CN101395271A - 天冬氨酸转氨酶基因和l-膦丝菌素的制备方法 - Google Patents

天冬氨酸转氨酶基因和l-膦丝菌素的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于提供一种新的天冬氨酸转氨酶(AAT)基因和高效的L－膦丝菌素的制备方法。根据本发明，提供了由序列号1的DNA序列或其改变序列组成的多核苷酸和利用增强了AAT活性的放线菌制备L－膦丝菌素的方法。

Description

天冬氨酸转氨酶基因和L-膦丝菌素的制备方法
技术领域
本发明涉及天冬氨酸转氨酶及其基因，以及L-膦丝菌素的制备方法。本发明还涉及用于使转氨酶基因表达的重组载体和导入了该载体的宿主。
背景技术
L-膦丝菌素是双丙氨酰膦的构成成分，是一种具有除草活性的物质(Tachibana，K.，J.pesticide Sci.，11:27-31，1986)。本发明者们迄今为止，已经构建了在氨基供给体的存在下，通过利用微生物所具有的转氨酶的作用，将4-(羟甲基氧膦基)-2-氧代-丁酸(以下有时也称为“OMPB”)转化为L-膦丝菌素的技术(日本专利第2638541号公报)，并且，还建立了通过利用L-膦丝菌素转氨酶基因，减少所使用的微生物的菌体量(培养液量)的技术(特开平2-195889号公报)。
通过这样的微生物转化(酶转化)进行的L-膦丝菌素的制备方法中，一般使用与OMPB等量(或等摩尔量)的谷氨酸和天冬氨酸。这是因为，在只使用谷氨酸时，反应达到平衡，以50％的理论转化率结束，一起使用谷氨酸和天冬氨酸时，天冬氨酸的氨基转移到由于谷氨酸的脱氨所产生的α-酮戊二酸上，反应连续进行，可以获得高转化率。此时，由天冬氨酸的脱氨而产生的草酰乙酸在通常的反应温度(例如37℃)下容易脱羧，形成丙酮酸，排出于反应系统之外，因此对收率没有影响。
另一方面，在制备L-膦丝菌素作为除草剂，并进行售卖时，希望其制备费用明显便宜。具体而言，主要的问题在于要提高由原料OMPB向L-膦丝菌素的转化率(至少90％以上)，并减少作为氨基供给体的谷氨酸和天冬氨酸使用量。作为用于解决此问题的一种手段，在日本专利3018261号公报的实施例4中，公开了通过混合使用大肠杆菌K-12来源的L-膦丝菌素转氨酶和猪来源的GOT(天冬氨酸转氨酶)，即使在减少了谷氨酸的底物(OMPB(HMPB):谷氨酸:天冬氨酸＝1:0.2:1)中也可以合成L-膦丝菌素。但是这种技术，向L-膦丝菌素的转化率最高也只有86％，并不能满足工业目的的收率，而且使用了难以便宜地大量采购的猪来源的酶，因此可以说该技术是一种实质上难以实用化的技术。作为另一种方法，还公开了以天冬氨酸作为直接的氨基供给体的转氨酶(特表2003-528572号公报)。但是该技术由于只使用OMPB和天冬氨酸作为底物，因此具有完全不使用谷氨酸的优点，但是最高的转化率仅为约75％，可以说在工业上而言此结果是不充分。
因此，现在，通过微生物(或酶)制备L-膦丝菌素的方法中，主要的问题在于要更加提高由原料OMPB向L-膦丝菌素的转化率并从标准的底物(即，OMPB:谷氨酸:天冬氨酸＝1:1:1)中减少谷氨酸，现在迫切希望解决这些问题。
发明的概述
本发明者们从吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)中分离出编码天冬氨酸转氨酶(以下有时也称为“AAT”)的新基因，用含有该基因的表达载体转化吸水链霉菌，将获得的转化体的AAT活性与亲本株的AAT活性进行比较的结果是，发现其活性为亲本株的约47倍(实施例3)。在使用该AAT活性增强株制备L-膦丝菌素时，显示出97％这样的比使用比较对照株时更高的转化率，而且，即使在减少了谷氨酸的底物(OMPB:谷氨酸:天冬氨酸＝1:0.25:1)中也显示出90.1％的高转化率(实施例4)。而且，通过在吸水链霉菌中使L-膦丝菌素转氨酶(以下有时也称为“PAT”)的一种AT-II和AAT共表达，制备出PAT活性和AAT活性均增强的菌株，将获得的转化体的AAT活性和PAT活性与亲本株相比较，其结果发现，PAT活性为亲本株的约16倍，AAT活性为亲本株的约170倍(实施例5)。使用该AAT和PAT活性增强株制备L-膦丝菌素时，显示出与使用比较对照株相比，为95.3％的高转化率，而且即使在减少了谷氨酸的底物(OMPB:谷氨酸:天冬氨酸＝1:0.25:1)中也显示出95.5％这样的极高的转化率(实施例6)。本发明基于这些认识而完成。
本发明的目的在于提供AAT基因和AAT蛋白质。
本发明目的还在于提供可以使目的基因高表达的启动子。
本发明的目的还在于提供用于将AAT基因导入宿主的重组载体和导入了AAT基因的宿主。
本发明的目的还在于提供以高转化率制备L-膦丝菌素的方法。
根据本发明，提供了选自以下的(i)、(ii)、(iii)和(iv)的多核苷酸：
选自以下(i)、(ii)、(iii)和(iv)的多核苷酸：
(i)由序列号1所示的碱基序列组成的多核苷酸；
(ii)由序列号1所示的碱基序列中缺失、替换、插入或添加了1个或多个核苷酸的碱基序列组成的、且编码具有AAT活性的蛋白质的多核苷酸；
(iii)在严格条件下与序列号1所示的碱基序列杂交、且编码具有AAT活性的蛋白质的多核苷酸；和
(iv)含有与由序列号1所示的碱基序列组成的多核苷酸具有至少90％的同一性的碱基序列、且编码具有AAT活性的蛋白质的多核苷酸。
根据本发明，提供了选自以下的(v)、(vi)、(vii)和(viii)的蛋白质(以下有时也称为“根据本发明的蛋白质”)：
(v)由序列号2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(vi)由序列号2所示的氨基酸序列中缺失、替换、插入或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的、且具有AAT活性的蛋白质；
(vii)由与编码序列号2所示的氨基酸序列的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸所编码的、且具有AAT活性的蛋白质；和
(viii)由与序列号2所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列组成的、且具有AAT活性的蛋白质。
根据本发明，还提供了编码根据本发明的蛋白质的多核苷酸。(将该多核苷酸和前述的选自(i)、(ii)、(iii)和(iv)的多核苷酸合起来，有时也称为“根据本发明的AAT基因”。)
根据本发明，提供了选自以下的(ix)、(x)、(xi)和(xii)的多核苷酸(以下有时也称为“根据本发明的启动子”)：
(ix)由序列号3所示的碱基序列组成的多核苷酸；
(x)由序列号3所示的碱基序列中缺失、替换、插入或添加了1个或多个核苷酸的碱基序列组成的、且具有启动子活性的多核苷酸；
(xi)在严格条件下与序列号3所示的碱基序列杂交且具有启动子活性的多核苷酸；和
(xii)含有与序列号3所示的碱基序列组成的多核苷酸具有至少95％的同一性的碱基序列、且具有启动子活性的多核苷酸。
根据本发明，提供了含有根据本发明的AAT基因的重组载体(以下，有时也称为“根据本发明的第一种方案的重组载体”)。
根据本发明，提供了由根据本发明的第一种方案的重组载体转化的宿主(以下，有时也称为“根据本发明的第一种方案的宿主”)。
根据本发明，提供了含有根据本发明的AAT基因和编码具有PAT活性的蛋白质的多核苷酸(以下有时也称为“PAT基因”)的重组载体(以下，有时也称为“根据本发明的第二种方案的重组载体”)。
根据本发明，提供了由根据本发明的第二种方案的重组载体转化的宿主(以下，有时也称为“根据本发明的第二种方案的宿主”)。
根据本发明，提供了制备式(I)：
[化学式1]
Figure A200780007518D00101
所示的L-膦丝菌素或其盐的方法，其特征在于：该方法包括在谷氨酸或其盐和天冬氨酸或其盐的存在下，使式(II)：
[化学式2]
Figure A200780007518D00111
所示的4-羟基甲基氧膦基-2-氧代-丁酸或其盐与显示出AAT活性和PAT活性，且能够产生L-膦丝菌素的放线菌相接触的步骤，使用的放线菌显示出超过亲本株的AAT活性的活性(以下有时也称为“根据本发明的第一种方案的方法”)。
根据本发明，提供了制备式(I)：
[化学式3]
Figure A200780007518D00112
所示的L-膦丝菌素或其盐的方法，其特征在于：包括在谷氨酸或其盐和天冬氨酸或其盐的存在下，使式(II)：
[化学式4]
Figure A200780007518D00113
所示的4-羟基甲基氧膦基-2-氧代-丁酸或其盐与显示出AAT活性和PAT活性且能够产生L-膦丝菌素的放线菌相接触的步骤，使用的放线菌显示出超过亲本株的AAT活性的活性，且显示出超过亲本株的PAT活性的活性(以下有时也称为“根据本发明的第二种方案的方法”)。
附图的简要说明
图1是表示含有AAT基因的约5.8Kbp的限制性酶图谱的图。
图2是表示构建表达载体pLG04的图。
图3是表示构建表达载体pSG11的图。
图4是表示构建质粒pATSG01的图。
图5是表示构建表达载体pAHSG7201的图。
发明的具体说明
[微生物的保藏]
本发明中使用的吸水链霉菌SF1293 NP-50株于1987年5月20日提交给独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(
Figure A200780007518D0012140606QIETU
305-8566日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)进行保藏。保藏号为FERM BP-1368。
本发明中使用的吸水链霉菌SF1293株于1982年5月19日提交给独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(
Figure A200780007518D0012100201QIETU
305-8566日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)进行保藏。保藏号为FERM BP-130。
被质粒pSG11转化的放线菌(变铅青链霉菌(Streptomyceslividans))(实施例3(1))于2006年2月1日提交给独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(
Figure A200780007518D0012140639QIETU
