CN101393128A - 荧光探针在检测酶活性和筛选抑制剂中的应用 - Google Patents

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CN101393128A CNA2007101221976A CN200710122197A CN101393128A CN 101393128 A CN101393128 A CN 101393128A CN A2007101221976 A CNA2007101221976 A CN A2007101221976A CN 200710122197 A CN200710122197 A CN 200710122197A CN 101393128 A CN101393128 A CN 101393128A
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Abstract

本发明涉及一种荧光探针在检测酶活性和筛选抑制剂中的应用。本发明应用一系列的水溶性共轭聚合物、共轭寡聚物以及具有发色团的非共轭聚合物或寡聚物作为荧光探针，使用这种具有高荧光量子产率的聚合物或寡聚物作为荧光探针，并对酶的底物进行单标记，在应用于检测酶活性和筛选抑制剂时，可以具有高效、灵敏、定量、直接、简便、快速、灵敏、普适等优点。

Description

荧光探针在检测酶活性和筛选抑制剂中的应用
技术领域
本发明属于酶分析技术领域，具体地说是涉及一种荧光探针的应用，其可用于检测酶活性和筛选抑制剂。
背景技术
传统的定量检测酶活性的方法是分光光度法。该方法是利用酶促反应前后底物吸光度的变化求出底物浓度的变化值，从而得出酶的活性。这种方法由于需要依靠紫外检测，使得其灵敏度低，而且酶和底物的消耗大，无法在低浓度下检测酶活性。
另外一些定量检测酶活性的方法包括HPLC分析、电化学分析、化学发光分析等。HPLC分析虽然具有定量分析的优点，但需要较多的样品量，灵敏度偏低，而且难以连续、实时地进行检测。在大多情况下，电化学分析需要偶联多步反应，甚至需要其它酶的参与，使反应体系变得复杂。灵敏度较高的化学发光分析同样如此，而且不易操作，重复性差，难以准确地定量检测酶活性。
近年来由于荧光分析技术的灵敏度高，其在检测酶的活性方面越来越受到人们关注，这种技术通常是将酶的底物设计成双标记分子，即在底物两端共价连接两个不同的染料分子，两染料分子之间发生能量转移或电子转移，酶作用于底物后两染料分子分开，切断了转移过程，使荧光光谱发生变化。但双标记的成本较高，而且大多底物分子难以双标记修饰，酶的活性也可能受到较大影响，所以此方法也不能广泛地应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有酶活性检测技术的种种不足，从而应用一系列的水溶性共轭聚合物、共轭寡聚物以及具有发色团的非共轭聚合物或寡聚物作为荧光探针，使用这种具有高荧光量子产率的聚合物或寡聚物作为荧光探针，并对酶的底物进行单标记，在应用于检测酶活性和筛选抑制剂时，可以具有高效、灵敏、定量、直接、简便、快速、灵敏、普适等优点。
本发明的目的是通过如下的技术方案实现的：
本发明在检测酶活性和筛选抑制剂中所使用的荧光探针为下列之一：
(一)水溶性共轭聚合物或共轭寡聚物：
优选的，所述的水溶性共轭聚合物或共轭寡聚物为式I，II或III所示的化合物：
Figure A200710122197D00081
    式I
其中，R1代表链末端含有磺酸根、羧酸根、或磷酸根的烷基(链长为2—12个碳)或芳基，优选下列基团中的一种：2-磺基乙基、4-磺基丁基、6-磺基己基、4-(2-磺基乙氧基)苯基、4-(3-磺基丙氧基)苯基、4-(4-磺基丁氧基)苯基、4-(5-磺基戊氧基)苯基、4-(6-磺基己氧基)苯基、2-羧基乙基、4-羧基丁基、6-羧基己基、4-(4-羧基丁氧基)苯基、6-磷酸基己基；
