CN106399108B - 一种简便高效的雨生红球藻营养细胞培养和采收方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别提供了一种简便、高效的雨生红球藻营养细胞培养和采收方法。本发明主要通过在雨生红球藻营养培养基中添加碳酸氢盐和碳酸盐缓冲液，提高培养液中二氧化碳溶解度和碳源的供给，提升藻细胞密度；在培养结束前，停止补充二氧化碳，利用藻细胞光合作用吸收碳酸氢盐的特性，破环缓冲体系，使培养液pH值自然升高，促进游动细胞鞭毛的脱落，并利用雨生红球藻细胞在高碱性环境下快速沉降的特性去除营养培养基，实现营养细胞高效采收，提升营养细胞诱导活性。该方法操作简便、效率高、能耗低，实现高效营养细胞采收的同时，提高了第二阶段虾青素诱导效率。

Description

一种简便高效的雨生红球藻营养细胞培养和采收方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别提供了一种简便高效的雨生红球藻营养细胞培养和采收方法。
背景技术
虾青素（Astaxanthin），即3,3′-二羟基-4,4 ′-二酮基-β,β′-胡萝卜素，化学分子式为C40H52O4，是一种广泛存在于自然界中的类胡萝卜素。天然来源的虾青素是迄今为止自然界发现的最强抗氧化剂，其抗氧化能力是β-胡萝卜素的10倍，辅酶Q10的800倍，可以有效清除自由基，具有抗氧化、抑制肿瘤生成、增强免疫功能、抵御紫外线伤害等多种生理功效。
目前，作为主要的天然虾青素生物来源的雨生红球藻中，虾青素含量可达到3.0%，甚至更高，被看作是天然虾青素的浓缩品。大量研究表明雨生红球藻对虾青素的积累速率和生产总量较其它绿藻高，而且雨生红球藻所含虾青素及其酯类的配比与水产养殖动物自身配比极为相似，这是通过化学合成和利用红发夫酵母等提取的虾青素所不具备的优势。因此，雨生红球藻被公认为是自然界中生产天然虾青素的最好生物，利用这种微藻提取虾青素无疑具有广阔的发展前景。
雨生红球藻的规模化养殖通常采用两步法，第一步采用全营养成分的培养基进行营养生长，第二步采用营养缺失培养基进行诱导。由于前后两步培养所使用的培养基不同，因此，第一步营养生长结束后需要去除培养基并采收藻细胞，然后接种至诱导培养基进行培养。在第一步营养生长阶段，由于二氧化碳在水中溶解度低，限制了藻细胞碳源的利用，细胞密度低且带鞭毛的游动细胞多，收集难度大。现有的微藻采收方法，如自然沉降、离心、过滤等，存在效率低、能耗高、适用性差等缺点；而新研究开发的添加絮凝剂采收方法，如专利201310484780.7、201410453206.X等采用的添加絮凝剂的方法，虽然可以实现沉降采收，但絮凝剂和藻体无法分离，不能进行第二步诱导培养，并且以上方法在一定程度上会损坏雨生红球藻的细胞活性，导致诱导阶段生物量和虾青素转化能力受损。
发明内容
在保持营养细胞活性，且不影响第二阶段虾青素诱导效率的前提下，本发明提供一种简便高效的雨生红球藻营养细胞采收方法。采用的技术方案如下：
一种简便高效的雨生红球藻营养细胞培养和采收方法，包括以下步骤：
a、营养培养基配制：向全营养培养基中添加10~30mM碳酸氢盐和1~5mM碳酸盐，得到营养培养基；
b、营养培养：将雨生红球藻接种至步骤a的营养培养基中，得到接种后的藻液，向藻液中通入二氧化碳和过滤空气的混合气体，混合气体中二氧化碳含量为0.5~5%，维持藻液pH值在7.0~8.0；
c、调控：营养培养结束前，停止通入二氧化碳，仅通入过滤空气，继续悬浮培养；
