CN106442506A - 一种快速检测豆浆生熟度的工艺 - Google Patents

Abstract

一种快速检测豆浆生熟度的工艺，包括以下步骤：制备试剂1：称取0.1g苯酚红粉末，加入1‑2mL摩尔浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液使苯酚红粉末溶解，再用蒸馏水定容至250mL，摇匀即可，苯酚红溶液的pKHIn值为6.8‑8.4；制备试剂2：用蒸馏水和尿素颗粒配制成质量浓度为5％‑10％的尿素溶液；制备试纸：将试剂1和试剂2按照1:1的比例混合均匀，将裁剪成条状的滤纸条完全浸没于该混合溶液中，浸泡吸收5‑10分钟后，用镊子夹取出，于通风处自然干燥，制成试纸，并避光密封于试纸罐中；试纸法豆浆脲酶活性的测定或者试剂法豆浆脲酶活性的测定，本发明能快速对豆浆中的脲酶活性进行检测。

Description

一种快速检测豆浆生熟度的工艺

技术领域

本发明属于豆浆生熟度检测工艺，具体为一种快速检测豆浆生熟度的工艺。

背景技术

近年来，豆浆作为与牛奶一样的蛋白质营养饮品，凭借其“优质植物蛋白来源”，越来越受到老百姓的喜爱。豆浆其营养丰富，含有丰富的优质大豆蛋白。大豆蛋白质氨基酸组成比例是植物性食物中最合理、最接近于人体所需比例的，属于优质蛋白质。世界卫生组织(WHO)1985年正式认可大豆蛋白质和优质动物蛋白相当。1999年，美国食品药物管理局(FDA)发布公告宣称，“每日摄取大豆蛋白25g可降低血液中的胆固醇含量，有效预防心血管病”。大豆蛋白质作为天然、健康食品的理念得到广泛认同。大豆蛋白相对于肉、鱼、牛奶等来源的蛋白质，价格较低，可解决贫困地区蛋白质缺乏的问题，同时也减少了动物蛋白带来的诸多弊病。豆浆不仅富含优质蛋白质，还含有不饱和脂肪酸、维生素和矿物质等多种营养成分，而且含有异黄酮、大豆皂甙、大豆低聚糖和卵磷脂等具有显著保健功能的特殊保健因子。

根据中国豆制品专业委员会的统计显示，我国每年豆浆的消费量约占传统豆制品消费总量的10％，2012年全国用于豆制品的大豆消费量约600万吨，豆浆的消费量为60万吨左右(该数据不包括消费者自制豆浆及散装豆浆)。并且现在世界上越来越多的国家已经注意到豆浆对健康的重要性，欧美等地区也在陆续开拓豆浆的市场。美国这样一个在过去很长时间内仅仅把大豆作为榨油原料的国家也已完全改变了看法，提倡多食用豆浆，以减少食用动物食品蛋白质带来的诸多弊病。

在豆浆日益受欢迎的同时，豆浆的安全问题备受消费者和社会各界的极大关注。豆浆中毒症状主要表现为腹痛、恶心，少数有低烧、呕吐和腹泻，有的伴有头晕等症状。现有不少关于学校集体食物中毒案件的报道，其中由于饮食豆浆而引起的中毒事件不在少数。2002年广东梅州嘉应大学的100多名学生因喝了食堂供应的豆浆而中毒，学生先后出现呕吐、头昏头痛、呼吸困难、胸闷等；前不久河北省舒城县千人桥镇30名学生因在校外喝过豆浆，先后发生呕吐反应等等。当地卫生局、卫生防疫站和医院进行调查发现中毒原因是豆浆未煮熟所致。

