CN101402961A - 一种生产糖蛋白疫苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产糖蛋白疫苗的方法。本发明生产糖蛋白疫苗的方法是将糖蛋白基因导入α－1，6－甘露糖转移酶基因灭活的重组毕赤酵母中生产糖蛋白，以所述糖蛋白作为疫苗的活性成分。本发明生产的糖蛋白疫苗中的活性成分是低糖基化的糖蛋白，其免疫诱导产生抗体的能力明显优于普通酵母生产的过度糖基化糖蛋白和大肠杆菌生产的非糖蛋白，本发明生产糖蛋白疫苗的方法生产的疫苗可以提高抗体滴度、降低抗原用量和减少免疫次数。

Description

一种生产糖蛋白疫苗的方法

技术领域

本发明涉及一种生产糖蛋白疫苗的方法。

背景技术

毕赤酵母已成为近年来发展最快的酵母表达系统，广泛用于各种重组蛋白表达，尤其在疫苗生产中具有明显优势。

毕赤酵母与大肠杆菌相比，它可用于复杂蛋白表达，且表达蛋白具有天然生物活性或构型。与其它酵母相比，它还具有外源蛋白分泌能力强、蛋白表达水平高和适合于高密度培养等优点。与哺乳动物细胞表达系统相比，它又具有生长快、便于基因操作、大规模培养和培养成本低廉等优势。

毕赤酵母可以对其表达的蛋白进行N-糖基化修饰，糖基化修饰对蛋白质的正确折叠、稳定性和生物活性至关重要。但毕赤酵母的N-糖基化修饰与哺乳动物细胞有明显区别，哺乳动物细胞的N-糖基修饰，一般每个糖基含10-20个单糖，分子量为1500-3000。而毕赤酵母的N-糖基化修饰常常为过度糖基化修饰，每个糖基可以含三十至上百个甘露糖，分子量为四千至数万，糖蛋白分子量明显增大，而且由于过度糖基化修饰往往不均一，因而糖蛋白分子量也不均一，SDS-PAGE分析时出现明显“拖尾”。

毕赤酵母用于糖蛋白疫苗生产时，这种过度糖基化修饰可遮蔽抗原表位，降低抗原的免疫原性。在酵母表达系统中，简单地通过将蛋白上的糖基化位点突变来去除蛋白过度糖基化修饰对抗原的遮蔽又可能会带来新的问题：如酵母表达的HBV的pre-S1和pre-S2都会被过度糖基化修饰，形成含有30多个甘露糖残基的糖链，将pre-S1和pre-S2的糖基化位点都突变后，免疫原性虽然比过度糖基化修饰的要强，但却出现了合成困难，易被蛋白酶降解的问题，难以用于产业化生产(Jeewon Lee，Jin-Seung Park，Je-Young Moon，et al.The influence of glycosylation on secretion，stability，and immunogenicity of recombinant HBV pre-S antigen synthesized inSaccharomyces cerevisiae[J].Biochem Biophy Res Commun，2003，303(2)：427-432.)。

α-1，6-甘露糖基转移酶是酵母在高尔基体中向来自内质网的蛋白N-糖基(N-GluNac₂Man₈)上加上第一个α-1，6-甘露苷的糖基转移酶，其产物N-GluNac₂Man₉是后续甘露糖基转移酶的底物。

发明内容

本发明的目的是提供一种生产糖蛋白疫苗的方法。

本发明所提供的生产糖蛋白疫苗的方法，是将糖蛋白基因导入α-1，6-甘露糖转移酶基因灭活的毕赤酵母中构建重组菌，用所述重组菌生产糖蛋白，以所述糖蛋白作为疫苗的活性成分。

其中，本发明所述的糖蛋白可以是各种可作为疫苗的糖蛋白及其变异体，如流感神经氨酸酶、流感血凝素、含preS的乙肝病毒表面大抗原、HIV病毒的GP120蛋白、丙肝的E1抗原、丙肝的E2抗原、SARS的刺突蛋白、单纯疱疹病毒糖蛋白、狂犬病毒糖蛋白、嗜B细胞病毒gp340蛋白、日本脑炎病毒糖蛋白或典型猪瘟病毒糖蛋白E2等。优选的糖蛋白为流感神经氨酸酶或含preS的乙肝病毒表面大抗原。

所述生产糖蛋白疫苗的方法中，还可包括将所述糖蛋白与佐剂混合。佐剂和糖蛋白混合使用，不但有助于注射物质的沉积或汇集，而且能增强抗体反应，所述佐剂可为现有的多种佐剂，如氢氧化铝或MF59等。

α-1，6-甘露糖转移酶基因灭活的重组毕赤酵母可以是通过敲除部分或全部的α-1，6-甘露糖转移酶基因(序列表中序列3)序列，也可以通过诱变或筛选自发突变株获得，其中较优的是敲除部分或全部的基因序列，所述敲除部分的基因序列较优的是指敲除至少10％的α-1，6-甘露糖转移酶基因序列，更好的是敲除其启动子序列或编码序列。

一种优选的α-1，6-甘露糖转移酶基因灭活的重组毕赤酵母是敲除了α-1，6-甘露糖转移酶基因约1000bp编码序列的毕赤酵母GJK0601 CGMCC No.1853(简称为GJK)，其详细构建方法见实施例1。与诱变或自发突变株产生的点突变中的单个碱基的变化不同，这种α-1，6-甘露糖转移酶部分或全部基因序列的敲除，具有不易产生回复突变的优势，这在疫苗大规模生产中具有重要的意义。因为在疫苗规模生产时，如果出现少量菌株的回复突变，由于回复突变后的菌株生长速度比α-1，6-甘露糖转移酶缺陷株快，因此随着生长时间的延长，回复突变的野生表型菌株就会讯速增加，从而导致表达的糖蛋白上糖基结构的改变。这样就会导致生产过程的不稳定和难以控制。