305-8566日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)进行保藏。保藏号为FERM BP-10495。
被质粒pMSB515转化的放线菌(变铅青链霉菌)于1989年6月30日提交给独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(
Figure A200780007518D0012140702QIETU
305-8566日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)进行保藏。保藏号为FERM BP-2496。
被质粒pAHSG7201转化的放线菌(变铅青链霉菌)(实施例5(1))于2006年2月1日提交给独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(305-8566日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)进行保藏。保藏号为FERM BP-10496。
[AAT基因和AAT蛋白质]
根据本发明的AAT基因只要其编码的蛋白质具有AAT活性即可，对其来源没有特别的限制，但优选来源于放线菌，尤为优选来源于吸水链霉菌。
在本申请说明书中，所谓“多核苷酸中缺失、替换、插入或添加了1个或多个核苷酸”和“氨基酸序列中缺失、替换、插入或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列”是指通过定点诱变法等公知的方法，或通过可天然产生的程度的多个核苷酸或氨基酸的替换等发生改变。核苷酸和氨基酸改变的个数为1个或多个(例如，1个至几个或1、2、3或4个)。
作为改变的碱基序列的例子，可以列举具有1个或多个(例如，1个至几个或1、2、3、或4个)对AAT活性没有影响的变异的序列号1中记载的碱基序列。
作为改变的氨基酸序列的例子，可以列举具有1个或多个(例如，1个至几个或1、2、3、或4个)对AAT活性没有影响的变异的序列号2中记载的氨基酸序列。
此处所谓“AAT活性”定义为AAT催化将L-天冬氨酸的氨基转移到α-酮戊二酸上，产生L-谷氨酸和草酰乙酸的反应(或其逆反应)的能力。更具体的是，定义为混合AAT活性测定用底物(150mM天冬氨酸、50mMα-酮戊二酸、0.1mM磷酸吡哆醛、100mM Tris-HCl缓冲液；pH8.5)和AAT，于37℃，温育20分钟后，停止反应，通过氨基酸分析用HPLC(model LC-VP、岛津制作所社制)分析生成的谷氨酸的量而求出的酶活性(以1分钟生成1μmol的谷氨酸的能力为1U(单位))。
本发明中，评价微生物所产生的AAT活性时，理想的是以比活性(U/mg)作为指标进行评价。
通过AAT活性(U)除以蛋白质量(例如，可以用蛋白质检测试剂盒(protein assay kit)(Bio-Rad公司制)，以γ-球蛋白作为标准品测定)求出比活性(U/mg)。
另外，作为“对活性没有影响的变异”的例子，可以列举保守的替换。这里，所谓“保守的替换”是指，用其它的化学上类似的氨基酸残基替换1个或多个氨基酸残基使得蛋白质活性基本不改变。例如，可以列举某个疏水性残基被其它疏水性残基替换的情况，某个极性残基被其它具有相同电荷的极性残基替换的情况等。可以进行这种替换的功能类似的氨基酸是对于每一个氨基酸而言，在本领域中都是公知的。若要举具体的例子，作为非极性(疏水性)氨基酸，可以列举丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸等。作为极性(中性)氨基酸，可以列举甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。作为带有正电荷(碱性)的氨基酸，可以列举精氨酸、组氨酸、赖氨酸等。而且，作为带有负电荷的(酸性)氨基酸，可以列举天冬氨酸、谷氨酸等。
本申请说明书中所谓“严格条件”是指在高温下低盐浓度溶液中进行杂交后的膜的清洗操作，例如0.5×SSC浓度(1×SSC：15mM柠檬酸三钠、150mM氯化钠)、60℃、15分钟的清洗条件，优选0.5×SSC浓度、0.1％SDS溶液中，于60℃、15分钟的清洗条件。
杂交可以按照公知的方法进行。而且，使用市售的文库时，可以按照附带的使用说明书中记载的方法进行。
本申请说明书中，对于碱基序列或氨基酸序列的所谓“同一性”是指，所比较的序列之间，构成各个序列的碱基或氨基酸残基的一致的程度。本说明书中所示的“同一性”的数值，可以是本领域技术人员用公知的同源性检索程序计算出的数值，例如通过使用FASTA、BLAST等中默认(初期设定)的参数，可以容易地算出。
本发明中，只要给出了序列号2所示的氨基酸序列，就可以容易地确定编码其的多核苷酸，选择编码序列号2所示的氨基酸序列的各种多核苷酸。
因此，所谓编码序列号2所示的氨基酸序列的多核苷酸，除了序列号1所示的DNA序列的一部分或全部，还指具有编码相同的氨基酸的DNA序列的处于简并关系的密码子作为DNA序列的序列。而且还包括它们所对应的RNA序列。
作为编码序列号2所示的氨基酸序列的多核苷酸的优选例子，可以列举由序列号1所示的碱基序列组成的多核苷酸。
[启动子序列]
根据实施例3，对于在分离自吸水链霉菌的AAT基因的全长序列中，通过用含有BamHI～XhoI片段的表达载体转化的宿主，研究AAT活性，结果其活性是亲本株的47倍。这比通过含有PstI～XhoI片段的表达载体转化的宿主中的活性明显高很多。由此发现，AAT基因的启动子区域中，转录起始点至上游的BamHI位点的序列起到强力的启动子作用。通常从5’上游切出上游区域时，由该上游区域控制的结构基因的表达降低，而本发明的启动子则意外地具有强力的启动子活性。
作为本发明的启动子的碱基序列，可以列举序列号3中记载的碱基序列，作为本发明的启动子的碱基序列不仅包括该序列，还包括具有同等程度启动子活性的该序列的改变序列。
其中，是否具有“启动子活性”，可以通过以下方式进行评价：例如，如实施例3中记载的那样制备AAT基因的表达载体，用宿主表达，测定AAT活性。如果发现AAT活性，则可以认为有启动子活性，但优选在发现亲本株的2倍以上，更优选20倍以上，最优选40倍以上的AAT活性的增强时，可以评价为具有“启动子活性”。
本发明的启动子通过以可以发挥作用的方式与目的基因连接，能够使目的基因高表达。作为可以通过本发明的启动子以更高水平表达的目的基因，可以列举放线菌来源的基因。而且，作为可以以更高水平使目的基因表达的宿主，可以列举放线菌。
其中，所谓“放线菌”，可以列举吸水链霉菌、白色链霉菌(Streptomyces albus)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、维及尼链霉菌(Streptomyces virginiae)、绿色产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)、多毛链霉菌(Streptomyces pilosus)、肉桂色链轮丝菌(Streptoverticillium cinnamoneum)、师岗链霉菌(Streptomycesmorookaensis)、地中海诺卡氏菌(Nocardia mediterranei)、达氏拟诺卡氏菌(Nocardopsis dassonvillei)、披发糖多孢菌(Saccharopolysporahirsuta)、光隧北里孢菌(Kitasatosporia phosalacinea)、炭样小单孢菌(Micromonospora carbonacea)、假普通链孢囊菌(Streptosporangiumpseudovulgare)，更优选为吸水链霉菌。
根据本发明的优选方案，可以将本发明的启动子以能够起作用的方式与放线菌(优选吸水链霉菌)来源的基因(优选AAT基因)相连接。
根据本发明的优选方案，还可以将本发明的启动子以能够起作用的方式与放线菌(优选吸水链霉菌)来源的基因(优选AAT基因)相连接的重组载体导入放线菌(优选吸水链霉菌)中。
[PAT基因]
本发明的重组载体中使用的PAT基因只要其编码的蛋白质具有PAT活性即可，对其来源没有特别的限制，但优选来源于放线菌，更优选来源于吸水链霉菌。
其中，所谓“PAT活性”定义为PAT催化将L-谷氨酸的氨基转移到OMPB，生成L-膦丝菌素和α-酮戊二酸的反应(或其逆反应)的能力。更具体的是，定义为混合PAT活性测定用底物(150mM谷氨酸、50mM OMPB、0.1mM磷酸吡哆醛、100mM Tris-HCl缓冲液；pH8.5)和PAT，于37℃，温育20分钟后，停止反应，通过氨基酸分析用HPLC(model LC-VP、岛津制作所社制)分析生成的L-膦丝菌素的量而求出的酶活性(以1分钟生成1μmol的L-膦丝菌素的能力为1U(单位))。
本发明中，评价微生物所产生的PAT活性时，理想的是以比活性(U/mg)作为指标进行评价。
通过PAT活性(U)除以蛋白质量(例如，可以用蛋白质检测试剂盒(protein assaykit)(Bio-Rad公司制)，以γ-球蛋白作为标准品测定)求出比活性(U/mg)。
作为编码具有PAT活性的蛋白质的多核苷酸，可以使用选自以下的(i’)、(ii’)、(iii’)和(vi’)的多核苷酸。
(i’)由序列号4所示的碱基序列组成的多核苷酸；
(ii’)由序列号4所示的碱基序列中缺失、替换、插入或添加了1个或多个核苷酸的碱基序列组成、且编码具有PAT活性的蛋白质的多核苷酸；
(iii’)在严格条件下与序列号4所示的碱基序列杂交、且编码具有PAT活性的蛋白质的多核苷酸；和
(iv’)含有与由序列号4所示的碱基序列组成的多核苷酸具有至少90％的同一性的碱基序列、且编码具有PAT活性的蛋白质的多核苷酸。
作为具有PAT活性的蛋白质，可以使用选自以下的(v’)、(vi’)、(vii’)和(viii’)的蛋白质：
(v’)由序列号5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(vi’)由序列号5所示的氨基酸序列中缺失、替换、插入或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、且具有PAT活性的蛋白质；
(vii’)由与编码序列号5所示的氨基酸序列的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸编码的、且具有PAT活性的蛋白质；和
(viii’)由与序列号5所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列组成、且具有PAT活性的蛋白质。