大豆营养物质很高，但也含有一些对营养物质有破坏作用或引起胃肠反应的化学物质，我们把它统称为抗营养因子(anti-nutritionalfactors，ANF)。这些物质在食用前必须经过处理后，大豆才能发挥有效的营养作用，也才能防止可能造成的危害。大豆中重要的抗营养物质有以下几种：植酸、蛋白酶抑制剂、皂角素、植物血球凝集素、棉子糖合成酶等。植酸广泛地存在于植物种子中，能与金属离子形成不溶性的植酸盐，从而影响了人们对矿物质的吸收。蛋白质酶抑制剂，可以抑制体内胰蛋白酶等十几种消化酶的流活性，其代表为脲酶、胰蛋白酶抑制剂等，它能抑制蛋白酶对蛋白质的消化吸收。皂角素，对消化道粘膜有强烈的刺激性，人吃了没有煮熟的大豆或豆浆，常会产生恶心、呕吐、腹泻等症状，就是由于皂角素没有完全破坏所引起。植物血球凝集素，可使人体细胞凝集，但加热即可被破坏，或在体内经蛋白酶作用也可使其失去活性，不致被肠道吸收后引起凝血。棉子糖合成酶，它进入人体后，可以合成大量低聚糖，如棉子糖、水苏糖等。这些糖不能被子人体吸收，大部分在肠中被细菌分解利用，同时产生大量二氧化碳、氢和甲烷。所以，多吃大豆后肚子容易胀气。以上这些大豆中的抗营养因子都是热敏型的抗营养因素，因此若采用恰当的加热方式可以将这些抗营养因子的危害大大降低。

豆浆中毒原因之一是由于不良商贩的黑心行为所造成，更重要的是由于豆浆存在“假沸”现象，即原料豆在豆浆机研磨下，产生大量的泡沫，一方面影响了豆浆间的热交换和热传导，使得豆浆并未在高温下持续均匀受热而使得其中的有毒物质未完全失活；另一方面由于“假沸”现象的误导，在豆浆还没达到煮沸温度就产生泡沫而提前结束加热。这些中毒事件都与抗营养因子(如脲酶、胰蛋白酶抑制剂等)未彻底灭活具有一定关系。

因为抗营养因子未完全破坏时会影响人体的正常生理代谢过程，使得豆浆及其它豆制品的市场利用率受到严重限制，甚至影响到其安全性和食品品质。同时这造成消费者的不信任心理，大大影响了其市场销量，因此如何准确判断出豆浆的生熟度尤为重要。不少的研究报告已证实,豆浆中脲酶的失活温度高于抗营养因子的失活温度，同时要分别检测这些抗营养因子的难度很高，有些抗营养因子甚至没有可行的检测方法，因此我们通过检测脲酶的活性可判断这些抗营养因子的失活情况，亦可作为判断豆浆生熟度的标准。

现有的脲酶活性检测方法只适用于在实验室内检验，生豆浆中脲酶活性含量很高,但因存放温度高低、时间长短容易导致其发生变化，更可因豆浆变质使脲酶破坏，从而难以判断原始豆浆样品的脲酶活性强弱。有研究表明，将脲酶阳性的85℃豆浆用保暖瓶存放半小时后浆温降至82℃，脲酶已经转阴；而将脲酶强阳性的80℃豆浆用保暖瓶保温150分钟后浆温降至75℃而脲酶也已转阴。因此豆浆采样、送验要求高，一般以低温快速为佳。市售豆浆现场采样的豆浆常为热的样品，故应在现场设法使浆样冷却，保温送验可致检验结果失真。实验室收到样品后也应低温放置并尽快及时检验，久置则可造成结果不准确。

因此脲酶现场快检技术的研发具有重要的意义，首先应用在食品监管上可以确保在采样源头对豆浆样品的脲酶活性进行定性分析，减少因运输和储藏过程不当导致结果的失真；其次对生产企业的产品质控可以快速检测、实时监控；同时可以家庭自制豆浆具有实际应用价值。因而若开发出脲酶现场快速检测试剂盒、试纸来应用到市场流通领域的抽检、超市、餐厅或校园周边、市街散卖以及家庭自制豆浆有毒性的检测，对于食品安全的监管、广大群众的食品安全保障具有重大意义。