所述通过敲除部分或全部的α-1，6-甘露糖转移酶基因序列灭活的重组毕赤酵母具体可用如下方法获得：

1)在载体的多克隆位点插入α-1，6-甘露糖转移酶基因的上游同源区和下游同源区构建α-1，6-甘露糖转移酶基因灭活载体；所述α-1，6-甘露糖转移酶基因的上游同源区为如下A)或B)的DNA片段，所述α-1，6-甘露糖转移酶基因的下游同源区为如

A)大小为至少200bp的DNA片段，该片段选自序列表中序列3；

B)在严格条件下与A)限定的DNA片段杂交的片段；

C)大小为至少200bp的DNA片段，该片段选自序列表中序列3，且该片段位于所述片段A)的下游，与所述片段A)相距至少10％α-1，6-甘露糖转移酶基因序列；

D)在严格条件下与C)限定的DNA片段杂交的片段；

2)将所述α-1，6-甘露糖转移酶基因灭活载体导入毕赤酵母中获得重组毕赤酵母。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

为了便于筛选，在上游同源区和下游同源区中间可以带有作为筛选标记的基因，如抗生索抗性基因(如Zeo、Kan等)、营养缺陷补偿基因(如His4、Arg、ADE、URA3等)。这种用于重组的核酸片段可以通过PCR的方法获得或着用人工合成的方法获得。相应的序列可以从公开的数据库获得，如毕赤酵母的α-1，6-甘露糖转移酶基因序列，在美国国立医学图书馆的GenBanK中已经公开(收录号E12456)。毕赤酵母可以从商业化的或各菌种保藏中心获得，如毕赤酵母GS115可以从美国invitrogen公司购买。

将重组灭活载体或片段导入酵母中可以用电转化、PEG转化法(如J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002)，将转化后的菌体涂布在与质粒中选择性标记相对应的筛选培养基上，筛选阳性克隆。可以通过PCR、Southern杂交等方法确证敲除是否正确。

本发明实施例1提供了一种敲除部分α-1，6-甘露糖转移酶基因序列灭活该酶的重组毕赤酵母构建的详细方法。

所述将糖蛋白基因导入α-1，6-甘露糖转移酶基因灭活的重组毕赤酵母中生产糖蛋白的方法，可以用各种酵母表达载体，具体可为pPIC9、pPICZ、pHIL-D2或pHIL-S1。这些基因在毕赤酵母中的表达可以用与该酵母相适应的各种启动子控制，优选的是醇氧化酶启动子AOX1。

这些糖蛋白的氨基酸序列及编码这些氨基酸序列的核酸序列可以从各种公开的文献、书籍和公共数据库中获得，如从美国国立医学图书馆的GenBank获得，根据这些序列，可以用本领域周知的方法如PCR(Saiki等Science.239：487-491，1988)、RT-PCR方法、人工合成的方法和构建筛选cDNA文库的方法等获得相应的基因，用作PCR模板和用于构建cDNA文库的mRNA或cDNA可以来源于任何含有相应mRNA或cDNA的病毒、细胞及文库等，这些病毒、细胞可以从各种菌、毒种库获得，细胞和文库也可以从一些公司购得。较优的方法是采用人工合成的方法获得，在人工合成时可以通过选用酵母偏爱密码子、优化mRNA二级结构等方法优化设计相应蛋白的编码序列，从而提高其在毕赤酵母中的表达水平。

若需要可用本领域公知的方法对多聚核苷酸进行突变、缺失、插入和与其它多聚核苷酸连接等。如果需要可在编码基因的两侧引入多聚核苷酸，引入的多聚核苷酸可有限制性内切酶识别位点。可用本领域公知的方法将含编码序列的核酸克隆到各种表达载体中去。所用标准的分子克隆过程见J.萨姆布鲁克等(J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995.)的叙述。

本方法制备的糖蛋白可以用各种方法分离如离心、盐析、沉淀、超滤和液相层析等技术及这些技术的组合。其中液相层析可以用凝胶排阻、亲和、离子交换、疏水和反相等层析技术。本发明方法生产的糖蛋白还可以有各种衍生物，这些衍生物可以是但不局限于其不同形式的盐和修饰产物等。如在多肽的氨基、羧基、羟基或巯基上再进行修饰。所用修饰剂可以但不局限于聚乙二醇或葡聚糖等。

本发明的生产糖蛋白疫苗的方法生产的疫苗也属于本发明的保护范围。

所述疫苗中的活性成分是低糖基化的糖蛋白，所述低糖基化糖蛋白的50％以上的N-糖链上的单糖数不大于20个，糖含量小于30％。所述疫苗可由所述糖蛋白单独组成，也可由所述糖蛋白与其它抗原联合组成，还可由所述糖蛋白与佐剂联合使用。

本发明用α-1，6-甘露糖转移酶基因灭活的重组毕赤酵母生产糖蛋白，即具有毕赤酵母生长快，适合于规模化生产，产业化成本低等优点，又避免了普通毕赤酵母存在的对蛋白进行过度糖基化修饰的问题。普通毕赤酵母表达的过度糖基化修饰的糖蛋白常表现为分子量不均一，SDS-PAGE分析出现明显“拖尾”，且其中大部分蛋白的分子量明显大于根据其氨基酸序列计算的理论分子量，糖含量常大于30％。每个糖基可以含30至上百个甘露糖，分子量为4000至数万。而用α-1，6-甘露糖转移酶基因灭活的重组毕赤酵母表达的糖蛋白，为低糖基化修饰的糖蛋白，分子量基本均一。SDS-PAGE分析“拖尾”现象消失，糖含量小于30％。