[重组载体]
本发明的重组载体可以按照例如Sambrook，J.等人，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室(Molecular cloning：a laboratory manual，ColdSpring Harbor Laboratory)，纽约(1989)等中记载的基因重组技术的常规方法进行制备。
本发明的重组载体中，各基因的表达所必需的控制序列，例如启动子、转录开始信号、核糖体结合部位、翻译停止信号、转录终止信号等的转录调节信号、翻译调节信号等可以以能够起作用的方式与目的基因连接。
本发明的重组载体还可以含有用于选择转化体的选择标记，可以根据所使用的宿主选择适当的选择标记。作为选择标记，可以列举药物抗性基因、互补营养需求性的基因等，作为优选的例子，在宿主为细菌时，可以列举氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因等，宿主为酵母时，可以列举色氨酸生物合成基因(TRP1)、尿嘧啶生物合成基因(URA3)、亮氨酸生物合成基因(LEU2)等，宿主为放线菌时，可以列举潮霉素抗性基因、双丙氨酰膦抗性基因、博莱霉素抗性基因、短梗霉菌素抗性基因、硫链丝菌肽抗性基因等。
本发明的重组载体，可以一边考虑使用的宿主的种类，从病毒、质粒、粘粒载体等中适当选择。例如，宿主细胞为大肠杆菌时，可以列举λ噬菌体系统的细菌噬菌体、pBR322系统、pUC系统的载体；为枯草杆菌时，可以列举pUB110系统、pPL603系统、pC194系统的载体；为酵母时可以列举pYC系统、pYE系统的载体，为放线菌时可以列举pIJ702系统、pIJ680系统、pAK114系统的载体。
根据本发明的第一种方案的重组载体优选也可以进一步含有本发明的启动子。此时，本发明的启动子可以以能够起作用的方式与本发明的AAT基因连接。这种重组载体从在宿主(尤其是放线菌)中可以使AAT基因高表达这一点上来说，是有利的。
根据本发明的第二种方案的重组载体优选也可以进一步含有本发明的启动子。此时，本发明的启动子可以以能够起作用的方式与本发明的AAT基因连接。这种重组载体从在宿主(尤其是放线菌)中可以使AAT基因和PAT基因高表达这一点上来说，是有利的。
根据本发明的第二种方案的重组载体也可以进一步含有诱导PAT基因表达的启动子，这种启动子可以以能够起作用的方式与PAT基因连接。
本领域技术人员可以合适地选择PAT基因的启动子，优选可以使用特开平2-195889号公报中记载的质粒pMSB515中的AT-II基因启动子。
例如，可以按照常规的方法，将编码目的蛋白质的基因(目的基因)的翻译区域正向插入于启动子的下游实施与本发明的启动子的连接。此时，还可以通过将目的基因与编码其它蛋白质的翻译区域的外源基因相连接，作为融合蛋白质表达。
在根据本发明的第二种方案的重组载体中，本发明的AAT基因与PAT基因可以反向连接，也可以正向连接，但从增强AAT活性的观点来看，可以优选反向连接。
可以将本发明的AAT基因之外的目的基因连接到本发明的启动子上。
[转化体]
被转化的宿主，可以根据所使用的重组载体的种类，从放线菌、大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、丝状真菌、其它微生物中适当选择。作为可作为宿主使用的放线菌，可以列举吸水链霉菌、白色链霉菌(Streptomycesalbus)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、维及尼链霉菌(Streptomyces virginiae)、绿色产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)、多毛链霉菌(Streptomyces pilosus)、肉桂色链轮丝菌(Streptoverticillium cinnamoneum)、师岗链霉菌(Streptomycesmorookaensis)、地中海诺卡氏菌(Nocardia mediterranei)、达氏拟诺卡氏菌(Nocardopsis dassonvillei)、披发糖多孢菌(Saccharopolysporahirsuta)、光隧北里孢菌(Kitasatosporia phosalacinea)、炭样小单孢菌(Micromonospora carbonacae)、假普通链孢囊菌(Streptosporangiumpseudovulgare)，优选吸水链霉菌，更优选可以列举保藏号为FERM BP-1368的保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心的SF1293NP-50株或保藏号为FERM BP-130的保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心的SF1293株。
向宿主中导入重组载体的方法是公知的，根据宿主和载体的种类选择最有效的方法。在转化放线菌时，可以实施通过与大肠杆菌的接合进行的传递，通过放线菌噬菌体进行的感染、向宿主菌的原生质体导入等。通过转化获得的重组体的选择中，可以利用所使用的载体所具有的遗传指标例如抗生素抗性、痘疱形成、黑色素生物合成等。
被转化的宿主的培养，可以按照常规方法，使用本领域中常用的培养基、培养条件。
对于培养基，可以使用常用的成分，例如作为碳源，使用葡萄糖和其它糖类，以及淀粉等。而且，作为氮源，可以使用肉膏和蛋白胨、和玉米、小麦、大豆、微生物等各种提取物。另外，根据需要，还可以添加钠、钾、钙、镁、钴、氯、磷酸、硫酸等的无机盐类和各种维生素。为了抑制培养中的发泡，还可以添加市售的消泡剂。
培养基的杀菌方法，可以使用蒸汽杀菌和过滤杀菌等方法。
对于培养条件，可以通过使用旋转振荡器的烧瓶培养，使用小型发酵罐装置或罐设备的通气搅拌培养等进行。培养基的pH、培养温度、培养天数可以根据转化体适当确定。
作为根据本发明的第一种方案的转化体的优选例子，可以列举被本发明的AAT基因与本发明的启动子以能够起作用的方式连接的第一种方案的重组载体转化的放线菌(尤其是吸水链霉菌)。该转化体显示出超过亲本株的放线菌的AAT活性，在这一点看来十分有利。
作为根据本发明的第一种方案的转化体的更为优选的例子，可以列举经由保藏号为FERM BP-10495的保藏于独立行政法人产业技术综合研究所的转化体制备的表达载体pSG11转化的吸水链霉菌，最优选可以列举由该表达载体pSG11转化的保藏号为FERM BP-1368的保藏于独立行政法人产业技术综合研究所的SF1293 NP-50株。该转化体与亲本株相比，显示出极高的AAT活性，从这一点看来极为有利。
作为根据本发明的第二种方案的转化体的优选例子，可以列举被本发明的AAT基因与本发明的启动子以能够起作用的方式连接的第二种方案的重组载体转化的放线菌(尤其是吸水链霉菌)。该转化体显示出超过亲本株的放线菌的AAT活性和PAT活性，在这一点看来十分有利。
作为根据本发明的第二种方案的转化体的更为优选的例子，可以列举被本发明的AAT基因与本发明的启动子以能够起作用的方式连接，且本发明的AAT基因与PAT基因反向连接的第二种方案的重组载体转化的放线菌(尤其是吸水链霉菌)。该转化体显示出超过亲本株的放线菌的AAT活性和PAT活性，在这一点看来十分有利。
作为根据本发明的第二种方案的转化体的更为优选的例子，可以列举被由保藏号为FERM BP-10496的保藏于独立行政法人产业技术综合研究所的转化体制备的表达载体pAHSG7201转化的吸水链霉菌，最优选可以列举被该表达载体pAHSG7201转化的保藏号为FERM BP-1368的保藏于独立行政法人产业技术综合研究所的SF1293 NP-50株。该转化体与亲本株相比，显示出极高的AAT活性和PAT活性，从这一点看来极为有利。
[L-膦丝菌素的制备方法]
酶反应
本发明的制备方法中使用的放线菌显示出AAT活性和PAT活性，参与L-膦丝菌素的制备。具体而言，该放线菌在OMPB、L-天冬氨酸、L-谷氨酸存在下，参与以下的酶反应的进行。
(1)PAT通过作用于L-谷氨酸和OMPB，将L-谷氨酸的氨基转移到OMPB上，生成L-膦丝菌素和α-酮戊二酸。
(2)AAT通过作用于L-天冬氨酸和α-酮戊二酸，将L-天冬氨酸的氨基转移到α-酮戊二酸上，生成L-谷氨酸和草酰乙酸。
(3)(2)中生成的L-谷氨酸在(1)中再次被利用，反应继续。
转化率的定义
本发明的制备方法中，所谓“转化率”，是指作为底物的OMPB中转化为L-膦丝菌素的比例，可以用下式计算。
数1
Figure A200780007518D00211
第一种方案的制备方法
根据本发明的第一种方案的制备方法，显示出AAT活性和PAT活性且可以产生L-膦丝菌素的放线菌中，通过将具有AAT活性超过亲本株的AAT活性的放线菌用于L-膦丝菌素的制备中，可以以迄今为止无法达到的高效率制备L-膦丝菌素。尤其是，本发明的第一种方案的制备方法可以减少L-膦丝菌素的制备原料谷氨酸，而且可以以高效率制备L-膦丝菌素，因此从减少成本的观点考虑极为有利。
也就是说，如果根据实施例4，使用具有AAT活性超过亲本株的AAT活性的转化体制备L-膦丝菌素时，转化率为97％。若考虑亲本株的转化率为93.2％，而且只使PAT基因高表达的株的转化率为92.6％，可以认为通过增加AAT活性，L-膦丝菌素的转化率增加。
若根据实施例4，使用具有AAT活性超过亲本株的AAT活性的转化体，由减少谷氨酸量的底物制备L-膦丝菌素时，转化率为90.1％。若考虑亲本株的转化率为76.2％，而且只使PAT基因高表达的株的转化率为82.7％，则认为即使在使用谷氨酸减量底物时，L-膦丝菌素的转化率由于AAT活性的增强而提高。
迄今为止，在L-膦丝菌素的制备中，着眼于直接作用于向L-膦丝菌素的转化过程中的PAT，尝试增强放线菌的PAT活性，但无法达到以可以满足的高效率进行制备。而且，逐渐认为，即使增强AAT活性，由于PAT活性成为限速因素，结果也无法实现以高效率制备L-膦丝菌素。
虽然不拘泥于以下理论，但一般认为若增加产生L-膦丝菌素的放线菌中的AAT活性，由于与L-膦丝菌素一起产生的α-酮戊二酸由于增强的AAT而迅速返回到L-谷氨酸，不会受到α-酮戊二酸所产生的生成物抑制，反应得以顺利地进行。
本发明的第一种方案的制备方法的特征在于：使用显示出AAT活性和PAT活性且能够产生L-膦丝菌素的放线菌，且该放线菌显示出超过亲本株的AAT活性的活性。根据本发明的第一种方案的制备法中，只要所使用的放线菌的AAT活性超过亲本株的活性即可，优选2倍以上、更优选10倍以上、特别优选20倍以上、最优选40倍以上。
