CN101396432B - 一种富集分离香椿叶黄酮类物质的方法 - Google Patents

一种富集分离香椿叶黄酮类物质的方法 Download PDF

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Abstract

一种双水相体系富集分离香椿叶黄酮类物质的方法，先将香椿叶干燥、粉碎，回流提取、除杂后得到香椿叶粗提液，浓缩后按比例加入硫酸铵和乙醇，加热，混匀，分为上、下两相，黄酮类物质主要分配在含乙醇的上相，并得到浓缩和纯化。将上、下两相分开后，下相降温、结晶、过滤，回收硫酸铵晶体；上相液加无水乙醇沉淀除去硫酸铵等残存杂质后回收乙醇，浓缩液真空干燥得产品。本方法的优点是分相迅速，过程集成，提高了黄酮类物质在上相的浓度和纯度；物耗降低，毒性小，乙醇和硫酸铵易回收利用；且香椿叶黄酮类物质的回收率高，生产方法简单，易于掌握，不受环境影响；成本低廉，适合产业化生产。

Description

一种富集分离香椿叶黄酮类物质的方法
技术领域
本发明属双水相体系富集分离香椿叶黄酮类物质的方法。
背景技术
香椿[Toona sinensis(A.Juss.)Roem]又名春芽树、椿、椿树，在《植物名实图考》中称为红椿，属楝科(Meliaceae)香椿属落叶乔木，是我国特有珍贵速生材、菜、药多用途树种，落叶乔木，树冠庞大，叶繁茂，树干通直，生长迅速。香椿具有很高的药用价值，《本草纲目》中指出，香椿的叶、芽、根、皮和果实均可入药。现代医学实验研究表明香椿叶提取物体内有调节脂质代谢、缓解高血糖症、增进精子活力、延缓肝纤维化、诱导癌细胞凋亡和抑制肉瘤生长等作用。此外香椿叶提取物还有体外抗氧化、抗菌和对害虫的毒杀、拒食或驱避活性等作用。香椿叶主要有效成分之一为黄酮类化合物，主要以苷的形式存在，已发现的黄酮类化合物主要有槲皮素-3-0-葡萄糖苷、槲皮素-3-0-鼠李糖苷、槲皮素-3-0-葡萄糖苷(6-1)鼠李糖、山萘酚-3-0-葡萄糖苷、山萘酚-3-0-阿拉伯糖、6，7，8，2′-四甲氧基-5，6′-二羟基黄酮、5，7-二羟基-8-甲氧基黄酮等，所含黄酮醇苷的苷元主要是槲皮素、山萘酚，与银杏叶所含黄酮苷元大致相同，而且同季节香椿叶中总黄酮苷元含量比银杏叶中的含量高出2-3倍。
黄酮类化合物具有广泛的生物活性，如保肝、抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化作用以及对心血管的作用和雌激素样作用。植物中黄酮类化合物现有的提取富集分离方法主要有有机溶剂萃取、大孔树脂吸附等方法，也有用双水相和超滤方法的报道。
目前用于富集分离黄酮类化合物的双水相体系，多是聚乙二醇(PEG)-盐双水相体系、聚乙二醇(PEG)-K2HPO4-H2O双水相体系、聚乙二醇(PEG)-硫酸铵-H2O双水相体系等；也有用环氧乙烷(EO)和用环氧丙烷(PO)的无规共聚物(EOPO)/混合磷酸钾(KHP)双水相体系、丙酮-K2HPO4双水相体系的。
高聚物与盐形成的双水相富集分离黄酮类物质时，黄酮类化合物在大分子高聚物相富集，为回收大分子高聚物，还需采用萃取或超滤的方法将黄酮类化合物中的大分子高聚物提出，不仅技术上比较麻烦，而且因大分子高聚物的价格较高，导致提取黄酮类物质的成本较高。用丙酮-K2HPO4双水相体系富集分离黄酮类物质时，黄酮类化合物在丙酮相富集，丙酮虽是小分子，相对大分子高聚物也较易回收，但丙酮有低毒且价格贵，残存在产物中影响产品的安全。因此有必要研究一种产品的安全性高、生产成本低的富集分离黄酮类物质的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种产品的安全性高、生产成本低、适合产业化开发的富集分离香椿叶黄酮类物质的方法。
本发明以如下技术方案解决上述技术问题：