本发明生产的糖蛋白疫苗中的活性成分是低糖基化的糖蛋白，其免疫诱导产生抗体的能力明显优于普通酵母生产的过度糖基化修饰糖蛋白和大肠杆菌生产的非糖蛋白，本发明生产糖蛋白疫苗的方法生产的疫苗可以提高抗体滴度、降低抗原用量和减少免疫次数。

附图说明

图1为毕赤酵母GS115生产的NA(GS115-NA)的SDS-PAGE。

图2为毕赤酵母GJK0601 CGMCC No.1853生产的NA(GJK-NA)的SDS-PAGE。

图3为大肠杆菌生产的非糖基化NA蛋白(E.coli-NA)的SDS-PAGE。

图4为GJK-NA、GS115-NA和E.coli-NA分别免疫小鼠二次后的血清抗体水平。

图5为GJK-NA、GS115-NA和E.coli-NA分别免疫小鼠三次后的血清抗体水平。

图6为毕赤酵母GJK0601 CGMCC No.1853生产的HBV-L抗原(GJK-L)和毕赤酵母GS115生产的HBV-L抗原(GS115-L)的SDS-PAGE分析

1：GJK-L；2、3：蛋白分子量标准；4：GS115-L。

图7为GJK-L和GS115-L分别免疫小鼠三次后的血清抗体水平。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、生产流感神经氨酸酶糖蛋白疫苗

一、α-1，6-甘露糖转移酶灭活的毕赤酵母GJK0601 CGMCC No.1853的构建

1.敲除质粒的构建

用玻璃珠制备法(A.亚当斯等，《酵母遗传学方法实验指南》，科学出版社，2000)提取毕赤酵母GS115(购自Invitrogen life technologies，carlsbad，california92008，USA)的基因组，以该基因组为模板扩增α-1，6-甘露糖转移酶(OCH1)两侧的同源臂、URA3基因和ADE基因(PCR反应所用的pyrobest酶购自宝生物工程有限公司，大连；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，北京)，OCH1两侧的同源臂为900bp，中间缺失约1000bp的编码基因，扩增OCH1 5’端同源臂所用的引物为p1105：5’-acggatccccggaaaaccgagagaactct-3’和p1106：5’-acgcggccgcagagcgatagagaatgttccagg-3’，扩增OCH1 3’端同源臂所用的引物为p1103：5’-acgcggccgcggatcctaatgaggccaaggaattggagctggct-3’和p1104：5’-agggtacctgggaagagatgtcttgtgcac-3’。两个同源臂的PCR扩增条件如下：94℃变性5min后，按照94℃变性30sec、55℃复性30sec、72℃延伸1min进行30次循环，最后72延伸10min。

以毕赤酵母GS115基因组为模板，扩增URA3基因的引物为pURA3-5：5’-aaccaactgcagtggggagataaccacctttgac-3’和pURA3-3：5’-tttcggtaccttgctggctactccttgagtctg-3’，PCR扩增条件如下：94℃变性5min后，按照94℃变性30sec、55℃复性30sec、72℃延伸2min，进行30次循环，最后72延伸10min，目的片断大小在2kb左右；以酿酒酵母基因组为模板，扩增ADE基因所用的引物为pADE-5：5’-atttgcggccgctattcacgagtcagtctgactct-3’和pADE-3：5’-atttgcggccgcaatcctcgagaagcaagctattg-3’，PCR扩增条件如下：94℃变性5min后，按照94℃变性30sec、55℃复性30sec、72℃延伸1min30sec进行30次循环，最后72延伸10min，目的片断大小在1.5kb左右。PCR产物用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收(购自鼎国生物技术有限公司，北京)。

以质粒pYes2(购自Invitrogen life technologies，carlsbad，california 92008，USA)为模板，p1101：5’-atagatctagaacatgtgagcaaaaggc-3’和p1102：5’-acagatctggcccgataggccatcccgggcgcggccgcggtaccctagcttttcaattcaattcatca-3’为引物进行PCR反应，PCR扩增条件如下：94℃变性5min后，按照94℃变性30sec、55℃复性30sec、72℃延伸3min，进行30次循环，最后72延伸10min，目的片断在3kb左右。反应产物回收后以限制性内切酶BglII(本试验所用的限制性内切酶均购自宝生物工程有限公司，大连)酶切回收，回收产物中加入T4连接酶(购自宝生物工程有限公司，大连)，16℃反应过夜，酶切产物自连生成质粒pGE1201，转化大肠杆菌DH5α(购自鼎国生物技术有限公司，北京)，用含氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆。

将PCR扩增的5’同源臂以BamHI和NotI酶切，克隆到用BamHI/NotI酶解的上述制备的pGE1201质粒上，形成pGE1202，转化大肠杆菌DH5α，用含氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆。酶切鉴定正确。再将PCR扩增的3’同源臂以NotI和KpnI酶切，克隆到用NotI/KpnI酶解的pGE1202上，形成pGE1203，转化大肠杆菌DH5α，用含氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆。酶切鉴定正确。再以PstI和KpnI酶切PCR扩增的URA3基因，克隆到用PstI/KpnI酶解的pGE1203上，形成pGE1203-URA3，转化大肠杆菌DH5α，用含氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆。酶切鉴定正确。将pGE1203-URA3以NotI酶切，再用CIAP(购自宝生物工程有限公司)去磷酸化，与同样用NotI酶切的ADE基因以T4连接酶连接，形成pGE1203-ADE-URA3，转化大肠杆菌DH5α，用含氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，经PCR鉴定和酶切鉴定表明筛选出的克隆在NotI位点处插入了两个串联的ADE基因。