目前脲酶的测定方法主要有国标纳氏试剂法、光电比色法、pH增值法、氨气敏电极法等。

国标法：是利用脲酶水解尿素产生的氨，在适当条件下能与纳氏试剂中的碘化钾汞复盐作用生成棕色的碘化双汞铵。国标法灵敏度较高，但过程复杂、耗时也较长且所用的试剂具有剧毒，只适宜于在专业的实验室内进行操作，因此不适合于用来快检。

光电比色法：原理同国标法，脲酶在一定条件下，可水解尿素生成铵，在碱性条件下，铵盐转化成为氨，其与纳氏试剂反应生成黄棕色络合物，其色度与脲酶活性成正比。采用光电比色法可定量测定脲酶活性的高低，其测定方法稳定性好，结果可靠，但整个操作耗时长，在2h左右，不便应用于现场试验。且由于酶活性受温度、时间影响较大，从定量考虑，操作过程从往样品中加入尿素、水浴保温至使脲酶灭活，水浴温度、时间一定要准确，否则容易失真。并且测定体系容易受到钙、镁、铁等因素的干扰。所以也不适合快检。

pH增值法：尿素被样品中的脲酶催化分解产生氨，导致溶液pH增加，增加的程度与脲酶活性大小呈正相关，因此可以用其与空白溶液的差值表示脲酶活性高低。陶顺兴等人利用pH计根据豆浆中脲酶催化尿素分解的原理测定豆浆pH值的变化的大小来判断生熟豆浆，虽然该法的操作较为简单，所用的试剂也少，但是该法的检出限较低，需要精密的pH计，不适合市面的广泛推广。

同时目前市面上也有在售的脲酶快检试剂盒，但是通过试验不难发现市售的脲酶快速检测试剂盒存在以下几个方面的问题：①有些试剂盒保质期较短；②有些在样品中加入试剂后的显色时间较长，有的甚至需要15-30分钟，不能达到快检的目的；③有些显色不明显，难以观察判定；④所用试剂有较强的腐蚀性，安全性不高。同时最重要的是目前市面上还没出现脲酶快检试纸，试纸不光在操作上还是安全性方面均比试剂加入法有明显的优势，这也是本发明专利的一大亮点。

现国内外关于脲酶快速检测技术的研究甚少，基本上也是在实验室中通过国标法对脲酶活性的测定，而市面上的快检试剂盒或多或少存在保质期时间短或者反应时间长或者试剂具有腐蚀性等缺点，并且脲酶快检试纸还尚未成熟。因而若开发出一种显色快速、明显，保质期长且低毒的脲酶快检试剂盒以及豆浆生疏度的快检试纸来应用到市场流通领域的抽检、超市、餐厅或校园周边、市街散卖以及家庭自制豆浆有毒性的检测，对于食品安全的监管、广大群众的食品安全保障具有重大意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测豆浆生熟度的工艺，解决背景技术中的问题。

本发明采用以下技术方案实现：

本发明拟在现有脲酶活性的国标测定方法基础上，根据尿素在脲酶的催化作用下生成碳酸铵，碳酸铵不稳定在常温下分解生成氨气使体系由中性变成碱性而使酸碱指示剂变色的原理，来建立一种新型快速、适用于豆浆中脲酶现场快速检测的新技术，其中包括脲酶活性现场快速检测试纸、试剂盒。反应过程如下：

(NH₄)₂CO₃+2NaOH→NaCO₃+NH₄OH

NH₄OH→NH₃+H₂O→酸碱指示剂变色

利用脲酶对尿素的催化分解成氨导致体系的pH升高，且在底物含量一定的条件下pH升高的快慢与脲酶的含量呈正比的原理，对豆浆中脲酶活性检测进行研究，通过选择合适的酸碱指示剂，优化试剂的配比，以及反应时间、反应温度等参数制定对脲酶活性强弱的判定依据，开发一种操作简便快捷、灵敏度低、能实现现场快速筛查毒豆浆的检测方法，同时创造性得制备了豆浆脲酶快速检测试纸，应用更为便捷。