其中，是否“使用的放线菌显示出超过亲本株的AAT活性的活性”可以通过测定使用的放线菌产生的AAT的比活性，与亲本株的比活性进行比较来确定。
作为可以在本发明的第一种方案的制备方法中使用的放线菌，只要是显示出超过亲本株的AAT活性的活性的放线菌即可，例如，可以使用用含有AAT基因的表达载体转化获得的放线菌，通过突变处理(亚硝基胍处理、UV处理等)育种的AAT活性得以增强的放线菌株。优选地，可以使用AAT活性比亲本株增强20倍以上的放线菌，具体的是，根据本发明的第一种方案的宿主(放线菌)更优选用从保藏号为FERM BP-10495的保藏于独立行政法人产业技术综合研究所的转化体制备的表达载体pSG11转化的吸水链霉菌，最优选地，可以使用用该表达载体pSG11转化的保藏号为FERM BP-1368的保藏于独立行政法人产业技术综合研究所的SF1293NP-50株。
就本发明的第一种方案的制备方法中使用的底物而言，可以使式(II)的化合物或其盐:谷氨酸或其盐:天冬氨酸或其盐的比例为1:0.25～1:1，从经济的观点出发，优选为约1:约0.25:约1。
作为根据本发明的第一种方案的制备方法的优选方案，可以列举式(I)所示的L-膦丝菌素或其盐的制备方法，其包括使式(II)所示的4-羟基甲基氧膦基-2-氧代-丁酸或其盐与根据本发明的第一种方案的宿主(放线菌)接触的步骤。
作为根据本发明的第一种方案的制备法的更为优选的方案，可以列举包括使式(II)所示的4-羟基甲基氧膦基-2-氧代-丁酸或其盐与根据本发明的第一种方案的宿主(放线菌)接触的步骤的、制备式(I)所示的L-膦丝菌素或其盐的方法，该方法中导入该宿主中的重组载体还含有本发明的启动子，而且本发明的AAT基因与本发明的启动子以能够起作用的方式相连接。
作为根据本发明的第一种方案的制备法的特别优选的方案，可以列举包括使式(II)所示的4-羟基甲基氧膦基-2-氧代-丁酸或其盐与根据本发明的第一种方案的宿主(放线菌)相接触的步骤的式(I)所示的L-膦丝菌素或其盐的制备方法，其中导入该宿主中的重组载体还含有本发明的启动子，而且本发明的AAT基因与本发明的启动子以能够起作用的方式相连接，且该宿主是吸水链霉菌来源。
第二种方案的制备方法
根据本发明的第二种方案的制备方法，通过将显示出AAT活性和PAT活性且可以产生L-膦丝菌素的放线菌中的具有超过亲本株的AAT活性和PAT活性的活性的放线菌用于L-膦丝菌素的制备，则可以以迄今为止无法实现的极高效率制备L-膦丝菌素。尤其是，本发明的第二种方案的制备方法中，即使减少L-膦丝菌素的制备原料谷氨酸，也可以以高效率制备L-膦丝菌素，因此从降低成本的观点考虑极为有利。
也就是说，如果按照实施例6，使用具有超过亲本株的AAT活性和PAT活性的活性的转化体制备L-膦丝菌素时，转化率为95.3％。若考虑亲本株的转化率为93.2％，且只使PAT基因高表达的菌株的转化率为92.6％，则可以认为通过增加AAT活性和PAT活性，L-膦丝菌素的转化率进一步提高。
如果根据实施例6，使用具有超过亲本株的AAT活性和PAT活性的活性的转化体，由减少了谷氨酸量的底物制备L-膦丝菌素时，转化率为95.5％。亲本株的转化率为76.2％，且只使PAT基因高表达的菌株的转化率为82.7％，则可以认为，即使在使用谷氨酸减量底物时，通过增强AAT活性和PAT活性，L-膦丝菌素的转化率提高。
如前所述，即使只增强放线菌的PAT活性，也不能使L-膦丝菌素的转化率提高。而且，还没有关于在L-膦丝菌素的制备中不仅增强AAT活性还增强PAT活性的报道。
本发明的第二种方案的制备方法的特征在于：使用显示出AAT活性和PAT活性，且可以产生L-膦丝菌素的放线菌，该放线菌显示出超过亲本株的AAT活性和PAT活性的活性。根据本发明的第二种方案的制备法中，只要使用的放线菌的AAT活性超过亲本株的活性就可以了，优选约2倍以上、更优选约20倍以上、更优选约40倍以上、尤为优选约100倍以上、最优选约170倍以上。此外，根据本发明的第二种方案的制备法中，只要使用的放线菌的PAT活性超过亲本株的活性就可以了，优选约2倍以上、更优选约10倍以上、最优选约16倍以上。
如果根据实施例6，增强的AAT活性比增强的PAT活性相对强时，L-膦丝菌素的极高制备效率得以实现。虽然不拘泥于以下理论，但一般认为被认为引起生成物抑制的α-酮戊二酸由于相对增强的AAT而迅速转化为谷氨酸。因此，本发明的第二种方案的制备方法中，在使用的放线菌中，优选AAT活性比PAT活性相对更强的。
其中，是否“使用的放线菌显示出超过亲本株的AAT活性的活性”可以通过测定使用的放线菌产生的AAT的比活性，与亲本株的比活性进行比较来确定。此外，是否“使用的放线菌显示出超过亲本株的PAT活性的活性”，可以通过测定使用的放线菌产生的PAT的比活性，与亲本株的比活性进行比较来确定。
作为可以在本发明的第二种方案的制备方法中使用的放线菌，只要是显示出超过亲本株的AAT活性和PAT活性的活性的放线菌就可以了，例如，可以使用用含有AAT基因和PAT基因的表达载体转化获得的放线菌、或者通过突变处理(亚硝基胍处理、UV处理等)育种的AAT活性和PAT活性得以增强的放线菌株。优选可以使用AAT活性比亲本株增强40倍以上，且PAT活性比亲本株增强10倍以上的放线菌，具体的是，根据本发明的第二种方案的宿主(放线菌)更优选用从保藏号为FERM BP-10496的保藏于独立行政法人产业技术综合研究所的转化体制备的表达载体pAHSG7201转化的吸水链霉菌，最优选地，用该表达载体pAHSG7201转化的保藏号为FERM BP-1368的保藏于独立行政法人产业技术综合研究所的SF1293NP-50株。
就本发明的第二种方案的制备方法中使用的底物而言，可以使式(II)的化合物或其盐:谷氨酸或其盐:天冬氨酸或其盐的比例为1:0.25～1:1，从经济的观点出发，优选为约1:约0.25:约1。
作为根据本发明的第二种方案的制备方法的优选方案，可以列举式(I)所示的L-膦丝菌素或其盐的制备方法，其包括使式(II)所示的4-羟基甲基氧膦基-2-氧代-丁酸或其盐与根据本发明的第二种方案的宿主(放线菌)接触的步骤。
作为根据本发明的第二种方案的制备法的更为优选的方案，可以列举包括使式(II)所示的4-羟基甲基氧膦基-2-氧代-丁酸或其盐与根据本发明的第二种方案的宿主(放线菌)接触的步骤的制备式(I)所示的L-膦丝菌素或其盐的方法，该方法中导入该宿主中的重组载体还含有本发明的启动子，而且本发明的AAT基因与本发明的启动子以能够起作用的方式相连接。
作为根据本发明的第二种方案的制备法的特别优选的方案，可以列举包括使式(II)所示的4-羟基甲基氧膦基-2-氧代-丁酸或其盐与根据本发明的第二种方案的宿主(放线菌)相接触的步骤的式(I)所示的L-膦丝菌素或其盐的制备方法，其中导入该宿主中的重组载体还含有本发明的启动子，而且本发明的AAT基因与本发明的启动子以能够起作用的方式相连接，且该宿主是吸水链霉菌来源。
作为根据本发明的第二种方案的制备法的最优选方案，可以列举包括使式(II)所示的4-羟基甲基氧膦基-2-氧代-丁酸或其盐与根据本发明的第二种方案的宿主(放线菌)相接触的步骤的制备式(I)所示的L-膦丝菌素或其盐的方法，该方法中导入该宿主中的重组载体还含有本发明的启动子，而且本发明的AAT基因与本发明的启动子以能够起作用的方式相连接，该宿主为吸水链霉菌来源，且AAT基因与PAT基因反向连接。
制备条件
本发明的制备方法可以按照日本专利第2638541号公报的记载进行。例如，通过以下方式进行：以3％ OMPB或其盐和0.75％～3％谷氨酸或其盐和3％天冬氨酸或其盐的混合液作为底物，用氢氧化钠将其中和，在pH7.0～9.5、优选地pH约8.5、温度30～45℃、优选地37℃的条件下，使AAT活性增强了的放线菌或AAT活性和PAT活性增强了的放线菌作用0.5-5天。而且，在转化反应时，还可以添加微量的磷酸吡哆醛或其盐。
而且，在本发明中，可以从含有获得的L-膦丝菌素的混合液中，经过纯化步骤纯化L-膦丝菌素。此时的纯化方法完全可以使用本领域中常用的方法，理想的是使用离子交换层析或通过溶剂(例如甲醇等)进行的沉淀法。本发明中获得的转化液可以通过这些纯化方法容易地进行纯化，因此即使在转化液中存在微量的丙氨酸也不会成为特殊的问题。
式(I)的化合物、式(II)的化合物、谷氨酸、和天冬氨酸可以分别以盐的形式存在。
作为式(I)的化合物的盐，可以列举钠盐、钾盐、铵盐等与无机碱形成的盐，以及与有机碱、无机酸、有机酸形成的盐，但优选钠盐。
式(II)的化合物的盐，可以列举钠盐、钾盐、铵盐等与无机碱形成的盐，和与有机碱形成的盐，但优选钠盐。
作为谷氨酸的盐，可以列举钠盐、钾盐、铵盐等的与无机碱形成的盐，以及与有机碱、无机酸、有机酸形成的盐，但优选钠盐。
作为天冬氨酸的盐，可以列举钠盐、钾盐、铵盐等与无机碱形成的盐，以及与有机碱、无机酸、有机酸形成的盐，但优选钠盐。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明不限于此。
实施例1：吸水链霉菌来源的AAT基因的克隆
(1)通过PCR法制备长链探针
A)吸水链霉菌的基因组DNA的制备
将吸水链霉菌(SF1293NP-50株、FERM BP-1368)接种于SPY培养基(2％淀粉、1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.05％KH2PO4：pH7.0)中，于28℃振荡培养24小时。从获得的培养液中通过离心分离回收菌体，冷冻干燥。通过用WO00/24879号公报的实施例B2记载的方法处理该冷冻干燥菌体，制备基因组DNA。
b)通过PCR法扩增AAT基因部分片段
将从公知的数据库(在DDBJ主页http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html上可以利用的公共数据库)获得的2种放线菌(维及尼链霉菌和天蓝色链霉菌)来源的AAT的氨基酸序列进行比较，检索存在同源性的区域。其结果，鉴定了存在同源性的两个位置的氨基酸序列(GEPDFPTP和KTYAMTG W RVG)，制备了对应于所述部位的2种合成寡核苷酸引物。
SV-GOT-N：
5’-GGCGAGCCCGACTTCCCGACCCCG-3’(序列号6)
5’-CCCACGCGCCAGCCGGTCATGGCGTACGTCTT-3’(序列号7)
使用这种引物，以上述的吸水链霉菌的基因组DNA作为模板实施PCR。PCR中，使用带GC缓冲液的TAKARA LA Taq(TAKARABIO公司制)，在94℃ 1分钟的热变性后、重复进行30个98℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 1分15秒的循环后，于72℃再温育10分钟。反应终止后，将样本提供给0.8％琼脂糖电泳进行分析，结果发现了约0.6kbp的特异性条带的扩增。