2.敲除质粒对毕赤酵母的转化

用毕赤酵母GS115(购自Invitrogen life technologies，carlsbad，california92008，USA)，通过Lin Cereghino，G.P.等(New selectable marker/auxotrophichost strain combinations for molecular genetic manipulation of Pichia pastoris.2001，Gene，263，159-69.)提供的方法构建获得含有(ade^-、ura3^-、arg^-、his^-)标记的毕赤酵母JC308。采用电转化法将敲除质粒转化入毕赤酵母JC308中，电转化的方法为本领域所共知的(如A.亚当斯等，《酵母遗传学方法实验指南》，科学出版社，2000)。电转化前，先将敲除质粒用3’同源臂上BglII酶切位点线性化，然后电转入制备好的感受态细胞中，涂布于含有精氨酸和组氨酸的MD培养基(YNB 1.34g/100ml，生物素4×10^-5％g/100ml，葡萄糖2g/100ml，琼脂1.5g/100ml，精氨酸100mg/ml，组氨酸100mg/ml)上。待培养基上长出克隆后，随机挑取几个克隆提取基因组，通过PCR的方法鉴定敲除质粒是否正确整合到了染色体上的目标位点，PCR反应所用的两对引物分别是：OCH1基因3’同源臂外的引物序列p1108：5’-tcttgtcaattcggaaagtgtc-3’和ADE基因的5’端引物pADE-5：5’-atttgcggccgctattcacgagtcagtctgactct-3’，以及引物p1108和OCH1基因5’同源臂外的引物序列p1107：5’-gcctgacagccttaaagagcc-3’。PCR反应所用的酶为rTaq(购自宝生物工程有限公司)，PCR扩增条件如下：94℃变性5min后，按照94℃变性30sec、55℃复性30sec、72℃延伸3min进行30次循环，最后72延伸10min。通过凝胶电泳分析PCR产物条带的大小，以p1108和pADE-5为引物所扩增的条带在2.4kb左右，以p1107和p1108为引物不能扩增出条带，说明随机挑选的几个克隆中，敲除质粒已经正确整合到了染色体上的目标位点。

将其中一个克隆接种于YPD培养基(1g/100ml酵母提取物，2g/100ml蛋白胨，2g/100ml葡萄糖)中，25℃摇床培养12小时后，将菌液涂布于腺嘌呤缺陷的5-FOA培养基(YNB 1.34g/100ml，生物素4×10^-5g/100ml，葡萄糖2g/100ml，琼脂1.5g/100ml，精氨酸100mg/ml，组氨酸100mg/ml，尿嘧啶100mg/ml，5-FOA 0.1g/100ml)(其中，YNB，为无氨基酸酵母氮源，购自北京欣经科生物技术有限公司，5-FOA为5-氟尿嘧啶，购自Sigma-aldrich P.O.BOX14508，St.Louis，MO 63178 USA)，置于25℃培养。

3.PCR鉴定阳性克隆

待腺嘌呤缺陷的5-FOA培养基上长出克隆后，提取这些克隆的基因组，进行PCR鉴定：以基因组为模板，鉴定引物为染色体上OCH1基因同源臂外的序列p1107：5’-gcctgacagccttaaagagcc-3’和p1108：5’-tcttgtcaattcggaaagtgtc-3。同时将以JC308菌株的基因组为模板的PCR反应体系设为对照。PCR反应所用的酶为LA Taq(购自宝生物工程有限公司)，PCR扩增条件如下：94℃变性5min后，按照94℃变性30sec、55℃复性30sec、72℃延伸3min30sec进行30次循环，最后72延伸10min。将产物进行琼脂糖凝胶电泳，以JC308菌株基因组为模板的PCR产物大小在2.8kb左右，以待鉴定克隆基因组为模板的PCR产物大小在4.8kb左右，证明了α-1，6-甘露糖转移酶敲除的菌株构建正确。其相应位置已经被ADE基因取代。这个通过二次同源重组后，用ADE基因替代JC308菌株基因组中OCH1基因约1Kb编码序列后获得的毕赤酵母菌株被命名为GJK0601。

毕赤酵母GJK0601已于2006年10月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC No.1853。

二、用毕赤酵母GJK0601 CGMCC No.1853生产流感神经氨酸酶糖蛋白制备疫苗

1)流感神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)酵母表达载体的构建

流感病毒H1N1的神经氨酸酶基因序列见序列表中序列1，根据该序列分段合成，即先合成序列1的DNA正向片段，每段58bp，及其反向互补序列58bp/段，每条反向片段分别与正向序列前一段和后一段各有29bp互补，所有DNA片段各取1pmol混合，然后用上游引物：ATGAATCCAAATCAAAAAATAATAACC和下游引物：CTACTTGTCAATGGTGAACGGCAAC为正向和反向引物，PCR扩增拼接，获得NA基因。NA基因由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

NA的N端为跨膜区，为形成分泌型表达，去掉N端的120个碱基，同时在C端带6聚组氨酸(6XHis)标签编码序列，以NA基因为模板，以NA5和NA3方引物，硬用pyrobest DNA聚合酶进行PCR扩增：

引物NA5和NA3的核苷酸序列如下：

NA5：GTG CTC GAG AAA AGA AGT CAC TCA ATC CAA ACT GGA

NA3：TT GTC GAC GAATTC CTA GTG ATG GTG ATG GTG GTG ACCTCCACC CTT GTC AATGGT GAA CGG

PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环；72℃延伸10min。

回收PCR扩增获得的约1.2kb片段，Xho1和EcoR1双酶切后与Xho1和EcoR1双酶切的pPIC9载体相连，构建重组表达载体pPIC9-NA(实验中的pyrobest DNA聚合酶、内切酶、连接酶、试剂盒等购自上海生工生物工程技术服务有限公司和北京博大泰克生物基因技术有限公司，pPIC9购自美国Invitrogen公司)。重组表达载体pPIC9-NA用于转化酵母。