R2代表氢或链长为2—12个碳的烷氧基，优选下列基团中的一种：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基、2-甲氧基乙氧基、2-(2-甲氧基乙氧基)-乙氧基、2-(2-(2-甲氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基、2-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基；
Ar为芴基、苯基、或噻吩基；
Figure A200710122197D00082
式II
其中，R1为链末端含有磺酸根、羧酸根、或磷酸根的且含有2—12个碳原子的烷基或芳基，优选下列基团中的一种：2-磺基乙基、4-磺基丁基、6-磺基己基、4-(2-磺基乙氧基)苯基、4-(3-磺基丙氧基)苯基、4-(4-磺基丁氧基)苯基、4-(5-磺基戊氧基)苯基、4-(6-磺基己氧基)苯基、2-羧基乙基、4-羧基丁基、6-羧基己基、4-(4-羧基丁氧基)苯基、6-磷酸基己基；
B为乙烯基(-CH＝CH-)或乙炔基(-C≡C-)；
为了淬灭式I或II所示的化合物，需要使用下述的淬灭剂：
Ar为芴基或苯基时，或B为乙炔基时，使用选自对甲基红、苯醌、蒽醌、硝基苯、多硝基苯、芘、吖啶、荧光素、罗丹明、联吡啶、卟啉中的一种作为淬灭剂；
Ar为噻吩基或B为乙烯基时，使用选自对甲基红、苯醌、蒽醌、吖啶、联吡啶、卟啉中的一种作为淬灭剂。
 式III
其中，R3为含有2—12个碳原子的烷基或烷氧基，优选下列基团中的一种：甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、2-甲氧基乙基、2-(2-甲氧基乙氧基)-乙基、2-(2-(2-甲氧基乙氧基)-乙氧基)-乙基、2-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙基；
R4为链末端含有磺酸根、羧酸根、或磷酸根的且含有2—12个碳原子的烷基或烷氧基，优选下列基团中的一种：2-磺基乙氧基、4-磺基丁氧基、6-磺基己氧基、2-(2-磺基乙氧基)-乙氧基、2-(2-(2-磺基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基、2-羧基乙氧基、3-羧基丙氧基、4-羧基丁氧基、5-羧基戊氧基、6-羧基己氧基、2-(3-羧基乙氧基)-乙氧基、2-(2-(3-羧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基、2-(2-(2-(3-羧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基、6-磷酸基己基；
Ar为芴基、苯基或噻吩基；
为了淬灭式III所示的化合物，需要使用选自对甲基红、苯醌、蒽醌、硝基苯、多硝基苯、芘、吖啶、荧光素、罗丹明、联吡啶、卟啉中的一种作为淬灭剂。
(二)具有发色团的非共轭聚合物或寡聚物
优选的，所述的具有发色团的非共轭聚合物或寡聚物包括式IV所示的化合物：
Figure A200710122197D00101
式IV
其中，R5为链末端含有磺酸根、羧酸根、或磷酸根的且含有2—12个碳原子的烷基或芳基，优选下列基团中的一种：2-磺基乙基、4-磺基丁基、6-磺基己基、4-(2-磺基乙氧基)苯基、4-(3-磺基丙氧基)苯基、4-(4-磺基丁氧基)苯基、4-(5-磺基戊氧基)苯基、4-(6-磺基己氧基)苯基、2-羧基乙基、4-羧基丁基、6-羧基己基、4-(4-羧基丁氧基)苯基、6-磷酸基己基；
R6为氢或含有2—12个碳原子的烷氧基，优选下列基团中的一种：氢、甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基、2-甲氧基乙氧基、2-(2-甲氧基乙氧基)-乙氧基、2-(2-(2-甲氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基、2-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基；
Ar为芴基、苯基或噻吩基；