c)扩增的基因片段的亚克隆
从凝胶中回收实施例1(1)b)中获得的约0.6kbp的基因条带后，用Wizard SV Gel and PCR Clean-up System(Promega公司制)纯化DNA，用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen公司制)，采用大肠杆菌(E.coli)感受态细胞JM109(TAKARABIO公司制)亚克隆。将获得的质粒称为pSH-AAT。对质粒pSH-AAT的插入片段的碱基序列进行分析，结果确认了与编码维及尼链霉菌(Streptomyces virginiae)来源的AAT的DNA序列的同源性(碱基序列的分析装置采用Applied biosystem公司制的ABIPRISM310 Genetic Analyzer。测序反应采用同一公司的DNA测序试剂盒dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction。分析用引物采用试剂盒附带的M13引物)。因此，判断此插入片段是吸水链霉菌来源的AAT基因的部分片段，作为以后的实验的探针使用。
(2)AAT基因的克隆
a)基因组DNA的文库的构建
用Sau3AI消化实施例1(1)a)中获得的基因组DNA后，提供给0.8％琼脂糖凝胶电泳，从凝胶中回收9～23kbp的DNA片段。用酚处理回收片段，通过乙醇沉淀纯化后，用λEMBL3/BamHI Vector Kit(Statagene公司制)和DNA Ligation Kit ver.2(TAKARABIO公司制)，将部分消化的基因组DNA片段与λEMBL3载体相连接。用Maxplax Packaging Extract(エピセンタ—公司制)包装获得的连接混合物后，使之感染大肠杆菌XL1-Blue MRA株。采用通过该方法获得的2.0×105个噬菌体文库，进行目的基因的克隆。
b)文库的筛选
用EcoRI消化实施例1(1)c)中获得的质粒pSH-AAT后，提供给0.8％琼脂糖凝胶电泳、从凝胶中回收约0.6kbp的DNA片段。用W izard SVGel and PCR Clean-up System(Promega公司制)纯化回收的DNA片段，用DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitI(Roche-diagnostics公司制)对探针进行DIG标识。
然后，将实施例1(2)a)中获得的噬菌体文库转印入Hybond-N+膜(Amersham Biosciences公司制)，用0.5N氢氧化钠变性后，用5×SSC(1×SSc：15mM柠檬酸三钠、150mM氯化钠)清洗，通过使之干燥固定DNA。按照前述试剂盒的记载，在1小时的预杂交(42℃)后，添加热变性的标识化探针，进行16小时的杂交(42℃)。对于标识的清洗也按照试剂盒记载的方法，首先用含有0.1％SDS的2×SSC，于室温5分钟；这样清洗2次后，用含有0.1％SDS的0.5×SSC，于65℃15分钟，这样清洗2次。再按照试剂盒记载的方法，使碱性磷酸酶标识的抗DIG抗体反应后，添加试剂盒附带的底物(NBT/BCIP)。结果获得了呈现蓝色的2个阳性克隆。
c)噬菌体DNA的制备
按照前述λEMBL3/BamHI Vector Kit记载的方法使阳性的噬菌体感染大肠杆菌XL1-Blue MRA株后，16小时后回收噬菌体颗粒，按照Grossberger的方法(Grossberger，D.，Nucleic Acids.Res.，15:6737，1987)，进行蛋白酶K和酚处理后，通过乙醇沉淀制备噬菌体DNA。
d)Southern杂交
用多个限制性酶分别消化实施例1(1)a)中获得的基因组DNA和实施例1(2)c)中获得的噬菌体DNA后，提供给0.8％琼脂糖凝胶电泳。通过Southern的方法(Southern，E.M.，J.Mol.Biol.，98:503-517，1975)将DNA转印入Hybond-N+膜后，用ECF Random-Prime Labelling AndDetection System(Amersham Biosciences公司制)实施杂交。通过本系统记载的方法，在30分钟的预杂交(60℃)后，添加热变性的标识化探针，进行16小时的杂交(60℃)。探针，用本系统记载的方法对实施例1(2)b)中获得的pSH-AAT来源的约0.6kbp的DNA片段进行荧光素标识后再使用。对于标识的清洗也按照本系统记载的方法，首先用含有0.1％SDS的1×SSC，于60℃清洗15分钟后，用含有0.1％SDS的0.5×SSC于60℃清洗15分钟。进而，按照本系统记载的方法，使碱性磷酸酶标识的抗荧光素抗体反应后，添加本系统附带的底物(ECF底物)，用Molecular imager FX(Bio-RadLaboratories公司制)检测获得的荧光条带。其结果，清楚了用BamHI处理基因组DNA和噬菌体DNA时，获得了约4.3kbp的共同的条带，在用Pst处理时获得了约2.7kbp的共同的条带，在用BamHI和XhoI处理时获得了约1.5kbp的共同的条带。
e)目的基因的亚克隆
首先，用限制性酶BamHI消化实施例1(2)c)中获得的噬菌体DNA后，提供给0.8％琼脂糖凝胶电泳，从凝胶中回收约4.3kbp的DNA片段，并纯化。将获得的DNA片段与pUC118 BamHI-BAP处理DNA(TAKARABIO公司制)连接，将获得的质粒称为p118G-411B。同样，用限制性酶PstI处理噬菌体DNA，从凝胶中回收约2.7kbp的DNA片段后，与pUC118 PstI-BAP处理DNA连接，将获得的质粒称为p118G-411P。
用限制性酶PstI消化获得的质粒p118G-411P后，提供给0.8％琼脂糖凝胶电泳，从凝胶中回收约2.7kbp的DNA片段，并进行纯化。接着，用限制性酶PstI消化质粒p118G-411B后，提供给0.8％琼脂糖凝胶电泳，从凝胶中回收约6.2kbp的DNA片段，并纯化。通过用碱性磷酸酶(BAP；TAKARABIO公司制)处理获得的DNA片段进行脱磷酸化后，与先前获得的p118G-411P来源的约2.7kbp的DNA片段相连接。将获得的质粒称为pAAT3-5。
用限制性酶HindIII、XhoI消化获得的质粒pAAT3-5后，提供给0.8％琼脂糖凝胶电泳，从凝胶中回收并纯化约2.9kbp的DNA片段。然后，用限制性酶HindIII、SAII消化质粒pUC19(TAKARABIO公司制)后，从凝胶中回收并纯化约2.7kbp的DNA片段，与先前获得的质粒pAAT3-5来源的约2.9kbp的HindIII-XhoI片段相连接。将获得的质粒称为pHX-01。
含有吸水链霉菌来源的AAT基因的约5.8Kbp的限制性酶图谱示于图1。
实施例2：吸水链霉菌来源的AAT基因的碱基序列分析
(1)质粒pHX-01的碱基序列的分析
a)测序反应
测序反应用BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit(AppliedBiosystem公司制)实施。反应中，使用质粒pHX-01作为模板DNA，使用具有下述序列的合成寡核苷酸作为引物。
M13-20：5’-CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3’(序列号8)
M13-R：5’-GGAAACAGCTATGACCATGATTAC-3’(序列号9)
按照附带的手册制备反应液后，在热循环仪中使用，通过重复进行30个96℃10秒、50℃5秒、60℃4分钟的循环实施测序反应。
b)序列分析
通过乙醇沉淀法从实施例2(1)a)获得的反应液中除去剩余的荧光色素和引物后，将样本提供给3730xl DNA Analyzer(Applied Biosystem公司制)。基于获得的碱基序列数据制备新的引物，通过反复进行测序反应和分析，获得在两个方向上覆盖全长的序列数据。最后，使用测序仪(ジ—ンコ—ド公司制)，汇编获得的序列数据，确定碱基序列(序列号10)。
(2)利用公共的数据库的同源性分析
用实施例2(1)b)中确定的序列，实施与公共的数据库(在DDBJ主页http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html上可以利用的公共数据库)上的序列的同源性检索。使用blastx(DNA序列×氨基酸序列DB)作为检索程序，在Filter OFF的条件下进行检索，其结果分别显示，与天蓝色链霉菌(Streptomyces celicolor)的AAT基因有87％的同一性，与维及尼链霉菌的AAT基因有88％的同一性。
实施例3：吸水链霉菌来源的AAT基因的高表达
(1)表达载体pLG04、pSG11的构建
表达载体pLG04如图2所示方式构建。而且，表达载体pSG11如图3所示方式构建。
a)质粒pSYTL03的构建
用限制性酶PstI、SacI切割Katz，E.，J.Gen.Microbiol.，129，2703-2714，1983中记载的质粒pIJ702，提供给0.8％琼脂糖凝胶电泳后，从凝胶中回收并纯化约4.9kbp的DNA片段。然后，同样用PstI、SacI切割pUC19(TAKARABIO公司制)，提供给0.8％琼脂糖凝胶电泳后，从凝胶中回收并纯化DNA片段。用DNA Ligation Kit ver.2(TAKARABIO公司制)连接获得的2种DNA片段，构建出质粒pSYTL03(图2)。
b)表达载体pLG04的构建