2、毕赤酵母GJK0601 CGMCC No.1853生产流感神经氨酸酶糖蛋白疫苗

a)毕赤酵母GJK0601 CGMCC No.1853生产流感神经氨酸酶糖蛋白

pPIC9-NA用SalI线性化后分别电转化毕赤酵母GJK0601 CGMCC No.1853和毕赤酵母GS115(Invitrogen公司)，待长出单克隆后，PCR鉴定阳性克隆。方法为分别挑取单克隆接于2mLYPD培养基中，在30℃下以200rpm培养20-24h，转移至离心管，12000rpm离心5min，弃上清。加入50μL裂解缓冲液(0.1M Tris-HCl(pH8.0)，5mMEDTA，1g/100ml SDS)悬浮菌体，并加入少量0.5mm的玻璃珠和20μL TE(0.1M pH8.0的Tris-HCl，1mM EDTA)，高速振荡2min。12000rpm离心5min，上清移至一新离心管中，加入等体积的苯酚，充分振荡，离心，将水相转移至新的离心管中，再加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)溶液，高速振荡2min，离心抽提取水相。水相中加入2倍体积的95％的冷乙醇和0.1倍体积的3mol/L的乙酸钠-乙酸溶液，-20℃放置15min，4℃高速离心沉淀DNA，弃上清，用70％乙醇清洗，最后悬浮于100μL左右的无菌水中。取1μL作为模板，NA5和NA3为引物，PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环。取10μL PCR产物，1％琼脂糖电泳分析。

PCR产物约1.3Kb的克隆为阳性克隆。pPIC9-NA转化毕赤酵母GJK0601 CGMCCNo.1853的阳性克隆命名为GJK(pPIC-NA)，pPIC9-NA转化毕赤酵母GS115的阳性克隆命名为GS115(pPIC-NA)。

GJK(pPIC-NA)和GS115(pPIC-NA)分别接种于50mlYPD培养基，GS115(pPIC-NA)在30℃培养，GJK(pPIC-NA)在25℃培养，培养24-48h后，以5ml/100ml的接种量接种到1000ml BMGY培养基(1g/100ml酵母提取物，2g/100ml蛋白胨，YNB 1.34g/100ml，生物素4×10^-5g/100ml，100mmol/L pH6.0的磷酸盐缓冲液，2g/100ml甘油)中，24h后加入0.5ml/100ml甲醇进行诱导表达，每12h补加一次甲醇(0.5ml/100ml)，诱导72后离心取上清，用于纯化。

上清600ml，分别用53g/100ml(NH₄)₂SO₄沉淀45min，10000r/m，20min离心收沉淀，100mL 20mM pH7.5的Tris-HCl溶解，10000r/m，10min离心收上清，弃残渣。上清用金属离子亲和层析柱Chelationg sepharose fast flowФ1.6×20cm柱纯化(介质购自美国GE公司，空柱购自华美实验仪器厂)，层析柱先用0.1M的硫酸镍以4ml/分钟的流速冲洗60分钟，使介质充分吸附镍离子，再用A液：20mM pH7.5的Tris-HCl+0.5M NaCl，平衡30分钟后，将上述含NA的上清以4ml/分钟的流速流过金属离子亲和层析柱，再用A液平衡30分钟，96ml/100ml A液+4ml/100ml B液(B液：20mM pH7.5的Tris-HCl+0.5M NaCl+0.5M咪唑)预洗脱杂蛋白20分钟，然后直接用100％B液洗脱，分别收集洗脱峰，即为纯化的毕赤酵母GJK0601 CGMCC No.1853生产的流感神经氨酸酶糖蛋白(GJK-NA)和毕赤酵母GS115生产的流感神经氨酸酶糖蛋白(GS115-NA)，SDS-PAGE分析纯度。为了使纯化的GJK-NA和GS115-NA有利于免疫动物，将上述纯化的GJK-NA和GS115-NA用Sephadex G-25，Ф2.5×40cm柱脱盐(介质购自美国GE公司，空柱购自华美实验仪器厂)，流动相为50mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)。收集蛋白峰，用Bradford蛋白定量试剂盒(试剂盒购自北京天为时代科技有限公司)，按试剂盒说明的方法进行蛋白定量。根据测定的蛋白浓度，用50mM磷酸盐缓冲液将蛋白浓度调整为30μg/ml。

图1为GS115(pPIC-NA)生产的NA的SDS-PAGE分析，“1”为蛋白分子量标准，“2-5”为GS115(pPIC-NA)生产的GS115-NA。图2为GJK(pPIC-NA)生产的NA的SDS-PAGE分析，“1”为蛋白分子量标准，“2-5”为GJK(pPIC-NA)生产的GJK-NA。

