CN101398386B - 乳品中尿素检测试纸的制备及尿素检测方法 - Google Patents
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Abstract
乳品中尿素检测试纸的制备及尿素检测方法，取脲酶源粉与pKHIn大于6.8的pH指示剂混合，用去离子水稀释后取滤液或自然沉降后的上层悬浊液，通过涂敷、印刷或浸泡均匀固定在吸水性良好的载体上并干燥，即成尿素检测试纸。乳品中检测方法如下：首先用普通pH试纸测试待检乳，查看待检乳是否处于正常pH6.3-6.8范围内。若在此范围，则直接进行尿素检测。如不在此范围，调节pH到达此范围再行尿素检测。取尿素检测试纸一条蘸取待检乳液，观察颜色变化便可。若试纸不变色属于合格乳；若试纸变色则为掺入尿素的问题乳；从而可对乳品进行定性判断。将所显颜色与标准比色卡对比，便可进行乳品中尿素半定量测定。
Description
技术领域
本发明涉及食品安全监测中尿素的快速定性或半定量检测，尤其是对尿素掺假乳中尿素的定性或半定量测定方法及其所用尿素检测试纸的制备方法。
背景技术
尿素检测是实验室检测的常见指标，用于食品行业、饲料行业的安全监管监测和打假及环境保护检测，如尿素掺假鲜乳的检测、动物蛋白祠料的掺假、游泳池水中尿素含量的检测等等。
目前，尿素检测的实验室方法不少，对乳中尿素的快速测定大多使用显色法，所应用的显色剂主要有对二甲氨基苯甲醛、亚硝酸盐—格里斯试剂和丁二酮肟等，这些方法都需要借助实验室仪器，难以满足现代食品安全现场监测对检测方法简单快速便携的要求。
2004年有报道称将尿素酶法改良成为试纸条用于尿素掺假乳制品的检测(徐黎，叶兴乾，原料乳中尿素掺假快速检测方法的研究，中国乳牛，2004(02)：51-53；徐黎，叶兴乾等，原料乳中尿素掺假快速检测方法的研究，中国乳品工业，32(4)：34-35)，是不错的研究方向。但该论文称“在研究试纸的保藏性、酶固定化方面遇到了一定的困难，有待进一步深入研究。”可见所报道的技术方案有缺陷，有待完善。
首先，该检测方法的原理是依赖于化学反应后的pH变化而显色，体系就不应该用缓冲系统做酶的溶解剂，因为化学反应导致的pH变化会因缓冲剂的存在而难以体现出来，从而降低检测灵敏度，缓冲剂浓度越高，灵敏度降低越多，最终导致假阴性结果。
此外，论文描述使用的酶缓冲液为磷酸盐缓冲液，而该缓冲液其实是脲酶的强烈抑制剂，不仅我们的重复实验证明了这点，先前也有不少文献报道过这一事实(冯仰婕等，一些抑制剂对脲酶反应速率的影响，应用化学，1994，11(3)：78-80；孙金艳单安山刘大森，脲酶抑制剂在畜牧生产上的应用，中国饲料，2004，(8)：24-25；李杰，葛蔚，反刍动物脲酶抑制剂的研究进展，东北农业大学学报，2004，35(1)：119—122等)。重复上述实验发现，用磷酸盐缓冲液制成的检测试纸，当磷酶比高的时候，试纸根本就没有活性不能显色；当磷酶比低的时候，试纸虽有活性，但灵敏度很低，需要大量尿素才能显色，而且显色时间大大延长；保存时间短，最长仅2周，不能满足产品要求。上述论文中提及的将酶吸附到载体上的过程中，在“……酶固定化方面遇到了一定的困难”的说法，实际上是脲酶被磷酸盐抑制失活造成的遇尿素无显色现象，被误认为是酶不能固定在滤纸上。