d、浓缩采收：待藻液pH值上升至10~11，停止通入过滤空气，自然沉降，去除上层澄清培养基，收集下层的营养细胞，得到浓缩藻细胞；
e、诱导培养：将上述浓缩藻细胞接种至营养缺失培养基中进行诱导培养，积累虾青素。
优选的，步骤a中的全营养培养基为BG-11、BBM、NIES-C培养基中的一种。
优选的，步骤b中的营养培养，其培养温度为20~25℃，光照强度为50~80μmol/m2/s，培养时间为7~10天。
优选的，步骤c中的悬浮培养，其培养时间为不少于6小时。
优选的，步骤d中的自然沉降其沉降时间为0.5~1.5小时。
优选的，步骤e中的营养缺失培养基为缺氮培养基、缺硫培养基、缺磷培养基中的一种。
本发明主要通过在雨生红球藻营养培养基中添加碳酸氢盐和碳酸盐缓冲液，提高培养液中二氧化碳溶解度和碳源的供给，提升藻细胞密度。在培养结束前，停止补充二氧化碳，利用藻细胞光合作用吸收碳酸氢盐的特性，破坏缓冲体系，使培养液pH值自然升高，促进游动细胞鞭毛的脱落，并利用雨生红球藻细胞在高碱性环境下快速沉降的特性去除营养培养基，实现营养细胞高效采收，提升营养细胞诱导活性。
该方法具有操作简便、效率高、能耗低的有益效果，实现高效营养细胞采收的同时，提高了第二阶段虾青素诱导效率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、结合、简化，均为等效形式，同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
（1）向BG-11全营养培养基中添加30mM碳酸氢盐和5mM碳酸盐，得到营养培养基。
（2）将雨生红球藻接种至步骤（1）的营养培养基中，然后向藻液中通入二氧化碳和过滤空气的混合气体，混合气体中二氧化碳含量为0.5~5%，维持藻液pH值在7.0~8.0；营养培养的培养温度为20~25℃，光照强度为50~80μmol/m2/s。
（3）营养培养10天，营养培养结束前，停止通入二氧化碳，仅通入过滤空气，继续悬浮培养培养12小时。
（4）待藻液pH值上升至11，停止通入过滤空气，自然沉降1小时，去除上层澄清培养基，收集下层的营养细胞，得到浓缩藻细胞。
（5）将步骤（4）的浓缩藻细胞接种至BG-11缺氮培养基中进行诱导培养，积累虾青素。
以不添加碳酸氢钠和碳酸钠培养的雨生红球藻作为对照组。实验数据显示，添加有碳酸氢钠和碳酸钠的情况下，营养培养结束时藻细胞密度达到0.74 g/L，相比于对照组提高了34.5%；通过显微镜观察，实施例1游动细胞比例在5%左右，相比于对照组减少了7.3倍。营养培养结束，自然沉降1小时后，实施例1采收率达到95.2%，对照组只有20.3%；对照组自然沉降24小时后，采收率仅为78.6%。
收集实施例1自然沉降1小时的营养细胞和对照组自然沉降24小时的营养细胞，分别接种至BG-11缺氮培养基中进行诱导，初始浓度均为0.4 g/L，培养10天，收集藻细胞并使用改良的Boussiba方法测定虾青素浓度。实验数据显示，实施例1虾青素浓度为38.8 mg/L，相比于对照组提高了38.9%，营养细胞诱导活性显著得到明显的提升。
综合考虑营养阶段细胞密度和采收损失，实施例1虾青素的产量比对照组提高了126.4%，而营养细胞采收阶段沉降时间仅仅是对照组的1/24。
实施例2
（1）向BG-11全营养培养基中添加10mM碳酸氢盐和1mM碳酸盐，得到营养培养基。
（2）将雨生红球藻接种至步骤（1）的营养培养基中，得到接种后的藻液，向藻液中通入二氧化碳和过滤空气的混合气体，混合气体中二氧化碳含量为0.5~5%，维持藻液pH值在7.0~8.0；营养培养的培养温度为20~25℃，光照强度为50~80μmol/m2/s。