b)大肠杆菌生产流感神经氨酸酶蛋白

E.coli-NA5和E.coli-NA3作为正反向引物，NA基因为模板，pyrobest DNA聚合酶PCR扩增用于大肠杆菌表达的NA基因，引物序列如下：

E.coli-NA5：tg AGT CAC TCA ATC CAA ACT GGA；

E.coli-NA3：ATACTCGAG CTT GTC AAT GGT GAA CGG。

PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，共25个循环。

电泳回收PCR扩增片段，XhoI单酶切。PET22b载体(购自Novagen公司)用NdeI单切后用Klenow酶补平，再用XhoI酶单切，回收后与上述XhoI单酶切的PCR扩增片段连接，转化BL21(DE3)感受态细胞，氨苄青霉素抗性LB平板培养，取阳性克隆测序，序列正确的克隆命名为BL21(DE3)(PET22b-NA)。挑取该菌单克隆接于50mL LB(0.5g/100ml酵母提取物，1g/100ml蛋白胨，1g/100ml NaCl，100mg/mL氨苄青霉素)培养基中37℃培养过夜，5ml/100ml接种量接种1L LB培养基，待菌生长至OD₆₀₀为0.4-0.6时，加入2g/L乳糖后诱导培养6个小时，离心取菌体。用30mL 20mM pH7.5的Tris-HCl重悬菌体，超声破碎30分钟后，10000转/分钟，10分钟离心收沉淀，1ml/100ml Triton X-100洗涤一遍，10000转/分钟，10min离心收沉淀，20mM pH7.5的Tris-HCl+8M脲+20mM DTT溶解，变性1小时。用乙酸调pH至5.0后SP-SepharoseFast FlowФ1.6×20cm柱纯化(介质购自美国GE公司，空柱购自华美实验仪器厂)。A液：20mM pH5.0的NaAc+8M脲，B液：20mM pH5.0的NaAc+8M脲+1M NaCl。用A液平衡柱，上样后，10ml/100ml，40ml/100ml，100ml/100ml B洗脱液阶段洗脱，收集40ml/100ml B洗脱峰为纯化的大肠杆菌生产流感神经氨酸酶糖蛋白(E.coli-NA)，SDS-PAGE分析纯度。图3为大肠杆菌生产的非糖基化NA蛋白(E.coli-NA)的SDS-PAGE分析，“1-5”为纯化的E.coli-NA，“6”为蛋白分子量标准。为了使纯化的E.coli-NA有利于免疫动物，用Sephadex G-25脱盐方法，去除E.coli-NA中的盐和尿素，换成50mM pH7.4的磷酸盐缓冲液体系。

c)毕赤酵母GJK0601 CGMCC No.1853生产的低糖基化流感神经氨酸酶糖蛋白、毕赤酵母生产的过度糖基化流感神经氨酸酶糖蛋白和大肠杆菌生产的非糖基化流感神经氨酸酶制备疫苗及其免疫原性比较

GJK-NA、GS115-NA和E.coli-NA分别用生理盐水稀释成10μg/ml和2μg/ml，分别与等体积的AL(OH)₃佐剂混合，制成疫苗GJK-NA10、GS115-NA10、E.coli-NA10、GJK-NA2、GS115-NA2和E.coli-NA2。

每种疫苗设两个剂量组(1μg/只/次和0.2μg/只/次)，用于免疫小鼠。Balb/c小鼠，雌性，6-8周，42只，分成7组，每组6只，每只小鼠每次腹腔注射，

7组分别为：

1μg的GJK-NA组：注射GJK-NA10疫苗200μl；

1μg的GS115-NA组：注射GS115-NA10疫苗200μl；

1μg的E.coli-NA组：注射E.coli-NA10疫苗200μl；

0.2μg的GJK-NA组：注射GJK-NA2疫苗200μl；

0.21μg的GS115-NA组：注射GS115-NA2疫苗200μl；

0.2μg的E.coli-NA组：注射E.coli-NA2疫苗200μl；

对照组：注射生理盐水与AL(OH)3佐剂混合液200μl。

每间隔3个星期腹腔注射免疫一次，共免疫3次。每次免疫后两星期尾静脉采血，ELISA检测抗体产生水平。

ELISA检测抗体方法如下：用包被液(0.15g/100ml Na₂CO₃，0.293g/100ml NaHCO₃，pH9.6)稀释含NA1抗原的流行性感冒病毒裂解疫苗(凡尔灵VAXIGRIP2006/2007株流行性感冒病毒裂解疫苗，深圳赛诺菲巴斯德生物制品有限公司生产)至0.3μg/ml包被酶联板，不同稀释度的免疫后小鼠血清作为一抗，辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(1∶500)(购自北京鼎国生物技术有限公司)为二抗，OPD显色(显色液：1.84g/100mlNa₂HPO₄·12H₂O，0.5g/100ml柠檬酸，临用前再加0.04g/100ml OPD和0.15ml/100mlH₂O₂)，于492nm处比色。

ELISA检测结果显示除对照组外，其他组在二、三次免疫后，均可以检测到抗体的产生。

以对照组的最高吸光度值的两倍为抗体产生阳性值，计算每组血清的抗体滴度。

抗体滴度结果如图4和图5所示，表明随着免疫剂量和次数的增加，抗体滴度增加。二次免疫后，1μg GJK-NA免疫产生的抗体水平(1∶5500)明显高于相同剂量的GS115-NA的抗体水平(1∶10)和E.coli-NA的抗体水平(1∶13)，分别是后两者的550倍和400倍(P＝0.004和P＝0.01，差异具有显著的统计学意义)。0.2μg各组抗原免疫产生的抗体水平均明显低于1μg各组，其中GJK-NA组抗体水平(1∶71)略高于GS115-NA组抗体水平(1∶17)和E.coli-NA组抗体水平(1∶14)，但统计学差异不显著。三次免疫后，0.2μg剂量组的GJK-NA免疫产生的抗体水平上升(1∶4900)，明显高于同剂量的GS115-NA和E.coli-NA免疫产生的抗体水平(1∶3和1∶17)(P＝0.0002和P＝0.01，差异具有显著的统计学意义)。0.2μg剂量组的GJK-NA三次免疫产生的抗体水平基本达到了其二次免疫1μg剂量组的水平。而GS115-NA和E.coli-NA三次免疫产生的抗体水平增加不明显；1μg剂量组三次免疫后，GJK-NA免疫产生的抗体水平已经进入平台，抗体水平变化不明显(1∶4700)，GS115-NA和E.coli-NA免疫产生的抗体水平有所增加(1∶19和1∶630)，但依然低于GJK-NA。