可见其检测方法既然利用pH指示剂显色原理，使用缓冲溶液本身就是一个错误，何况所使用的缓冲剂还是脲酶抑制剂，结果使检测试纸中的主要成分脲酶无法发挥作用。
最后，按照该检测原理，对于腐败变质的酸性乳或者为了掩盖事实真相掺碱而矫枉过正的碱性乳，尿素检测试纸都会发生颜色变化而导致假性结果。但该论文并未给出区别判断腐败乳和尿素掺假乳的方法。因此若按其方法检测，对于碱性乳必将导致假阳性结果，对于酸性乳则可能导致假阴性结果。这也是上述方法存在的不足之处。
可见目前并未有适合于尿素检测的简便、快速、便携的方法。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种可以对乳液中尿素进行定性或半定量的检测试纸的制备方法。
本发明的第二个目的在于提供一种采用该尿素检测试纸对乳品中尿素进行定性或半定量的检测方法。
为达到上述目的，本发明尿素检测试纸的制备方法为：
1)试纸原液制备：取脲酶源粉与pKHIn大于6.8的pH指示剂固体或者其水溶液混合，用去离子水或纯水稀释使脲酶源粉含量为0.5％-10％，指示剂量为其对水饱和度的10％-100％，搅拌混匀后用50-100目筛或6-8层纱布过滤或静置自然沉降10-30分钟后，取滤液或自然沉降的上层悬浊液，即为试纸原液；
2)尿素检测试纸制备：将试纸原液通过涂敷、印刷或浸泡均匀固定在载体上并干燥，即成尿素检测试纸。
本发明的脲酶源粉为刀豆(巨豆)粉、毛豆粉、豌豆粉、青豆粉、木豆粉、大豆粉、芸豆粉、四季豆粉、豇豆粉、扁豆粉、红豆粉、绿豆粉、西瓜籽粉或西葫芦籽粉；pKHIn大于6.8的指示剂如溴百里酚蓝、中性红、苯酚红、酚酞、百里酚蓝或百里酚酞；载体为不与试纸原液发生化学反应的可吸水性固相材料中的定性滤纸、定量滤纸或层析滤纸。
本发明的检测方法为：
1)查看待检乳是否酸败：在现场检测液态乳或固体乳的水溶液时，首先用普通pH测试法测试待检乳，查看其是否处于正常pH6.3-6.8范围内，若在此范围，则直接进行尿素检测，若pH低于6.3，则乳品已酸败；如pH高于6.8，乳品酸败后加碱而矫枉过正；pH不在6.3-6.8范围内，则原乳液为腐败变质乳，调节pH在6.3-6.8范围内再行尿素检测；
2)用尿素检测试纸蘸取待检乳液使其吸水浸润，观察颜色变化；
3)试纸若不变色属于合格乳，试纸若有颜色变化，则为尿素掺假乳，颜色深度与乳中尿素含量正相关，将所显颜色与标准比色卡对比，便可进行乳中尿素半定量测定；所述比色卡是尿素检测试纸在标准浓度的尿素乳液中形成的颜色呈现梯度变化的一组彩色图片。
本发明方法与以往尿素检测方法相比有其突出的优点，表现在：
1)检测组件仅仅是一条试纸，体积小而可以随身携带，检测方法简单迅速，结果鲜明便于目测辨别，使用及其方便简单，大大简化了检测程序。满足当前食品安全检测对检测方法“简单、快速、便携”的要求。
2)产品为绿色环保成分，对环境和人没有污染，可以直接将尿素检测试纸插入待检乳液中，没有不安全因素。检测为微量操作，环保而节约。
3)直接采用植物籽粒粉替代昂贵的脲酶纯化学品，大大降低了成本。
4)以去离子水或纯水作为植物籽粒的溶解液而不引入任何外源成分，附着在干燥试纸上的实际上是籽粒自身的天然成分，如此制作的试纸条，解决了脲酶的易被抑制和难以长期保存的问题。