（3）营养培养10天，营养培养结束前，停止通入二氧化碳，仅通入过滤空气，继续悬浮培养6小时。
（4）待藻液pH值上升至10，停止通入过滤空气，自然沉降1.5小时，去除上层澄清培养基，收集下层的营养细胞，得到浓缩藻细胞。
（5）将步骤（4）的浓缩藻细胞接种至BG-11缺氮培养基中进行诱导培养，积累虾青素。
以不添加碳酸氢钠和碳酸钠培养的雨生红球藻作为对照组。实验数据显示，添加有碳酸氢钠和碳酸钠的情况下，营养培养结束时藻细胞密度达到0.68 g/L，相比于对照组提高了26.9%；通过显微镜观察，实施例2游动细胞比例在8%左右，相比于对照组减少了4.5倍。营养培养结束，自然沉降1小时后，实施例2采收率达到90.4%，对照组只有20.3%；对照组自然沉降24小时后，采收率仅为78.6%。
收集实施例2自然沉降1小时的营养细胞和对照组自然沉降24小时的营养细胞，分别接种至BG-11缺氮培养基中进行诱导，初始浓度均为0.4 g/L，培养10天，收集藻细胞并使用改良的Boussiba方法测定虾青素浓度。实验数据显示，实施例2虾青素浓度为36.3 mg/L，相比于对照组提高了30.1%，营养细胞诱导活性显著得到明显的提升。
综合考虑营养阶段细胞密度和采收损失，实施例2虾青素的产量比对照组提高了84.9%，而营养细胞采收阶段沉降时间仅仅是对照组的1/16。
此外，需要说明的是，本说明书中所描述的具体实施例，其各部分名称等可以不同，凡依本发明专利构思所述的构造、特征及原理所做的等效或简单变化，均包括于本发明专利的保护范围内。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种简便高效的雨生红球藻营养细胞培养和采收方法，其特征在于包括以下步骤：
a、营养培养基配制：向全营养培养基中添加10~30mM碳酸氢盐和1~5mM碳酸盐，得到营养培养基；
b、营养培养：将雨生红球藻接种至步骤a所述的营养培养基中，得到接种后的藻液，向所述藻液中通入二氧化碳和过滤空气的混合气体，所述混合气体中二氧化碳含量为0.5~5%，维持藻液pH值在7.0~8.0；
c、调控：营养培养结束前，停止通入二氧化碳，仅通入过滤空气，继续悬浮培养；
d、浓缩采收：待藻液pH值上升至10~11，停止通入过滤空气，自然沉降，去除上层澄清培养基，收集下层的营养细胞，得到浓缩藻细胞；
e、诱导培养：将上述浓缩藻细胞接种至营养缺失培养基中进行诱导培养，积累虾青素。
2.按照权利要求1所述的一种简便高效的雨生红球藻营养细胞培养和采收方法，其特征在于：步骤a所述的全营养培养基为BG-11、BBM、NIES-C培养基中的一种。
3.按照权利要求1所述的一种简便高效的雨生红球藻营养细胞培养和采收方法，其特征在于：步骤b所述的营养培养，其培养温度为20~25℃，光照强度为50~80μmol/m2/s，培养时间为7~10天。
4.按照权利要求1所述的一种简便高效的雨生红球藻营养细胞培养和采收方法，其特征在于：步骤c所述的悬浮培养，其培养时间为不少于6小时。
5.按照权利要求1所述的一种简便高效的雨生红球藻营养细胞培养和采收方法，其特征在于：步骤d所述的自然沉降其沉降时间为0.5~1.5小时。
6.按照权利要求1所述的一种简便高效的雨生红球藻营养细胞培养和采收方法，其特征在于：步骤e所述的营养缺失培养基为缺氮培养基、缺硫培养基、缺磷培养基中的一种。
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