将香椿叶干燥、粉碎、乙醇回流提取、过滤除杂浓缩得香椿叶粗提液的浓缩液，用双水相体系富集分离此浓缩液中的黄酮类物质，上相液处理后真空干燥得到香椿叶黄酮类物质；其特征是取上述香椿叶粗提液的浓缩液，按以下比例加入硫酸铵和乙醇：浓缩液体积占浓缩液和乙醇体积之和的70～90％；液体体积mL∶硫酸铵质量g为100∶15～31；加热至40℃～45℃，混匀，静置1～3h，分为上、下两相，将上相、下相分开，下相降温、结晶，过滤得硫酸铵晶体供循环使用；上相液加无水乙醇沉淀除残存杂质后回收乙醇，上清液浓缩真空干燥即得香椿叶黄酮类物质。
应用乙醇-硫酸铵双水相富集分离香椿叶黄酮类化合物，具有明显的优点：
(1)分相迅速
在实验中观察到，采用乙醇-硫酸铵双水相富集分离法，香椿叶粗提液的浓缩液、硫酸铵和乙醇按合适比例加入加热，混匀后，约10分钟左右即可分相(不需要离心分离)，且没有乳化层，缩短了实验周期。
(2)过程集成
乙醇-硫酸铵双水相富集分离既达到了初步纯化的目的，又浓缩了料液。表现为杂质(如亲水性物质糖、蛋白质等)进入下相，黄酮类物质富集在上相，上相较原始处理液减少，黄酮浓度和纯度都提高。
(3)降低物耗
本发明方法用乙醇作为双水相的有机溶剂，毒性小，乙醇和硫酸铵容易回收利用，大大降低了原材料的消耗。
(4)用本发明的方法香椿叶黄酮类物质的回收率高，生产方法简单，易于掌握，不受环境影响；成本低廉，适合产业化生产。
具体实施方式
在用双水相富集分离黄酮类化合物技术中，被广泛使用的富集相大分子高聚物，不仅较难与黄酮类化合物分离，而且大分子高聚物的售价一般都比较高，不利于降低成本。现有技术中也有用丙酮作富集相，丙酮虽是小分子，也较易回收，但丙酮有低毒且价格较高，易发生产品的安全问题。
乙醇是小分子，沸点低易回收且毒性小，应用乙醇-硫酸铵双水相，用乙醇作为双水相的有机溶剂，乙醇和硫酸铵可以回收利用，成本低廉，操作简单。用本发明的方法，香椿叶黄酮类物质富集分离在上相乙醇相，上相液加无水乙醇沉淀除去硫酸铵等残存杂质后上层清液旋转真空蒸发回收乙醇、真空干燥即可得香椿叶黄酮类物质成品；下相液冷却结晶过滤得硫酸铵晶体供循环使用。
在提取香椿叶获得粗提液时可用超声波、微波等外场或相关酶如纤维素酶或果胶处理，提取效果更佳。
香椿叶粗提液的浓缩液按以下比例加入硫酸铵和乙醇：粗提液的浓缩液体积占浓缩液和乙醇体积之和的70～90％；液体体积mL∶硫酸铵质量g为100∶15～31；加热、混匀、静置后分为上、下两相，黄酮类物质主要分配在含乙醇的上相，并得到浓缩和纯化；将上相、下相分开，下相降温、结晶、过滤，所得硫酸铵晶体供循环使用；上相液加3～5倍体积无水乙醇沉淀除去硫酸铵等残存杂质后旋转真空蒸发回收乙醇循环使用，所得浓缩液真空干燥即可得香椿叶黄酮类物质。
实施例1：
(1)香椿叶黄酮类物质的提取
香椿叶烘干、粉碎，以料液比1∶9(g/mL)加入Φ(C2H5OH)＝70％乙醇溶液，回流提取4次，每次1.5h，过滤除杂后得到香椿叶粗提液，真空浓缩至原体积的约1/6得浓缩液。
(2)香椿叶黄酮类物质的双水相富集分离
取香椿叶浓缩液9mL，加入硫酸铵3.1g和乙醇1mL混匀，45℃水浴2h，期间不断振摇，分相后趁热分开上下相，冷却至室温量取上下相体积，分别为3.36mL和8.00mL，相比(上下相体积比，下同)0.420。分别测定(分光光度法，下同)上相液的黄酮浓度为7380.110mg/L，下相液的黄酮浓度为259.434mg/L，黄酮在上下相的分配系数为28.447，总黄酮的收率达92.28％。将下相降温、结晶，过滤，过滤所得硫酸铵晶体供循环使用。
(3)上相液用无水乙醇纯化、浓缩、干燥得成品
将上相液加5倍体积无水乙醇沉淀除去硫酸铵等残存杂质后，上层清液旋转真空蒸发回收乙醇循环使用，所得浓缩液70℃下真空干燥即得到香椿叶黄酮类物质成品(0.1514g)。实施例2：
(1)香椿叶黄酮类物质的提取
香椿叶烘干或阴干、粉碎，以料液比1∶9(g/mL)加入Φ(C2H5OH)＝70％乙醇溶液，回流提取4次，每次1.5h，过滤除杂后得到香椿叶粗提液，真空浓缩至原体积的约1/6得浓缩液，测定浓缩液黄酮浓度为3238.011mg/L。