L为含有2—12个碳原子的烷基或环烷基，优选下列基团中的一种：亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、亚壬基、3-氧杂亚戊基、3，6-二氧杂亚辛基、环己基；
为了淬灭式IV所示的化合物，需要使用选自对甲基红、苯醌、蒽醌、硝基苯、多硝基苯、芘、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素、联吡啶、卟啉中的一种作为淬灭剂。
本发明提供一种上述荧光探针在检测酶活性中的应用，该酶活性定量检测方法，包括如下的步骤：
第一步，对酶底物进行化学修饰：通过共价键合，在酶底物上连接一个与荧光探针所匹配的淬灭剂基团，得到修饰过的酶底物；
第二步，绘制标准检测曲线：将修饰过的酶底物与上述的荧光探针反应，完全淬灭荧光探针的荧光：分批将第一步得到的修饰过的酶底物加入含有荧光探针的缓冲液中，修饰过的酶底物与荧光探针通过静电作用在缓冲液中形成静电复合物并淬灭荧光，直至荧光探针的荧光淬灭至99％以上，记录此过程中酶底物浓度[Q]和荧光强度F，以(F0/F-1)为纵坐标，[Q]为横坐标，绘制Stern-Volmer淬灭曲线，以此作为标准检测曲线，建立了荧光强度与酶底物浓度的定量关系；
该淬灭曲线是直线的情况下，Stern-Volmer方程为：
F0/F-1＝Kapp[Q]
其中，F0是加入酶底物之前的荧光强度，
F是加入酶底物之后的荧光强度，
[Q]是混合液中酶底物浓度，
Kapp是表观系数，为一常数值；
该淬灭曲线是抛物线的情况下，Stern-Volmer方程为：
(F0/F-1)＝A[Q]+B[Q]2
其中，F0是加入酶底物之前的荧光强度，
F是加入酶底物之后的荧光强度，
[Q]是混合液中酶底物浓度，
A、B为常数；
第三步，待测酶的活性分析：将不同浓度的修饰过的酶底物与荧光探针反应后，分别加入待测的酶，荧光信号随着酶的加入量逐渐恢复，进行一系列荧光发射光谱测定混合液的荧光强度值，然后根据第二步得到的标准检测曲线将荧光强度值转换为底物浓度值，并以此底物浓度变化值为纵坐标，反应时间为横坐标，在同一张图上绘制不同底物浓度下的浓度变化曲线，斜率即为反应初速度；
再以反应初速度的倒数为纵坐标Y，酶底物初始浓度的倒数为横坐标X，绘制Lineweaver-Burk曲线，该曲线接近直线，且符合方程：
Y＝61.067+241.90445 X，通过斜线的横截距-1/Km求出Km，可以计算出酶促反应过程中某时刻在溶液中的酶底物的浓度，从而计算酶的活性。
所述的待测的酶可以是酯酶、磷酸酶、半乳糖核苷酶等。
本发明提供一种上述荧光探针在酶抑制剂的筛选中的应用，该酶抑制剂的筛选方法，包括如下的步骤：
第一步，如前所述，先绘制荧光强度与酶底物浓度的标准检测曲线；
第二步，在酶促反应缓冲液中加入酶和待筛选的抑制剂，平行进行多个反应，每个反应缓冲中酶的浓度相同，抑制剂的浓度为从零开始的不同的浓度，温育0-20分钟时间；
第三步，向第二步的混合液中加入前述的荧光探针，测定初始荧光强度后加入经淬灭剂修饰的酶底物，继续温育0-120分钟时间后，测定荧光光谱，取荧光强度值，并按第一步的标准曲线将荧光强度值转换成酶底物浓度；按照下列公式，计算抑制率IE％；
IE％＝(Ct(in hibitor)—Ct(no inhibitor))/(C0—Ct(no inhibitor))×100％
其中，C0为底物的初始浓度，
Ct(in hibitor)和Ct(no inhibitor)分别是加了抑制剂和不加抑制剂的底物浓度。
第四步，然后以计算出的IE％为纵坐标、抑制剂浓度为横坐标绘制曲线，求出IE％为50％时对应的抑制剂浓度，即酶活性被抑制50％时的抑制剂浓度，得到该抑制剂的IC50值。
本发明基于利用具有优越的荧光性能的荧光探针与共价连接酶底物的淬灭剂分子先形成复合物淬灭荧光，然后再用靶酶分子使荧光信号恢复，可以连续、均相、定量且实时地混合即测定(“mix and detect”)地观察底物被酶消化的过程。