上述结果说明GJK-NA免疫诱导产生抗体的能力明显优于GS115-NA和E.coli-NA，作为疫苗时，可以提高抗体滴度、降低抗原用量和减少免疫次数。

实施例2、毕赤酵母GJK0601 CGMCC No.1853生产乙肝表面抗原糖蛋白制备疫苗

1)含pre-S的乙肝病毒表面大抗原-L抗原的酵母表达载体的构建

现在已经上市的乙肝疫苗的抗原是乙肝病毒表面抗原中的小抗原(small antigen，S)，这种疫苗对大部分人群产生免疫保护，但仍有约10％的人对这种疫苗不能产生抗体。研究表明，含pre-S的乙肝病毒表面抗原-大抗原(Larg antigen，L)可以产生更强的免疫保护作用，但pre-S上含有两个N-糖基化位点，在普通酵母中表达易产生过度甘露糖化修饰，影响其免疫原性。用哺乳动物细胞生产虽然可以得到低糖基化修饰的抗原，但生产成本较高。

含pre-S的乙肝病毒表面抗原-大抗原基因序列见序列表中序列2，根据该序列分段合成，即先合成序列2的DNA正向片段，每段58bp，及其反向互补序列58bp/段，每条反向片段分别与正向序列前一段和后一段各有29bp互补，所有DNA片段各取1pmol混合，然后以HBL5和HBL3为引物pyrobest DNA聚合酶PCR扩增该基因。HBL5和HBL3引物序列如下：

HBL5：GAAAAGAATGGGAGGTTGGTCTTCCAAACCT；

HBL3：TATGCGGCCGCTTAAATGTATACCCAGAGACAAAAG。

PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸120s，共40个循环；72℃延伸10min。

回收PCR扩增获得的约1.2kb片段，NotI单切后回收。pPIC9载体先用XhoI单切后，用Klenow酶补平后回收该载体，再用NotI单切，将该载体与上述NotI单切后回收的1.2kb的片段连接。转化大肠杆菌DH5α。涂布于氨苄青霉素LB平板，挑阳性克隆测序。测序结果表明插入片段的核苷酸序列如序列表中序列2所示的重组表达载体命名为pPIC9-HBL。

实验中的pyrobest DNA聚合酶、内切酶、连接酶、试剂盒等购自上海生工生物工程技术服务有限公司和北京博大泰克生物基因技术有限公司，pPIC9购自美国Invitrogen公司。

2)毕赤酵母GJK0601 CGMCC No.1853生产乙型肝炎病毒L抗原糖蛋白

pPIC9-HBL用SalI线性化后分别电转化毕赤酵母GJK01 CGMCC No.1853和毕赤酵母GS115(Invitrogen公司)待长出单克隆后，PCR鉴定阳性克隆。PCR鉴定以HBL5和HBL3为引物，阳性克隆命名为GJK(pPIC-L)和GS115(pPIC-L)。

GJK(pPIC-L)和GS115(pPIC-L)分别接种于50mlYPD培养基，GS115(pPIC-L)在30℃培养，GJK(pPIC-L)在25℃培养，培养24-48h后，以5ml/100ml的接种量接种到1000ml BMGY培养基(1g/100ml酵母提取物，2g/100ml蛋白胨，1.34g/100ml YNB，4×10^-5g/100ml生物素，100mmol/L pH6.0的磷酸盐缓冲液，2g/100ml甘油)中，24h后加入0.5ml/100ml甲醇进行诱导表达，每12h补加一次甲醇(0.5ml/100ml)，诱导72后离心收集菌体，高压匀浆法破菌，离心收集上清，分别加入1M硫酸铵后，用Butyl sepharose Fast flowФ1.6×20cm柱纯化(介质购自美国GE公司，空柱购自华美实验仪器厂)，A液：1M硫酸铵+20mM pH7.0的Tris-HCl，B液：20mM Tris-HCl，柱先用A液平衡，上样后用0→100％B线性梯度洗脱，280nm紫外检测，分段收集各级份，用Hepatitis B surface antigen(HBsAg)BioAssayTM ELISA kit(自北京华美生物工程有限公司)检测各级份中L抗原含量，收集80-100％B洗脱的组分为乙型肝炎病毒L抗原糖蛋白，分别将毕赤酵母GJK(pPIC-L)和GS115(pPIC-L)制备的L抗原糖蛋白命名为GJK-L和GS115-L。

SDS-PAGE分析结果如图6所示，表明毕赤酵母GJK0601 CGMCC No.1853生产的乙型肝炎病毒L抗原糖蛋白(GJK-L)分子量约为46KD，毕赤酵母GS115生产的乙型肝炎病毒L抗原糖蛋白(GS115-L)分子量约为55KD，而根据氨基酸序列计算未糖化L抗原的蛋白分子量为43KD，因此GJK-L的L抗原为低糖基化的乙肝表面糖蛋白抗原。GS115-L为过度糖计化的乙肝表面糖蛋白抗原。

3)用毕赤酵母GJK01 CGMCC No.1853生产的乙肝表面抗原糖蛋白制备疫苗

将步骤2)中制备的GJK-L抗原糖蛋白用生理盐水稀释至10μg/ml和2μg/ml，分别加入等体积的铝佐剂混合，获得α-1，6-甘露糖转移酶基因灭活的重组毕赤酵母制备的低糖化的乙肝表面抗原糖蛋白疫苗GJK-L10和GJK-L2

将步骤2)中制备的GS115-L抗原糖蛋白用生理盐水稀释至10μg/ml和2μg/ml，分别加入等体积的铝佐剂混合，获得普通毕赤酵母制备的过度糖基化的乙肝表面抗原糖蛋白疫苗GS115-L10和GS115-L2。