脲酶为生物化学品，最困难的是在体外活性的保持，一般采用缓冲液。但按照本检测原理却不能使用任何缓冲液，本发明用仅仅含有指示剂的去离子水或纯水溶解籽粒粉自身成分作为脲酶的天然保护剂。实践证明该方法对脲酶活性的保持效果非常好，使得尿素检测试纸的保存期大大延长。2008年9月，实验对2006年7月制作简单存放于室温的尿素检测试纸进行了测试，发现其仍然有效。说明该试纸保存期至少为2年。如此长时间的保存期对于生物制品是少见的。
5)检测尿素的灵敏度可通过改换指示剂种类而随国家标准调整。采用本发明方法，用苯酚红和溴百里酚蓝作指示剂时，对尿素掺假乳的检测下限分别为50mg/100mL和30mg/100mL。
6)尿素检测试纸可反复使用。由于吸附在试纸上的脲酶是催化剂，显色反应不消耗它的含量，加上生成产物为气体，试纸干燥后便会基本还原为原始状态，故可反复使用数次。
必须指出，若要反复使用尿素检测试纸，必须在试纸干燥并完全褪色后进行。但若试纸在保存中或者使用前不小心接触了酸性或碱性物质，则试纸作废。
7)市场范围宽：可以提供给食品安全监管相关部门用于劣质产品筛查；也可以推广进家庭，满足人们对食品安全的自行检测和防范；或其它行业，如公共卫生行业用于游泳池水中的尿素检测，检测方法相同。
附图说明
图1为刀豆(巨豆)-苯酚红试纸检测尿素掺假乳照片；
图2为黄豆粉-苯酚红试纸检测尿素掺假乳照片；
图3为芸豆粉-苯酚红试纸检测尿素掺假乳照片；
图4为黄豆粉-溴百里酚蓝试纸检测尿素掺假乳照片；
图中数据指尿素含量(g/100mL)。
具体实施方式
下面对本发明作进一步详细说明。
1.尿素检测试纸制备：
1)试纸原液制备：取脲酶源粉与pKHIn大于6.8的pH指示剂固体或者其水溶液混合，用去离子水或纯水稀释使脲酶源粉含量为0.5％-10％，指示剂量为其对水饱和度的10％-100％，搅拌混匀后用50-100目筛或6-8层纱布过滤或静置自然沉降10-30分钟后，取滤液或自然沉降的上层悬浊液，即为试纸原液；
2)尿素检测试纸制备：将试纸原液通过涂敷、印刷或浸泡均匀固定在载体上并干燥，即成尿素检测试纸。
3)为节约起见可将尿素检测试纸按需要裁剪成小片，形状和大小随意，接上手柄使用，也因无毒可以直接用手接触象pH试纸一样使用。
试纸制备中的脲酶源粉为刀豆(巨豆)粉、毛豆粉、豌豆粉、青豆粉、木豆粉、大豆粉、芸豆粉、四季豆粉、豇豆粉、扁豆粉、红豆粉、绿豆粉、西瓜籽粉或西葫芦籽粉；pKHIn大于6.8的指示剂如溴百里酚蓝、中性红、苯酚红、酚酞、百里酚蓝或百里酚酞；载体为不与试纸原液发生化学反应的可吸水性固相材料中的定性滤纸、定量滤纸或层析滤纸。
2、阳性标准液准备：
该检测试纸条若形成产品，阳性标准液是必须装入试剂盒的。目的是为了确认尿素检测试纸条的有效性。阳性标准液为含有0.05-0.1％叠氮化钠(防腐剂)的50mg/100mL的尿素水溶液(灵敏度相当于100mg/100mL浓度的尿素掺假乳)，装入小滴瓶。
3、标准比色卡：
用制备的尿素检测试纸条对不同标准浓度尿素乳液进行检测，采集其颜色并制作成彩色图片，作为估计乳液中掺入尿素量的参考依据。
4、检测步骤：
1)尿素检测试纸有效性确认：在对样品进行检测之前，首先对试纸的有效性进行确认，对于同批次试纸至少进行一次确认，以排除保存过久或保存不当的失效试纸。确认方法是，随机抽取试纸条一张，滴一滴阳性标准液于试纸上，观察颜色变化并与标准比色卡上0.1g/100mL浓度尿素乳的颜色对比，如果试纸显色达到标准程度，说明试纸良好，有效；如果颜色比标准色度变淡或者不显色，说明试剂盒减效或失效。减效试剂使检测灵敏度降低，检测结果不可靠；失效试纸将不能检出尿素，应废弃不用。
