CN101220386A

CN101220386A - 一种从爪哇伪枝藻中提取多糖的方法

Info

Publication number: CN101220386A
Application number: CNA2008100467719A
Authority: CN
Inventors: 谢作明; 刘永定; 王焰新; 黄泽波; 胡春香; 沈银武
Original assignee: China University of Geosciences
Current assignee: China University of Geosciences
Priority date: 2008-01-25
Filing date: 2008-01-25
Publication date: 2008-07-16

Abstract

本发明公开了一种从爪哇伪枝藻中提取多糖的方法，首先将磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、柠檬酸、柠檬酸铁铵、乙二胺四乙酸二钠盐、碳酸钠，微量元素溶液按比例配制成爪哇伪枝藻培养液；然后将爪哇伪枝藻置于培养液中培养并制取爪哇伪枝藻粉，最后从爪哇伪枝藻粉中提取多糖并所得多糖纯化、收获与干燥。本发明方法易行、操作方便、安全可靠、产量高、产品质量好、且所用设备简单适用于工业化规模生产。

Description

一种从爪哇伪枝藻中提取多糖的方法

技术领域

本发明涉及一种从爪哇伪枝藻中提取多糖的方法，属于生物技术领域。

背景技术

爪哇伪枝藻是一种广泛分布于荒漠生境的丝状蓝藻，它属于蓝藻门、蓝藻纲、段殖体目、伪枝藻科、伪枝藻属。目前，对爪哇伪枝藻的利用一般只停留在进行人工藻结皮上，对爪哇伪枝藻的其他应用开发几乎还是一片空白。爪哇伪枝藻之所以用于形成人工藻结皮进行荒漠治理，主要的是由于其富含多糖，多糖含量一般都在其干重的16.6％以上。藻类多糖可以改变溶液流动学特征，增加溶液的粘度，形成稳定凝胶，可以作为絮凝剂；多糖大分子的亲水性和疏水性，可以作为乳化剂或生物凝聚剂；其结合电荷的能力，可用于去除废水中的重金属离子；藻类多糖还具有潜在的抗肿瘤、抗病毒、降低胆固醇含量等活性可用作抗癌活性药物。因此，它们可以用于食品工业、制药工业、化妆品工业、纺织品工业和石油工业等。由于多糖大多是从大型海藻中提取得到，这些藻的生产成本较高或很高，从而抬高了多糖的价格。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用爪哇伪枝藻提取多糖的方法，此方法易行、操作方便、安全可靠，成本低，产品质量好，且所用设备简单适宜于工业化生产。

从爪哇伪枝藻提取多糖的方法包括如下步骤：

A、培养液的配制：按每升水加入磷酸氢二钾0.02～0.05g、硫酸镁0.06～0.09g、氯化钙0.02～0.05g、柠檬酸0.004～0.008g、柠檬酸铁铵0.004～0.008g、乙二胺四乙酸二钠盐0.001～0.003g、碳酸钠0.01～0.04g，微量元素溶液0.5～2ml，其中微量元素溶液按每100ml蒸馏水中加入硼酸270～300mg、四水氯化锰170～200mg、七水硫酸锌18～25mg、二水钼酸钠15～30mg、五水硫酸铜6～10mg，完全溶解后搅匀即制得培养液；

B、爪哇伪枝藻的培养：首先是一级培养，将爪哇伪枝藻种置于培养液中通气培养，调节气流在1.5～3.5L.min^-1，光强控制在65～85μE.m^-2.s^-1，温度控制在22～35℃，培养5～10天后转入到二级培养；其次是二级培养，将一级培养所得的培养物接入到新的培养液中，通气培养，调节气流在2.5～5L.min^-1，无菌处理，光强控制在75～95μE.m^-2.s^-1，温度控制在22～35℃，培养5～10天后转入到三级培养；第三是三级培养，将二级培养所得的培养物接入到新的培养液中通气培养，调节气流在3～6L.min^-1，无菌处理，光强控制在70～100μE.m^-2.s^-1，温度控制在22～35℃，培养5～10天后作为继续培养的接种种源；第四是继续培养，首先是小循环培养池培养，将三级培养后所得的藻种接入小循环培养池，控制温度在22～35℃，利用自然光进行光照，控制光照强度在120～180μE.m^-2.s^-1，搅动培养基；其次是大循环培养池培养，将小循环培养池中培养4～7天的爪哇伪枝藻转接到大循环培养池中培养，小循环培养池与大循环培养池中培养液的体积比为1∶20～25，将大循环培养池中控制温度在22～35℃，用自然光进行光照，控制光照强度在120～180μE.m^-2.s^-1，培养10～20天后的爪哇伪枝藻过滤收得爪哇伪枝藻藻浆；