首先，用限制性酶HindIII、EcoRI切割实施例3(1)a)中获得的质粒pSYTL03，提供给0.8％琼脂糖凝胶电泳后，从凝胶中回收约4.9kbp的DNA片段，并纯化DNA。然后，同样，用限制性酶HindIII、EcoRI切割实施例1(2)e)中获得的质粒pHX01，电泳后，从凝胶中回收约2.9kbp的DNA片段，并进行纯化。用DNA Ligation Kit ver.2(TAKARABIO公司制)连接这两种DNA片段，用获得的连接混合物转化放线菌变铅青链霉菌。变铅青链霉菌的转化按照Thompson的方法(Thompson，C.J.，J.Bactriol.，151:668-677，1982)实施。将变铅青链霉菌原生质体、连接混合物、T培养基混合在一起后，添加20％聚乙二醇1000，导入DNA，在R2YE琼脂板上(20ml培养基/板)上于30℃培养一晚。然后，在一块平板上再涂覆一层2ml 100μg/ml的硫链丝菌肽(硫链丝菌肽终浓度10μg/ml)。于30℃再培养数日，以形成的菌落作为转化体。用含有10μg/ml硫链丝菌肽的80mlYEME培养基，于30℃振荡培养获得的转化体2天后，从培养液制备质粒DNA。使用Q IAfilter Plasmid Midi Kit(QIAGEN公司制)，按照试剂盒附带的说明书从变铅青链霉菌转化体中制备质粒DNA。其中，为了促进菌体的溶菌，向试剂盒附带的缓冲液P1中添加溶菌酶使终浓度达到10mg/ml，用该溶液，于室温对该菌体再追加实施30分钟的被称为预温育的前处理步骤。从20ml培养液中回收DNA，最终溶解于50μl的TE缓冲液。处理多个转化体，用限制性酶HindIII、EcoRI切割获得的质粒DNA后，提供给0.8％琼脂糖电泳，确认切割模式。选择出现约2.9kbp和约4.9kbp的条带的质粒DNA作为目的DNA，将其称为表达载体pLG04(图2)。
c)表达载体pSG11的构建
用限制性酶BamHI切割实施例1(2)e)中获得的质粒pHX01，电泳后，从凝胶中回收约1.5kbp的DNA片段，进行纯化。将该DNA片段与pUC118BamHI-BAP处理DNA(TAKARABIO公司制)相连接，将获得的质粒称为p118-G1(图3)。
用限制性酶HindIII、EcoRI切割该质粒p118-G1，电泳后，从凝胶中回收约1.5kbp的DNA片段，并纯化。而且，同样，用限制性酶HindIII、EcoRI切割实施例3(1)a)中获得的质粒pSYTL03，电泳后，从凝胶中回收约4.9kbp的DNA片段，并纯化。用DNA Ligation Kit ver.2连接这2种DNA片段，按照实施例3(1)b)的方法用获得的连接混合物转化放线菌变铅青链霉菌。用含有10μg/ml的硫链丝菌肽的80ml YEME培养基，于30℃振荡培养获得的转化体2天后，按照实施例3(1)b)的方法，从培养液中制备质粒DNA。用限制性酶HindIII、EcoRI切割获得的质粒DNA后，提供给0.8％琼脂糖电泳，确认了切割模式。选择出现约1.5kbp和约4.9kbp的条带的质粒DNA作为目的DNA，将其命名为表达载体pSG11(图3)。
(2)用表达载体pLG04、pSG11对吸水链霉菌的转化
a)原生质体的制备
将吸水链霉菌(SF1293 NP-50株、FERM BP-1368)的菌株原种(冷冻干燥菌体)接种于10ml的S1培养基(2％淀粉、1％多聚蛋白胨、0.3％麦芽提取物、0.05％K2HPO4；pH7.0)中，于28℃振荡培养40小时。将获得的培养液中的2ml接种于含有5％甘氨酸的80ml的S2培养基(1％葡萄糖、0.4％蛋白胨、0.4％酵母提取物、0.05％MgSO4·7H2O、0.2％KH2PO4、0.4％K2HPO4；pH7.0)中，于28℃振荡培养18小时。通过离心分离从获得的培养液中收集菌体，用0.5M蔗糖清洗后，悬浮于含有终浓度2.5mg/ml的溶菌酶和终浓度1.25mg/ml的消色肽酶的P3培养基(70mM NaCl、0.5M蔗糖、5mM MgCl2·6H2O、5mM CACl2·2H2O、25mM TES缓冲液；pH7.2)中，于30℃振荡一小时，使之溶菌。用P3培养基清洗生成的原生质体后，悬浮于约500μl的P3培养基中，将其作为原生质体溶液。
b)转化
b)-1培养基的制备
转化时使用的TH培养基按以下的方法制备。首先，按照Okanishi的方法(Okanishi，M.，J.Gen.Microbiol.，80，389-400，1974)，制备痕量元素溶液(Trace element solution)。然后，26.7g蔗糖、0.0375g K2SO4溶解于约60ml中，加入0.3ml痕量元素溶液后，用水混合成77.5ml，将其称为3/2TH培养基。在7.75ml的3/2TH培养基中加入0.75ml的2M CaCl2和1.5ml的0.5M Tris-马来酸缓冲液(pH8.0)，将其称作TH培养基。
原生质体再生用的RME培养基按以下方法制备。首先，将2g脯氨酸、10g葡萄糖、2g酵母提取物、2g酪蛋白氨基酸、174g蔗糖、15g KCl、0.25gK2SO4、0.05g硫酸葡聚糖、1g LAB DEMCO溶解于水中，用10％ NaOH调整至pH7.2，加水至500ml，将其称作2×RME培养基。将2×RME培养基500ml、0.5％KH2PO4 10ml、1M CaCl2 50ml、100ml 3％玉米浆(用NaOH调整至pH7.0)、10ml 5％天冬氨酸钠(用NaOH调整至pH7.0)、330ml 3.03％琼脂分别杀菌后，将它们混合，称作RME培养基(琼脂终浓度为1％)。形成多层用的RME软琼脂培养基采用将RME培养基的琼脂终浓度变更为0.5％的RME软琼脂培养基。
b)-2转化体的制备
将实施例3(1)b)中获得的载体pLG04和实施例3(1)c)中获得的载体pSG11的DNA溶液各25μl、TE缓冲液25μl中加入实施例3(2)b)-1中获得的TH培养基100μl，充分混合后，加入100μl实施例3(2)a)中获得的原生质体溶液，缓缓混合。向该DNA/原生质体混合液中加入375μl PEG溶液(3g聚乙二醇1000、6ml TH培养基)，混合约1分钟后，将适当量(10μl～100μl)平铺到RME培养基(约20ml/平板)上，再铺上RME软琼脂培养基(约2ml/平板)。于28℃培养约2天后，在平板上添加并涂布2ml的100μg/ml的硫链丝菌肽溶液。再于28℃培养7～10天，获得的菌落为转化体。
(3)用表达载体pLG04和pSG11获得的转化体的评价
a)转化体的培养
将实施例3(2)b)-2中获得的菌落接种于含有10μg/ml的硫链丝菌肽的10ml的SPY培养基中，于28℃振荡培养2天。将获得的培养液中的2ml接种于含有10μg/ml硫链丝菌肽的30ml的SPY培养基中，于28℃再振荡培养2天。
b)转化体的评价
通过离心分离从实施例3(3)a)中获得的培养液中回收菌体，用0.9％食盐水清洗后，于-80℃冷冻菌体。将冷冻菌体溶解于20ml的缓冲液A2(20mM磷酸缓冲液、0.1mM磷酸吡哆醛、5mM2-巯基乙醇、1mM苯甲基磺酰氟；pH7.0)中，并悬浮，用超声波破碎菌体。通过离心分离从破碎液中除去细胞碎片，将上清作为粗酶液。使用获得的粗酶液，按照Tanaka等人的方法(Tanaka，T.，Agric.Biol.Chem.，54:625-631，1990)，测定37℃、pH7.5的AAT活性。
其结果是，pSG11转化体的AAT活性为pLG04转化体的AAT活性的约5.4倍这样的显著的高活性(表1)，因此将pSG11转化体作为AAT高表达株应用于以后的实验中。
【表1】
 
质粒 AAT活性(U/mg)
pLG04 0.021
pSG11 0.113
(4)用表达载体pSG11获得的转化体的评价
a)转化体的培养
将由实施例3(2)b)-2中获得的表达载体pSG11转化的转化体的菌株原种(冷冻干燥菌体)接种于10ml含有10μg/ml硫链丝菌肽的SPY培养基中，于28℃振荡培养2天。将获得的培养液中的2ml接种于含有10μg/ml硫链丝菌肽的30ml的P-101培养基(7％葡萄糖、4.4％大豆胨、0.327％KH2PO4、0.085％ Na2HPO4、1.15％ TES、0.0001％ CoCl2·6H2O；pH6.0)中，于28℃振荡培养4天。作为对照，用同样的步骤培养亲本株(无质粒)和特开平2-195889号公报记载的由质粒pMSB515形成的转化体(其中，用不含硫链丝菌肽的培养基培养亲本株)。
b)酶活性的测定
b)-1粗酶液的制备
通过离心分离从实施例3(4)a)中获得的培养液中回收菌体，用0.9％食盐水清洗后，于-80℃冷冻菌体。将冷冻菌体溶解于20ml的缓冲液A2中，并悬浮，用超声波破碎菌体。通过离心分离从破碎液中除去细胞碎片，将上清作为粗酶液。使用获得的粗酶液，测定AAT和PAT活性。
b)-2PAT活性和AAT活性的测定
按照Schulz的方法(Schulz，A.，Appl.Environ.Microbiol.，56，1-6，1990)实施PAT活性的测定。混合PAT活性测定用底物(150mM谷氨酸、50mM OMPB、0.1mM磷酸吡哆醛、100mM Tris-HCl缓冲液；pH8.5)和粗酶液，于37℃温育20分钟后，通过在沸水浴中加热5分钟停止反应。反应停止后，用0.45μm的过滤器过滤样本，提供给氨基酸分析用HPLC(model LC-VP、岛津制作所社制)，测定生成的L-膦丝菌素浓度。酶活性被定义为：以1分钟生成1μmol的L-膦丝菌素的能力为1U(单位)。使用蛋白质检测试剂盒(protein assay kit)(Bio-Rad公司制)，以γ-球蛋白作为标准品测定粗酶液中的蛋白质浓度，求出粗酶液的比活性(U/mg)。
AAT活性的测定用以下方法实施。混合AAT活性测定用底物(150mM天冬氨酸、50mMα-酮戊二酸、0.1mM磷酸吡哆醛、100mM Tris-HCl缓冲液；pH8.5)和粗酶液，于37℃温育20分钟后，通过沸水浴中加热5分钟停止反应。用0.45μm的过滤器过滤试样，提供给氨基酸分析用HPLC(model LC-VP、岛津制作所社制)，测定生成的谷氨酸浓度。酶活性被定义为：以1分钟生成1μmol的谷氨酸的能力为1U(单位)。用上述的蛋白质检测试剂盒(protein assay kit)测定粗酶液中的蛋白质浓度，求出粗酶液的比活性(U/mg)。
其结果是，pSG11的重组体的PAT活性与亲本株相比基本没变，而AAT活性为亲本株的约47倍(表2)。
表2
 
质粒 本专利 PAT活性(U/mg) AAT活性(U/mg)
无(亲本株) 日本专利第2638541号 0.37 0.17
pMSB515 特开平2-195889号 4.9 0.16
pSG11 本发明 0.38 8.0
实施例4：通过AAT基因的高表达株进行的L-膦丝菌素的生产
(1)由表达载体pSG11产生的转化体的培养
将由实施例3中获得的pSG11产生的转化体的菌株原种(冷冻干燥菌体)接种于含有10μg/ml硫链丝菌肽的30ml的SPY培养基中，于28℃振荡培养2天。将获得的培养液中的2ml接种于含有10μg/ml的硫链丝菌肽的40ml的SPY培养基中，于28℃振荡培养2天。将获得的培养液中的20ml接种于含有10μg/ml硫链丝菌肽的400ml的SBK培养基(2％淀粉、3％脱脂大豆渣、0.05％KH2PO4；pH7.0)中，于28℃振荡培养2天。将获得的培养液中的5ml接种于4L的SBK培养基中，于28℃通气搅拌培养2天。将获得的培养液中的400ml接种于4L的P2培养基(3％葡萄糖、3％脱脂大豆渣、1％谷蛋白粗粉、0.001％CoCl2·6H2O、0.01％MgSO4·7H2O、0.013％CaCl2·2H2O；pH7.0)，于28℃通气搅拌培养4天。用获得的培养液，在下述的条件下实施微生物转化，进行L-膦丝菌素的生产。而且，同样的步骤培养作为对照的亲本株(无质粒)和由质粒pMSB515产生的转化体(其中，用不含硫链丝菌肽的培养基培养亲本株)，同样进行转化反应。