2)待检样准备：待检样若是液态就直接取样检测；若是固体如乳粉，可按其说明加水制成液体检测，
3)样品检测：首先用普通pH测试法测试待检乳，查看其是否处于正常pH6.3-6.8范围内，若在此范围，则直接进行尿素检测，若pH低于6.3，则乳品已酸败；如pH高于6.8，乳品酸败后加碱而矫枉过正；pH不在6.3-6.8范围内，则原乳液为腐败变质乳，调节pH在6.3-6.8范围内再行尿素检测；取有效尿素检测试纸1条，加一滴待检乳液，或者将其直接浸入液体试样中蘸取乳液(试纸浸过的乳液无毒无害，但不建议回收)，观察颜色变化。
5、结果判读：
若试纸显色度与比色卡中空白对照乳液显色度一致，属于合格乳。试纸若有颜色变化，属于尿素掺假的问题乳。试纸干燥之前颜色不褪。若要半定量测定，则在试纸干燥之前与比色卡对比，进行乳中尿素含量的估计。
所使用技术原理及产品工作原理
1、尿素检测原理：在水存在下，尿素在其特异催化酶——脲酶(生物催化剂)的作用下分解释放出二氧化碳和氨从而使含水溶液(乳液)由酸变碱，进而体系中预先加入的pH指示剂就会发生颜色变化。反应式如公式-1：
公式1
2、尿素检测试纸反复使用原理：
如公式1所示，脲酶是催化剂，不会在反应中被消耗。变色试纸随着水分的挥发，溶入水中的氨气也不断逸出，在试纸完全干燥后，氨气完全逃逸，试纸颜色还原。还原后的试纸条因为脲酶和指示剂没有完全损失，故可反复使用。随着反复使用次数的增多，乳液成分会越来越多沉淀在试纸上使得检测灵敏度下降，故建议反复使用次数不超过5次。必须指出，使用中若试纸不慎接触到酸性或碱性物质，试纸条则不可反复使用。
3、用植物籽粒粉替代脲酶的原理：脲酶能特异性促进尿素分子中肽键的水解，广泛分布于植物的籽粒中。目前市售纯脲酶多由刀豆籽粒提纯而来，价格高昂，且易受多种抑制剂作用而失活。从公式1可见，脲酶作为催化剂并不参与化学反应，因此酶量的多少只会影响显色时间(反应速度)，并不会影响显色效果(反应结果)，所以对脲酶无需严格定量；只要体系中不含抑制剂，对其纯度要求也无需很高。这样我们就有理由在不引入任何外源抑制剂的前提下，用廉价的植物籽粒粉代替纯的脲酶试剂，实验证明此替代在大大降低成本的同时，不仅不影响检测效果，反而因使用了天然的籽粒粉保护成分而使脲酶的保存期大大延长。
4、植物籽粒粉(脲酶)溶剂的改良原理：上已述及，和本发明最接近的技术方案中，用到缓冲液而且是对脲酶有抑制作用的磷酸缓冲液，因此导致试剂失效。资料表明(冯仰婕等，一些抑制剂对脲酶反应速率的影响，应用化学，1994，11(3)：78-80；孙金艳单安山刘大森，脲酶抑制剂在畜牧生产上的应用，中国饲料，2004，(8)：24-25；李杰，葛蔚，反刍动物脲酶抑制剂的研究进展，东北农业大学学报，2004，35(1)：119~122)，脲酶受多种抑制剂抑制而失活，这就要求在配制其溶解液时特别小心。我们知道脲酶存在于无论是新鲜湿润的还是失水干燥的籽粒中，并不存在失活或者受抑制问题，否则籽粒就不能发芽了，这是生物进化过程中形成的脲酶天然保护机理，也就是说，籽粒的成分是合适的脲酶保护剂。这样只要简单地用纯水将籽粒粉混合成分和脲酶一起溶出共同固着在载体上，干燥后的混合成分便可像在籽粒内部一样起到保护脲酶活性的作用。