上述爪哇伪枝藻接种时，按每升培养液0.1～0.5g湿重的比例接入。

C、爪哇伪枝藻粉的制备：将爪哇伪枝藻藻浆离心获得爪哇伪枝藻藻泥，然后将爪哇伪枝藻藻泥经浓缩、脱水、干燥、粉碎后得到爪哇伪枝藻粉；

D、爪哇伪枝藻多糖的抽提：向爪哇伪枝藻粉中加入7～10倍重量的蒸馏水，搅匀，然后在70～90℃下，利用搅拌器不停地搅拌抽提3～5小时，在离心机中，3000～6000rpm离心10～15min，收集上清液，向上清液中加入等体积的氯仿正丁醇溶液，所用正丁醇溶液中氯仿与正丁醇体积比为4～7∶1。振荡20～30min，3000～6000rpm离心10～15min，收集上层溶液，加入3～5倍体积的预先冷冻到0～4℃的无水乙醇，摇匀，静置10～20min，析出的白色絮状沉淀物即为爪哇伪枝藻多糖，3000～6000rpm离心5～10min收集多糖；

E、纯化、收获与干燥：首先是纯化，将上述所得多糖溶于4～6倍蒸馏水中，用10～15倍0～4℃冷的无水乙醇洗涤；其次是收获，将所得的纯化溶液在离心机中8000～10000rpm离心5～10min，收集多糖沉淀物；第三是干燥，将收集到的多糖沉淀物在-60～-110℃下冷冻干燥，得多糖产品。

本发明具有以下优点和卓著的效果：方法易行、经济快捷、操作方便、设备简单、产量高、产品质量好、安全可靠，适用于工业化规模生产。

具体实施方式

提取爪哇伪枝藻多糖的具体实施步骤如下：

A、培养液的配制

按每升水加入磷酸氢二钾0.04g、硫酸镁0.075g、氯化钙0.036g、柠檬酸0.006g、柠檬酸铁铵0.006g、乙二胺四乙酸二钠盐0.001g、碳酸钠0.02g，微量元素溶液1ml，其中微量元素溶液按每100ml蒸馏水中加入硼酸286mg、四水氯化锰181mg、七水硫酸锌22.2mg、二水钼酸钠25.2mg、五水硫酸铜7.9mg，完全溶解后搅匀。

B、爪哇伪枝藻的培养

(1)一级培养：将爪哇伪枝藻种接入装有培养液的三角瓶(150～200ml)中，静止培养或通气培养，通气培养时，调节气流大小在2.5L.min^-1，气流经过棉花球进行无菌处理，光强控制在70μE.m^-2.s^-1，温度控制在30℃。当培养7～10天后，转入到二级培养。

(2)二级培养：将一级培养所得的培养物接入装有培养液的到培养瓶(500～1000ml)中，通气培养，调节气流大小在3L.min^-1，无菌处理，光强控制在80μE.m^-2.s^-1，温度控制在30℃。当培养7～10天后，转入到三级培养。

(3)三级培养：将二级培养所得的培养物接入到装有培养液的培养瓶(5000～20000ml)中，通气培养，调节气流大小在5L.min^-1，无菌处理，光强控制在90μE.m^-2.s^-1，温度控制在30℃。当培养7～10天后，便可作为继续培养的接种种源。

(4)继续培养

①小循环培养池(1～2m³)培养：采用三级培养后所得的藻种，接入小循环培养池。采用玻璃温棚控制温度在30℃，利用自然光进行光照，采用遮荫网控制光照强度在120～180μE.m^-2.s^-1，叶轮或潜水泵搅动培养基。

②大循环培养池(40～60m³)培养：将小循环培养池中培养4～7天的爪哇伪枝藻转接到大循环培养池中，按小循环培养池与大循环培养池中培养液的体积比为1∶20～25进行扩大。其他培养条件与小循环培养池的培养条件相同。