与一般的荧光染料分子相比，本发明应用的水溶性共轭聚合物、共轭寡聚物和具有发色团的非共轭聚合物或寡聚物在水溶液中具有更高的荧光量子产率，是一种可以在低浓度下使用的荧光探针。
本发明使用了这种荧光检测体系检测酶的活性时，荧光探针的荧光淬灭达到99％以上，即深度淬灭(Superquenching)，可以显著降低荧光背景，从而可以大幅度地提高检测方法的灵敏度。此外，本发明应用的这种荧光探针还可大幅提高荧光信号恢复倍数，甚至可恢复达100倍以上。
应用了本发明的这种荧光探针的检测酶活的方法，还可拓展到抑制剂的筛选研究中。例如，乙酰胆碱酯酶(AChE)、丁酰胆碱酯酶(BuChE)、β-半乳糖苷酶等，是阿尔茨海默氏症、肿瘤等相关的靶酶或标志酶，与人类自身许多疾病密切相关，可以使用本发明的方法来对其进行酶活性的检测，在疾病诊断方面具有重要意义。而且，许多酶抑制剂在医学上是研究疾病药物的一个重要方向和途径，酶抑制剂筛选的工作无疑具有不可或缺的作用，本发明为其提供了另一种新的途经。
本发明在检测酶活性和筛选抑制剂中应用了具有优越的荧光性能的荧光探针，使得这些方法具有操作简便、响应快、灵敏度高等特点。
附图说明
图1为实施例1中向PFP-SO3 -加入经修饰的酶底物后的荧光光谱；
图2为实施例1得到的Stern-Volmer淬灭曲线；其中，F0是加入酶底物之前的荧光强度，F是加入酶底物之后的荧光强度，[Q]是混合液中酶底物浓度，即修饰的酶底物浓度；
图3为实施例1中不同底物初始浓度和反应时间的曲线；
图4为实施例1中的Lineweaver-Burk曲线；
图5为实施例1中的酶抑制曲线；
图6为实施例2中向PFP-COOH加入经修饰的酶底物后的荧光光谱；
图7为实施例2得到的Stern-Volmer淬灭曲线；
图8为实施例2中不同底物初始浓度和反应时间的曲线；
图9为实施例2中的Lineweaver-Burk曲线；。
具体实施方式
以下结合附图及本发明的技术方案提供实施例。
实施例1、荧光探针PFP-SO3 -在酶活性分析及抑制剂筛选中的应用
化学修饰的酶底物制备：在氮气保护下，向装有二甲基亚砜(0.5mL)的10mL二口瓶中加入6-(对甲基红)氨基己酸(38mg，0.1mmol)和羰基二咪唑(24mg，0.15mmol)，室温下磁力搅拌30分钟。用注射器将反应液转移到装有溴乙酰胆碱(10mg，0.08mmol)、二氮双环十一碳-7-烯(21μL，0.14mmol)和二甲基亚砜(0.25mL)的5mL单口瓶中，于40℃搅拌反应24小时。减压浓缩后，经硅胶柱分离(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇/水＝65/25/4，v/v/v)，得到目标产物6-(对甲基红)氨基己酰胆碱溴(15mg，34％)，即在酶底物上连接了与荧光探针PFP-SO3 -所匹配的淬灭剂基团。
Figure A200710122197D00141
式V
标准检测曲线的绘制：向3mL比色池加入1.0mL磷酸缓冲溶液(25mM，pH8)，加入作为荧光探针的聚合物PFP-SO3 -(式V)至2.0μM，在376nm激发波长下测定其荧光发射光谱。然后持续滴加上述修饰过的酶底物至0.80μM，每次滴加酶底物后测定荧光发射光谱(如图1所示)。记录荧光发射光谱424nm处的荧光强度值，以(F0/F-1)为纵坐标，[Q]为横坐标，绘制Stern-Volmer曲线，以此作为标准检测曲线，建立了荧光强度与酶底物浓度的定量关系如图2所示。
乙酰胆碱酯酶(AChE)活性分析：向3mL比色池中加入1.0mL磷酸缓冲溶液(25mM，pH8)，加热至37℃，加入聚合物PFP-SO3 -至2.0μM，记录荧光发射光谱424nm处的荧光强度值，再加入上述修饰过的酶底物至0.2μM，记录荧光发射光谱424nm处的荧光强度值，加入1.0单位AChE，荧光信号逐渐恢复，80秒内测定一系列荧光发射光谱，并记录荧光发射光谱424nm处的荧光强度值。改变上述修饰过的酶底物初始浓度值分别为0.25，0.3，0.4，0.6μM，重复上述实验。按标准检测曲线(图2)将荧光强度值转换为底物浓度值，以底物浓度变化值为纵坐标，反应时间为横坐标，在同一张图上绘制不同底物浓度下的浓度变化曲线(图3)，斜率为反应初速度。再以反应初速度的倒数为纵坐标，酶底物初始浓度的倒数为横坐标，绘制Lineweaver-Burk曲线(图4)，曲线接近直线，方程为：Y＝61.067+241.90445X，横截距-1/Km＝-0.252，求出Km＝4.0μM。
乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂IC50值测定：按照上述标准检测曲线的绘制方法，在pH7.4的磷酸缓冲液中绘制标准检测曲线。向1.0mL磷酸缓冲液(25mM，pH7.4)加入1.0单位AChE，和不同浓度的抑制剂(加兰他敏：0，0.002，0.01，0.02，0.1，0.3μM；多奈派奇：0，0.005，0.01，0.05，0.1μM)，在25℃温育15分钟，然后加入PFP-SO3 -至2.0μM，加入酶底物至0.3μM，在37℃温育10分钟后，测定荧光光谱。按标准检测曲线将荧光强度值转换为底物浓度值，按公式：IE％＝(Ct(in hibitor)—Ct(no inhibitor))/(C0—Ct(no inhibitor))×100％计算抑制率IE％，公式中C0为底物的初始浓度，Ct(in hibitor)和Ct(no inhibitor)分别为加入抑制剂和不加抑制剂的底物浓度。然后以抑制率为纵坐标、抑制剂浓度为横坐标绘制曲线(图5)，求出抑制率为50％对应的抑制剂浓度，即该抑制剂的IC50值。
实施例2、荧光探针PFP-COOH在酶活性分析中的应用
先按照实施例1中的方法制备相同的化学修饰的酶底物。
绘制标准检测曲线：向3mL比色池加入1.0mL磷酸缓冲溶液(25mM，pH8)，加入聚合物PFP-COOH(式VI)至2.0μM，376nm激发波长下测定其荧光发射光谱。然后持续滴加上述修饰过的酶底物，每次滴加上述修饰过的酶底物后测定荧光发射光谱。记录荧光发射光谱424nm处的荧光强度值，以(F0/F-1)为纵坐标，[Q]为横坐标，绘制Stern-Volmer曲线，以此作为标准检测曲线，如图7所示。
Figure A200710122197D00151
 式VI
AChE活性分析：向3mL比色池加入1.0mL磷酸缓冲溶液(25mM，pH8)，平衡至37℃，加入聚合物PFP-COOH(式VI，m＝n＝0.5)至2.0μM，记录λem＝424nm处的荧光强度值，加入修饰的上述修饰过的酶底物至0.2μM，荧光发射光谱424nm处的荧光强度值，加入1.0单位AChE，80s内测定一系列荧光光谱，记录荧光发射光谱424nm处的荧光强度值。改变底物初始浓度值分别为0.25，0.3，0.4，0.6μM，重复上述实验。按标准检测曲线(图7)将荧光强度值转换为底物浓度值，以底物浓度变化值为纵坐标，反应时间为横坐标，在同一张图上绘制不同底物浓度下的浓度变化曲线(图8)，斜率为反应初速度。再以反应初速度的倒数为纵坐标，酶底物初始浓度的倒数为横坐标，绘制Lineweaver-Burk曲线(图9)，曲线接近直线，方程为：Y＝8.54621+74.51479X，横截距-1/Km＝-0.115，求出Km＝8.7μM。

Claims (10)

1、一种荧光探针在检测酶活性和筛选抑制剂中的应用，所述的荧光探针为式I，II或III所示的水溶性共轭聚合物或共轭寡聚物：
 式I
其中，R1代表链末端含有磺酸根、羧酸根、或磷酸根的且含有2—12个碳原子的烷基或芳基；
R2代表氢或链长为2—12个碳的烷氧基；
Ar为芴基、苯基、或噻吩基；
Figure A200710122197C00022
  式II
其中，R1为链末端含有磺酸根、羧酸根、或磷酸根的且含有2—12个碳原子的烷基或芳基；
B为乙烯基(-CH＝CH-)或乙炔基(-C≡C-)；
Figure A200710122197C00023
    式III
其中，R3为含有2—12个碳原子的烷基或烷氧基；
R4为链末端含有磺酸根、羧酸根、或磷酸根的且含有2—12个碳原子的烷基或烷氧基；
Ar为芴基、苯基或噻吩基。