由于检测需要必须加入pH指示剂，实验证明，pH指示剂的引入并不影响脲酶活性。
5、指示剂选择原理：正常乳的pH范围是pH6.3-6.8，尿素的加入将使酶促反应后的pH超过6.8，因此，我们选择的pH指示剂其pKHIn也应该大于6.8。符合这个原则的部分指示剂如表1。
表1可供选择的pH指示剂
可以推测，在指示剂用量相当的情况下，指示剂的pKHIn越接近6.8，其检测灵敏度越高，因此，更换指示剂可以随国标要求调节尿素检测的灵敏度。
旧版的“鲜乳收购国家标准”中没有尿素检测标准，新版国标正在出台。因为尿素掺假乳普遍存在，在国标制定尿素标准是非常必要的。资料报道，正常乳尿素含量为21～34mg/100mL(J.S.jonker，R.A.kohn，R.A.Erdman，Using Milk Urea Nitrogen to Predict Nitrogen Excretionand Utilization Efficiency in Lactating Dairy Cows，Journal of DairyScience，1998，81(10)：2682-2692)，台湾DHI推荐的正常乳尿素氮含量为24～36mg/100mL(http://www.angrin.tlri.gov.tw/cow/dhi54/dhi54P49.htmH)。可见尿素检测试纸的检测下限不能低于36mg/100mL，否则会造成假阳性。
本发明在对几种pH指示剂筛选后，选苯酚红做指示剂，用其制作的尿素检测试纸灵敏度为50mg/100mL尿素，不会检出正常乳中的微量尿素，但也足够敏感。如果日后出台的国标要求的尿素检出浓度比此低，可以将指示剂换为溴百里酚蓝或者中性红，使检测灵敏度提高，从实验结果(见附图)可见，溴百里酚蓝指示剂的灵敏度为30mg/100mL，比苯酚红指示剂更为敏感；反之换成pKHIn更大的指示剂如酚酞，百里酚蓝等，使检测灵敏度降低。
下面结合附图对本发明举例说明
实施例1：刀豆-苯酚红试纸制备及其对尿素掺假乳的检测
1、尿素检测试纸制备：
1)指示剂溶液配制：用去离子水配制苯酚红或其钠盐的饱和溶液备用；
2)试纸原液制备：取刀豆8g磨粉，用100ml去离子水溶解，6层纱布过滤去渣，滤液待用；
3)将步骤1)、2)所得溶液等体积混合，即成试纸原液；
4)将定量滤纸浸入试纸原液中充分吸收饱和，沥去多余液汁，平铺在玻璃板上自然干燥，即成尿素检测试纸。
5)将尿素检测试纸裁剪成小方块，直接使用或者接上手执柄使用。
2、检测方法：
1)购买品牌纯乳，配制含有不同浓度尿素的掺假乳，尿素含量为0的乳即为阴性空白对照；
2)取本发明尿素检测试纸数张，分别蘸取不同浓度尿素掺假乳，观察，在数秒至数十秒之内，不同浓度尿素掺假乳呈现出不同深度的红色，显色结果如图1所示，图中数字代表模拟掺假乳中含尿素量(g/100mL)。显色时间与籽粒粉浓度与指示剂浓度有关，但不影响半定量检测结果。只要保持试纸湿润状态，颜色不褪。
实施例2：黄豆粉-苯酚红试纸制备及其对尿素掺假乳的检测
1、尿素检测试纸制备：
1)指示剂溶液配制：用蒸馏水配制苯酚红或其钠盐的饱和溶液，稀释至50％，待用；