(2)通过微生物转化进行的L-膦丝菌素的生产
a)底物溶液A的制备
首先，量取OMPB、天冬氨酸、谷氨酸各66g，悬浮于约1L的水中。然后，用25％氢氧化钠水溶液调制到pH8.5，加水至1760ml，将其作为底物溶液A。
b)底物溶液B的制备
首先，量取OMPB、天冬氨酸各66g，量取谷氨酸各16.5g，悬浮于约1L的水中。然后，用25％氢氧化钠水溶液调制到pH8.5，加水至1760ml，将其作为底物溶液B。
c)微生物转化
将440ml实施例4(1)中获得的培养液和1760ml实施例4(2)的a)或b)中分别获得的底物溶液A或B相混合，开始反应。转化条件为温度37℃、pH8.5(用氢氧化钠调整)，一边搅拌一边培养3天(约70小时)实施反应。转化终止后，用0.45μm的过滤器过滤样本，提供给氨基酸分析用HPLC(model LC-VP、岛津制作所社制)，测定生成的L-膦丝菌素的浓度。而且，正确地测定转化终止时的转化液量，由它们的积求出生产的L-膦丝菌素量。再通过求出使用的OMPB和生产的L-膦丝菌素的摩尔比，计算各培养液中向L-膦丝菌素的转化率。
其结果是AAT高表达株与亲本株和由pMSB515产生的转化体相比，即使在降低了谷氨酸浓度的底物溶液B中也显示出了显著高的转化率(表3)。
表3
 
质粒 相关专利 底物 转化率(％)
无(亲本株) 日本专利第2638541号 底物A(等量) 93.2
无(亲本株) 日本专利第2638541号 底物B(谷氨酸减少量) 76.2
pMSB515 特开平2-195889号 底物A(等量) 92.6
pMSB515 特开平2-195889号 底物B(谷氨酸减少量) 82.7
pSG11 本发明 底物A(等量) 97.0
pSG11 本发明 底物B(谷氨酸减少量) 90.1
实施例5：AAT基因和PAT基因的共表达
(1)表达载体pAHSG7201的构建
按图4所示方式构建质粒pATSG01。而且，按图5所示方式构建表达载体pAHSG7201。
a)质粒pATII515-03的构建
PAT基因为使用PAT的一种即AT-II(参照特开平2-195889号公报)的基因。首先，从特开平2-195889号公报记载的质粒pMSB515中，用限制性酶SacI(SstI)切割PAT的一种即AT-II的基因，提供给0.8％琼脂糖凝胶电泳后，从凝胶中回收约4.7kbp的DNA片段，纯化DNA。然后，同样，也用SacI切割pUC18(TAKARABIO公司制)，提供给0.8％琼脂糖凝胶电泳后，从凝胶中回收DNA片段，纯化DNA。用碱性磷酸酶(BAP；TAKARABIO公司制)处理pUC18的SacI片段后，与pMSB515来源的约4.7kbp的SacI片段相连接。将获得的质粒称为pATII515-03(图4)。
b)质粒pATSG01的构建
首先，用限制性酶BamHI切割实施例1(2)e)中获得的质粒pHX-01，提供给0.8％琼脂糖凝胶电泳后，从凝胶中回收约1.5kbp的DNA片段，纯化DNA。然后，用限制性酶BamHI切割实施例5(1)a)中获得的质粒pATII515-03，提供给0.8％琼脂糖凝胶电泳后，从凝胶中回收约7.4kbp的DNA片段，纯化DNA。用碱性磷酸酶(BAP)处理pATII515-03的BamHI片段后，与pHX-01来源的约1.5kbp的BamHI片段相连接。将获得的质粒称为pATSG01(图4)。
c)表达载体pAHSG7201的构建
首先，用限制性酶HindIII、EcoRI切割实施例3(1)a)中获得的质粒pSYTL03，提供给0.8％琼脂糖凝胶电泳后，从凝胶中回收约4.9kbp的DNA片段，纯化DNA。然后，同样，用限制性酶HindIII、EcoRI切割实施例5(1)b)中获得的质粒pATSG01，电泳后，从凝胶中回收约5.6kbp的DNA片段，并纯化。用DNA Ligation Kit ver.2连接这2种DNA片段，按照与实施例3(1)b)同样的方法用获得的连接混合物转化放线菌变铅青链霉菌。用含有10μg/ml硫链丝菌肽的80ml YEME培养基，于30℃振荡培养获得的转化体2天后，从培养液中制备质粒DNA。限制性酶HindIII、EcoRI切割获得的质粒DNA后，提供给0.8％琼脂糖电泳，确认了切割模式。选择出现约4.9kbp和约5.6kbp的条带的质粒DNA作为目的DNA，将其称为表达载体pAHSG7201(图5)。
(2)通过表达载体pAHSG7201进行的吸水链霉菌的转化和转化体的评价
a)通过表达载体pAHSG7201进行的转化的制备和转化体的培养
用实施例5(1)c)中获得的表达载体pAHSG7201转化吸水链霉菌(SF1293NP-50株、FERM BP-1368)。按照实施例3(2)的方法实施转化，培养获得的转化体。用与实施例3(4)a)相同的步骤进行培养，用含有10μg/ml硫链丝菌肽的P-101培养基，于28℃振荡培养4天，获得了培养液。从获得的培养液中回收菌体，按照实施例3(4)b)-1的方法制备粗酶液。
b)由表达载体pAHSG7201获得的转化体的评价
用由实施例5(2)a)中获得的表达载体pAHSG7201转化的转化体来源的粗酶液，测定PAT活性和AAT活性。酶活性的测定，按照实施例3(4)b)-2的方法(作为对照，一起记录了实施例3(4)b)-2的结果)。
其结果是，由pAHSG7201产生的转化体的PAT活性为亲本株的约16倍，AAT活性为亲本株的约170倍(表4)。
表4
 
质粒 相关专利 PAT活性(U/mg) AAT活性(U/mg)
无(亲本株) 日本专利第2638541号 0.37 0.17
pMSB515 特开平2-195889号 4.9 0.16
pSG11 本发明 0.38 8.0
pAHSG7201 本发明 6.0 29.0
实施例6：由AAT基因和PAT基因的共表达株生产L-膦丝菌素
(1)由表达载体pAHSG7201产生的转化体的培养
用与实施例4(1)同样的步骤培养由实施例5(2)中获得的表达载体pAHSG7201产生的转化体。在P-2培养基中，实施28℃、4天的通气搅拌培养，用获得的培养液进行L-膦丝菌素的生产。
(2)由表达载体pAHSG7201产生的转化体的培养
混合440ml的实施例6(1)中获得的表达载体pAHSG7201产生的转化体的培养液和1760ml的按照实施例4(2)的方法制备的底物溶液A或B，于37℃、pH8.5反应3天(约70小时)。按与实施例4(2)同样的方法分析获得的转化液，求出L-膦丝菌素的生产量(作为对照，一起记录实施例4(2)c)的结果)。
其结果是，即使在降低了谷氨酸的底物溶液B中，由表达载体pAHSG7201产生的转化体(也就是说，AAT和PAT的共表达株)与其它菌株相比，显示出显著高的转化率(表5)。
【表5】
 
质粒 相关专利 底物 转化率(％)
无(亲本株) 日本专利第2638541号 底物A(等量) 93.2
无(亲本株) 日本专利第2638541号 底物B(谷氨酸减少量) 76.2
pMSB515 特开平2-195889号 底物A(等量) 92.6
pMSB515 特开平2-195889号 底物B(谷氨酸减少量) 82.7
pSG11 本发明 底物A(等量) 97.0
pSG11 本发明 底物B(谷氨酸减少量) 90.1
pAHSG7201 本发明 底物A(等量) 95.3
pAHSG7201 本发明 底物B(谷氨酸减少量) 95.5
实施例7：在AAT基因和PAT基因的共表达株中高表达蛋白质的N末端氨基酸序列的鉴定
为了测定由表达载体pAHSG7201产生的转化体中高表达的蛋白质的N末端氨基酸序列，按照日本专利第3593134号公报的实施例A2记载的方法实施N末端氨基酸的测序。首先，用SDS-PAGE mini 12％Gel(TEFCO公司制)对实施例5(2)c)中获得的表达载体pAHSG7201产生的转化体的粗酶液进行电泳后，用Multifor II电泳装置(AmershamBiosciences公司制)将蛋白质转印入PVDF膜(Millipore公司制)。然后，用考马斯亮兰R-250(ナカライテスク社制)对该PVDF膜染色，脱色后，用水清洗，风干。从其中切出50kDa和43kDa的蛋白质印迹的部分，分别提供给蛋白质测序仪Model492(PerkinElmer公司制)，按下述方式测定N末端氨基酸序列。
43kDa蛋白质：
Ser-Ala-Ala-Thr-Pro-Ser-Ala-Ser(序列号11)
50kDa蛋白质：
Thr-Glu-Leu-Ser-Gly-Ala-Pro-Ala(序列号12)
43kDa蛋白质的N末端氨基酸序列与序列号2的第2位～第9位一致。因此清楚了43kDa蛋白质是AAT蛋白质。而且，50kDa蛋白质的N末端氨基酸序列与序列号5的第2位～第9位一致。因此清楚了50kDa蛋白质为PAT蛋白质。
序列表
<110>明治制果株式会社
<120>天冬氨酸转氨酶基因和L-膦丝菌素的制备方法
<130>164900PX
<150>JP2006-56726
<151>2006-03-02
<160>12
<170>PatentIn版本3.1
<210>1
<211>1236
<212>DNA
<213>吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1236)
<223>
<400>1
Figure A200780007518Q00441
Figure A200780007518Q00451
<210>2
<211>411
<212>PRT
<213>吸水链霉菌
<400>2
Figure A200780007518Q00452
Figure A200780007518Q00461
<210>3
<211>77
<212>DNA
<213>吸水链霉菌
<400>3
Figure A200780007518Q00472
Figure A200780007518Q00481
<210>4
<211>1350
<212>DNA
<213>吸水链霉菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1350)
<223>
<400>4
Figure A200780007518Q00482
Figure A200780007518Q00491