2、根据权利要求1所述的荧光探针在检测酶活性和筛选抑制剂中的应用，其特征在于：所述的R1选自下列基团中的一种：2-磺基乙基、4-磺基丁基、6-磺基己基、4-(2-磺基乙氧基)苯基、4-(3-磺基丙氧基)苯基、4-(4-磺基丁氧基)苯基、4-(5-磺基戊氧基)苯基、4-(6-磺基己氧基)苯基、2-羧基乙基、4-羧基丁基、6-羧基己基、4-(4-羧基丁氧基)苯基、6-磷酸基己基；
所述的R2选自下列基团中的一种：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基、2-甲氧基乙氧基、2-(2-甲氧基乙氧基)-乙氧基、2-(2-(2-甲氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基、2-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基。
3、根据权利要求1所述的荧光探针在检测酶活性和筛选抑制剂中的应用，其特征在于：所述的R3选自下列基团中的一种：甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、2-甲氧基乙基、2-(2-甲氧基乙氧基)-乙基、2-(2-(2-甲氧基乙氧基)-乙氧基)-乙基、2-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙基；
所述的R4选自下列基团中的一种：2-磺基乙氧基、4-磺基丁氧基、6-磺基己氧基、2-(2-磺基乙氧基)-乙氧基、2-(2-(2-磺基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基、2-羧基乙氧基、3-羧基丙氧基、4-羧基丁氧基、5-羧基戊氧基、6-羧基己氧基、2-(3-羧基乙氧基)-乙氧基、2-(2-(3-羧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基、2-(2-(2-(3-羧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基、6-磷酸基己基。
4、根据权利要求1或2所述的荧光探针在检测酶活性和筛选抑制剂中的应用，其特征在于：为了淬灭式I或II所示的化合物，使用的淬灭剂为：
Ar 为芴基或苯基时，或B为乙炔基时，使用选自对甲基红、苯醌、蒽醌、硝基苯、多硝基苯、芘、吖啶、荧光素、罗丹明、联吡啶、卟啉中的一种作为淬灭剂；
Ar 为噻吩基或B为乙烯基时，使用选自对甲基红、苯醌、蒽醌、吖啶、联吡啶、卟啉中的一种作为淬灭剂。
5、根据权利要求1或3所述的荧光探针在检测酶活性和筛选抑制剂中的应用，其特征在于：为了淬灭式III所示的化合物，使用选自对甲基红、苯醌、蒽醌、硝基苯、多硝基苯、芘、吖啶、荧光素、罗丹明、联吡啶、卟啉中的一种作为淬灭剂。
6、一种荧光探针在检测酶活性和筛选抑制剂中的应用，所述的荧光探针为式IV所示的具有发色团的非共轭聚合物或寡聚物：
Figure A200710122197C00041
式IV
其中，R5为链末端含有磺酸根、羧酸根、或磷酸根的且含有2—12个碳原子的烷基或芳基；
R6为氢或含有2—12个碳原子的烷氧基；
Ar 为芴基、苯基或噻吩基；
L 为含有2—12个碳原子的烷基或环烷基。
7、根据权利要求6所述的荧光探针在检测酶活性和筛选抑制剂中的应用，其特征在于：
所述的R5选自下列基团中的一种：2-磺基乙基、4-磺基丁基、6-磺基己基、4-(2-磺基乙氧基)苯基、4-(3-磺基丙氧基)苯基、4-(4-磺基丁氧基)苯基、4-(5-磺基戊氧基)苯基、4-(6-磺基己氧基)苯基、2-羧基乙基、4-羧基丁基、6-羧基己基、4-(4-羧基丁氧基)苯基、6-磷酸基己基；
所述的R6选自下列基团中的一种：氢、甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基、2-甲氧基乙氧基、2-(2-甲氧基乙氧基)-乙氧基、2-(2-(2-甲氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基、2-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基；