(2)香椿叶黄酮类物质的双水相富集分离
取香椿叶浓缩液16mL，加入硫酸铵5.2g和乙醇4mL混匀，40℃水浴3h，期间不断振摇，分相后趁热分开上下相，冷却至室温量取上下相体积，分别为10.00mL和12.20mL，相比0.820。测定上、下相液的黄酮浓度分别为4520.44mg/L和156.053mg/L，黄酮在上下相的分配系数为28.967，总黄酮的收率达95.96％。将下相降温、结晶，过滤，所得硫酸铵晶体供循环使用。
(3)上相液加无水乙醇纯化、浓缩、干燥得成品
将上相液加4倍体积无水乙醇沉淀除去硫酸铵等残存杂质后，上层清液旋转真空蒸发回收乙醇循环使用，所得浓缩液60℃下真空干燥即得到香椿叶黄酮类物质成品(0.2958g)。实施例3：
(1)香椿叶黄酮类物质的提取
香椿叶阴干、粉碎，称取20g，以料液比1：12加入70％的乙醇溶液，在80℃下每次微波提取20min，提取4次。过滤除杂后得到香椿叶粗提液，真空浓缩至原体积的约1/6得浓缩液。
(2)香椿叶黄酮类物质的双水相富集分离
取香椿叶浓缩液7mL，加入硫酸铵2.0g和乙醇3mL，45℃水浴2h，期间不断振摇，分相后趁热分开上下相，冷却至室温量取上下相体积，分别为6.30mL和4.50mL，相比1.400。测得上、下相液的黄酮浓度分别为3370.676mg/L和52.003mg/L，黄酮在上下相的分配系数67.12。总黄酮的收率达98.95％。将下相降温、结晶，过滤，所得硫酸铵晶体供循环使用。
(3)上相液用无水乙醇纯化、浓缩、干燥得成品
将上相液加3倍体积无水乙醇沉淀除去硫酸铵等残存杂质后，上层清液旋转真空蒸发回收乙醇循环使用，所得浓缩液65℃下真空干燥即得到香椿叶黄酮类物质成品(0.1429g)。
本发明基于以下发现：香椿叶黄酮类物质在乙醇-硫酸铵双水相系统中分配的极大不对称性，表1给出了香椿叶黄酮类物质在乙醇-硫酸铵双水相中的分配数据。双水相体系萃取分离技术的原理是：香椿叶黄酮类物质在双水相体系中的选择性分配。香椿叶黄酮类物质进入双水相体系后，在上相和下相间进行选择性分配.表现出一定的分配系数。香椿叶黄酮类物质对乙醇具有亲和性，使香椿叶黄酮类物质更易分配在富含乙醇的上相，而一些杂质如糖类、蛋白质等分配在下相，香椿叶黄酮类物质的分配系数在试验范围内大于14，回收率在86％～98.9％之间。
表1香椿叶黄酮类化合物在乙醇-硫酸铵双水相中的分配行为
Figure G2008100738369D00051
表中：R＝Vt/Vb，K＝ρt/ρb，G＝K(Vt/Vb)＝RK，Y＝(1+1/RK)-1×100％＝(1+1/G)-1×100％。
式中：R---相比；Vt—上相体积，mL；Vb---下相体积，mL；K---香椿叶黄酮在双水相体系中的分配系数；ρt---上相香椿叶黄酮的质量浓度，mg/mL；ρb---下相香椿叶黄酮的质量浓度，mg/mL；G---香椿叶黄酮在上下相的质量比；Y---得率，％(分离后，上相黄酮质量百分数+下相黄酮质量百分数＝1)。
因此，经上述固液提取、乙醇-硫酸铵双水相系统富集分离、无水乙醇沉淀等过程的处理，使香椿叶黄酮类物质得到浓缩和提纯.最终得到质量高、收率高、成本低的香椿叶黄酮类物质的成品。

Claims (1)

1.一种富集分离香椿叶黄酮类物质的方法，将香椿叶干燥、粉碎、乙醇回流提取、过滤除杂浓缩得香椿叶粗提液的浓缩液，用双水相体系富集分离此浓缩液中的黄酮类物质，上相液处理后真空干燥得到香椿叶黄酮类物质；其特征是取上述香椿叶粗提液的浓缩液，按以下比例加入硫酸铵和乙醇：浓缩液体积占浓缩液和乙醇体积之和的70～90％；液体体积mL∶硫酸铵质量g为100∶15～31，加热至40℃～45℃，混匀，静置1～3h，分为上、下两相，将上相、下相分开，下相降温、结晶，过滤得硫酸铵晶体供循环使用；上相液加无水乙醇沉淀除残存杂质后回收乙醇，上清液浓缩真空干燥即得香椿叶黄酮类物质。
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