Figure A200780007518Q00501
<210>5
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<213>吸水链霉菌
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Figure A200780007518Q00502
Figure A200780007518Q00511
Figure A200780007518Q00521
Figure A200780007518Q00531
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>6
Figure A200780007518Q00532
<210>7
<211>32
<212>DNA
<213>人工的
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<223>引物
<400>7
Figure A200780007518Q00533
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>8
Figure A200780007518Q00534
<210>9
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>9
Figure A200780007518Q00535
<210>10
<211>2916
<212>DNA
<213>吸水链霉菌
<400>10
Figure A200780007518Q00541
Figure A200780007518Q00551
Figure A200780007518Q00561
<210>11
<211>8
<212>PRT
<213>吸水链霉菌
<400>11
Figure A200780007518Q00562
<210>12
<211>8
<212>PRT
<213>吸水链霉菌
<400>12
Figure A200780007518Q00563

Claims (30)

1、选自以下(i)、(ii)、(iii)和(iv)的多核苷酸：
(i)由序列号1所示的碱基序列组成的多核苷酸；
(ii)由序列号1所示的碱基序列中缺失、替换、插入或添加了1个或多个核苷酸的碱基序列组成的、且编码具有天冬氨酸转氨酶(AAT)活性的蛋白质的多核苷酸；
(iii)在严格条件下与序列号1所示的碱基序列杂交、且编码具有AAT活性的蛋白质的多核苷酸；和
(iv)含有与由序列号1所示的碱基序列组成的多核苷酸具有至少90％的同一性的碱基序列、且编码具有AAT活性的蛋白质的多核苷酸。
2、选自以下(v)、(vi)、(vii)和(viii)的蛋白质：
(v)由序列号2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(vi)由序列号2所示的氨基酸序列中缺失、替换、插入或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的、且具有天冬氨酸转氨酶(AAT)活性的蛋白质；
(vii)由与编码序列号2所示的氨基酸序列的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸所编码的、且具有AAT活性的蛋白质；和
(viii)由与序列号2所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列组成的、且具有AAT活性的蛋白质。
3、编码根据权利要求2的蛋白质的多核苷酸。
4、选自以下(ix)、(x)、(xi)和(xii)的多核苷酸：
(ix)由序列号3所示的碱基序列组成的多核苷酸；
(x)由序列号3所示的碱基序列中缺失、替换、插入或添加了1个或多个核苷酸的碱基序列组成的、且具有启动子活性的多核苷酸；
(xi)在严格条件下与序列号3所示的碱基序列杂交且具有启动子活性的多核苷酸；和
(xii)含有与序列号3所示的碱基序列组成的多核苷酸具有至少95％的同一性的碱基序列、且具有启动子活性的多核苷酸。
5、含有根据权利要求1或3的多核苷酸的重组载体。
6、根据权利要求5的重组载体，其还含有根据权利要求4的多核苷酸，且该多核苷酸以能够起作用的方式连接至根据权利要求1或3的多核苷酸。
7、根据权利要求5或6的重组载体，其是从保藏号为FERM BP-10495的保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心的放线菌制备的表达载体pSG11。
8、用根据权利要求5～7中任意一项所述的重组载体转化的宿主。
9、根据权利要求8的宿主，其为放线菌。
10、根据权利要求9的宿主，其中所述放线菌为吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)。
11、根据权利要求8～10中任意一项所述的宿主，其是由保藏号为FERM BP-1368的保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心的SF1293NP-50株或保藏号为FERM BP-130的保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心的SF1293株经转化而形成的。
12、重组载体，其包含根据权利要求1或3的多核苷酸和编码具有L-膦丝菌素转氨酶活性的蛋白质的多核苷酸。
13、根据权利要求12的重组载体，其还包含根据权利要求4的多核苷酸，其中该多核苷酸以能够起作用的方式连接至根据权利要求1或3的多核苷酸。
14、根据权利要求12或13的重组载体，其中编码具有L-膦丝菌素转氨酶(PAT)活性的蛋白质的多核苷酸选自以下的(i’)、(ii’)、(iii’)和(iv’)：
(i’)由序列号4所示的碱基序列组成的多核苷酸；
(ii’)由序列号4所示的碱基序列中缺失、替换、插入或添加了1个或多个核苷酸的碱基序列组成、且编码具有PAT活性的蛋白质的多核苷酸；
(iii’)在严格条件下与序列号4所示的碱基序列杂交、且编码具有PAT活性的蛋白质的多核苷酸；和
(iv’)含有与由序列号4所示的碱基序列组成的多核苷酸具有至少90％的同一性的碱基序列、且编码具有PAT活性的蛋白质的多核苷酸。
15、根据权利要求12或13的重组载体，其中所述具有L-膦丝菌素转氨酶(PAT)活性的蛋白质选自以下的(v’)、(vi’)、(vii’)和(viii’)：
(v’)由序列号5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(vi’)由序列号5所示的氨基酸序列中缺失、替换、插入或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、且具有PAT活性的蛋白质；
(vii’)由与编码序列号5所示的氨基酸序列的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸编码的、且具有PAT活性的蛋白质；和
(viii’)由与序列号5所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列组成、且具有PAT活性的蛋白质。
16、根据权利要求12～15中任意一项所述的重组载体，其中根据权利要求1或3的多核苷酸与编码具有L-膦丝菌素转氨酶活性的蛋白质的多核苷酸反向连接。
17、根据权利要求12～15中任意一项所述的重组载体，其中根据权利要求1或3的多核苷酸与编码具有L-膦丝菌素转氨酶活性的蛋白质的多核苷酸正向连接。
18、根据权利要求12～16中任意一项所述的重组载体，其是由保藏号为FERM BP-10496的保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心的放线菌制备的表达载体pAHSG7201。
19、用权利要求12～18中任意一项所述的重组载体转化的宿主。
20、根据权利要求19的宿主，其为放线菌。
21、根据权利要求20的宿主，其中所述放线菌为吸水链霉菌。
22、根据权利要求19～21中任意一项所述的宿主，其是由保藏号为FERM BP-1368的保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心的SF1293NP-50株或保藏号为FERM BP-130的保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心的SF1293株经转化而形成的。
23、制备式(I)：
[化学式1]
Figure A200780007518C00051
所示的L-膦丝菌素或其盐的方法，其特征在于：该方法包括在谷氨酸或其盐和天冬氨酸或其盐的存在下，使式(II)：
[化学式2]
Figure A200780007518C00052
所示的4-羟基甲基氧膦基-2-氧代-丁酸或其盐与显示出天冬氨酸转氨酶活性和L-膦丝菌素转氨酶活性、且能够产生L-膦丝菌素的放线菌相接触的步骤，其中使用的放线菌显示出超过亲本株的天冬氨酸转氨酶活性的活性。
24、根据权利要求23的方法，其中使用的放线菌是权利要求8～11中任意一项所述的宿主。
25、根据权利要求23或24的方法，其中所述式(II)的化合物或其盐：谷氨酸或其盐:天冬氨酸或其盐＝1:0.25～1:1。
26、根据权利要求25的方法，其中式(II)的化合物或其盐:谷氨酸或其盐:天冬氨酸或其盐＝1:0.25:1。
27、制备式(I)：
[化学式3]
Figure A200780007518C00053
所示的L-膦丝菌素或其盐的方法，其特征在于：该方法包括在谷氨酸或其盐和天冬氨酸或其盐的存在下，使式(II)：
[化学式4]
Figure A200780007518C00061
所示的4-羟基甲基氧膦基-2-氧代-丁酸或其盐与显示出天冬氨酸转氨酶活性和L-膦丝菌素转氨酶活性且能够产生L-膦丝菌素的放线菌相接触的步骤，其中使用的放线菌显示出超过亲本株的天冬氨酸转氨酶活性的活性、和超过亲本株的L-膦丝菌素转氨酶活性的活性。
28、根据权利要求27的方法，其中使用的放线菌是权利要求19～22中任意一项所述的宿主。
29、根据权利要求27或28的方法，其中式(II)的化合物或其盐:谷氨酸或其盐:天冬氨酸或其盐＝1:0.25～1:1。
30、根据权利要求29的方法，其中式(II)的化合物或其盐:谷氨酸或其盐:天冬氨酸或其盐＝1:0.25:1。
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