循环培养之后，实验组的生物质产浓度是高于对照组的。该实验结果验证了循环培养基(即利用CO₂处理藻液絮凝沉降后得到的上清液)的可循环使用性，这种循环培养系统稳定可靠、操作简便、成本便宜，可以大规模、低成本的培养微藻。

实施例5：富油新绿藻的循环培养中的自絮凝

本实施例采用实施例4半连续式操作中取出的细胞用于自絮凝的测试，且不做任何的pH调节处理，即利用自身的pH。参见图5，0.1mol/L碳酸氢钠的沉降效率从80.4±0.1％提升至96.1±0.4％，0.3mol/L碳酸氢钠的沉降效率从84.1±1.3％提升至95.8±0.1％。如图4b)所示，可以看出在循环培养过程中，0.1mol/L碳酸氢钠实验组组其体积产率由0.14g/L/d上升至0.26g/L/d，0.3mol/L碳酸氢钠实验组由0.155g/L/d上升至0.39g/L/d，且与其各自的对照组并没有显著的差异。这说明富油新绿藻能在循环培养基中正常生长，碱絮凝收获后的培养基能够实现循环培养。且富油新绿藻的24小时的收获效率维持在90％左右，说明碱絮凝收获不会受到循环培养基的影响。这说明絮凝沉降与循环培养成功实现匹配。

最后需要强调的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或同等替换，而不脱离技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (3)

1.一种微藻碱性絮凝收获及循环培养的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)利用含有碳酸氢盐的培养基在微藻培养系统中培养微藻，待培养液pH上升至8.0-12.0时，收获部分或全部体积的培养液，并向培养系统中补充相同体积的培养基；

(2)加入絮凝离子絮凝沉降，收获微藻；

所述絮凝离子选自Ca²⁺；

(3)向步骤(2)中絮凝沉降得到的上清液中补充CO₂至pH 8.0-9.0；

(4)对照步骤(1)所述的培养基的成分，向步骤(3)中得到的上清液中添加除了碳酸氢盐之外的其他成分至初始浓度，并用于下一批次微藻的培养；

(5)重复上述步骤(1)到(4)；

所述微藻为富油新绿藻；

步骤(1)中所述培养基配方如下：

步骤(2)中加入的絮凝离子的浓度为：Ca²⁺浓度5-40mmol/L。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述Ca²⁺来自可溶性钙盐。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述Ca²⁺来自氯化钙或硝酸钙。

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