一种快速检测豆浆生熟度的工艺，包括以下步骤：

S1：制备试剂1：称取0.1g苯酚红粉末，加入1-2mL摩尔浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液使苯酚红粉末溶解，再用蒸馏水定容至250mL，摇匀即可，苯酚红溶液的pKHIn值为6.8-8.4；

S2：制备试剂2：用蒸馏水和尿素颗粒配制成质量浓度为5％-10％的尿素溶液；

S3：制备试纸：将试剂1和试剂2按照1:1的比例混合均匀，将裁剪成条状的滤纸条完全浸没于该混合溶液中，浸泡吸收5-10分钟后，用镊子夹取出，于通风处自然干燥，制成试纸，并避光密封于试纸罐中；

S4：试纸法豆浆脲酶活性的测定：用1mL的一次性塑料吸管吸取待测样品滴2～3滴样品于试纸上，若该样品为未煮熟的生豆浆，则其中的脲酶会催化试纸上附着的尿素产生氨气，而氨气溶于样品溶液中致使溶液pH增高，而使试纸上的苯酚红变色，同时变化后的颜色随着豆浆的生熟度而不同，越生的豆浆脲酶活性越强，试纸变色得越快颜色也越红；而脲酶活性为弱阳性的豆浆，试纸变色得越慢，颜色也越浅；其中反应过程如下：

(NH₄)₂CO₃+2NaOH→NaCO₃+NH₄OH

NH₄OH→NH₃+H₂O→酸碱指示剂变色。

本发明中，试纸法豆浆脲酶活性的测定过程中，对试纸的读取应该在20min内完成。

一种快速检测豆浆生熟度的工艺，包括以下步骤：

S1：制备试剂1：称取0.1g苯酚红粉末，加入1-2mL摩尔浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液使苯酚红粉末溶解，再用蒸馏水定容至250mL，摇匀即可，苯酚红溶液的pKHIn值为6.8-8.4；

S2：制备试剂2：用蒸馏水和尿素颗粒配制成质量浓度为5％-10％的尿素溶液；

S3：试剂法豆浆脲酶活性的测定：用1mL的一次性塑料吸管吸取1mL豆浆试样于2mL的一次性塑料离心管中，先滴加1滴试剂1，振摇均匀，观察豆浆颜色；再滴加1滴试剂2；振摇均匀，观察豆浆颜色变化，记录滴加试剂2后豆浆的颜色由黄变为玫红色的时间；对照环境的温度以及豆浆变色所需要的时间，可以直接读取该豆浆的脲酶活性强弱；脲酶活性越强，颜色变化越迅速，活性越弱，颜色变化越慢，且脲酶阴性的样品不变色，其中反应过程如下：

(NH₄)₂CO₃+2NaOH→NaCO₃+NH₄OH

NH₄OH→NH₃+H₂O→酸碱指示剂变色。

有益效果：本发明通过研究发现，豆浆中的脲酶能催化尿素形成氢氧化铵，从而使苯酚红指示剂由黄色变为红色，颜色与脲酶的活性成正相关。本发明基于上述研究，做出了一种用快速检测豆浆中脲酶活性的试剂盒和试纸，该试剂盒和试纸可适用于检测豆浆生熟度的重要指标为脲酶活性，为脲酶活性的快速检测提供了一种新方法。本发明的试剂盒和试纸可现场操作，无需其他特殊试剂和仪器，通过对比显色卡，能在一分钟左右得出检测结果，相比于国标方法所用仪器试剂多、步骤繁杂，本发明具有方便、直观、快速等优点，能够帮助使用者迅速判断出豆浆中的脲酶活性。本发明的试剂盒和试纸在常温下就可以使用，在温度为20℃-40℃的条件下使用效果最好，而相比于国标方法需要在40℃水浴中保温20min，以及其他快检方法需要用手捂热15min以上，本发明的使用更加简便。本发明通过研究发现，试剂盒对脲酶活性检测的灵敏度高，相比于其他快速检测方法，苯酚红显色更加明显，检测脲酶活性为：强阳性、次强阳性、阳性、弱阳性、阴性的不同样品时，颜色有明显差别，即使将生豆浆稀释至0.1％时，用国标法验证为脲酶弱阳性，仍能清楚地辨别出颜色的不同，说明该试剂盒具有较高的准确性和灵敏性。本发明的试剂盒和试纸制备方法简单，易于操作，适合大批量的生产，而且无需通过特殊的方法进行保存，在常温干燥条件保存即可。试纸的保质期较长，能达到一年以上。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合实例，进一步阐述本发明。