所述的L选自下列基团中的一种：亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、亚壬基、3-氧杂亚戊基、3，6-二氧杂亚辛基、环己基。
8、根据权利要求6或7中所述的荧光探针在检测酶活性和筛选抑制剂中的应用，其特征在于：为了淬灭式IV所示的化合物，使用选自对甲基红、苯醌、蒽醌、硝基苯、多硝基苯、芘、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素、联吡啶、卟啉中的一种作为淬灭剂。
9、根据权利要求1所述的荧光探针在检测酶活性和筛选抑制剂中的应用，所述的酶活性定量检测方法包括如下的步骤：
第一步，对酶底物进行化学修饰：通过共价键合，在酶底物上连接一个与荧光探针所匹配的淬灭剂基团，得到修饰过的酶底物；
第二步，绘制标准检测曲线：将修饰过的酶底物与上述的荧光探针反应，完全淬灭荧光探针的荧光：分批将第一步得到的修饰过的酶底物加入含有荧光探针的缓冲液中，修饰过的酶底物与荧光探针通过静电作用在缓冲液中形成静电复合物并淬灭荧光，直至荧光探针的荧光淬灭至99％以上，记录此过程中酶底物浓度[Q]和荧光强度F，以(F0/F-1)为纵坐标，[Q]为横坐标，绘制Stern-Volmer淬灭曲线，以此作为标准检测曲线，建立了荧光强度与酶底物浓度的定量关系；
该淬灭曲线是直线的情况下，Stern-Volmer方程为：
F0/F-1＝Kapp[Q]
其中，F0是加入酶底物之前的荧光强度，
F是加入酶底物之后的荧光强度，
[Q]是混合液中酶底物浓度，
Kapp是表观系数，为一常数值；
该淬灭曲线是抛物线的情况下，Stern-Volmer方程为：
(F0/F-1)＝A[Q]+B[Q]2
其中，F0是加入酶底物之前的荧光强度，
F是加入酶底物之后的荧光强度，
[Q]是混合液中酶底物浓度，
A、B为常数；
第三步，待测酶的活性分析：将不同浓度的修饰过的酶底物与荧光探针反应后，分别加入待测的酶，荧光信号随着酶的加入量逐渐恢复，进行一系列荧光发射光谱测定混合液的荧光强度值，然后根据第二步得到的标准检测曲线将荧光强度值转换为底物浓度值，并以此底物浓度变化值为纵坐标，反应时间为横坐标，在同一张图上绘制不同底物浓度下的浓度变化曲线，斜率即为反应初速度；
再以反应初速度的倒数为纵坐标Y，酶底物初始浓度的倒数为横坐标X，绘制Lineweaver-Burk曲线，该曲线接近直线，且符合方程：
Y＝61.067+241.90445X，通过斜线的横截距-1/Km求出Km，可以计算出酶促反应过程中某时刻在溶液中的酶底物的浓度，从而计算酶的活性。
10、根据权利要求1所述的荧光探针在检测酶活性和筛选抑制剂中的应用，所述的酶抑制剂的筛选方法包括如下的步骤：
第一步，绘制荧光强度与酶底物浓度的标准检测曲线；
第二步，在酶促反应缓冲液中加入酶和待筛选的抑制剂，平行进行多个反应，每个反应缓冲中酶的浓度相同，抑制剂的浓度为从零开始的不同的浓度，温育0-20分钟时间；
第三步，向第二步的混合液中加入前述的荧光探针，测定初始荧光强度后加入经淬灭剂修饰的酶底物，继续温育0-120分钟时间后，测定荧光光谱，取荧光强度值，并按第一步的标准曲线将荧光强度值转换成酶底物浓度；按照下列公式，计算抑制率IE％；
IE％＝(Ct(inhibitor)—Ct(noinhibitor))/(C0—Ct(noinhibitor))×100％
其中，C0为底物的初始浓度，
Ct(inhibitor)和Ct(noinhibitor)分别是加了抑制剂和不加抑制剂的底物浓度。
第四步，然后以计算出的IE％为纵坐标、抑制剂浓度为横坐标绘制曲线，求出IE％为50％时对应的抑制剂浓度，即酶活性被抑制50％时的抑制剂浓度，得到该抑制剂的IC50值。
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