2)试纸原液制备：取黄豆5g磨粉，加步骤1)制备的饱和度为50％的指示剂溶液100ml，混匀后自然沉降10-30分钟，取上层悬浊液即为试纸原液；
3)用大头毛笔蘸取试纸原液均匀涂刷在平铺于玻璃板上的定量滤纸上，使试纸充分渗透溶液，自然干燥，即成尿素检测试纸；
4)将尿素检测试纸裁剪成小块，直接使用或者接上手执柄使用。
2、检测：
1)对尿素掺假乳的检测与实施例1类似，只是用制备的黄豆粉-苯酚红试纸检测不同浓度尿素的掺假乳，显色结果如图2；
实施例3：芸豆粉-苯酚红试纸制备及其对尿素掺假乳的检测
同实施例1，将刀豆换成芸豆，同法制备尿素检测试纸；并用制备的芸豆粉-苯酚红试纸检测不同浓度尿素的掺假乳，显色结果如图3。
实施例4：黄豆粉-溴百里酚蓝试纸制备及其对尿素掺假乳的检测
同实施例2，将苯酚红指示剂换成溴百里酚蓝，其余方法同，制备的试纸为黄色。用制备的黄豆粉-溴百里酚蓝试纸检测不同浓度尿素的掺假乳，显色结果如图4。
本组照片只显示接近检测下限的情形，如果含量更高，其显色和本照片中最高浓度的颜色一致，此时，若需进行半定量，则要对待检原液进行稀释，直至显色度界于本显色卡颜色范围内才能进行比色半定量，原始含量为比色卡标准含量乘上稀释倍数。
Claims (5)
1.乳品中尿素检测试纸的制备方法，其特征在于：
1)试纸原液制备：取脲酶源粉与pKHIn大于6.8的pH指示剂固体或者其水溶液混合，用去离子水或纯水稀释使脲酶源粉含量为0.5％-10％，指示剂量为其对水饱和度的10％-100％，搅拌混匀后用50-100目筛或6-8层纱布过滤或静置自然沉降10-30分钟后，取滤液或自然沉降的上层悬浊液，即为试纸原液；
2)尿素检测试纸制备：将试纸原液通过涂敷、印刷或浸泡均匀固定在载体上并干燥，即成尿素检测试纸。
2.根据权利要求1所述的乳品中尿素检测试纸的制备方法，其特征在于：所述的脲酶源粉为刀豆粉、毛豆粉、豌豆粉、青豆粉、木豆粉、大豆粉、芸豆粉、四季豆粉、豇豆粉、扁豆粉、红豆粉、绿豆粉、西瓜籽粉或西葫芦籽粉。
3.根据权利要求1所述的乳品中尿素检测试纸的制备方法，其特征在于：所述的pKHIn大于6.8的指示剂为溴百里酚蓝、中性红、苯酚红、酚酞、百里酚蓝或百里酚酞。
4.根据权利要求1所述的乳品中尿素检测试纸的制备方法，其特征在于：所述的载体为不与试纸原液发生化学反应的可吸水性固相材料中的定性滤纸、定量滤纸或层析滤纸。
5.一种利用权利要求1所述的方法制备的乳品中尿素检测试纸检测乳品中尿素的方法，其特征在于：
1)查看待检乳是否酸败：在现场检测液态乳或固体乳的水溶液时，首先用普通pH测试法测试待检乳，查看其是否处于正常pH6.3-6.8范围内，若在此范围，则直接进行尿素检测，若pH低于6.3，则乳品己酸败；如pH高于6.8，乳品酸败后加碱而矫枉过正；pH不在6.3-6.8范围内，则原乳液为腐败变质乳，调节pH在6.3-6.8范围内再行尿素检测；
2)用尿素检测试纸蘸取待检乳液使其吸水浸润，观察颜色变化；
3)试纸若不变色属于合格乳，试纸若有颜色变化，则为尿素掺假乳，颜色深度与乳中尿素含量正相关，将所显颜色与标准比色卡对比，便可进行乳中尿素半定量测定；所述比色卡是尿素检测试纸在标准浓度的尿素乳液中形成的颜色呈现梯度变化的一组彩色图片。
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