实施例1

制备试剂1：通过对比不同的酸碱指示剂，根据豆浆pH范围一般为6.5-7.5，因此选择pKHIn值为6.8～8.4的苯酚红溶液来作为指示剂。当样品溶液的pH由酸性变成碱性时，溶液的颜色为黄色变为红色，且颜色的转变很明显。该指示剂溶液的配制为：称取0.1g左右苯酚红粉末，加入1～2mL 0.1mol/L氢氧化钠溶液使苯酚红粉末溶解，再用蒸馏水定容至250mL，摇匀即可；制备试剂2：5％～10％尿素溶液。用蒸馏水配制即可；制备试纸：将适量尿素粉末溶解于苯酚红溶液中，完全溶解后摇匀，或者分别将配制好的尿素溶液和苯酚红溶液按一定比例混合，将裁剪成条状的滤纸条完全浸没于该混合溶液中。浸泡吸收5～10分钟后，用镊子夹取出，于通风处自然干燥，制成试纸，并避光密封于该试剂盒中的试纸罐中；试纸法豆浆脲酶活性的测定：试纸上附着有苯酚红和尿素的混合试剂，在使用试纸时，用提供的1mL一次性塑料吸管吸取待测样品滴2～3滴样品于试纸上。若该样品为未煮熟的生豆浆，则其中的脲酶会催化试纸附着的尿素产生氨气，而氨气溶于样品溶液中致使溶液pH增高，而使试纸上的苯酚红变色。同时变化后的颜色随着豆浆的生疏度而不同，越生的豆浆脲酶活性越强，试纸变色得越快颜色也越红；而脲酶活性为弱阳性的豆浆，试纸变色得越慢，颜色也越浅。根据试纸的颜色对照试剂盒中提供的比色卡，读取豆浆的脲酶活性强弱。脲酶活性越强，则豆浆越生，毒性越大。例如实验中分别取不同脲酶活性的豆浆试样滴在试剂盒中提供的快检试纸上，观察试纸的颜色变化，根据试纸变化后的颜色对照比色卡的颜色，可以直观地读取出不同豆浆样品的脲酶活性强弱，但是值得注意的是，生成的氨气有挥发性，当试纸上的水分挥干后，变红色的部分会褪色重新呈黄色，而使实验失真，因此，在使用试纸法对豆浆脲酶活性进行测试时，应在20min 内完成对试纸颜色的读取，时间延长或者试纸干燥后颜色会褪去，从而影响结果的判断。

实施例2

制备试剂1：通过对比不同的酸碱指示剂，根据豆浆pH范围一般为6.5-7.5，因此选择pKHIn值为6.8～8.4的苯酚红溶液来作为指示剂。当样品溶液的pH由酸性变成碱性时，溶液的颜色为黄色变为红色，且颜色的转变很明显。该指示剂溶液的配制为：称取0.1g左右苯酚红粉末，加入1～2mL 0.1mol/L氢氧化钠溶液使苯酚红粉末溶解，再用蒸馏水定容至250mL，摇匀即可；制备试剂2：5％～10％尿素溶液。用蒸馏水配制即可；试剂法豆浆脲酶活性的测定：用试剂盒中1mL的一次性塑料吸管吸取1mL豆浆试样于提供的2mL一次性塑料离心管中，先滴加1滴试剂1，振摇均匀，观察豆浆颜色。再滴加1滴试剂2，振摇均匀，观察豆浆颜色变化，记录滴加试剂2后豆浆的颜色由黄变为玫红色的时间。参见表1，不同温度下不同脲酶活性豆浆的显色时间卡，根据试剂盒中提供的显色时间卡，对照环境的温度以及豆浆变色所需要的时间，可以直接读取该豆浆的脲酶活性强弱。活性越强，颜色变化越迅速，活性越弱，颜色变化越慢，且脲酶阴性的样品不变色。