每种疫苗设两个剂量组(1μg/只/次和0.2μg/只/次)，用于免疫小鼠。balb/c小鼠，雌性，6-8周，30只，分成5组，每组6只，每只小鼠每次腹腔注射如下抗原：

0.2μg的GJK-L组：注射GJK-L2疫苗200μl；

0.2μg的GS115-L组：注射GS115-L2疫苗200μl；

1μg的GJK-L组：注射GJK-L10疫苗200μl；

1μg的GS115-L组：注射GS115-L疫苗200μl；

对照组：注射生理盐水与AL(OH)3佐剂混合液200μl。

每间隔3个星期腹腔注射免疫一次，共免疫3次。每次免疫后两星期尾静脉采血，ELISA检测抗体产生水平。

ELISA检测抗体方法如下：用包被液(0.15g/100ml Na₂CO₃，0.293g/100ml NaHCO₃，pH9.6)稀释含乙型肝炎抗原的重组乙型肝炎疫苗(华北制药金坦生物技术股份有限公司，河北石家庄)至0.3μg/ml包被酶联板，不同稀释度的免疫后小鼠血清作为一抗，辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(1∶500)(购自北京鼎国生物技术有限公司)为二抗，OPD显色(显色液：1.84g/100ml Na₂HPO₄·12H₂O，0.5g/100ml柠檬酸，临用前再加0.04g/100ml OPD和0.15ml/100ml H₂O₂)，于492nm处比色。

ELISA检测结果显示除对照组外，其他组在三次免疫后，均可以检测到抗体的产生。以对照组的最高吸光度值的两倍为抗体产生阳性值，计算每组血清的抗体滴度。

抗体滴度结果如图7所示，1μg和0.2μgGJK-L免疫产生的抗体水平分别为(1∶1500和1∶(1∶1100)明显高于相同剂量的GS115-L免疫产生的抗体水平(1∶280和1∶54)，分别提高5倍和20倍(P＝0.04和P＝0.02，差异具有统计学意义)。上述结果说明GJK-L免疫诱导产生抗体的能力优于GS115-L，作为疫苗时，可以提高抗体滴度。

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所

<120>一种生产糖蛋白疫苗的方法

<130>CGGNARW81898

<160>3

<210>1

<211>1413

<212>DNA

<213>毕赤酵母(pichia pastoris)

<400>1

atgaatccaa atcaaaaaat aataaccatt ggatcaatca gtatagcaat cggaataatt     60

agtctaatgt tgcaaatagg aaatattatt tcaatatggg ctagtcactc aatccaaact    120

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<210>2

<211>1203

<212>DNA

<213>毕赤酵母(pichia pastoris)

<400>2

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<210>3

<211>2859

<212>DNA

<213>毕赤酵母(pichia pastoris)

<400>3

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tgaatacctt cttctaagcg atcgtccgtc atcatagaat atcatggact gtatagtttt    2340

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caacatgatc ctcgaaatgg gtggcaagca tcgttccaga cctgcctcct ctggtagatg    2700

gagtgttgtt tttgacaggg gattacaagt ctattgatga agatacccta aagcaactgg    2760

gggacgttcc aatatacaga gactccttca tctaccagtg ttttgtgcac aagacatctc    2820

ttcccattga cactttccga attgacaaga acgtcgacc                           2859

Claims (9)

1、一种生产糖蛋白疫苗的方法，是将糖蛋白基因导入α-1，6-甘露糖转移酶基因灭活的毕赤酵母中构建重组菌，用所述重组菌生产糖蛋白，以所述糖蛋白作为疫苗的活性成分。

2、根据权利要求1中生产糖蛋白疫苗的方法，其特征在于：所述α-1，6-甘露糖转移酶基因灭活的毕赤酵母是缺失至少10％的α-1，6-甘露糖转移酶基因序列的重组菌。

3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述α-1，6-甘露糖转移酶基因灭活的毕赤酵母是按照如下方法获得的：

1)在载体的多克隆位点插入α-1，6-甘露糖转移酶基因的上游同源区和下游同源区构建α-1，6-甘露糖转移酶基因灭活载体；所述α-1，6-甘露糖转移酶基因的上游同源区为如下A)或B)的DNA片段，所述α-1，6-甘露糖转移酶基因的下游同源区为如下C)或D)的DNA片段；

A)大小为至少200bp的DNA片段，该片段选自序列表中序列3；

B)在严格条件下与A)限定的DNA片段杂交的片段；

C)大小为至少200bp的DNA片段，该片段选自序列表中序列3，且该片段位于所述片段A)的下游，与所述片段A)相距至少10％的α-1，6-甘露糖转移酶基因序列；

D)在严格条件下与C)限定的DNA片段杂交的片段；

2)将所述α-1，6-甘露糖转移酶基因灭活载体导入毕赤酵母中获得重组毕赤酵母。

4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述α-1，6-甘露糖转移酶基因灭活的毕赤酵母为毕赤酵母GJK0601 CGMCC No.1853。

5、根据权利要求1-4中任一所述生产糖蛋白疫苗的方法，其特征在于：所述糖蛋白基因由醇氧化酶启动子AOX1控制。

6、根据权利要求5所述的生产糖蛋白疫苗的方法，其特征在于：所述糖蛋白为流感神经氨酸酶或含preS的乙肝病毒表面大抗原。

7、根据权利要求6所述的生产糖蛋白疫苗的方法，其特征在于：所述生产糖蛋白疫苗的方法中，还包括将所述糖蛋白与佐剂混合。

8、根据权利要求7所述的生产糖蛋白疫苗的方法，其特征在于：所述佐剂为氢氧化铝或MF59。

9、由权利要求1至8中任一所述生产糖蛋白疫苗的方法生产的疫苗。

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