C、爪哇伪枝藻粉的制备

将大循环培养池培养15～20天后的爪哇伪枝藻用泵抽到过滤装置——振动斜面筛上，经过振动斜面筛后，收得爪哇伪枝藻藻浆，然后将藻浆经过离心机离心获得爪哇伪枝藻藻泥，将爪哇伪枝藻藻泥经浓缩、脱水、干燥、粉碎后得到爪哇伪枝藻粉。

D、爪哇伪枝藻多糖的抽提

向爪哇伪枝藻粉中加入7～10倍重量的蒸馏水，充分搅匀。然后在80℃下，利用搅拌器不停地搅拌抽提3～5小时。在离心机中，3000～6000rpm离心10～15min，收集上清液。向上清液中加入等体积的氯仿-正丁醇(5∶1，v/v)溶液，振荡20～30min，3000～6000rpm离心10～15min。下层为氯仿、正丁醇溶液，中层为主要包含蛋白质的悬浮液，上层即为主要包含多糖的粗多糖溶液。收集这些粗多糖溶液，加入3～5倍体积的预先冷冻到0～4℃的无水乙醇，摇匀，静置10～20min，析出的白色絮状沉淀物即为爪哇伪枝藻多糖。3000～6000rpm离心5～10min收集多糖。

E、纯化、收获与干燥

纯化：将上述所得多糖溶于4～6倍蒸馏水(w/v)中，用10～15倍(w/v)0℃冷的无水乙醇洗涤；

收获：将所得纯化溶液在离心机中8000～10000rpm离心5～10min，收集多糖沉淀物；

干燥：将收集到的多糖沉淀物在-100℃下冷冻干燥，得多糖产品。

Claims

1.一种从爪哇伪枝藻提取多糖的方法，其特征在于包括如下步骤：

B、爪哇伪枝藻的培养：首先是一级培养，将爪哇伪枝藻种置于培养液中静止培养或通气培养，调节气流在1.5～3.5L.min^-1，光强控制在65～85μE.m^-2.s^-1，温度控制在22～35℃，培养5～10天后转入到二级培养；其次是二级培养，将一级培养所得的培养物接入到新的培养液中，通气培养，调节气流在2.5～5L.min^-1，无菌处理，光强控制在75～95μE.m^-2.s^-1，温度控制在22～35℃，培养5～10天后转入到三级培养；第三是三级培养，将二级培养所得的培养物接入到新的培养液中，通气培养，调节气流在3～6L.min^-1，无菌处理，光强控制在70～100μE.m^-2.s^-1，温度控制在22～35℃，培养5～10天后作为继续培养的接种种源；第四是继续培养，首先是小循环培养池培养，将三级培养后所得的藻种接入小循环培养池，控制温度在22～35℃，利用自然光进行光照，控制光照强度在120～180μE.m^-2.s^-1，搅动培养基；其次是大循环培养池培养，将小循环培养池中培养4～7天的爪哇伪枝藻转接到大循环培养池中培养，将大循环培养池中控制温度在22～35℃，用自然光进行光照，控制光照强度在120～180μE.m^-2.s^-1，培养10～20天后的爪哇伪枝藻过滤收得爪哇伪枝藻藻浆；

D、爪哇伪枝藻多糖的抽提：向爪哇伪枝藻粉中加入7～10倍重量的蒸馏水，搅匀，然后在70～90℃下，利用搅拌器不停地搅拌抽提3～5小时，在离心机中，3000～6000rpm离心10～15min，收集上清液，向上清液中加入等体积的氯仿正丁醇溶液，振荡20～30min，3000～6000rpm离心10～15min，收集上层溶液，加入3～5倍体积的预先冷冻到0～4℃的无水乙醇，摇匀，静置10～20min，析出的白色絮状沉淀物即为爪哇伪枝藻多糖，3000～6000rpm离心5～10min收集多糖；

2.根据权利要求1所述的从纤细席藻中提取多糖的方法，其特征在于：小循环培养池与大循环培养池中培养液的体积比为1∶20～25。

3.根据权利要求1所述的从纤细席藻中提取多糖的方法，其特征在于：所用氯仿正丁醇溶液中氯仿与正丁醇体积比为4～7∶1。