表1：不同温度下不同脲酶活性豆浆的显色时间卡

例如，要测试一份豆浆样品的生熟度，可在20℃左右的室温条件下，加入试剂1摇匀后再加入试剂2后开始记录豆浆的颜色变化。若豆浆颜色变为玫红色需要的时间约1min，则根据表1可以读取该豆浆的脲酶活性为阳性，是一份未煮熟的豆浆，不得食用。根据国家标准，豆浆的脲酶活性只有为阴性时才是符合标准的，因此，若往豆浆样品中加入试剂1和试剂2后经过一段时间颜色变为玫红色，那则可以认为该豆浆的脲酶活性不符合国家标准，不得食用。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (3)

1.一种快速检测豆浆生熟度的工艺，其特征在于，包括以下步骤：

S1：制备试剂1：称取0.1g苯酚红粉末，加入1-2mL摩尔浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液使苯酚红粉末溶解，再用蒸馏水定容至250mL，摇匀即可，苯酚红溶液的pKHIn值为6.8-8.4；

S2：制备试剂2：用蒸馏水和尿素颗粒配制成质量浓度为5％-10％的尿素溶液；

S3：制备试纸：将试剂1和试剂2按照1:1的比例混合均匀，将裁剪成条状的滤纸条完全浸没于该混合溶液中，浸泡吸收5-10分钟后，用镊子夹取出，于通风处自然干燥，制成试纸，并避光密封于试纸罐中；

S4：试纸法豆浆脲酶活性的测定：用1mL的一次性塑料吸管吸取待测样品滴2～3滴样品于试纸上，若该样品为未煮熟的生豆浆，则其中的脲酶会催化试纸上附着的尿素产生氨气，而氨气溶于样品溶液中致使溶液pH增高，而使试纸上的苯酚红变色，同时变化后的颜色随着豆浆的生熟度而不同，越生的豆浆脲酶活性越强，试纸变色得越快颜色也越红；而脲酶活性为弱阳性的豆浆，试纸变色得越慢，颜色也越浅；其中反应过程如下：

(NH₄)₂CO₃+2NaOH→NaCO₃+NH₄OH

NH₄OH→NH₃+H₂O→酸碱指示剂变色。

2.根据权利要求1所述的一种快速检测豆浆生熟度的工艺，其特征在于，试纸法豆浆脲酶活性的测定过程中，对试纸的读取应该在20min内完成。

3.一种快速检测豆浆生熟度的工艺，其特征在于，包括以下步骤：

S1：制备试剂1：称取0.1g苯酚红粉末，加入1-2mL摩尔浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液使苯酚红粉末溶解，再用蒸馏水定容至250mL，摇匀即可，苯酚红溶液的pKHIn值为6.8-8.4；

S2：制备试剂2：用蒸馏水和尿素颗粒配制成质量浓度为5％-10％的尿素溶液；

S3：试剂法豆浆脲酶活性的测定：用1mL的一次性塑料吸管吸取1mL豆浆试样于2mL的一次性塑料离心管中，先滴加1滴试剂1，振摇均匀，观察豆浆颜色；再滴加1滴试剂2；振摇均匀，观察豆浆颜色变化，记录滴加试剂2后豆浆的颜色由黄变为玫红色的时间；对照环境的温度以及豆浆变色所需要的时间，可以直接读取该豆浆的脲酶活性强弱；脲酶活性越强，颜色变化越迅速，活性越弱，颜色变化越慢，且脲酶阴性的样品不变色，其中反应过程如下：

(NH₄)₂CO₃+2NaOH→NaCO₃+NH₄OH

NH₄OH→NH₃+H₂O→酸碱指示剂变色。